CS257757B2

CS257757B2 - Method of reaction determination between antigen and antibody and reaction agent for realization of this process

Info

Publication number: CS257757B2
Application number: CS823121A
Authority: CS
Inventors: Satoshi Tsutsui; Tadamitsu Sudo; Michio Ito
Original assignee: Mitsubishi Chem Ind
Priority date: 1981-05-02
Filing date: 1982-04-30
Publication date: 1988-06-15
Also published as: CA1195925A; JPS6367864B2; EP0064274A1; DK190682A; DD202178A5; DK158481B; KR880001533B1; AU8282382A; US4672045A; ES8302313A1; NO159820C; NO159820B; ATE12010T1; AU559966B2; ZA822726B; HU188057B; ES511797A0; EP0064274B1; DK158481C; CS312182A2

Description

Vynález se týká Činidla pro stanovení reakce mezi antigenem a protilátkou a způsobu stanovení reakce mezi antigenem a protilátkou.

V současné době se věnuje velká pozornost reakcím in vivo, které mají vztah к interakci mezi antigenem a protilátkou, zejména v lékařství a hygieně. Tyto reakce jsou analyzovány a sledovány s cílem zajistit preventivní opatření, léčbu onemocnění, které spočívají na této reakci a podobně. Mimoto, pokud jde o reakce in vitro, provádí se intenzívní imunochemický výzkum při použití vzorků, které patrně jsou příčinou reakcí in vivo a část těchto reakcí již vedla к praktickému použití získaných výsledků. Typickým vysoce citlivým způsobem stanovení je například radioimunologické stanovení (RIA), aglutinace latexu se stanovením zákalu v části infračerveného spektra (LPIA), imunoanalýza při použití enzymu (EIA), fluoroimunoanalýza a nefelometrie. Až dosud byla provedena velká řada imunologických reakcí, při nichž se stanoví antigen nebo protilátka ve vzorku při použití reakčního činidla, které sestává kromě kapalné fáze ještě také z nosiče ve formě matrice, jde například o biologické nosiče jako červené krvinky nebo bakterie nebo částice Latexu, tvořené syntetickým organickým polymerem, které je možno senzitizovat příslušnou protilátkou nebo antigenem.

Imunologické reakce jsou vysoce specifické v. tom smyslu, že se reakce dostavuje okamžitě a selektivně, což je jedna z výjimečných vlastností těchto reakcí, které jsou důležitým lékařským stanovením.

Na druhé straně tělesné tekutiny, keré se obvykle zkoumají také in vivo mají měnlivé složení i fyzikální vlastnosti. Z tohoto důvodu není možno řadu imunologických reakcí oprostit úplně od nespecifických reakcí, které je možno nazvat vedlejšími reakcemi, nezávislými na reakci mezi antigenem a protilátkou. Částečným opatřením, vylučujícím některé tyto reakce je přidání kaolinu nebo podobného adsorpčního činidla nebo provedení extrakce, která někdy neutralizuje nespecifické faktory. Část těchto opatření je účinná, některé reakce však nelze pomocí těchto opatření ovlivnit a je tedy zapotřeby se přesvědčit při každé jednotlivé reakci mezi antigenem a protilátkou, což působí velké obtíže při praktickém použití reakcí tohoto typu.

V poslední době byla provedena celá rada různých sledování s cílem odstranit svrchu uvedené nevýhody dříve známých reakcí mezi antigenem a protilátkou, přičemž bylo zjištěno, že v průběhu reakce mezi antigenem a protilátkou v případě, že se reakce provádí se vzorkem, к němuž byl přidán polyanion, je možno zlepšit výtěžek látky, která má být zjištěna i přesnosti stanovení, takže jsou к dispozici přesnější hodnoty pro antigen nebo protilátku.

Předmětem vynálezu je tedy způsob sta novení reakce mezi antigenem a protilátkou, při němž se stanovovaný antigen nebo protilátka uvádí do reakce s odpovídající protilátkou nebo antigenem v reakční směsi, vyznačující se tím, že se stanovení reakce mezi antigenem a protilátkou provádí aglutinací, při níž se ke vzorku s obsahem antigenu nebo protilátky přidá přírodní nebo syntetický polymer s obsahem sulfonylových nebo karboxylových aniontů, rozpustný v reakčním prostředí.

Předmětem vynálezu je rovněž reakční činidlo pro stanovení reakce mezi antigenem a protilátkou, vyznačující se tím, že ve vodném reakčním prostředí pro reakci mezi antigenem a protilátkou obsahuje 0,001 až 0,5 procenta hmot, přírodního nebo syntetického polymeru se sulfonovými nebo karboxylovými anionty, rozpustného v reakčním prostředí, například heparinu nebo dextransulíátu.

Polyanionty, jichž je možno užít při provádění způsobu podle vynálezu jsou různé látky včetně přírodních nebo syntetických polymerů jako polysacharidů nebo polystyrenu s několikanásobným aniontem, například sulfonylovým zbytkem nebo karboxylem, přičemž tyto látky jsou rozpustné v reakčním prostředí, které je užito pro reakci mezi antigenem a protilátkou.

Specifickými příklady těchto polyaniontů jsou například síran dextranu, heparin, kyselina polystyrensulfonová, acetát ftalátu celulózy, kyseliny hyaluronová, sulfát kyseliny chondroitinsírové a podobně.

Při provádění způsobu podle vynálezu se vzorek s obsahem antigenu a protilátky uvede ve styk s polyaniontem a pak se provádí reakce mezi antigenem a protilátkou při použití odpovídající protilátky nebo antigenu v reakčním prostředí.

Anion je možno přidávat do reakčního prostředí tak, že se

i) reakce mezi antigenem a protilátkou provádí v prostředí, které obsahuje polyanion, nebo se ii) působí na vzorek v pevné nebo kapalné fázi s obsahem polyaniontů, přičemž vzorek s obsahem polyaniontů a antigenu nebo protilátky je možno podrobit reakci mezi' antigenem a protilátkou i po odstranění polyaniontu, obvykle se však provádí reakce se vzorkem, který polyanion ještě obsahuje.

Reakční prostředí, vhodné pro použití pro reakci mezi antigenem a protilátkou je zejména vodné prostředí, jako voda, roztok soli nebo pufru, tento roztok může obsahovat jednu nebo větší počet dalších přísad jako jsou stabilizátory, konzervační činidla, chelatační činidla, smáčedla a podobně.

Pokud jde o pufr, je možno užít například pufr s glycinem, pufr s kyselinou fosforečnou, s kyselinou citrónovou, barbitialový pufr, tris-pufr s kyselinou chlorovodíkovou nebo s malátem, pufr s amoniakem a podobně.

2S7757

Ze stabilizátorů je možno užít například aminokyseliny, polypeptidy, bílkoviny a podobně, přičemž tyto látky je nutno volit tak, aby se neúčastnily imunologické reakce, užívají se obvykle v koncentraci 0,001 až 1, s výhodou 0,05 až 0,6 %.

Výhodným příkladem konzervačních látek je azid sodíku a merthiolát.

Výhodnými příklady chelatačních činidel jsou kyselina ethyle-ndiamintetraoctová, kyselina nitrilotrioctová, kyselina cyklohexandiamintetraoctová a podobně.

Ze smáčedel je vhodné použití smáčedel neiontového typu.

Reakční prostředí má pil v obvyklém rozmezí, používaném pro reakci mezi -antigenem a protilátkou, toto rozmezí je obvykle 5 až 10.

Koncentrace polyaniontu v. reakčním prostředí obvykle nepřevyšuje 5 hmot. %, s výhodou 0,001 až 0,5 hmot. %.

Při vyšší koncentraci polyaniontu může být reakce nestálá, zejména při použití některých systémů. Při nižší koncentraci se snižuje inhibiční účinek proti nespecifickým reakcím, které ruší stanovení, takže je pak nemožné získat přesné výsledky a zhoršuje se celková přesnost stanovení. Dochází totiž к tomu, že určité složky séra také reagují s odpovídajícím antigenem.

Antigeny, které je možno tímto způsobem stanovit, jsou například bílkoviny, polypep: tidy, steroidy, polysacharidy, tukové látky, pyly, prachy a hapteny. Pokud jde o protilátky, jde převážně o bílkoviny, které vznikly jako reakce na svrchu uvedené antigeny.

Způsob podle vynálezu je možno aplikovat na jakýkoliv známý způsob stanovení reakce mezi antigenem a protilátkou. Je možno je užít v případě, v. němž obě stanovené látky i reakční činidla jsou rozpustné v reakčním prostředí, je však možno tohoto způsobu užít také v případě, kdy reakční činidlo je vázáno na nosiči ve formě částic, který je prákticky nerozpustný v reakčním prostředí a je reakčním činidlem senzitizován. Specifickým příkladem reakcí mezi antigenem a protilátkou, které je možno zlepšit způsobem podle vynálezu, jsou radioimunologické reakce, aglutinace latexu při stanovení zákalu v infračerveném světle, imunologické stanovení pomocí enzymu, fluoroimunologické stanovení, imunonefelometrie, shlukování červených krvinek, aglutinace latexu a podobně. Způsob podle vynálezu je zvláště vhodný pro aglutinaci latexu ke stanovení zákalu v infračerveném světle, kdy je možno využít například pasivní aglutinace v reverzní fázi.

Způsobem podle vynálezu je možno zabránit nespecifickým reakcím, které jsou obvyklé při provádění reakcí mezi antigenem a protilátkou, takže je možno dosáhnout přesnějšího stanovení.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady, všechna procentuální stanovení v příkladech jsou hmotnostní, není-li uvedeno jinak.

Příklad 1

Aglutinace latexu a stanovení zákalu v infračerveném světle.

μΐ séra normálního člověka s obsahem nejvýš 2 ^g/ml ai-fetoproteinu (AFP) se smísí s 50 μ\ roztoku s obsahem 1 ^g/ml AFP a pak se přidá 100 μΐ sérového albuminu skotu v roztoku chloridu sodného s obsahem dextransulfátu, čímž vzniká zkoumaný roztok. К 50 μΐ tohoto roztoku se přidá 50 μΐ latexového reakčního činidla, senzitizovaného protilátkou proti AFP a 200 ^1 pufru, načež so měří za stálého míchání změna zákalu při vlnové délce 940 nm. Hodnoty vzorku se odečítají na standardní křivce a vypočítá se přesnost měření. Výsledky jsou uvedeny v tabulce I a jsou srovnány s kontrolním vzorkem, který je prostý polyaniontu.

Jak je zřejmé z tabulky 1, je možno do sáhnout podstatného zlepšení přesnosti (P je nižší než 0,01) přidáním dextransulfátu do konečné koncentrace 0,1 %, vysoce zlepšen je také koeficient variace (CV). Výtěžek každého pokusu je relativní hodnota, vztažená na výtěžek, získaný při použití normálního séra, pokus byl prováděn na 10 vzorcích bez zákalu, jejichž hodnota byla pokládána za 100.

Příklad 2

Opakuje se postup z příkladu 1 s tím rozdílem, že se jako polyanion užije kyselina polystyrensulfonová do konečné koncentrace 0,2 %. Výsledky jsou rovněž uvedeny v tabulce 1, z níž je zřejmé, jak velkého zlepšení koeficientu variace bylo dosaženo.

Příklad 3

Opakuje se způsob podle příkladu 1 s tím rozdílem, že jako polyanion se užije heparin v koncové koncentraci 0,1 %. Jak je zřejmé z tabulky 1, i v tomto případě bylo dosaženo velkého zlepšení.

Příklad 4

Opakuje se postup z příkladu 1 s tím rozdílem, že se jako polyanion užije acetát ftalátu celulózy v koncové koncentraci 0,1 procenta. Jak je zřejmé z tabulky 1, také v tomto přípiadě bylo dosaženo zlepšení.

Tabulka 1

Výtěžek %

Kontrola bez Příklad 1 Příklad 2 Příklad 3 Příklad 4 polyaniontu dextransulfát kyselina heparin acetát polysty- ftalátu rensulfo- celulózy nová

237757

Číslo Vzorek Zákal

Hernolýza

1	—
2.	—
3	—
4	4~~l·
5	—
6	—
7	—
8	—
9	—
10	—
11	—
12	4-4-
13	4-
14	4-
15	—
16	4-
17	—
18	4-
19	-1-4-4-
20 Průměr	—
Standardní odchylka CV (%]

4-4-4-	93,7	101,4	93,9	96,2	98,3
4- 4- Ή	86,8	88,8	88,2	88,9	88,9
	83,8	105,8	80,2	87,2	82,9
4-4-4-	88,0	96,5	90,0	92,2	93,2
4-4-4-	76,7	86,6	80,3	82,3	85,2
+	84,6	98,1	85,2	87,8	91,2
4-	90,7	103,3	93,4	93,5	98,5
4-	85,9	103,0	86,8	85,9	91,7
i-	72,9	96,2	85,0	82,4	91,7
	100,6	100,6	100,0	99,8	101,7
4-	105,1	100,4	89,9	100,2	111,2
4~	92,7	101,0	94,3	102,0	98,4
4-	96,5	99,1	• ‘97,8	100,0	101,2
+	92,4	97,5	95,2	99,0	101,2
4-	100,0	100,2	97,5	102.0	101,5
4-	79,6	93,1	80,4	85,0	88,4
—.	95,6	100,1	95,5	99,4	100,9
—	81,1	93,2	87,5	8'5,5	93,5
—	82,6 Q9 П	85,5 ιης 1	83,7 Q7 9	87,0 1П9 Γ)	86,0 QR П

89,07 +8,39 9,42

Příklad 5

V tomto příkladu se uvádí výsledek přidání dextranusulfátu na shlukování červených krvinek, které může být v některých případech doprovázeno pseudoreakcí a v důsledku toho je reakce nesprávně odečtena.

Vzorek s obsahem AFP se dvacetkrát zředí roztokem dextransulfátu ve fosfátovém pufru o pH 4, který se připravuje tak, že konečná koncentrace dextransulfátu je 0,001 procenta, přičemž 100 //1 takto zředěného vzorku se přidá к suspenzi ovčích červených krvinek, které byly senzitizovány protilátkou proti AFP. Výsledná směs se nechá stát 2 hodiny. U těch vzorků, které obsahovaly nejvýš 50 mg/1 AFP bylo možno pozo-

97,78	90,1	92,92	95,18
+5,76	+6,33	+7,21	+7,07
5,89	7,02	7,76	7,43

rovat shlukování prstencovitého tvaru, kdežto u vzorků, které obsahovaly alespoň 100 (Ug/1 AFP bylo možno pozorovat větší prstencovitou aglutinaci nebo zákal celého vzorku. V případě, že tentýž pokus byl prováděn se vzorky o známé koncentraci, došlo к menšímu počtu pseudoreakcí i v případě, že byly použity vysoce zakalené vzorky, takže je zřejmé, že uvedeným způsobem je možno usnadnit stanovení.

Vynález byl popsán v souvislosti s několika zvláštními provedeními, je však zřejmé, že je možno provést ještě řadu změn a modifikací, které budou stále spadat do oboru vynálezu.

Claims

1. Způsob stanovení reakce mezi antigenem a protilátkou, při němž se stanovovaný antigen nebo protilátka uvádí do reakce s odpovídající protilátkou nebo antigenem v reakční směsi, vyznačující se tím, že se stanovení reakce mezi antigenem a protilátkou provádí aglutinací, při níž se ke vzorku s obsahem antigenu nebo protilátky přidá přírodní nebo syntetický polymer s obsahem sulfonylových nebo karboxylových a-niontů, rozpustný v reakčním prostředí.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako přírodní nebo syntetický polymer s obsahem sulfonylových nebo karboxylových aniontů ke vzorku přidá dextransulfát.

3. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že se stanovení reakce mezi antigenem a protilátkou provádí pasivní aglutinací v reverzní fázi.

4. Reakční činidlo pro stanovení reakce mezi antigenem a protilátkou, vyznačující se tím, že ve vodném reakčním prostředí pro reakci mezi antigenem a protilátkou, obsahuje 0,001 až 0,5 hmot. % přírodního nebo syntetického polymeru se sulfonovými nebo karboxylovými anionty, rozpustného v reakčním prostředí, například heparinu nebo dextransulfátu.

5. Reakční činidlo podle bodu 4, vyznačující se tím, že reakční prostředí je roztok pufru, například fosforečnanového pufru nebo pufru s glycinem.