CS277597B6 - Způsob přípravy myších monoklonálních protilátek proti C-peptidu lidského proinsulinu - Google Patents
Způsob přípravy myších monoklonálních protilátek proti C-peptidu lidského proinsulinu Download PDFInfo
- Publication number
- CS277597B6 CS277597B6 CS893421A CS342189A CS277597B6 CS 277597 B6 CS277597 B6 CS 277597B6 CS 893421 A CS893421 A CS 893421A CS 342189 A CS342189 A CS 342189A CS 277597 B6 CS277597 B6 CS 277597B6
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- peptide
- human proinsulin
- monoclonal antibodies
- mice
- proinsulin
- Prior art date
Links
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 title abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 5
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 title 1
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 claims abstract description 46
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 claims description 21
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 6
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 6
- 101000800130 Bos taurus Thyroglobulin Proteins 0.000 claims description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 5
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 claims description 3
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 claims 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 6
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 6
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 3
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 101500028775 Homo sapiens Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 101000632994 Homo sapiens Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 101000985214 Mus musculus 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 102000045305 human SST Human genes 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 208000010522 hyperproinsulinemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 1
- 206010022498 insulinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 208000021255 pancreatic insulinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000011833 salt mixture Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Jedná se o způsob přípravy myších monoklonálních
protilátek proti C-peptidu lidského proinsulinu.
Způsob zahrnuje postup k získání hyperlmunizovaných
myší, jejichž slezinné buňky
jsou použity k přípravě hybridomů produkujících
monoklonální protilátkyvhodné pro použití
ke kvantitativnímu stanovení koncentrace Cpeptidu
lidského proinsulinu nebo ke stanovení
lidského proinsulinu.
Description
Tyto monoklonální protilátky mohou být využity hlavně v klinické diagnostice u diabetiků k analytickému stanovení C-peptidu lidského proinsulinu v seru a moči pacientů.
C-peptid je součástí proinsulinu syntetizovaného v beta-buňkách Langerhansových ostrůvků pankreatu. Ještě v beta-buňce je většina proinsulinu (86 aminokyselin) rozštěpena na insulin (51 aminokyselin), C-peptid (31 aminokyselin) a dva dipeptidy. Z beta-buněk vychází insulin a C-peptid v ekvimolárním poměru 1:1 a současně malá část ještě nerozštěpeného proinsulinu (do 20%).
Lidský insulin má stejnou imunoreaktivitu jako insuliny zvířecí, které jsou používány k léčbě diabetiků (neshoda v 1 aminokyselině v případě insulinu vepřového a ve 3 aminokyselinách v případě insulinu hovězího). Proto u diabetiků léčených insulinem není stanovený insulin ukazatelem sekrece z vlastních Langerhansových ostrůvků. U takových diabetiků podá informaci o zbytkové, sekreci pouze vyšetření C-peptidu lidského proinsulinu.
. Protilátky proti C-peptidu lidského proinsulinu lze dosud vyrábět tak, že C-peptid je opakovaně injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji morčatům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek užívaných zejména pro kvantitativní stanovení C-peptidu lidského proinsulinu v séru nebo moči metodou radioimunologické nebo enzymoanalytické analýzy. Tento postup, nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, tzv. polyklonálních, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality.
Nevýhodu konvenčních sér proti C-peptidu v principu odstraňuje použití hybridomové technologie. Produkt hybridomu - monoklonální protilátka - je namířen proti jediné antigenní determinantě. Tento přístup, tj. příprava hybridomů produkujících monoklonální protilátky specificky rozeznávající C-peptid lidského proinsulinu, byl použit v následujících publikacích: Madsen O.D., Cohen R.M. , Fitch F.W., Rubinstein A.H. , Steiner D.F.: The production and characterization of monoclonal antibodies specific for human proinsulin using a sensitive microdot assay procedure. Endocrinology 113:2135-2144, 1983; Madsen O.D., Frank B.H., Steiner D.F.: Human proinsulin - specific antigenic determinants indentified by monoclonal antibodies. Diabetes 33:1012-1016, 1984. Monoklonální protilátky specifické pro lidský proinsulin jsou používány zatím pouze k výzkumným účelům. Monoklonální protilátky C-peptidu lidského proinsulinu s určením pouze k imunohistochemii jsou uvedeny v katalogu firmy Novo (Dánsko). Tyto monoklonální protilátky proti C-peptidu lidského proisulinu nebyly . dosud připraveny s takovými parametry (nízká asociační konstanta), aby mohly být využity pro sestavení diagnostické soupravy. C-peptid lidského proinsulinu se dosud stanovuje soupravami za loženými na polyklonálních antiserech např. Biodata-Serano nebo v roce 1989 zaváděná souprava Ústavem pro výzkum, výrobu a využití radioizotopů, Praha.
Normální hodnoty C-peptidu v séru či plasmě zdravých osob na lačno jsou 0,3-0,9 μmol/l (tj. 1-3 ng/ml), při stimulaci dochází ke zvýšení o 150-200 %. Do moči je C-peptid vylučován v kvantu 9-45 μmol/24 hod., tzn. v koncentracích 4-25 μmol/l. Zvláště vyšetření C-peptidu v* moči pomocí radioimunologické analýzy vyžaduje vysoce specifické protilátky (vzhledem k přítomnosti mnoha štěpů jiných bílkovin v moči). Polyklonální protilátky nemají dostatečnou specifitu pro universální využití.
Tento nedostatek malé specifičnosti může být odstraněn použitím monoklonálních protilátek získaných způsobem podle vynálezu, jehož podstatnou je, že po imunizaci samic kříženců inbredních myší kmenů BIO.A a BALB/c navázáním C-peptidu lidského proinsulinu na bílkovinné nosiče - hovězí albumin nebo thyreoglobulin, emulgováním těchto v adjuvans a podkožním podáním, se slezinné buňky z imunizovaných myší sfůzují s buňkami myelomové linie Sp 2/0 - Agl4 a vzniklé hybridomy se adaptují k růstu in vivo v peritoneu myší inbredního kmene BALB/c, načež se z 1 ml ascitické tekutiny produkované hybridomy v peritoneu myší izoluje 4 - 10 mg monoklonálního imunoglobulinu proti C-peptidu lidského proinsulinu s asociační konstantou v systému 125I-Tyr-C-peptid/C-peptid v rozmezí od K = 107 1/mol do 1010 1/mol.
Zvláště popsaný postup imunizace k získání hyperimunních myší je nejdůležitější krok přípravy monoklonální protilátky proti C-peptidu lidského proinsulinu. Tento postup byl vybrán jako optimální a z mnoha zkoušených.
a) Postup imunizace myší
Samice kříženců inbredních myších kmenů BIO.A a BALB/c byly několikanásobně imunizovány C-peptidem lidského proinsulinu jednak navázaného na hovězí thyreoglobulin, jednak na hovězí albumin. Na bílkovinný nosič navázaný antigen byl emulgován v kompletním nebo inkompletním adjuvans (Bacto adjuvant incomplete/complete-Freund, Difco Laboratories). Tyto imunogenní formy antigenu byly myším podávány podkožně na břišní stranu a do tlapek. U kříženců (BIO.A x BALB/c) myši lépe odpovídají na C-peptid lidského proinzulinu než homozygoti.
b) Příprava hybridomů produkujících monoklonální protilátky proti C-peptidu lidského proinsulinu
Hybridomy byly získány na principu známém z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S., Shceidigger, D.: Production of monoclonal · antibodies: Strategy and tactics, J. Immunol. Meth. 35:1-21, 1980; Galfré, G., Howe, S.C., Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, J.C.: Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines, Nature 266: 550, 1977). Pozitivita specifických protilátek byla sledována v sérech myší imunizovaných C-peptidem. Z myší, jejichž séra byla pozitivní v ře dění 1:500 (zjišťovaná pomocí radioimunologického precipitačního testu) byly odebrány sleziny a použity k fúzi s buňkami myší myelomové linie Sp2/0-Agl4. Buňky z 1 sleziny byly po fúzi naneseny do osmi 96 jamkových destiček s plochým dnem. Z několika fúzí byly získány 3 hybridomy produkující protilátky proti C-peptidu lidského proinsulinu. Stabilita hybridomů byla kontrolována trojnásobnou klonací.
c) Adaptace hybridomů k růstu in vivo v myších inbredního kmene BALB/c '
Pro množení hybridních buněk v myších kmene BALB/c bylo nutné hybridomové buňky vzniklé fúzí slezinné buňky heterozygotní myši kříženců (BIO.A x BALB/c) adaptovat na růst in vivo. Vyklenované hybridové buňky produkující monoklonální protilátku byly aplikovány v množství 5 x 10 buněk do peritonealm dutiny myši kříženců (BIO.A x BALB/c). Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 7 dní před přenosem buněk hybridomů ovlivněna Přistáném (2,6,10,14-Tetramethylpentadecane, Sigma, USA) (0,3 ml intraperitoneálně). Po 20 dnech růstu hybridomů v peritoneální dutině byla myš uhubena a buňky (5 x 106) byly přeneseny do peritoneální dutiny bezthymových myší (nu-nu). Příjemcům byl podán opět 7 dní před přenosem buněk hybridom Přistaň. Po 20 dnech růstu hybridomů v peritoneu byla myš uhubena a buňky (10 ) byly přeneseny do peritoneální dutiny myší kmene BALB/c předem ovlivněných Přistáném. Ve většině myší kmene BALB/c hybridom rostl. Adaptované hybridomy na růst v kmenu myší BALB/c byly po pomnožení v tkáňové kultuře zamraženy a uchovávány v tekutém dusíku.
d) Způsob biosynthézy monoklonálních protilátek in vivo
Adaptované buňky hybridomů injikované do peritoneální dutiny myší BALB/c jsou schopny produkovat ascitickou tekutinu, která obsahuje za ekonomicky výhodných podmínek velké množství monoklonální protilátky. Z ascitické tekutiny je možné izolovat monoklonální imunoglobulin např. několikanásobným přesrážením 50 % nasycením síranem amonným. Výhodou monoklonální protilátky oproti protilátce polyklonální (viz úvod) je hlavně v tom, že monoklonální protilátka reaguje s určitým místem (jednou determinantou) na molekule C-peptidu lidského proinsulinu. Tato reakce je vysoce specifická. Hybridomy produkující monoklonální protilátky proti C-peptidu lidského proinsulinu je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a jsou adaptovány pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Z konserv uchovávaných v kapalném dusíku je možné zajistit produkci protilátky bez potřeby dalšího antigenu. Monoklonální protilátky reagují s C-peptidem lidského proinsulinu a není třeba se zbavovat protilátek balastních. Tímto způsobem mohou být získány monoklonální protilátky s vysokou asociační konstantou, a proto jich může být použito pro analytické stanovení c-peptidu lidského proinsulinu v séru a moči pacientů RIA metodou. Aplikační oblastí je tedy klinická diagnostika u diabetiků. Dále jsou monoklonální protilátky použitelné ke stanovení lidského proinsulinu imunoradiometrickou metodou (IRMA) či metodou ELISA. Aplikační oblastí je zde diagnostika nádorů vycházejících z beta-buněk Langerhansových ostrůvků (nesidiom - insulinom), familiární hyperproinsulinemie a studium sekrece insulinu a proinsulinu za jiných patologických stavů. Dá se předpokládat využití monoklonálních protilátek proti C-peptidu lidského proinsulinu pro imunohistochemické a imunocytochemické analýzy, včetně elektromikroskopických, zaměřených na studium biosyntézy proinsulinu a proinsulinu za normálních a patologických stavů a řešení otázky internalizace proinsulinu. Monoklonální protilátka může být využita v průběhu biosyntetické výroby lidského insulinu, včetně kontroly kvality konečného produktu.
Příklad 1
Monoklonální protilátky proti C-peptidu lidského proinsulinu jsou produkovány hybridními buňkami vzniklými fúzí buněk myší myelomové linie Sp2/O-Agl4 a buněk, získaných ze sleziny F-l hybridů myších kmenů BIO.A x BALB/c imunizovaných C-peptidem lidského proinsulinu podle schématu popsaného v následující tabulce:
Tabulka
Schema imunizace myši F^ (BIO.A x BALB/c) C-peptidem lidského proinsulinu
| dávka den podání způsob podání a množství forma na 1 dávku antigenu1 | |||
| 1. 2. 3. 4. -5. 6.-7. | 0. den 21. den 35. den 50. a 51. den 52. a 53. den | s.c.; 50 μg/0,2 ml;břicho s.c.; 50 μg/0,2 ml;tlapky s.c.; 50 μg/0,2 ml;břicho i.v. a 2x 15 μg/0,2 ml; ocasní vena i.p. a 2x 30 μg/0,2 ml | kompl. adj uvans n nekompl. adg uvans44 , 9 kompl. ad^uvans roztok ve fyziol. roztoku roztok ve fyziol. roztoku |
^C-peptid navázaný na hovězí thyreoglobulin byl použit u dávek 1, 2a 3. C-peptid navázaný na hovězí albumin byl použit při 4.-7. dávce.
^Bacto adjuvant incomplete (complete) Freund, Difco Laboratorie.
Lidský , syntetický 1-Tyr-C-peptid, který byl připraven ve spolupráci Ústavu organické chemie a biochemie ČSAV a Výzkumného ústavu endokrinologického v Praze (B. Bendlová, M. Lebl, P, Štolba, L. Stárka) byl připojen na hovězí thyreoglobulin nebo albumin na principu jednostupňové glutaraldehydové reakce (Avrameas, S., Ternynck, T.: The crosslinking of proteins with glutaraldehyde and its use for the preparation of immunosorbents, Immunochemistry 6:53-66, 1969). Reakční poměr albumin: C-peptide-glutaraldehyd byl 1:10:100. Kvalita konjugátu byla sledována stanovením imunoreaktivity při RIA, připojením 125I-Tyr-C-peptidu a připojením Tyr-C-peptid-Ile s následnou analýzou aminokyselin.. Takto bylo stanoveno, že na 1 mol albuminu bylo navázáno asi 7 mol C-peptidu a na 1 mol thyreoglobulinu asi 40 mol C-peptidu.
Příklad 2
Hybridomové buňky produkující monoklonální protilátky proti C-peptidu lidského proinsulinu rostou in vitro jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí doplněné o neesenciální aminokyseliny, L-glutamin (3 mM), pyruvát sodný (1 mM). Toto médium (označované jako RPMI, Ústav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomů doplněno penicilinem, streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem (0,05 mM), pufrem Hepes (kyselina N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N'-2 ethansulfonová) (10 mM) a inaktivovaným bovinním sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10 %). Hybridomy jsou kultivovány při 37 °C.
Příklad 3 .
Za účelem pomnožení adaptovaných hybridomových buněk na růst in vivo bylo aplikováno 5 x 106 buněk do peritoneální dutiny myší kmene BALB/c. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 10 dní před přenosem buněk hybridomů ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml intraperitoneálně). Po 10 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byla myš uhubena a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána. V případě hybridomů produkujícího monoklonální protilátku C-PEP-01 bylo celkem získáno 2 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 9 mg/ml imunoglobulinu. Produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin podtřídy IgGl s lehkými řetězci typu kapa, její isoelektrický bod je v rozmezí pH 6,0-6,7.
Příklad 4
Vyšetření C-peptidu pomocí radioimunologické analýzy vyžaduje protilátky o co nejvyšší specifitě a co nejvyšší afinitě. Monoklonální protilátky C-PEP-01, C-PEP-02, C-PEP-03 reagují specificky s C-peptidem lidského proinsulinu a lidským proinsulinem (preparát od firmy Lilly, USA). Nereagují s lidským a vepřovým insulinem, lidským glukagonem a vepřovým proinsulinem (preparát od firmy Novo, Dánsko), lidským somatostatinem (preparát od firmy Serono, Itálie). Nejvyšší asociační konstantu ze tří testovaných monoklonálních protilátek má monoklonální protilátka C-PEP-01, která má asociační konstantu v svitému 12^I-Tyr-C-peptid/C-peptid: K = 1,1 . 109 1/mol. Obě zbývající monoklonální protilátky C-PEP-02 a C-PEP-03 mají K = 107 1/mol.
Claims (1)
- Způsob přípravy vyšších monoklonálních protilátek proti C-peptidu lidského proinsulinu vyznačující se tím, že po imunizaci samic kříženců inbredních myší kmenů BIO.A a BALB/c navázáním C-peptidu lidského proinsulinu na bílkovinné nosiče - hovězí albumin nebo thyreoglobulin, emulgováním těchto v adjuvans a podkožním podáním, se slezinné buňky z imunizovaných myší sfúzují s buňkami myelomové linie Sp 2/0 - Agl4 a vzniklé hybridomy se adaptují k růstu in vivo v peritoneu myší inbredního kmene BALB/c, načež se z 1 ml ascitické tekutiny produkované hybridomy v peritoneu myší izoluje 4 - 10 mg monoklonálního imunoglobulinu proti C-peptidu lidského proinsulinu s asociační konstantou v systému 125 I-Tyr-C-peptid/C-peptid v rozmezí od K = 107 1/mol do 1010 1/mol.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS893421A CS277597B6 (cs) | 1989-06-07 | 1989-06-07 | Způsob přípravy myších monoklonálních protilátek proti C-peptidu lidského proinsulinu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS893421A CS277597B6 (cs) | 1989-06-07 | 1989-06-07 | Způsob přípravy myších monoklonálních protilátek proti C-peptidu lidského proinsulinu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS342189A3 CS342189A3 (en) | 1992-11-18 |
| CS277597B6 true CS277597B6 (cs) | 1993-03-17 |
Family
ID=5374234
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS893421A CS277597B6 (cs) | 1989-06-07 | 1989-06-07 | Způsob přípravy myších monoklonálních protilátek proti C-peptidu lidského proinsulinu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS277597B6 (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102520098A (zh) * | 2011-10-24 | 2012-06-27 | 南京大学 | 一种天然水体中痕量的低价磷酸盐测定方法 |
-
1989
- 1989-06-07 CS CS893421A patent/CS277597B6/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS342189A3 (en) | 1992-11-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0864865B1 (en) | Method for measuring glycated hemoglobin | |
| US4599229A (en) | Method of promoting animal growth using antibodies against somatostatin | |
| JP2665503B2 (ja) | インシュリン様成長因子の免疫分析を可能にするインシュリン様成長因子に対するモノクローナル抗体対 | |
| Marnet et al. | Subpicogram determination of oxytocin by an enzyme immunoassay using acetylcholinesterase as label | |
| US4676981A (en) | Monoclonal antibodies against GnRH | |
| EP0212522A2 (en) | Method for the measurement of TSH | |
| CS277597B6 (cs) | Způsob přípravy myších monoklonálních protilátek proti C-peptidu lidského proinsulinu | |
| US4764475A (en) | Pancreas dependant immunoassay for determining subpopulations of monoclonal antibodies to somatostatin. | |
| Haba et al. | Quantitation of IgE antibodies by radioimmunoassay in the presence of high concentrations of non-IgE antibodies of the same specificity | |
| JPH04222595A (ja) | アベルメクチンに対するモノクローナル抗体 | |
| FI91976B (fi) | Menetelmä ja reagenssi follikkelia stimuloivan hormonin määrittämiseksi sekä tähän tarkoitukseen sopivat monoklonaaliset vasta-aineet | |
| KR890003591B1 (ko) | 황체화 호르몬에 대한 단클론성 항체의 제조방법 | |
| US4879112A (en) | Monoclonal antibodies agaisnt GnRH | |
| CN113637642A (zh) | 一株分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN1180107A (zh) | 一种单克隆抗体,能生产该抗体的细胞系及该抗体的用途 | |
| KR100493932B1 (ko) | 레지스틴에 대한 단클론 항체, 이의 제조 방법, 및 용도 | |
| CN120082519A (zh) | 一株分泌氯氮平及其代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞株 | |
| RU2049816C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к тироксину | |
| KR920008367B1 (ko) | 프로제스테론 홀몬의 특이항체 분비 세포주 | |
| Danse et al. | Preparation and characterization of monoclonal antibodies against β-bungarotoxin and its A-and B-chains | |
| RU2059721C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток мыши mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к тиреотропному гормону человека | |
| CN120665821A (zh) | 一株分泌抗利血平单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CS265473B1 (cs) | Myší lymfocytárnf hybridom produkující protilátku proti lidskému choriogonadotropnímu hormonu | |
| CS260066B1 (cs) | Myší lymfocytórní hybridom produkující monoklonální imunoglobulín proti lidskému choriogonadotropnímu hormonu | |
| JPH1072500A (ja) | 分子量約２００００のヒト成長ホルモンに特異的に反応するモノクローナル抗体、該抗体を産生する細胞株及び該抗体を用いる分子量約２００００のヒト成長ホルモンの免疫測定方法 |