RU2059721C1 - Strain of hybrid cultured murine cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibodies to the human thyrotropic hormone - Google Patents
Strain of hybrid cultured murine cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibodies to the human thyrotropic hormone Download PDFInfo
- Publication number
- RU2059721C1 RU2059721C1 RU93031277/13A RU93031277A RU2059721C1 RU 2059721 C1 RU2059721 C1 RU 2059721C1 RU 93031277/13 A RU93031277/13 A RU 93031277/13A RU 93031277 A RU93031277 A RU 93031277A RU 2059721 C1 RU2059721 C1 RU 2059721C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- monoclonal antibodies
- human
- tsh
- concentration
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МкАт) к тиреотропному гормону (ТТГ) человека. The invention relates to biotechnology and can be used to obtain monoclonal antibodies (MKAT) to human thyroid stimulating hormone (TSH).
Для правильной и своевременной диагностики заболеваний, связанных с нарушениями функций гипофиза и щитовидной железы, а также для контроля за эффективностью лечения необходима оценка уровня ТТГ в крови человека. Современные методы иммуноанализа (иммуноферментный, иммунофлюоресцентный, иммунорадиометрический) основаны на использовании моноклональных антител. For the correct and timely diagnosis of diseases associated with impaired functions of the pituitary and thyroid glands, as well as for monitoring the effectiveness of treatment, an assessment of the level of TSH in human blood is necessary. Modern methods of immunoassay (enzyme immunoassay, immunofluorescence, immunoradiometric) are based on the use of monoclonal antibodies.
В ряде лабораторий а рубежом были получены моноклональные антитела к ТТГ, константы связывания которых составляли от 108 до 1011 М-1 (М.М.Benkirane, D. Bon, S. Costagliola, F. Paolucci, B.Darbouret, P.Prince, P.Carayon//Endocrinology. 1987. V. 121, N 3. 1171-1177; J.M.Braun, G.Charreire//J. Immunol. Meth. 1990. 132, N 2. 197-203; М.Soos, K.Siddle//J.Immunol.Meth. 1982. V. 51, N 1. 57-64).Monoclonal antibodies to TSH were obtained in a number of laboratories abroad, the binding constants of which ranged from 10 8 to 10 11 M -1 (M.M. Benkirane, D. Bon, S. Costagliola, F. Paolucci, B. Darbouret, P. Prince, P. Carayon // Endocrinology. 1987. V. 121,
Известный отечественный штамм гибридных культивируемых клеток Т-32 (А.С. СССР N 1742324, кл. С 12 N 5/00, 1992) целесообразно рассматривать как наиболее близкий аналог предлагаемого нами технического решения по ряду признаков. It is advisable to consider the well-known domestic strain of hybrid cultured T-32 cells (A.S. USSR N 1742324, class C 12
Предложенный нами штамм аналогичен прототипу по способу получения (гибридизация спленоцитов мышей линии Balb/c с клетками мышиной миеломы Х63 Ag 653). Также общим качеством является высокая специфичность к тиреотропному гормону человека (ТТГ), отсутствие перекрестных реакций с родственными гликопротеидными гормонами гипофиза и плаценты (ЛГ, ФСГ, ХГЧ). Our proposed strain is similar to the prototype according to the production method (hybridization of splenocytes of Balb / c mice with cells of mouse myeloma X63 Ag 653). Also a common quality is the high specificity for human thyroid stimulating hormone (TSH), the absence of cross-reactions with related glycoprotein hormones of the pituitary and placenta (LH, FSH, hCG).
Аффинность антител, продуцируемых штаммом Т-32, достаточна для создания иммуноферментной тест-системы, позволяющей определять уровень ТТГ в биологических жидкостях человека в диапазоне концентраций от 2,4 до 50,0 мкМЕ/мл. Однако нормальные значения концентрации ТТГ в сыворотке крови колеблются от 0,30 до 5,00 мкМЕ/мл. Следовательно, такая тест-система позволит проводить только грубый скрининг и выявлять пациентов с повышенными значениями ТТГ (соответствует гипотиреозу). При этом большая часть нормальных значений и пониженные концентрации ТТГ не смогут быть определены по причине недостаточной чувствительности. The affinity of antibodies produced by strain T-32 is sufficient to create an enzyme-linked immunosorbent assay system that allows you to determine the level of TSH in human biological fluids in the concentration range from 2.4 to 50.0 µI / ml. However, normal serum TSH concentrations range from 0.30 to 5.00 μMU / ml. Consequently, such a test system will allow only coarse screening and identification of patients with elevated TSH values (consistent with hypothyroidism). Moreover, most of the normal values and low TSH concentrations cannot be determined due to insufficient sensitivity.
Целью предлагаемого технологического решения было получение стабильных гибридных культивируемых клеток мыши линии BALB/c, продуцирующих высокоаффинные МкАт к ТТГ человека, не дающие перекрестных реакций со структурно подобными гликопротеидными гормонами (лютеинизирующим, фолликуло- стимулирующим и хорионическим гонадотропным). The aim of the proposed technological solution was to obtain stable hybrid cultured mouse cells of the BALB / c line producing high-affinity McAb for human TSH, which do not give cross-reactions with structurally similar glycoprotein hormones (luteinizing, follicle-stimulating, and chorionic gonadotropic).
Аффинность предлагаемых моноклональных антител делает их пригодными для разработки иммунометрических тест-систем для определения ТТГ в биологических жидкостях с чувствительностью не более 0,15 мкМЕ/мл. Такая чувствительность позволяет проводить дифференциальную диагностику нормальных, пониженных и повышенных концентраций ТТГ в биологических жидкостях (соответствует эугипер- и гиротиреозу). The affinity of the proposed monoclonal antibodies makes them suitable for the development of immunometric test systems for the determination of TSH in biological fluids with a sensitivity of not more than 0.15 μMU / ml. Such sensitivity allows differential diagnosis of normal, low and high concentrations of TSH in biological fluids (corresponds to eugiper and gyrotyroidism).
Для получения гибридомных клеток, продуцирующих МкАт, клетки мышиной миеломной линии Х63.Ag8.653 гибридизовали с помощью 50% полиэтиленгликоля 4000 со спленоцитами мыши линии BALB/c, иммунизированной ТТГ. To obtain hybridoma cells producing McAb, cells of the mouse myeloma line X63.Ag8.653 were hybridized using 50% polyethylene glycol 4000 with splenocytes from the mouse line BALB / c immunized with TSH.
Самок мышей линии BALB/c иммунизировали в течение 4 мес тиреотропным гормоном человека. Для иммунизации использовали гормон с иммунологической активностью не менее 6 МЕ/мг. Female BALB / c mice were immunized for 4 months with human thyroid stimulating hormone. A hormone with immunological activity of at least 6 IU / mg was used for immunization.
После гибридизации клетки ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержащей компоненты селективной среды (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Супернатанты анализировали иммунометрическим методом. Специфичность моноклональных антител оценивали в конкурентном ИФА. Положительные клоны реклонировали и наращивали в виде асцитной опухоли в мышах линии BALB/c, которым за 10-12 дней до введения клеток вводили пристан. Антитела из асцитных жидкостей выделяли осаждением сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе. Полученные МкАт были использованы в иммуноферментном двухсайтовом методе определения ТТГ. After hybridization, the cells were resuspended in RPMI 1640 medium containing components of a selective medium (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). Supernatants were analyzed by immunometric method. The specificity of monoclonal antibodies was evaluated in competitive ELISA. Positive clones were recloned and expanded as an ascites tumor in BALB / c mice, which were injected with pristan 10-12 days before the introduction of the cells. Antibodies from ascites fluids were isolated by precipitation with ammonium sulfate, followed by ion exchange chromatography on DEAE cellulose. The obtained McAt were used in the enzyme-linked immunosorbent two-site method for determining TSH.
Получение штамма:
1. Иммунизация.Getting strain:
1. Immunization.
Самой линии BALB/с иммунизировали внутрибрюшинно в течение 4 мес, вводя каждые 2 недели по 30 мкг препарата ТТГ в 0,5 мл эмульсии PBS с полным (первая инъекция) либо с неполным (последующие инъекции) адъювантом Фрейнда. За 4 дня до гибридизации вводили внутривенно 20 мкг ТТГ в PBS. Для иммунизации использовали препарат ТТГ, который, согласно данным анализа, проведенного с помощью тест-системы фирмы Bio-Merieux, имел иммунологическую активность не менее 6 МЕ/мг. The BALB / c line itself was immunized intraperitoneally for 4 months, injecting every 2 weeks with 30 μg of TSH preparation in 0.5 ml of PBS emulsion with complete (first injection) or incomplete (subsequent injections) Freund adjuvant. 4 days before hybridization, 20 μg of TSH in PBS was intravenously administered. For immunization, a TSH preparation was used, which, according to an analysis carried out using a Bio-Merieux test system, had an immunological activity of at least 6 IU / mg.
2. Получение гибридом. 2. Obtaining hybridomas.
Гибридизацию спленоцитов иммунизированных животных проводили с клетками миеломной линии Х63.Ag8.653 в соотношении клеток 2:1 по методу Келера-Мильштейна с использованием ПЭГ 4000. После гибридизации клетки ресуспендировали в среде RPMI 1640 с двойной концентрацией компонентов селективной среды (гипоксантина, аминоптерина, тимидина), и рассеивали по 100 мкл в 96-луночные планшеты, содержащие по 100 мкл фидерного слоя макрофагов. Культуральная среда на всех этапах выращивания гибридом содержала 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ глутамина. Гибридомы клонировали не менее 2 раз методом лимитирующих разведений. Наличие положительных клонов определяли методом иммуноферментного анализа. Hybridization of the splenocytes of the immunized animals was carried out with X63.Ag8.653 myeloma cells in a cell ratio of 2: 1 according to the Köhler-Milstein method using PEG 4000. After hybridization, the cells were resuspended in RPMI 1640 medium with a double concentration of components of the selective medium (hypoxanthine, aminopterin, thymidine ), and 100 μl were scattered into 96-well plates containing 100 μl of the macrophage feeder layer. The culture medium at all stages of growing hybridomas contained 20% fetal calf serum, 4 mm glutamine. Hybridomas were cloned at least 2 times by limiting dilution method. The presence of positive clones was determined by enzyme immunoassay.
3. Скренинг первичных клонов. 3. Scanning of primary clones.
Тестирование культуральной жидкости на наличие антител к ТТГ проводили иммунометрическим двухсайтовым методом. В качестве твердой фазы использовали полистироловые планшеты с максимальной сорбирующей способностью фирмы "Нунк". Testing the culture fluid for the presence of antibodies to TSH was carried out by the immunometric two-site method. As a solid phase, polystyrene tablets with the maximum sorbing ability of Nunk were used.
Планшеты сенсибилизировали иммуноглобулиновой фракцией кроличьей антисыворотки к ТТГ (Кооператив "Гормон"). Антитета сорбировали из раствора с концентрацией 10 мкг/мл в PBS в течение ночи при 4оС или 1,5 ч при 37оС. Все последующие инкубации проводили 1 ч при 37оС. Между инкубациями несвязавшиеся компоненты отмывали PBS с 0,05% твин-20.The tablets were sensitized with an immunoglobulin fraction of rabbit antiserum to TSH (Hormon Cooperative). Antiteta sorbed from solution with a concentration of 10 ug / ml in PBS overnight at 4 ° C or 1.5 hours at 37 ° C. All subsequent incubations were performed for 1 h at 37 ° C. Between incubations unbound components were washed with PBS 0.05 % tween-20.
После блокирования оставшихся свободными участков связывания на пластике 0,5% раствором желатина в PBS вносили ТТГ в концентрации 10 нг/мл. Затем вносили культуральные супернатанты. Связавшиеся с антигеном антитела определяли с помощью пероксидазного конъюгата кроличьих антител к IgG мыши. В качестве хромогена использовали ортофенилендиамин. Оптическое поглощение измеряли на плашечном спектрофотометре "Мультискан". After blocking the remaining free binding sites on the plastic with a 0.5% gelatin solution, TSH at a concentration of 10 ng / ml was introduced into PBS. Then, culture supernatants were added. Antigen-bound antibodies were determined using a rabbit anti-mouse IgG peroxidase conjugate. Orthophenylenediamine was used as a chromogen. Optical absorption was measured on a Multiscan spot spectrophotometer.
4. Производство моноклональных антител в виде асцита. 4. Production of monoclonal antibodies in the form of ascites.
Положительные моноклоны наращивали в виде асцитной опухоли в мышах линии BALB/c, которым за 7-10 дней до введения клеток вводили по 0,5 мл пристана. После развития у мышей асцитной опухоли животных забивали цервикальной дислокацией, асцитную жидкость собирали, клетки удаляли центрифугированием. Positive monoclones were grown as an ascites tumor in BALB / c mice, which were injected with 0.5 ml pristan 7-10 days before the introduction of cells. After the development of an ascites tumor in mice, animals were sacrificed by cervical dislocation, ascites fluid was collected, cells were removed by centrifugation.
Асцитную жидкость, содержащую 5-10 мг/мл антител, замораживали при -20оС.The ascites fluid containing 5.10 mg / ml antibody, was frozen at -20 ° C.
5. Очистка моноклональных антител. 5. Purification of monoclonal antibodies.
Антитела из асцитной жидкости выделяли осаждением иммуноглобулиновой фракции 50% от насыщения сульфатом аммония с последующим обессоливанием на колонке с сефадексом G-25 и ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе. Антитела связывали с целлюлозой, уравновешенной 5 мМ натрий-фосфатным буфером, рН 8,0; элюцию проводили в градиенте ионной силы от 0,01 до 0,30 М, создаваемом хлоридом натрия. Antibodies from ascites fluid were isolated by precipitation of an immunoglobulin fraction of 50% of saturation with ammonium sulfate, followed by desalination on a Sephadex G-25 column and ion-exchange chromatography on DEAE-cellulose. Antibodies were bound to cellulose equilibrated with 5 mM sodium phosphate buffer, pH 8.0; elution was carried out in a gradient of ionic strength from 0.01 to 0.30 M created by sodium chloride.
Чистоту проверяли электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Примеси составили не более 5%
Определение подкласса полученных антител в культуральном супернатанте проводили с использованием моноспецифических антител к изотипам мышиных иммуноглобулинов согласно рекомендациям фирмы-поставщика. Антитела, синтезируемые клоном 624D, относятся к подклассу IgG1.The purity was checked by polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing conditions. Impurities were not more than 5%
A subclass of the obtained antibodies in the culture supernatant was determined using monospecific antibodies to murine immunoglobulin isotypes according to the recommendations of the supplier. Antibodies synthesized by clone 624D belong to the IgG1 subclass.
6. Определение специфичности моноклональных антител. 6. Determination of the specificity of monoclonal antibodies.
Специфичность оценивали конкурентным ИФА. Для этого в лунки полистироловых планшетов вносили раствор ТТГ в концентрации 400 нг/мл (2 мМЕ/мл) в PBS и инкубировали в течение ночи при 4оС или 1,5 ч при 37оС. Для блокирования неспецифического связывания использовали 0,5% раствор желатина в PBS. Затем одновременно инкубировали исследуемые антитела в избыточной концентрации (5 мкг/мл) и гормоны: ЛГ, ФСГ, ХГЧ, бета-субъединица ТТГ и ТТГ в диапазоне концентраций от 10 до 1000 нг/мл, что соответствует 0,07-7,00 МЕ/мл для ЛГ и ФСГ; 0,14-14,00 МЕ/мл для ХГЧ и 0,07-7,00 мкМЕ/мл для ТТГ. Связавшиеся с иммобилизованным тиротропином моноклональные антитела проявляли пероксидазным конъюгатом кроличьих антител к IgG мыши. Процент ингибирования связывания моноклональных антител с ТТГ, иммобилизованным на фазе, при добавлении конкурирующих гормонов в раствор, определяли по формуле
(Во/B) х 100% где Во концентрация ТТГ, иммобилизованного на фазе,
В концентрации ЛГ, ФСГ, ХГЧ и бета-субъединицы ТТГ в растворе, при которых достигается 50% ингибирования связывания ТТГ, иммобилизованного на фазе, с данными антителами.Specificity was evaluated by competitive ELISA. For this purpose, the wells of polystyrene plates TTG solution was added at a concentration of 400 ng / ml (2 mIU / ml) in PBS and incubated overnight at 4 ° C or 1.5 hours at 37 ° C. To block nonspecific binding, 0.5 % solution of gelatin in PBS. Then, the studied antibodies were incubated at an excessive concentration (5 μg / ml) and hormones: LH, FSH, hCG, TSH beta-subunit and TSH in the concentration range from 10 to 1000 ng / ml, which corresponds to 0.07-7.00 IU / ml for LH and FSH; 0.14-14.00 IU / ml for hCG and 0.07-7.00 μMU / ml for TSH. Monoclonal antibodies bound to immobilized thyrotropin exhibited a rabbit anti-mouse IgG antibody peroxidase conjugate. The percentage inhibition of the binding of monoclonal antibodies to TSH immobilized in phase, when competing hormones are added to the solution, was determined by the formula
(VO / B) x 100% where Va is the concentration of TSH immobilized in phase,
In the concentration of LH, FSH, hCG and beta subunits of TSH in solution, at which 50% inhibition of the binding of TSH, immobilized in phase, with these antibodies is achieved.
Полученные антитела В2Т взаимодействуют с антигенной детерминантной, экспонированной на бета-субъединице в составе интактного ТТГ. При этом процент перекрестных реакций с ЛГ, ФСГ и ХГЧ составил не более 0,06% а со свободной бета-субъединицей ТТГ 1,60%
Полученный штамм гибридных культивируемых клеток депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером 624D.The obtained B2T antibodies interact with the antigenic determinant exposed on the beta subunit as part of intact TSH. Moreover, the percentage of cross-reactions with LH, FSH and hCG was not more than 0.06% and with a free beta subunit of TSH 1.60%
The resulting strain of hybrid cultured cells was deposited in the Specialized collection of transplantable somatic vertebrate cells of the All-Union collection of cell cultures under the number 624D.
Штамм характеризуется следующими признаками:
Стандартные условия выращивания: 37оС, 5% СО2, среда RPMI 1640, содержащая 20% ЭТС.The strain is characterized by the following features:
Standard growing conditions: 37 ° C, 5% CO 2 , RPMI 1640 medium containing 20% ETS.
Культуральные свойства: клетки культивируются в монослое в концентрации 5 · 105 1 · 106 кл/мл, время субкультивирования составляет около 48 ч.Cultural properties: cells are cultured in a monolayer at a concentration of 5 · 10 5 1 · 10 6 cells / ml, subculture time is about 48 hours.
Характеристика культивирования гибридомы в организме животного: гибридома культивируется в организме мышей линии BALB/c, при перевивке используется доза 5 · 106 клеток на мышь, сенсибилизация животных проводится за 7-10 дней путем в/б инъекции 0,5 мл пристана, асциты образуются через 7-14 дней.Characterization of hybridoma cultivation in the animal organism: the hybridoma is cultured in the organism of BALB / c mice, a dose of 5 · 10 6 cells per mouse is used for inoculation, the animals are sensitized for 7-10 days by intravenous injection of 0.5 ml pristan, ascites are formed in 7-14 days.
Характеристика биосинтеза моноклональных антител: выход моноклональных антител в культуральной жидкости составляет 15-20 мкг/мл, в асцитной жидкости 5-10 мг/мл. Characterization of the biosynthesis of monoclonal antibodies: the yield of monoclonal antibodies in the culture fluid is 15-20 μg / ml, in ascites fluid 5-10 mg / ml.
Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении не менее 20 массажей в культуре и 3 пассажей на животных. The stability of antibody production is maintained for at least 20 massages in culture and 3 passages in animals.
Характеристика моноклональных антител, продуцируемых гибридомой 624D: гибридома продуцирует моноклональные антитела класса IgG1 к тиротропину человека. Активность моноклональных антител определяется методом гетерогенного иммуноферментного анализа. В качестве антигена используется тиротропин. Специфичность антител оценивали в конкурентном иммуноферментном анализе, используя в качестве конкурирующих лютеинизирующий, фоликулостимулирующий гормоны и хорионический гонадотропин. Процент перекрестной реактивности полученных антител с указанными гормонами составил не более 0,06% по молярному соотношению. Characterization of monoclonal antibodies produced by 624D hybridoma: the hybridoma produces monoclonal antibodies of the IgG1 class against human thyrotropin. The activity of monoclonal antibodies is determined by the method of heterogeneous enzyme-linked immunosorbent assay. Thyrotropin is used as an antigen. The specificity of antibodies was evaluated in a competitive enzyme-linked immunosorbent assay using luteinizing, follicle-stimulating hormones and chorionic gonadotropin as competing ones. The percentage of cross-reactivity of the obtained antibodies with these hormones was not more than 0.06% in molar ratio.
Способ криоконсервации гибридомы: криоконсервация гибридомы 624D проводится в ЭТС, содержащей 15% ДМСО. Первые трое суток ампулы с клетками хранятся при -70оС, затем переносятся в жидкий азот. Жизнеспособность гибридомы оценивали с помощью 0,5% раствора трипанового синего. Жизнеспособность составляет около 80%
Использование штамма иллюстрируется следующим примером:
Твердофазный иммунометрический анализ тиротропина.Hybridoma cryopreservation method: 624D hybridoma cryopreservation is carried out in an ETS containing 15% DMSO. The first three days of the ampoule with the cells stored at -70 ° C, then transferred to liquid nitrogen. Hybridoma viability was evaluated using a 0.5% trypan blue solution. Viability is about 80%
The use of the strain is illustrated by the following example:
Solid-phase immunometric analysis of thyrotropin.
В лунках планшетов для иммуноферментного анализа сорбировали моноклональные антитела 624D в концентрации 10 мкг/мл в 100 мкл PBS в течение 1,5 ч при 37оС. Последующие инкубации проводили в течение 1 ч при 37оС. Между инкубациями несвязавшиеся компоненты отмывали PBS, содержащим 0,05% твин-20.In the wells the plates for immunoassay sorbed monoclonal antibody 624D in a concentration of 10 ug / ml in 100 ul PBS for 1.5 hours at 37 ° C. Subsequent incubation was carried out for 1 hour at 37 ° C. Between incubations unbound components washed with PBS, containing 0.05% tween-20.
Неспецифическое связывание блокировали 0,5% раствором бычьего сывороточного альбумина в PBS. Затем вносили 100 мкл пробы с неизвестной концентрацией ТТГ или стандартного раствора ТТГ. После инкубации и отмывки добавляли 100 мкл пероксидазного конъюгата вторых антител к тиротропину. Nonspecific binding was blocked with a 0.5% solution of bovine serum albumin in PBS. Then, 100 μl of a sample with an unknown concentration of TSH or a standard TSH solution was added. After incubation and washing, 100 μl of the peroxidase conjugate of the second antibodies to thyrotropin was added.
В качестве хромогена использовали ортофенилендиамин (для приготовления 10 мл субстратного раствора брали 6 мг ортофенилендиамина и 5 мкл 30% перекиси водорода в 0,15 М цитрат-фосфатном буфере, рН 5,0). После развития окраски реакцию останавливали добавлением в планшеты по 100 мкл 4,9% серной кислоты и измеряли оптическое поглощение при 492 нм. Orthophenylenediamine was used as the chromogen (to prepare 10 ml of the substrate solution, 6 mg of orthophenylenediamine and 5 μl of 30% hydrogen peroxide in 0.15 M citrate-phosphate buffer, pH 5.0) were taken. After color development, the reaction was stopped by adding 100 μl of 4.9% sulfuric acid to the plates and the optical absorption was measured at 492 nm.
Концентрацию тиротропина в пробе рассчитывали по калибровочной кривой. Для построения этой кривой по приведенной нами в примере схеме в лунки планшетов, заблокированные бычьим сывороточным альбумином, вносили по 100 мкл стандартных проб ТТГ со значениями концентраций: 0,0, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5, 15,0 мкМЕ/мл в параллелях. Определение оптической плотности при 492 нм, образующейся в результате остановки ферментативной реакции серной кислотой, проводили с помощью плашечного спектрофотометра Titertec Multiscan MCC/340. The concentration of thyrotropin in the sample was calculated from the calibration curve. To construct this curve according to the scheme given by us in the example, 100 μl of standard TSH samples with concentration values: 0.0, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, were added to the wells of the plates blocked by bovine serum albumin. 7.5, 15.0 μMU / ml in parallel. The optical density at 492 nm resulting from the stoppage of the enzymatic reaction by sulfuric acid was determined using a Titertec Multiscan MCC / 340 plate spectrophotometer.
На фиг. 1 показан образец типичной калибровочной кривой зависимости оптической плотности при 492 нм от концентрации ТТГ в пробе, полученная в результате проведения анализа с помощью 3 различных серий реагентов. Цифровой материал по каждой серии реагентов с указанием стандартных отклонений, рассчитанных на основании 4 параллельных определений, приведен в таблице 1. In FIG. Figure 1 shows a sample of a typical calibration curve of the dependence of the optical density at 492 nm on the concentration of TSH in the sample obtained as a result of analysis using 3 different series of reagents. Digital material for each series of reagents indicating standard deviations calculated on the basis of 4 parallel determinations is shown in table 1.
Стандартные пробы, использованные для построения калибровочной кривой, были отстандартизованы относительно II Международного стандартного препарата тиротропина человека 80/558. Чувствительность анализа определялась как (х ± 2s), где х среднее значение концентрации, полученное при анализе контрольной пробы, не содержащей тиротропин, s стандартное отклонение. The standard samples used to construct the calibration curve were standardized relative to the II International standard preparation of human thyrotropin 80/558. The sensitivity of the analysis was defined as (x ± 2s), where x is the average concentration obtained from the analysis of the control sample not containing thyrotropin, s standard deviation.
Предлагаемый нами метод был апробирован также на сыворотках здоровых (эутиреоидных) доноров и пациентов с заболеваниями щитовидной железы (с гипер- и гипотиреозом). Была проведена корреляция результатов, полученных нашим методом со значениями, полученными при тестировании этих же образцов в иммуноферментной тест-системе "TSH-EIA" ("ТТГ-ИФА") производства фирмы Ноffman la Roche (цифровые данные приведены в табл. 2). При этом коэффициент корреляции, рассчитанный на основании сравнения 25 проб, составил 0,995 (фиг. 2). Our method was also tested on the sera of healthy (euthyroid) donors and patients with thyroid diseases (with hyper- and hypothyroidism). The results obtained by our method were correlated with the values obtained by testing the same samples in the TSH-EIA (TSH-ELISA) enzyme-linked immunosorbent assay (manufactured by Hoffman la Roche) (numerical data are given in Table 2). Moreover, the correlation coefficient calculated on the basis of a comparison of 25 samples amounted to 0.995 (Fig. 2).
Таким образом, предлагаемое техническое решение может быть использовано для создания твердофазной иммуноферментной тест-системы для количественного определения тиреотропного гормона в сыворотке крови человека в диапазоне 0,30-15,00 мкМЕ/мл с чувствительностью не более 0,15 мкМЕ/мл. Она может применяться в клиническом анализе пациентов для дифференцирования гипо-, гипер- и эутиреоидных состояний. Thus, the proposed technical solution can be used to create a solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay system for the quantitative determination of thyroid-stimulating hormone in human serum in the range of 0.30-15.00 μMU / ml with a sensitivity of not more than 0.15 μMU / ml. It can be used in clinical analysis of patients to differentiate hypo-, hyper- and euthyroid states.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU93031277/13A RU2059721C1 (en) | 1993-06-11 | 1993-06-11 | Strain of hybrid cultured murine cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibodies to the human thyrotropic hormone |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU93031277/13A RU2059721C1 (en) | 1993-06-11 | 1993-06-11 | Strain of hybrid cultured murine cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibodies to the human thyrotropic hormone |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2059721C1 true RU2059721C1 (en) | 1996-05-10 |
RU93031277A RU93031277A (en) | 1996-08-20 |
Family
ID=20143263
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU93031277/13A RU2059721C1 (en) | 1993-06-11 | 1993-06-11 | Strain of hybrid cultured murine cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibodies to the human thyrotropic hormone |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2059721C1 (en) |
-
1993
- 1993-06-11 RU RU93031277/13A patent/RU2059721C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
RU, N 1742324, C 12N 5/00, 1992. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0203093B1 (en) | Monoclonal antibodies against alveolar surfactant protein | |
US4565687A (en) | Monoclonal antibodies specific for the unbound β subunit of human chorionic gonadotropin | |
EP0329699A1 (en) | Immunometric assay for the detection of human chorionic gonadotropin | |
EP0312540A4 (en) | Monoclonal antibodies to unreduced, nonenzymatically-glycated proteins. | |
EP0161638B1 (en) | Monoclonal antibody and method for quantitation of immoglobulins using the same | |
EP0421392B1 (en) | Anti-hCG-beta core monoclonal antibody, its production and use | |
US5248593A (en) | Process and reagent for the determination of the luteinizing hormone and monoclonal antibodies suitable thereof | |
US4676981A (en) | Monoclonal antibodies against GnRH | |
RU2059721C1 (en) | Strain of hybrid cultured murine cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibodies to the human thyrotropic hormone | |
RU2059720C1 (en) | Strain of hybrid cultured murine cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibodies to the human thyrotropic hormone | |
RIDGWAY et al. | Monoclonal antibody to human thyrotropin | |
US4762783A (en) | Process and reagent for the determination of the follicle-stimulating hormone and monoclonal antibodies suitable therefor | |
CA2254151A1 (en) | Method for immunological assay | |
Benkirane et al. | Characterization of monoclonal antibodies against human thyrotropin and use in an immunoradiometric assay and immunohistochemistry | |
KR890003591B1 (en) | Process and reagent for the determination of the luteinising hormone and monoclonal antibodies suitable therefor | |
RU2049817C1 (en) | Strain of hybrid cultured murine cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibodies to phenobarbital | |
Endo et al. | Epitope mapping of human thyrotropin | |
US6133427A (en) | Anti-human calcitonin monoclonal antibodies and an immunoassay utilizing said antibodies | |
SU1685997A1 (en) | Strain of hybridous cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to human thyrotropin | |
RU2049816C1 (en) | Strain of hybrid cultured murine cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibodies to thyroxine | |
SU1742324A1 (en) | Strain of hybridous cultured cells mus musculus l., used for preparation of high-specific monoclonal antibodies to human thyreotropin | |
Yamamoto et al. | Monoclonal antibody for calcitriol (1 α, 25-dihydroxyvitamin D3) | |
RU2049818C1 (en) | Strain of hybrid cultured murine cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibodies to digoxin | |
JPH04108397A (en) | Monoclonal antibody and method for measuring tsh with the same | |
JP3152429B2 (en) | Anti-hCG-β core monoclonal antibody producing hybridoma, said monoclonal antibody and use thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20060612 |