CS276445B6 - Myší lymfocytární hybridom TSH-51, produkující monoklonální protilátku třídy IgG2a proti lidskému thyreostimulačnimu hormonu - Google Patents

Abstract

Ce šeni oo týká myšího lymfocytárního hybrldomu TSH-51 produkujícího protilátku třídy IgG 2a proti lidskému tnyreostlmulačnimu hormonu. Samotná monoklonální protilátka hybridomů TSH-51 je vhodná pro použití k senoitivni a specifické detekci hladiny thyreostimulačniho hormonu imunochemickými metodami typu imunoradiomotrickó analýzy, jakož i k histochamickému průkazu thyreostimulačniho hormonu na tkáňových řezech a buňkách na úrovni optického a elektronového mikroskopu a při purifikaci proteinů metodou imunoafinitni chromatografie

Description

Vynález se týká nového hybridomu, t j. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného buněčnou fúzi myši myelomové linie P3-X63-AgB.653 a myší slszinné lymfoidní buňky. produkující protilátku proti lidskému thyreostimulačnímu hormonu (TSH).

Doposud se protilátky proti thyreostimulačníniu hormonu (TSH) vyrábějí tak, že je thyreostimulaní hormon opakovaně injikován (zpravidla spolu s adjuvans) pokusným zviřa“ tům, a to nejčastěji králíkům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebrané po určité době působsní antlgenu, slouženi jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro stanoveni hladiny thyreostimulačního hormonu v séru metodou radioimunoanalýzy (RIA) a pro průkaz . přítomnosti thyreostimulačního hormonu ve tkáních. Tento postup nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. V případě antisér proti thyreostimulačnímu hormonu je situace ještě komplikována tím, že thyreostimulační hormon má polovinu molekuly (alfa subjednotku) identickou s alfa subjednotkou jiných glykoproteinových hormonů hypofýzy (luteinizaČní hormon - LH a folikulostimulační hormon - FSH) a placenty (lidský choriový gonadotropin - HCG), takže vzniklá antiséra zkříženě reagují se všemi těmito hormony. Tyto nežádoucí reakce jo nutno odstraňovat složitým způsobem, zvaným vysycování. Výrobní šarže konvenčních antisér se proto dají jen velmi nesnadno standardizovat a vycházej! z výroby v širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit značně čistý imunizační antigen a další antigsny pře vysycaní balastnich protilátek proti podobným molekulám, zejména výše uvedeným glykoproteinovým hormonům. ·

V ČSFR byly připraveny lymfocytární hybridomy produkující protilátky proti thyreostimulačnímu hormonu. Tyto protilátky však mají příliš nízkou asociační konstantu a proto nejsou použitelné pro imunochemické stanovení hladiny thyreoetimulačního hormonu v tělesných tekutinách s dostatečnou citlivostí. Ve světové literatuře jsou popsány hybridomy ’ produkující protilátky proti thyreostimulačnímu hormonu s dostatečnou afinitou. Rozšířoni jejich palety by umožnilo nalézt další vzájemné kombinace protilátek vhodných ks stanovení thyreostimulačního hormonu, například metodou imunoradiometrické analýzy.

Uvsdsné nedostatky odstraňuje a rozšiřuje paletu monoklonálních protilátek vhodných ke stanovení thyreostimulačního hormonu hybridom podle vynálezu, produkující protilátku proti lidskému thyreostimulačnímu hormonu, který je uložený vo sbírce hybridomů Vědeckého střediska pro hormonální proteiny a peptidy Lékařské fakulty University Karlovy v Hrad- , ci Králové, Šimkova 870, pod označením TSH-51.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Campbell, A.M.: Monoclonal antibody technology. Elsevier, 1984, Coding, D.W.: Monoclonal antibodies: Principles and practice, Second ed., Academic Press, 1986) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných lidským thyreostimulačním hormonem izolovaným z hypofýz.

Výhodou lymfocytírniho hybridomu TSH-51 jo, že produkuje zcela homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s lidským thyreostimulačním hybridomem. Hybridom TSH-51 js možno kultivovat in vitro v médiích vhodných pro pěstování živočišných buněk nebo v podmínkách in vivo v peritoneálni dutině myší kmene BALB/c. Hybridom TSH-51 je vhodný k dlouhodobému uchovávání v konzervách uložených v kapalném dusíku. Produkci monoklonální protilátky je možno zahájit po rozmražení buněčné konzervy, aniž by bylo třeba dalšího antigenu. Protilátka produkovaná hybridomem TSH-51 ja specifická výhradně pro thyreostimulační hormon, nereaguje s ostatními glykoproteinovými hormony. Průkaz byl proveden vazbou hormonů značených izotopem jodu 125 na tuto protilátku jednak v systému radioimunoanalýzy (RIA) na pevné bázi (tab. 1), jednak v klasickém RIa systému ss separací pomocí druhé protilátky (tab. 2). Určitá vazba na protilátku byla zjištěna jen v případě folikulostimulačního hormonu a zejména lutelnizačního hormonu, toto však lze vysvětlit tím, že oba použité preparáty nejsou zcela čisté a obsahují určité

CS 276 445 B6 2 množství thyreostimulačního hormonu. Že nejde o zkříženou reakci protilátky dokazují výsledky zjištěné v systému imunoradiometrické analýzy (IRMA) jak bude uvedeno dále. Asóciační konstanta monoklonální protilátky TSH-51 byla určena za použití systému radioimunoanalýzy s druhou protilátkou tak, že byla zjištována vazba snižující se koncentrace mezinárodního standardu TSH IRP 80/558 s přídavkem značeného hormonu. Ke 100 mIU/1 IRP 80/558 bylo přidáno takové množství značeného thyreostimulačního hormonu, aby bylo dosaženo aktivity 100 000 cpm. Při stanovení byl použit tento materiál a řada 8 dvojnásobných ředění. Při výpočtu asociační konstanty byla zahrnuta i koncentrace traceru zjištěná metodou vnitřního standardu. Na základě těchto měření byla zjištěna asociační konstanta protilátky 5,5 . IO·*·⁰ 1/mol.

Protilátka produkovaná hybridomem TSH-51 spojuje spscifitu vazby lidského thyreostimulačniho hormonu s vysokou asociační konstantou. Tyto charakteristiky umožňuji při jejím použiti zkonstruovat systém imunoradiometrické analýzy (IRMA) pro stanovení hladin thyreostimulačního hormonu v séru, který je striktně specifický (tj. není ovlivněn ani vysokými hladinami příbuzných hormonů například v těhotenství) a má velmi nízký detekční limit (tj. umožňuje rozpoznání snížených hladin thyreostimulačního hormonu a použiti mikrometod při screeningu novorozenců).

Přiklad 1 θ Pro pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 1 x 10 buněk do peritoneálni dutiny myší BALB/c. Pro lepši uchycení injikováných buněk byla myš týden před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml intraperitonsálně). Po 14 dnech růstu hybridomu byla odebrána ascitická tekutina a tento odběr byl opakován ob den celkem třikrát. Celkem bylo získáno 16 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 8 mg/ml imunoglobulinu. Z této ascitické tekutiny byla Izolována čistá monoklonální protilátka chromatografii na komplexu protein A-Sepharose CL-48 a adsorbována na pevnou fázi zkuma•vek takto: Vnitřní povrch polystyrénových zkumavek Koh-i-noor byl upraven působením 1% roztoku glutaraldehydu ve vodě po dobu 4 h a po promyti zkumavek byl aplikován roztok izolované monoklonální protilátky produkované hybridomem TSH-51 ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem (PBS) pH 7,5 o koncentraci 5 ug/ml přes noc. Po promyti byla zbývající vazebná místa blokována roztokem bovinního sérového albuminu v P3S, pH 7,5 v koncentraci 1 % hmot. Zkumavek se zakotvenou protilátkou produkovanou hybridomem TSH-51 bylo použito pro stanovení hladiny TSH v séru. Do zkumavek bylo pipetováno 200 ul standardu o známé koncentraci TSH nebo vyšetřovaného vzorku, po hodinovém třepáni při pokojové teplotě byl materiál odsát, zkumavka jednou propláchnuta pufrem PBS, pH 7,5 a v dalším kroku bylo pipetováno 200 ul roztoku jiné monoklonální protilátky s kódovým označením TSH-116 označené jodem 125 v roztoku albuminu v pufru PBS, pH 7,5 o koncentraci 5 % hmot. Koncentrace značené protilátky TSH-116 byla připravena tak, aby počet impulzů byl 60 000 za minutu ve 200 ul. Po inkubaci značené protilátky přes noc byly zkumavky po odsátí dvakrát promyty pufrem PBS, pH 7,5 a zakotvená radioaktivita měřena na gamapočítači. Výsledky zjištěné se standardy o známé koncentraci TSH shrnuje kalibrační křivka, imunoradiometrického systému (IRMA) za použití protilátky TSH-51. Přerušovaná čára udává absolutní počet impulzů značené protilátky vázaných na pevnou fázi, plná čára počet impulzů po odečteni nespecifické vazby nulového vzorku (blanku). Průměrné hodnoty blaku při měření dvaceti zkumavek a pásmo 2 směrodatných odchylek nad tímto průměrem jsou znázorněny šrafovaným pásem. Radioaktivita odpovídající kalibračnímu bodu 0,05 mIU/1 je na horní hranici tohoto pásma a představuje tak detekční limit eseje. Byl zjištěn velmi nízký detekční limit stanovení - 0,05 mIU/1 TSH. Dále bylo zjištováno, jaké hodnoty budou v tomto systému stanovení imunoradiometrické analýzy (IRMA) zjištěny při použití roztoků dalších hormonů o známé koncentraci a jak tento přídavek jiných hormonů ovlivní výsledek stanovení hladiny TSH. Výsledky jsou shrnuty v tabulce č. 3. Systém IRMA nebyl ovlivněn použitými koncentracemi HCG a PRL, jedině mezinárodni standard LH IRP 68/40 v koncentraci 160 XU/1 vykazoval odečitatelnou hodnotu TSH (0,09 mIU/1). Standard však obsahuje podle

CS 276 445 86 údajů Světové zdravotnické organizace (WHO) 0,1 mlU TSH na 77 IU LH, tj. 0,129 % celkového množství LH a stanovená hodnota tak odpovídá přítomnosti TSH ve vzorku.

Příklad 2

Byly připraveny zkumavky se zakotvenou protilátkou produkovanou hybridomem TSH-51 stejně jako v přikladu 1. Oo zkumavek byly umístěny terčíky filtračního papíru se zaschlou krví o známé koncentraci TSH určené pro kalibraci kitu pro screening novorozenecké hypothyreosy firmy Pharmacia. Na terčíky bylo pipetováno 200 ul. roztoku jiné pro- . tilátky s kodovým označením TSH-61 označené jodem 125 v roztoku PBS, pH 7,5 s obsahem 0,1 % hmot, bovinního sérového albuminu. Koncentrace jodované protilátky TSH-51 byla taková, že 200 ul roztoku mělo aktivitu 60 000 impulzů za minutu. Po 24 hodinách inkubace byla tekutina odsáta, zkumavky dvakrát promyty roztokem PBS, pH 7,5 a navázaná radioaktivita měřena na gamapočítači. Ke kalibraci byly přidány dvě skvrny kontrolních krví. Výsledky jsou uvedeny na obr. 2, který znázorňuje kalibrační křivky systému IRMA pro stanovení TSH z krevních skvrn na papíře v rámci sereeningu novorozenecké hypothyreosy. Čárkovaně je zakreslena kalibrační křivka zahraničního kitu dosud používaného, jak je uvedena výrobcem. Plnou čarou je uvedena kalibrační křivka při použití protilátky TSH-51, která je strmější což umožňuje citlivější stanovení. 3e zřejmé, že popsaný systém je citlivější než dosud používaný kit zahraniční výroby. Výsledky zjištěné v kontrolních krevních skvrnách se shodovaly s hodnotami deklarovanými.

Buňky hybridomu TSH-51 mají morfologický charakter typických myelomových buněk.V podmínkách in vitřo rostou v podobě polosuspenzních kultur. Základním kultivačním médiem je □ulbeccova modifikace minimálního esendiálního média (DMEM) doplněná L-glutaminem (2 mM), penicilinem, streptomycinem a inaktivovaným fetálním telecím sérem. Hybridom je kulti-. vován při 37 °C v atmosféře 5 obj. % kysličníku uhličitého a jeho střední generační čas je 16 hodin. Produkovaná protilátka je myši monoklonální imunoglo&ulin třídy IgG 2a, specificky vážící lidský TSH s vysokou afinitou (asociační konstanta v systému RIA 5,5«10^θ Ι/mol). Modálni počet chromozomů hybridomu 6 měsíců po ustavení byl 86.

Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem TSH-51 je použitelná pro vysoce sensitivní a striktně specifické stanovení koncentryce TSH v lidském séru imunochemickými metodami (imunoradiomatrická analýza, imunoenzymomatrická analýzy atd.), jednak při diagnostice poruch funkce štítné žlázy u dospělých (včetně možnosti stanovit snížené hladiny), jednak při sereeningu novorozenecké hypothyreosy u všech novorozenců. 3e využitelná i pro průkaz thyreostimulačního hormonu ve tkáních imunohistochemickými metodami a při purifikaci hormonálních proteinů imunoafinitní chromatografií. Nalezne uplatnění v lékařství a preparativní biochemii.

Vazba značených hormonů na monoklonální protilátku produkovanou hybridomem TSH-51 zakotvenou na pevné fázi je vyjádřena v procentech celkového množství inkubovaného hormonu po odečtení nespecifické vazby. Koncentrace protilátky na pevné fázi je (jak vyplývá z vysokého procenta vazby TSH-O^X ) vysoká.

Hormon

TSH

LH

FSH

HCG

Vazba v procentech

68,6

2,99

0,66

0,03

CS 276 445 B6

Tabulka δ. 2

Vazba značených hormonů při použití monoklonálni protilátky produkovaná hybrldomem TSH-51 ve třech různých ředěních (titrech) v klasickém RIA systému se separací pomoci druhé protilátky. Vazba je uvedena v procentech celkového množství značeného hormonu po odečtení nespecifické vazby.

Hormon	1:500	Ředěni protilátky 1:10 000	1:100 000
TSH	62,8	50,0	13,7
FSH	0,7	0,4	0
LH	4,3	3,0	1.1
HCG	0,04	0	0
PRL	0	0	0
HGH	0	0	0

Použité zkratky: TSH - thyreostimulační hormon, FSH - folikulostimulačni hormon, LH luteinizačni hormon, HCG - lidský choriový gonadotropin, PRL - lidský prolaktin, HGH lidský růstový hormon.

Zkřížené reakce při stanoveni hladiny TSH metodou IRMA za použití protilátky produkované hybridomem TSH-51. Osou uvedeny stanovené hladiny TSH v roztoku standardů HCG, LH a PRL jednak bez přidáni TSH, jednak s přídavkem známé koncentrace standardu TSH. Mezinárodni standard LH IRP 68/40 obsahuje dle údajů WHO 0,129 % TSH.

Standard

Stanovená hodnota TSH mIU/1

HCG 10 000 IU/1	méně než 0,05 2,0 16,0
	+ 2 mIU/1 TSH +16 mIU/1 TSH
LH	160 IU/1		0,09
		+ 2 mIU/1 TSH	2,1
		+16 mIU/1 TSH	16,0
PRL	200 ng/tnl		méně než 0,05
		+30 mIU/1 TSH	30,0

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Myší lymfocytárni hybridom TSH-51, produkující monoklonálni protilátku třídy IgG 2a proti lidskému thyreostimujačnímu hormonu.