CS276445B6

CS276445B6 - TSH-51 mouse lymphocyte hybridoma producing IgG2a class monoclonal antibody against human thyreostimulatory hormone

Info

Publication number: CS276445B6
Application number: CS903470A
Authority: CS
Inventors: Jan Mudr Cap; Hana Rndr Strakova; Veleslava Phmr Jirkalova; Jaroslava Rndr Pribysova; Radovan Mudr Lomsky
Original assignee: Cap Jan; Hana Rndr Strakova; Jirkalova Veleslava; Jaroslava Rndr Pribysova; Lomsky Radovan
Priority date: 1990-07-12
Filing date: 1990-07-12
Publication date: 1992-05-13
Also published as: CS347090A3

Abstract

Ce šeni oo týká myšího lymfocytárního hybrldomu TSH-51 produkujícího protilátku třídy IgG 2a proti lidskému tnyreostlmulačnimu hormonu. Samotná monoklonální protilátka hybridomů TSH-51 je vhodná pro použití k senoitivni a specifické detekci hladiny thyreostimulačniho hormonu imunochemickými metodami typu imunoradiomotrickó analýzy, jakož i k histochamickému průkazu thyreostimulačniho hormonu na tkáňových řezech a buňkách na úrovni optického a elektronového mikroskopu a při purifikaci proteinů metodou imunoafinitni chromatografieThe present invention relates to a mouse lymphocyte hybridoma TSH-51 producing an IgG 2a class antibody against human thyroid-stimulating hormone. The TSH-51 hybridoma monoclonal antibody itself is suitable for use in the sensitive and specific detection of thyroid-stimulating hormone levels by immunochemical methods such as immunoradiomotor analysis, as well as for histochemical detection of thyroid-stimulating hormone on tissue sections and cells at the optical and electron microscope level and in protein purification by immunoaffinity chromatography.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, t j. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného buněčnou fúzi myši myelomové linie P3-X63-AgB.653 a myší slszinné lymfoidní buňky. produkující protilátku proti lidskému thyreostimulačnímu hormonu (TSH).The invention relates to a novel hybridoma, i.e. a hybrid single-celled organism, constructed by a cell fusion of a mouse myeloma line P3-X63-AgB.653 and a mouse tear cell lymphoid cell. producing an antibody against human thyroid stimulating hormone (TSH).

Doposud se protilátky proti thyreostimulačníniu hormonu (TSH) vyrábějí tak, že je thyreostimulaní hormon opakovaně injikován (zpravidla spolu s adjuvans) pokusným zviřa“ tům, a to nejčastěji králíkům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebrané po určité době působsní antlgenu, slouženi jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro stanoveni hladiny thyreostimulačního hormonu v séru metodou radioimunoanalýzy (RIA) a pro průkaz . přítomnosti thyreostimulačního hormonu ve tkáních. Tento postup nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. V případě antisér proti thyreostimulačnímu hormonu je situace ještě komplikována tím, že thyreostimulační hormon má polovinu molekuly (alfa subjednotku) identickou s alfa subjednotkou jiných glykoproteinových hormonů hypofýzy (luteinizaČní hormon - LH a folikulostimulační hormon - FSH) a placenty (lidský choriový gonadotropin - HCG), takže vzniklá antiséra zkříženě reagují se všemi těmito hormony. Tyto nežádoucí reakce jo nutno odstraňovat složitým způsobem, zvaným vysycování. Výrobní šarže konvenčních antisér se proto dají jen velmi nesnadno standardizovat a vycházej! z výroby v širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit značně čistý imunizační antigen a další antigsny pře vysycaní balastnich protilátek proti podobným molekulám, zejména výše uvedeným glykoproteinovým hormonům. ·To date, antibodies to thyroid stimulating hormone (TSH) have been produced by repeatedly injecting thyroid stimulating hormone (usually with an adjuvant) to experimental animals, most commonly rabbits. Serum from such immunized animals, collected after a certain period of action of the antigen, serves as a source of antibodies, used in particular for the determination of serum thyroid stimulating hormone levels by radioimmunoassay (RIA) and for detection. the presence of thyroid stimulating hormone in tissues. This procedure, called conventional immunization, has several disadvantages. The serum of immunized animals contains a heterogeneous mixture of antibodies, the spectrum of which is different and unrepeatable in each individual organism. In the case of antisera against thyroid stimulating hormone, the situation is further complicated by the fact that thyroid stimulating hormone has half a molecule (alpha subunit) identical to the alpha subunit of other pituitary glycoprotein hormones (luteinizing hormone - LH and follicle stimulating hormone - FSH) and placenta (human so that the resulting antisera cross-react with all these hormones. These side effects need to be eliminated in a complex way called saturation. Production batches of conventional antisera are therefore very difficult to standardize and get started! from production in a wide range of quality. For the production of each batch, it is necessary to prepare a highly pure immunizing antigen and other antigens before saturating the ballast antibodies against similar molecules, in particular the above-mentioned glycoprotein hormones. ·

V ČSFR byly připraveny lymfocytární hybridomy produkující protilátky proti thyreostimulačnímu hormonu. Tyto protilátky však mají příliš nízkou asociační konstantu a proto nejsou použitelné pro imunochemické stanovení hladiny thyreoetimulačního hormonu v tělesných tekutinách s dostatečnou citlivostí. Ve světové literatuře jsou popsány hybridomy ’ produkující protilátky proti thyreostimulačnímu hormonu s dostatečnou afinitou. Rozšířoni jejich palety by umožnilo nalézt další vzájemné kombinace protilátek vhodných ks stanovení thyreostimulačního hormonu, například metodou imunoradiometrické analýzy.Lymphocyte hybridomas producing antibodies against thyroid stimulating hormone were prepared in the Czechoslovak Socialist Republic. However, these antibodies have too low an association constant and are therefore not useful for the immunochemical determination of thyroid stimulating hormone levels in body fluids with sufficient sensitivity. The world literature describes hybridomas producing antibodies against thyroid stimulating hormone with sufficient affinity. Expanding their range would make it possible to find other mutual combinations of antibodies suitable for the determination of thyroid stimulating hormone, for example by immunoradiometric analysis.

Uvsdsné nedostatky odstraňuje a rozšiřuje paletu monoklonálních protilátek vhodných ke stanovení thyreostimulačního hormonu hybridom podle vynálezu, produkující protilátku proti lidskému thyreostimulačnímu hormonu, který je uložený vo sbírce hybridomů Vědeckého střediska pro hormonální proteiny a peptidy Lékařské fakulty University Karlovy v Hrad- , ci Králové, Šimkova 870, pod označením TSH-51.It eliminates these shortcomings and expands the range of monoclonal antibodies suitable for the determination of thyroid stimulating hormone hybridoma according to the invention, producing an antibody against human thyroid stimulating hormone, which is stored in the hybridoma collection of the Research Center for Hormonal Proteins and Peptides. , under the designation TSH-51.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Campbell, A.M.: Monoclonal antibody technology. Elsevier, 1984, Coding, D.W.: Monoclonal antibodies: Principles and practice, Second ed., Academic Press, 1986) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných lidským thyreostimulačním hormonem izolovaným z hypofýz.Said hybridoma was obtained in a manner known from the literature (Campbell, AM: Monoclonal antibody technology. Elsevier, 1984, Coding, DW: Monoclonal antibodies: Principles and practice, Second ed., Academic Press, 1986) by cloning a set of hybrid cells resulting from cell fusions. mouse myeloma line P3-X63-Ag8.653 and cells obtained from the spleen of BALB / c mice immunized with human thyroid stimulating hormone isolated from the pituitary gland.

Výhodou lymfocytírniho hybridomu TSH-51 jo, že produkuje zcela homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, která je schopna specificky reagovat s lidským thyreostimulačním hybridomem. Hybridom TSH-51 js možno kultivovat in vitro v médiích vhodných pro pěstování živočišných buněk nebo v podmínkách in vivo v peritoneálni dutině myší kmene BALB/c. Hybridom TSH-51 je vhodný k dlouhodobému uchovávání v konzervách uložených v kapalném dusíku. Produkci monoklonální protilátky je možno zahájit po rozmražení buněčné konzervy, aniž by bylo třeba dalšího antigenu. Protilátka produkovaná hybridomem TSH-51 ja specifická výhradně pro thyreostimulační hormon, nereaguje s ostatními glykoproteinovými hormony. Průkaz byl proveden vazbou hormonů značených izotopem jodu 125 na tuto protilátku jednak v systému radioimunoanalýzy (RIA) na pevné bázi (tab. 1), jednak v klasickém RIa systému ss separací pomocí druhé protilátky (tab. 2). Určitá vazba na protilátku byla zjištěna jen v případě folikulostimulačního hormonu a zejména lutelnizačního hormonu, toto však lze vysvětlit tím, že oba použité preparáty nejsou zcela čisté a obsahují určitéThe advantage of the TSH-51 lymphocyte hybridoma is that it produces a completely homogeneous antibody, the so-called monoclonal antibody, which is able to react specifically with the human thyroid stimulating hybridoma. The TSH-51 hybridoma can be cultured in vitro in media suitable for culturing animal cells or in vivo in the peritoneal cavity of BALB / c mice. The TSH-51 hybridoma is suitable for long-term storage in cans stored in liquid nitrogen. Monoclonal antibody production can be initiated after thawing the cell can without the need for additional antigen. The antibody produced by the TSH-51 hybridoma is specific exclusively for thyroid stimulating hormone, does not react with other glycoprotein hormones. The detection was performed by binding of iodine 125-labeled hormones to this antibody both in the solid-based radioimmunoassay (RIA) system (Table 1) and in the classical RIa system with separation with the second antibody (Table 2). Some binding to the antibody was found only in the case of follicle-stimulating hormone and in particular lutenizing hormone, but this can be explained by the fact that both preparations used are not completely pure and contain certain

CS 276 445 B6 2 množství thyreostimulačního hormonu. Že nejde o zkříženou reakci protilátky dokazují výsledky zjištěné v systému imunoradiometrické analýzy (IRMA) jak bude uvedeno dále. Asóciační konstanta monoklonální protilátky TSH-51 byla určena za použití systému radioimunoanalýzy s druhou protilátkou tak, že byla zjištována vazba snižující se koncentrace mezinárodního standardu TSH IRP 80/558 s přídavkem značeného hormonu. Ke 100 mIU/1 IRP 80/558 bylo přidáno takové množství značeného thyreostimulačního hormonu, aby bylo dosaženo aktivity 100 000 cpm. Při stanovení byl použit tento materiál a řada 8 dvojnásobných ředění. Při výpočtu asociační konstanty byla zahrnuta i koncentrace traceru zjištěná metodou vnitřního standardu. Na základě těchto měření byla zjištěna asociační konstanta protilátky 5,5 . IO·*·⁰ 1/mol.CS 276 445 B6 2 amount of thyroid stimulating hormone. The results obtained in the immunoradiometric analysis (IRMA) system prove that this is not an antibody cross-reaction as follows. The association constant of the TSH-51 monoclonal antibody was determined using a second antibody radioimmunoassay system to determine the binding of the decreasing concentration of the international standard TSH IRP 80/558 with the addition of labeled hormone. An amount of labeled thyroid stimulating hormone was added to 100 mIU / L IRP 80/558 to achieve an activity of 100,000 cpm. This material and a series of 8 two-fold dilutions were used in the assay. The tracer concentration determined by the internal standard method was also included in the calculation of the association constant. Based on these measurements, an antibody association constant of 5.5 was determined. IO · * · ⁰ 1 / mol.

Protilátka produkovaná hybridomem TSH-51 spojuje spscifitu vazby lidského thyreostimulačniho hormonu s vysokou asociační konstantou. Tyto charakteristiky umožňuji při jejím použiti zkonstruovat systém imunoradiometrické analýzy (IRMA) pro stanovení hladin thyreostimulačního hormonu v séru, který je striktně specifický (tj. není ovlivněn ani vysokými hladinami příbuzných hormonů například v těhotenství) a má velmi nízký detekční limit (tj. umožňuje rozpoznání snížených hladin thyreostimulačního hormonu a použiti mikrometod při screeningu novorozenců).The antibody produced by the TSH-51 hybridoma associates the specificity of human thyroid stimulating hormone binding with a high association constant. These characteristics allow the use of an immunoradiometric analysis (IRMA) system to determine serum thyroid stimulating hormone levels, which is strictly specific (ie not affected by high levels of related hormones, for example in pregnancy) and has a very low detection limit (ie allows detection reduced thyroid stimulating hormone levels and the use of micromethods in neonatal screening).

Přiklad 1 θ Pro pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 1 x 10 buněk do peritoneálni dutiny myší BALB/c. Pro lepši uchycení injikováných buněk byla myš týden před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0,5 ml intraperitonsálně). Po 14 dnech růstu hybridomu byla odebrána ascitická tekutina a tento odběr byl opakován ob den celkem třikrát. Celkem bylo získáno 16 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 8 mg/ml imunoglobulinu. Z této ascitické tekutiny byla Izolována čistá monoklonální protilátka chromatografii na komplexu protein A-Sepharose CL-48 a adsorbována na pevnou fázi zkuma•vek takto: Vnitřní povrch polystyrénových zkumavek Koh-i-noor byl upraven působením 1% roztoku glutaraldehydu ve vodě po dobu 4 h a po promyti zkumavek byl aplikován roztok izolované monoklonální protilátky produkované hybridomem TSH-51 ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem (PBS) pH 7,5 o koncentraci 5 ug/ml přes noc. Po promyti byla zbývající vazebná místa blokována roztokem bovinního sérového albuminu v P3S, pH 7,5 v koncentraci 1 % hmot. Zkumavek se zakotvenou protilátkou produkovanou hybridomem TSH-51 bylo použito pro stanovení hladiny TSH v séru. Do zkumavek bylo pipetováno 200 ul standardu o známé koncentraci TSH nebo vyšetřovaného vzorku, po hodinovém třepáni při pokojové teplotě byl materiál odsát, zkumavka jednou propláchnuta pufrem PBS, pH 7,5 a v dalším kroku bylo pipetováno 200 ul roztoku jiné monoklonální protilátky s kódovým označením TSH-116 označené jodem 125 v roztoku albuminu v pufru PBS, pH 7,5 o koncentraci 5 % hmot. Koncentrace značené protilátky TSH-116 byla připravena tak, aby počet impulzů byl 60 000 za minutu ve 200 ul. Po inkubaci značené protilátky přes noc byly zkumavky po odsátí dvakrát promyty pufrem PBS, pH 7,5 a zakotvená radioaktivita měřena na gamapočítači. Výsledky zjištěné se standardy o známé koncentraci TSH shrnuje kalibrační křivka, imunoradiometrického systému (IRMA) za použití protilátky TSH-51. Přerušovaná čára udává absolutní počet impulzů značené protilátky vázaných na pevnou fázi, plná čára počet impulzů po odečteni nespecifické vazby nulového vzorku (blanku). Průměrné hodnoty blaku při měření dvaceti zkumavek a pásmo 2 směrodatných odchylek nad tímto průměrem jsou znázorněny šrafovaným pásem. Radioaktivita odpovídající kalibračnímu bodu 0,05 mIU/1 je na horní hranici tohoto pásma a představuje tak detekční limit eseje. Byl zjištěn velmi nízký detekční limit stanovení - 0,05 mIU/1 TSH. Dále bylo zjištováno, jaké hodnoty budou v tomto systému stanovení imunoradiometrické analýzy (IRMA) zjištěny při použití roztoků dalších hormonů o známé koncentraci a jak tento přídavek jiných hormonů ovlivní výsledek stanovení hladiny TSH. Výsledky jsou shrnuty v tabulce č. 3. Systém IRMA nebyl ovlivněn použitými koncentracemi HCG a PRL, jedině mezinárodni standard LH IRP 68/40 v koncentraci 160 XU/1 vykazoval odečitatelnou hodnotu TSH (0,09 mIU/1). Standard však obsahuje podleExample 1 θ To propagate hybridoma cells in vivo, 1 x 10 6 cells were applied to the peritoneal cavity of BALB / c mice. To better adhere the injected cells, the mouse was treated with paraffin oil (0.5 ml intraperitoneally) one week before the transfer of the hybridoma cells. After 14 days of hybridoma growth, ascitic fluid was collected and repeated a total of three times each day. A total of 16 ml of ascitic fluid containing 8 mg / ml immunoglobulin was obtained. Pure monoclonal antibody was isolated from this ascitic fluid by protein A-Sepharose CL-48 complex chromatography and adsorbed onto the solid phase of the tube as follows: The inner surface of Koh-i-noor polystyrene tubes was treated with a 1% solution of glutaraldehyde in water for 4 hours. and after washing the tubes, a solution of the isolated monoclonal antibody produced by the TSH-51 hybridoma in phosphate buffered saline (PBS) pH 7.5 at a concentration of 5 μg / ml was applied overnight. After washing, the remaining binding sites were blocked with a 1% w / w solution of bovine serum albumin in P3S, pH 7.5. Tubes with anchored antibody produced by the TSH-51 hybridoma were used to determine serum TSH levels. 200 [mu] l of a standard of known TSH concentration or test sample was pipetted into the tubes, the material was aspirated after shaking for 1 hour at room temperature, the tube was rinsed once with PBS buffer, pH 7.5, and 200 [mu] l of another colonized antibody solution coded TSH-116 labeled with iodine 125 in a solution of albumin in PBS buffer, pH 7.5 at a concentration of 5% by weight. The concentration of labeled TSH-116 antibody was prepared so that the number of pulses was 60,000 per minute in 200 μl. After incubation of the labeled antibody overnight, the tubes were washed twice with PBS buffer, pH 7.5, and the anchored radioactivity was measured on a gamma counter. The results obtained with standards of known TSH concentration are summarized by the calibration curve of the immunoradiometric system (IRMA) using the TSH-51 antibody. The dashed line indicates the absolute number of pulses of labeled antibody bound to the solid phase, the solid line the number of pulses after subtracting the non-specific binding of the zero sample (blank). The average values of the bla when measuring twenty tubes and the band of 2 standard deviations above this average are shown by the hatched band. The radioactivity corresponding to the calibration point of 0.05 mIU / l is at the upper limit of this band and thus represents the detection limit of the assay. A very low detection limit of the determination was found - 0.05 mIU / 1 TSH. It was also determined what values will be determined in this system of immunoradiometric analysis (IRMA) using solutions of other hormones of known concentration and how this addition of other hormones will affect the result of the TSH level determination. The results are summarized in Table 3. The IRMA system was not affected by the used concentrations of HCG and PRL, only the international standard LH IRP 68/40 at a concentration of 160 XU / 1 showed a readable value of TSH (0.09 mIU / l). However, the standard contains according to

CS 276 445 86 údajů Světové zdravotnické organizace (WHO) 0,1 mlU TSH na 77 IU LH, tj. 0,129 % celkového množství LH a stanovená hodnota tak odpovídá přítomnosti TSH ve vzorku.EN 276 445 86 World Health Organization (WHO) data 0.1 mlU TSH per 77 IU LH, ie 0.129% of the total LH and the value determined corresponds to the presence of TSH in the sample.

Příklad 2Example 2

Byly připraveny zkumavky se zakotvenou protilátkou produkovanou hybridomem TSH-51 stejně jako v přikladu 1. Oo zkumavek byly umístěny terčíky filtračního papíru se zaschlou krví o známé koncentraci TSH určené pro kalibraci kitu pro screening novorozenecké hypothyreosy firmy Pharmacia. Na terčíky bylo pipetováno 200 ul. roztoku jiné pro- . tilátky s kodovým označením TSH-61 označené jodem 125 v roztoku PBS, pH 7,5 s obsahem 0,1 % hmot, bovinního sérového albuminu. Koncentrace jodované protilátky TSH-51 byla taková, že 200 ul roztoku mělo aktivitu 60 000 impulzů za minutu. Po 24 hodinách inkubace byla tekutina odsáta, zkumavky dvakrát promyty roztokem PBS, pH 7,5 a navázaná radioaktivita měřena na gamapočítači. Ke kalibraci byly přidány dvě skvrny kontrolních krví. Výsledky jsou uvedeny na obr. 2, který znázorňuje kalibrační křivky systému IRMA pro stanovení TSH z krevních skvrn na papíře v rámci sereeningu novorozenecké hypothyreosy. Čárkovaně je zakreslena kalibrační křivka zahraničního kitu dosud používaného, jak je uvedena výrobcem. Plnou čarou je uvedena kalibrační křivka při použití protilátky TSH-51, která je strmější což umožňuje citlivější stanovení. 3e zřejmé, že popsaný systém je citlivější než dosud používaný kit zahraniční výroby. Výsledky zjištěné v kontrolních krevních skvrnách se shodovaly s hodnotami deklarovanými.Tubes with anchored antibody produced by the TSH-51 hybridoma were prepared as in Example 1. Dried blood filter paper discs of known TSH concentration were placed in the tubes to calibrate the Pharmacia neonatal hypothyroidism screening kit. 200 .mu.l of a solution of another product were pipetted onto the targets. TSH-61-labeled antibodies iodine-125 labeled in PBS, pH 7.5, containing 0.1% w / w bovine serum albumin. The concentration of iodinated TSH-51 antibody was such that 200 μl of the solution had an activity of 60,000 pulses per minute. After 24 hours of incubation, the fluid was aspirated, the tubes were washed twice with PBS, pH 7.5, and the bound radioactivity was measured on a gamma counter. Two control blood spots were added for calibration. The results are shown in Figure 2, which shows the calibration curves of the IRMA system for the determination of TSH from blood stains on paper within the sereening of neonatal hypothyroidism. The dashed line plots the calibration curve of the foreign kit used so far, as specified by the manufacturer. The solid line shows the calibration curve using the TSH-51 antibody, which is steeper, allowing a more sensitive determination. It is clear that the described system is more sensitive than the previously used kit of foreign production. The results obtained in the control bloodstains agreed with the declared values.

Buňky hybridomu TSH-51 mají morfologický charakter typických myelomových buněk.V podmínkách in vitřo rostou v podobě polosuspenzních kultur. Základním kultivačním médiem je □ulbeccova modifikace minimálního esendiálního média (DMEM) doplněná L-glutaminem (2 mM), penicilinem, streptomycinem a inaktivovaným fetálním telecím sérem. Hybridom je kulti-. vován při 37 °C v atmosféře 5 obj. % kysličníku uhličitého a jeho střední generační čas je 16 hodin. Produkovaná protilátka je myši monoklonální imunoglo&ulin třídy IgG 2a, specificky vážící lidský TSH s vysokou afinitou (asociační konstanta v systému RIA 5,5«10^θ Ι/mol). Modálni počet chromozomů hybridomu 6 měsíců po ustavení byl 86.TSH-51 hybridoma cells have the morphological character of typical myeloma cells. They grow in vitro in the form of semi-suspension cultures. The basic culture medium is □ ulbecco's modification of the minimal essential medium (DMEM) supplemented with L-glutamine (2 mM), penicillin, streptomycin and inactivated fetal calf serum. The hybridoma is culti-. at 37 ° C in an atmosphere of 5% by volume of carbon dioxide and its mean generation time is 16 hours. The antibody produced is a mouse monoclonal immunoglobulin of the IgG 2a class, specifically binding human TSH with high affinity (association constant in the RIA system 5.5 10 10 θ θ / mol). The modal number of hybridoma chromosomes 6 months after establishment was 86.

Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem TSH-51 je použitelná pro vysoce sensitivní a striktně specifické stanovení koncentryce TSH v lidském séru imunochemickými metodami (imunoradiomatrická analýza, imunoenzymomatrická analýzy atd.), jednak při diagnostice poruch funkce štítné žlázy u dospělých (včetně možnosti stanovit snížené hladiny), jednak při sereeningu novorozenecké hypothyreosy u všech novorozenců. 3e využitelná i pro průkaz thyreostimulačního hormonu ve tkáních imunohistochemickými metodami a při purifikaci hormonálních proteinů imunoafinitní chromatografií. Nalezne uplatnění v lékařství a preparativní biochemii.The monoclonal antibody produced by the TSH-51 hybridoma is useful for highly sensitive and strictly specific determination of human serum TSH levels by immunochemical methods (immunoradiomatric analysis, immunoenzymometric analysis, etc.) and in the diagnosis of thyroid dysfunction in adults (including the ability to determine reduced levels). , on the one hand, in the sereening of neonatal hypothyroidism in all neonates. 3e can also be used for the detection of thyroid stimulating hormone in tissues by immunohistochemical methods and in the purification of hormonal proteins by immunoaffinity chromatography. It finds application in medicine and preparative biochemistry.

Vazba značených hormonů na monoklonální protilátku produkovanou hybridomem TSH-51 zakotvenou na pevné fázi je vyjádřena v procentech celkového množství inkubovaného hormonu po odečtení nespecifické vazby. Koncentrace protilátky na pevné fázi je (jak vyplývá z vysokého procenta vazby TSH-O^X ) vysoká.The binding of labeled hormones to a solid phase anchored monoclonal antibody produced by the TSH-51 hybridoma is expressed as a percentage of the total amount of incubated hormone after subtracting non-specific binding. The solid phase antibody concentration is high (as indicated by the high percentage of TSH-O ^X binding).

HormonHormone

TSHTSH

LHLH

FSHFSH

HCGHCG

Vazba v procentechBinding in percent

68,668.6

2,992.99

0,660.66

0,030.03

CS 276 445 B6CS 276 445 B6

Tabulka δ. 2Table δ. 2

Vazba značených hormonů při použití monoklonálni protilátky produkovaná hybrldomem TSH-51 ve třech různých ředěních (titrech) v klasickém RIA systému se separací pomoci druhé protilátky. Vazba je uvedena v procentech celkového množství značeného hormonu po odečtení nespecifické vazby.Binding of labeled hormones using a monoclonal antibody produced by the TSH-51 hybridoma in three different dilutions (titers) in a classical RIA system with separation by means of a second antibody. Binding is expressed as a percentage of the total amount of labeled hormone after subtracting non-specific binding.

Hormon Hormone 1:500 1: 500 Ředěni protilátky 1:10 000 Antibody dilution 1:10 000 1:100 000 1: 100,000 TSH TSH 62,8 62.8 50,0 50.0 13,7 13.7 FSH FSH 0,7 0.7 0,4 0.4 0 0 LH LH 4,3 4.3 3,0 3.0 1.1 1.1 HCG HCG 0,04 0.04 0 0 0 0 PRL PRL 0 0 0 0 0 0 HGH HGH 0 0 0 0 0 0

Použité zkratky: TSH - thyreostimulační hormon, FSH - folikulostimulačni hormon, LH luteinizačni hormon, HCG - lidský choriový gonadotropin, PRL - lidský prolaktin, HGH lidský růstový hormon.Abbreviations used: TSH - thyroid stimulating hormone, FSH - follicle stimulating hormone, LH luteinizing hormone, HCG - human chorionic gonadotropin, PRL - human prolactin, HGH human growth hormone.

Zkřížené reakce při stanoveni hladiny TSH metodou IRMA za použití protilátky produkované hybridomem TSH-51. Osou uvedeny stanovené hladiny TSH v roztoku standardů HCG, LH a PRL jednak bez přidáni TSH, jednak s přídavkem známé koncentrace standardu TSH. Mezinárodni standard LH IRP 68/40 obsahuje dle údajů WHO 0,129 % TSH.Cross-reactions in the determination of TSH levels by IRMA using an antibody produced by the TSH-51 hybridoma. The determined TSH levels in the solution of HCG, LH and PRL standards are given without the addition of TSH and with the addition of a known concentration of TSH standard. According to WHO data, the international standard LH IRP 68/40 contains 0.129% TSH.

StandardStandard

Stanovená hodnota TSH mIU/1Determined value of TSH mIU / 1

HCG 10 000 IU/1 HCG 10,000 IU / l méně než 0,05 2,0 16,0 less than 0.05 2.0 16.0 + 2 mIU/1 TSH +16 mIU/1 TSH + 2 mIU / 1 TSH +16 mIU / 1 TSH LH LH 160 IU/1 160 IU / 1 0,09 0.09 + 2 mIU/1 TSH + 2 mIU / 1 TSH 2,1 2.1 +16 mIU/1 TSH +16 mIU / 1 TSH 16,0 16.0 PRL PRL 200 ng/tnl 200 ng / tnl méně než 0,05 less than 0.05 +30 mIU/1 TSH +30 mIU / 1 TSH 30,0 30.0

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS

Claims

PATENT CLAIMS

Mouse lymphocyte hybridoma TSH-51, producing an IgG 2a class monoclonal antibody against human thyroid stimulating hormone.