WO2004088317A1 - リポプロテイン(a)の免疫比濁測定法およびその試薬 - Google Patents

リポプロテイン(a)の免疫比濁測定法およびその試薬 Download PDF

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Tadashi Yamazaki
Hiromi Goto
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to a method for accurately and quantitatively measuring an antigen having various phenotypes (phenotypes) in an immunoassay.
  • ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
  • Enzyme-linked immunosorbent assays using monoclonal antibodies that react one-to-one are desirable, and more than one monoclonal antibody must be used to support a variety of phenotypes (Clin Chem 1995; 41: 245-255). ).
  • immunoturbidimetry using polyclonal antibodies is widely used for the measurement of lipoprotein (a). It is intended for measurement at For this reason, when compared with the enzyme immunoassay, there was a problem that a difference was observed in the measured value due to a difference in the phenotype of the antigen (Curr Card iol Rep 1999; 1: 105-111).
  • Lipoprotein ( a ) is associated with arteriosclerosis, ischemic heart disease, etc., and the concentration of lipoprotein tin (a) in blood can be used to evaluate the risk of developing these diseases. Under such circumstances, there has been a demand for a method that can quickly and easily measure an accurate lipoprotein concentration.
  • Non-patent document 1
  • An object of the present invention is to solve the problem of measurement value divergence caused by a difference in antigen phenotype when compared with an enzyme immunoassay in an immunoturbidimetric assay. Specifically, it is an object of the present invention to provide a method for matching measured values with enzyme immunoassay by adjusting reagent components.
  • the present inventors have found that in an immunoturbidimetric assay for measuring an antigen having a plurality of phenotypes, the measured value can be controlled by adjusting the reagent components. In other words, by adding a large amount of antibody to the reagent components and adding a certain amount of basic amino acid such as arginine, the effect of measurement value variations due to phenotypic differences is avoided, and measurement in molecular units The present inventors have found that a measurement value having a high correlation with the measurement value obtained by the enzyme immunoassay method capable of performing the method can be obtained, thereby completing the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • the amount of antibody to be added is 0.16 mg / mL or more in the reaction solution during the antigen-antibody reaction.
  • Latex immunoturbidimetric detection reagent of [7] which is 3 mg / mL or less
  • FIG. 1 is a diagram showing the correlation between the measured value in the control measurement method and the measured value in the latex agglutination method at each antibody concentration.
  • FIG. 2 is a diagram showing the deviation of the specimen of each phenotype from the regression line at each antibody concentration.
  • FIG. 3 is a diagram showing the correlation between the measured value in the control measurement method and the measured value in the latex agglutination method at each arginine concentration.
  • FIG. 4 is a diagram showing the deviation of the specimen of each phenotype from the regression line at each arginine concentration.
  • the present invention is a method for avoiding fluctuations in measured values due to differences in antigen phenotype in the detection of antigens having various phenotypes using immunoturbidimetry.
  • the antigen to be detected is not limited as long as it is a protein having a plurality of phenotypes. Proteins having different molecular weights due to differences in phenotype are preferable, and lipopin tin (a) is particularly preferable. It is known that there are six phenotypes of lipoprotein (a), F, B, Sl, S2, S3, and S4 (Japanese clinical study, Vol. 57, 1999 extra edition, p42-44). These phenotypes can be determined by the method of Uterman et al.
  • the immunoturbidimetric method is a method in which an antibody is contained in a measurement reagent, an antigen-antibody reaction is caused by an antigen in a biological sample, an aggregate is formed, and the formation of the aggregate is measured by absorbance.
  • the antibody is used by sensitizing (binding) to an insoluble carrier.
  • the carrier to be used is not limited, and for example, latex particles, bentonite, collodion, kaolin, fixed sheep erythrocytes and the like can be used, but latex particles are preferably used.
  • Latex immunoturbidimetry using latex particles is called latex immunoturbidimetry.
  • Latex immunoturbidimetry involves mixing latex particles sensitized (bound) with an antigen in a biological sample to be measured. Then, aggregation of latex particles is formed, and the degree of the aggregation is measured by absorbance to qualitatively or quantitatively determine the antigen.
  • the biological sample used in the present invention is not limited, but blood, serum, and plasma can be suitably used.
  • the latex particles include, for example, monopolymer and / or copolymer polystyrene latex particles of vinylinole monomers such as biel chloride, acrylonitrile, vinyl acetate, atalinoleic acid ester, and estenol methacrylate, and styrene-butadiene copolymer methyl methacrylate.
  • vinylinole monomers such as biel chloride, acrylonitrile, vinyl acetate, atalinoleic acid ester, and estenol methacrylate
  • styrene-butadiene copolymer methyl methacrylate examples include butadiene-based copolymer latex particles such as butadiene copolymer, and polyvinyl toluene latex particles.
  • polystyrene-based latex particles are preferred because they have excellent adsorptivity for various proteins or polypeptides and can stably maintain biological activity for a long period of
  • the particle size of the latex particles is preferably from 0.01 to 1 ⁇ , and more preferably from 0.1 to 1 ⁇ . If the particle size is less than 0.1 ⁇ , microaggregation occurs frequently, and the apparent particle size becomes non-uniform, which may adversely affect simultaneous reproducibility, etc., and is sufficient for the number of antibodies. May not be obtained. If the particle size exceeds ⁇ , self-agglomeration proceeds and dispersibility decreases.
  • Antibodies used for sensitizing latex particles are preferably polyclonal antibodies such as egos, goats, sheep, pigs, and horses.
  • the polyclonal antibody is prepared by immunizing an animal using the purified lipoprotein (a) as an immunogen, obtaining an antiserum, and performing ammonium sulfate precipitation from the antiserum, ion exchange chromatography using an anion exchanger such as DEAE cellulose, Purification by appropriately selecting a known method such as molecular sieving chromatography, hydroxyapatite chromatography, affinity chromatography, etc., sieving according to the molecular weight and structure, or by combining these methods. Obtainable.
  • the phenotype of lipoprotein (a) used for immunization is not limited.
  • lipoprotein (a) has a specific gravity of 1.0 by ultracentrifugation from normal human serum.
  • Fractions of 63 to 1.15 can be collected and purified by chromatography using a column such as Sepharose CL-4B.
  • the method for sensitizing the latex particles with the antibody is not particularly limited.
  • the antibody may be physically adsorbed to the carrier, or may be chemically bonded. More specifically, for example, the antibody can be sensitized to the carrier by mixing the antibody and the carrier and then heating and shaking at 30 to 37 ° C for 1 to 2 hours.
  • the amount of antibody sensitized to the carrier Can be appropriately set according to the particle size of the carrier.
  • After the antibody is sensitized to the carrier it is preferable to block the unsensitized portion on the carrier surface with serum albumin, human serum albumin, rabbit serum albumin, ovalbumin and the like.
  • the carrier sensitized with the polyclonal antibody is preferably retained as a medium dispersion until the reaction with the biological sample.
  • the medium for example, a phosphate buffer, a glycine buffer, or the like can be used.
  • the content of the carrier sensitized to the polyclonal antibody can be usually 0.05 to 0.5% by weight, preferably 0.1 to 0.3% by weight based on the medium dispersion. . If necessary, serum albumin, gelatin, gum arabic and the like may be added to the medium.
  • Latex turbidimetry can be performed by mixing the antibody-sensitized latex particles and the biological sample in an appropriate buffer.
  • the amount of antibody present in the reaction system when the antibody-sensitized latex particles and the biological sample are mixed and aggregated is increased, and a basic amino acid is further present.
  • the final antibody concentration added to the reaction system is 0.05 to 0.1 mg / mL, whereas in the present invention, at least 0.15 mg / mL, preferably 0 Add at a concentration of 16 mg or more.
  • the upper limit is not limited in terms of the effect of suppressing the fluctuation of the measured value due to the phenotype.However, from the viewpoint of performing a latex immunoturbidimetry and obtaining a good agglutination image, the upper limit is preferably 1 mg / mL or less. The amount is preferably 3 mg / mL or less, particularly preferably 0.23 mg / mL or less. Regarding the amount of antibody to be added, the amount of latex sensitized with the antibody added to the reaction system may be increased, or the amount of sensitization per unit latex particle when sensitizing latex particles with the antibody may be increased. May be. As described above, the latex particles sensitized with the antibody are prepared as sensitized latex particles at a concentration of 0.05 to 0.5% by weight based on the medium dispersion. You may keep it.
  • the basic amino acid examples include arginine, histidine, glutamine, asparagine and citrulline. Among them, arginine is preferable.
  • the basic amino acid is added in a final concentration of 12% or more, preferably 15% or more in the reaction system when the antibody-sensitized latex particles and the biological sample are mixed and aggregated.
  • the upper limit of the concentration of the basic amino acid is not limited in terms of the effect of suppressing the fluctuation of the measured value due to the phenotype.For example, when arginine is used, it can be used at a concentration of about 40%. From the viewpoint of obtaining an aggregate image, 25% or less is preferable, and 20% or less is preferable. More preferably, it is particularly preferably 17% or less.
  • the latex agglutination method according to the present invention is typically performed by mixing 1 volume of a biological sample, 40 volumes of a first reagent containing a buffer, and 20 volumes of a sensitized latex particle solution.
  • the mixing ratio is not limited, and any ratio may be used as long as the abundance ratio of the antigen and the sensitized latex particles in the biological sample is appropriate and a ratio at which a good aggregation image is obtained.
  • the first reagent and the second reagent may be used together.
  • the particle concentration in the sensitized latex particle solution may be appropriately adjusted according to the volume ratio of the sensitized latex particle solution added to the reaction system to the total volume of the reaction system.
  • the buffer constituting the first reagent for example, phosphate buffer pH7 and glycine buffer pH7 are used.
  • the basic amino acid may be added to the first reagent, the second reagent, or both, as long as the final concentration is the above concentration.
  • the preferred concentration in the sensitized latex particle solution is 0.5 mg / mL or more and 0.7 mg / mL or less.
  • 7 to 10% may be added to the first reagent and 30% may be added to the second reagent.
  • the preferable concentration of the antibody or basic amino acid in these reagents can be easily converted from the final concentration in the above final reaction system or the volume ratio of each reagent.
  • the reaction is performed by mixing the biological sample, the first reagent and the second reagent.
  • the order of mixing is not limited, but first, the biological sample and the first reagent are mixed, and mixed for several minutes, preferably 1 to 5 minutes, more preferably 5 minutes, and then mixed with the second reagent. What is necessary is just to stir and mix.
  • the agglutination reaction is performed for 1 to 4 minutes, and the degree of agglutination is examined.
  • the temperature at this time is not limited, but it is desirable to carry out at 37 ° C. It can also be performed in a plastic or glass cell.
  • the amount (concentration) of lipoprotein (a) in the sample can be calculated by using a calibration curve prepared in advance. At this time, the phenotype of lipoprotein (a) used for preparing the calibration curve is not limited.
  • Agglomeration can be measured using, for example, an LPIA-S500 latex agglutination automatic analyzer from Mitsubishi Chemical Corporation, a TBA-200FR automatic analyzer from Toshiba Corp., and a Hitachi 7170 automatic analyzer from Hitachi, Ltd. it can.
  • the agglutination reaction is performed in physiological saline, pH 5.0 to 10; an appropriate buffer such as phosphate buffer. Solution, a borate buffer, a Tris buffer or the like.
  • the method of the present invention it is possible to avoid the fluctuation of the measured value depending on the type of each phenotype, and obtain a measured value having a high correlation with the measured value when lipoprotein (a) in a biological sample is measured in molecular units.
  • the measured value when lipoprotein (a) in a biological sample is measured in molecular units refers to, for example, a value measured by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) performed under specific conditions.
  • ELISA Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay
  • the ELISA method is a method for detecting an antibody that reacts with an antigen to be measured with a second antibody to which an enzyme such as peroxidase or galactosidase has been chemically bonded in advance. And the presence or amount of the target antigen is detected based on the degree of color development.
  • the detection of the target protein by the sandwich antibody method in which the antigen is immobilized with an immobilized antibody and a labeled antibody by combining a polyclonal antibody or a monoclonal antibody or a combination of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody, is currently mainstream.
  • the sandwich antibody method in which the antigen is immobilized with an immobilized antibody and a labeled antibody by combining a polyclonal antibody or a monoclonal antibody or a combination of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody
  • binding of one molecule of solid-phased antibody to one molecule of antigen to one molecule of labeled antibody is usually established, and multiple epitopes (antigenic determinants) recognized by the labeled antibody are placed on one antigen molecule.
  • the antigen does not exist, the above-mentioned binding is established for antigens having various phenotypes and antigens of any phenotype, so that measurement in molecular units becomes possible. In other words, no matter what phenotypic molecule is used as a standard, molecules with other phenotypes can be measured accurately in molecular units.
  • kringle4 exists in the apo (a) molecule, one of the constituent proteins, and is classified into ten different types from typel to typelO.
  • kringle4 type 1 and type3 to typelO exist only once in all apo (a)
  • kringle4 type2 has apo (a)
  • the difference in molecular weight due to the difference in lipoprotein phenotype is mainly due to the number of kringle4 type2 repeats.
  • lipoprotein (a) When lipoprotein (a) is measured using ELISA from the number of repetitions of each type of kringle4, if the antibody against kringle4 type 2 is contained in both the solid-phase antibody and the labeled antibody, the molecular Indicates that measurement in units is not possible (Clin Chem 1995; 41: 245-255). There are also identical or similar epitopes on different types of domains. Conversely, this is an antibody that can bind to any of kringle4 type1 and kringle4 type3 to 10 as a solid-phased antibody and a labeled antibody, and is selected from antibodies that recognize epitopes that are not commonly present in different types.
  • an antibody that recognizes a plurality of epitopes that do not exist in apo (a) is used as at least a labeled antibody, and preferably used as both a labeled antibody and an immobilized antibody. Is also good.
  • the measured value when the lipoprotein (a) is measured in molecular units is defined as the condition under which the binding of one molecule of the immobilized antibody to one molecule of the antigen to one molecule of the labeled antibody is established.
  • the ELISA performed An example of such an ELISA is the ELISA described in Clin Chem 1995; 41: 246-255.
  • the correlation coefficient (R 2 ) is 0.97 or more, preferably 0.98 or more, and more preferably 0.99 or more. That is all.
  • the present invention also provides an immunoturbidimetric method that avoids fluctuations in measured values depending on the type of each phenotype and obtains a measured value having a high correlation with a measured value when lipoprotein (a) in a biological sample is measured in molecular units.
  • IFCC International Federation of Clinic al Chemistry and Laboratory Mdeicme, Via Carlo Farini 81, 20159 Milano,
  • the standard concentration of lipoprotein (a) certified by (Italy) (PRM; IFCC proposed reference material) as a sample and serially diluted with physiological salt solution was measured by the immunoturbidimetric method. It is created when the same measurement is performed using a lipoprotein (a) of any expression type as a sample, against a calibration curve created by showing the relationship between measured values expressed as absorbance change graphs. This is an immunoturbidimetric method that shows substantial parallelism with the calibration curve.
  • the method of the present invention it is possible to avoid fluctuations in measured values depending on the type of each phenotype, and to obtain a measured value having a high correlation with a measured value obtained when the lipopin tin (a) in a biological sample is measured in molecular units. This means that almost identical measurements are always obtained, even if the phenotypic molecule used as the standard is changed. Therefore, the method of the present invention is a method that can obtain a constant measurement value regardless of the phenotype of the molecule used as the standard.
  • a specific description will be given based on examples of the present invention. However, the present invention is not limited to the following examples.
  • Example 1 Changes in measured values with reagents with different latex concentrations (antibody amounts) (correlation with control method (ELISA))
  • Eg heron anti-tripod-mouthed tin (a) Polyclonal antibody (obtained from DAK0) is mixed with latex particles (obtained from Sekisui Kogyo Co., Ltd.), then at room temperature for 60 minutes, and then in a thermostat at 60 ° C for 50 minutes. After heating, sensitization was performed by cooling in cold water for 20 minutes. The sensitization amount was 0.14 mg of polyclonal antibody per mg of latex particles. The sensitized latex particles were dispersed at a concentration of 0.5% by weight in 0.17M daricin buffer pH7 to obtain an anti-human pop-mouth tin (a) / a heron polyclonal antibody dispersion.
  • the final concentration of the antibody in the second reagent is about 0.3, 0.4, 0.5, 0, respectively. It was adjusted to 7 mg / mL and used as the second reagent.
  • a glycine buffer solution containing 0.1 M NaCl and 0.05 M EDTA, 1% BSA, and 25 mg / mL of normal persimmon globulin for the purpose of avoiding nonspecific reaction was used as the first reagent.
  • Arginine was added as a basic amino acid in an amount of 10% to the first reagent and 30% to the second reagent. The final concentration in the reaction solution was 16.7%.
  • the reaction 160 ⁇ L of the first reagent was added to 4 ⁇ L of serum serving as a sample and stirred, and after 5 minutes, the second reagent 80 was added and stirred, and an agglutination reaction was performed.
  • the measurement was performed using a Hitachi 7170-type automatic analyzer.
  • the aggregation reaction at 37 ° C for about 1 minute and 4 minutes was performed at a wavelength of 570 ⁇ . It was set to be measured as the change in absorbance in m.
  • a standard curve of a known concentration obtained from Technoclone was measured in advance under the same conditions as a sample, and a calibration curve showing the relationship between the concentration and the absorbance change was prepared.
  • the above 20 samples were measured by enzyme immunoassay as a control method as follows.
  • the monoclonal antibody used can be obtained by the method described in Clin Chem 1995; 41: 246-255.
  • a 96-well microtiter plate manufactured by Nunc was coated with an anti-human pop-mouth tin ( a ) monoclonal antibody ( a monoclonal antibody that binds to kringle4 type2 but does not bind to kringletypel and types 3 to 10).
  • the sample was appropriately diluted using PBS containing lg / L BSA and 0.5 mL / L Tween 20. Wash the gel 3 times with PBS pH 7.4, add HOL-labeled anti-human lipoprotein ( a ) monoclonal antibody (binding to kringle4 domain other than kringle4 type2) solution, add IOOL, and add 1 hour at 28 ° C With stirring. Then added 0PD and H 2 0 2, performs color reaction was terminated by adding the reaction of l mol / L sulfuric acid 100 L after 15 minutes. After the reaction was stopped, the absorbance of the reaction solution at 495 nm was measured. At this time, in order to calculate the concentration from the absorbance, a standard with a known concentration was measured under the same conditions as a sample, and a calibration curve showing the relationship between the concentration and the absorbance was created in advance.
  • HOL-labeled anti-human lipoprotein ( a ) monoclonal antibody binding to kringle4 domain other
  • a dispersion suspension of latex particles sensitized with anti-human pop-tin (a) ⁇ sagi polyclonal antibody was prepared in the same manner as in Example 1.
  • the final concentration of the antibody in the second reagent was adjusted to about 0.7 mg / mL.
  • Arginine as a basic amino acid was added to the first reagent so that the final concentrations in the reaction solution were 10, 15, and 17%, respectively (the concentration in the second reagent was 30%).
  • the correlation between the enzyme immunoassay and the measured values is excellent, and the measurement can be performed quickly and easily with an automatic analyzer.

Abstract

免疫学的測定法において、多様な表現型(フェノタイプ)を有する抗原を正確に定量測定するための方法の提供。　フェノタイプが存在する抗原の抗原抗体反応を利用した免疫比濁測定法を用いた検出において、測定系に添加する該抗原に対する抗体量を調節し、かつ測定系に塩基性アミノ酸を添加することにより、各フェノタイプの種類による測定値の変動を回避し、生体試料中の抗原を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関を有する測定値を得られる、抗原抗体反応を利用した免疫比濁測定法。

Description

明細書 リポプ口ティン（a)の免疫比濁測定法おょぴその試薬
技術分野
本発明は、 免疫学的測定法において、 多様な表現型（フ ノタイプ）を有する抗 原を正確に定量測定するための方法に関する。
背景技術
免疫学的測定法において、 多様な表現型（フ ノタイプ）を有し、 各表現型の分 子量が異なる抗原を分子単位で定量するためには、 異なる抗原部位を認識する複 数のモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法（ELISA)が必要とされていた。 例えば、 血液中の蛋白であるリポプロテイン（a)は、 アポ蛋白である apo (a)力 SLDL に結合した構造を有している。 apo (a)はプラスミノーゲンの kringle4と相同性の 高いドメィンの繰り返し構造を有しており、 この繰り返し数が個体によって一定 ではないため、 apo (a)の分子量に多様性が生じ、 Lp (a)に種々のフヱノタイプが 存在している。 例えば Utermann, G らは 6種類のフエノタイプに大別できること を報告してレヽる (Utermann G. et al. , J Coin Invest 1987； 80： 458-465) 。 このため、 各表現型の分子量の違いから、 通常免疫学的測定で用いられる重量単 位での測定を行なう場合、 ある分子量の表現型の分子を標準物質として用いて分 子量の異なる他の表現型の分子を測定した場合、 分子単位による測定値から乖離 した値が得られる。 また、 このとき表現型が異なれば、 ある抗体に対する反応性 が異なってくるという問題もある。 表現型の違いに拘らず総ての表現型の分子を 正確に定量的に測定するためには、 血清中の蛋白測定で一般的に用いられる重量 濃度の単位ではなく、 モル濃度による分子単位での測定が理想的とされる。 理論 上、 免疫学的測定法を用いて分子単位での測定を行なうためには、 抗原に対して
1対 1で反応するモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法が望ましく、 さらに 多様な表現型に対応するためには複数のモノクローナル抗体を使用する必要があ る（Clin Chem 1995 ; 41 : 245-255)。 一方で、 リポプロテイン（a)の測定にはポリク ローナル抗体を用いた免疫比濁測定法も広く用いられており、 一般的に重量濃度 での測定を目的としている。 このため、 酵素免疫測定法と比較した場合、 抗原の 表現型の違いによって測定値に乖離が認められることが問題であった（Curr Card iol Rep 1999 ; 1 : 105-111)。
リポプロテイン（a)は動脈硬化、 虚血性心疾患等と関係があり、 血中のリポプ 口ティン（a)濃度は、 これらの疾患の罹患リスクの評価にも用い得る。 このよう な状況下で、 迅速かつ簡便に正確なリポプロティン濃度を測定し得る方法が望ま れていた。 非特許文献 1
Clin Chem 1995； 1： 246-255
非特許文献 2
Curr Cardiol Rep 1999； 1： 105-111
発明の開示
本発明は、 免疫比濁測定法において、 酵素免疫測定法と比較した場合に抗原の 表現型の違いにより生じる測定値乖離の問題を解決することを目的とする。 具体 的には、 試薬成分の調整により、 酵素免疫測定法と測定値を一致させる方法を提 供することである。
本発明者らは、 複数の表現型を有する抗原の測定を行なうための免疫比濁測定 法において、 試薬成分の調整によって測定値の制御が可能となることを見出した。 すなわち、 試薬成分中に抗体量を多く添加し、 さらにアルギニン等の塩基性アミ ノ酸を一定量添加することで、 表現型の違いによる測定値のばらつきという影響 を回避し、 分子単位での測定が可能な酵素免疫測定法による測定値と高い相関を 有する測定値が得られることを見出し、 本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は以下の通りである。
[ 1 ] 複数のフエノタイプが存在するリポプ口ティン（a)の抗原抗体反応を利用 したラテックス免疫比濁測定法を用いた検出において、 測定系に添加するリポプ 口ティン（a)に対する抗体量を調節し、 かつ測定系に塩基性アミノ酸を添加する ことにより、 各フエノタイプの種類による測定値の変動を回避し、 生体試料中の リポプロテイン（a)を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関を有する測定 値を得られる、 抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定法、
[2] 添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において 0· lSmg/mL以上で ある [1]の方法、
[3] 添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において 0.16mg/mL以上 0.2 3mg/mL以下である [ 2 ]の方法、
[4] 添加する塩基性アミノ酸量が抗原抗体反応時の反応溶液において 15重量％ 以上である [1]から [3]のいずれかの方法、
[5] 塩基性アミノ酸の添加量が抗原抗体反応時の反応溶液において 15重量％以 上 17重量％以下である [ 4 ]の方法、
[6] 塩基性アミノ酸がアルギニンである [1]から [5]のいずれかの方法、
[7] フエノタイプが存在するリポプ口ティン（a)の抗原抗体反応を利用したラ テックス免疫比濁測定法を用いた検出試薬であって、 試薬中に抗原抗体反応時の 反応溶液中の抗体量が 0.16mg/mL以上となる分だけのリポプロテイン（a)に対する 抗体、 および試薬中に抗原抗体反応時の反応溶液中の塩基性ァミノ酸量が 15重 量％以上となる分だけの塩基性ァミノ酸を含む、 各フヱノタイプの種類による測 定値の変動を回避し、 生体試料中のリポプロテイン（a)を分子単位で測定した場 合の測定値と高い相関を有する測定値を得られる、 抗原抗体反応を利用したラテ ックス免疫比濁測定用検出試薬、
[8] 添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において 0.16mg/mL以上 0.2
3mg/mL以下である [ 7 ]のラテックス免疫比濁測定用検出試薬、
[ 9 ] 添加する塩基性ァミノ酸量が抗原抗体反応時の反応溶液において 15重量％ 以上 17重量％以下である [ 7 ]または [ 8 ]のラテックス免疫比濁測定用検出試薬、 および
[1 0] 塩基性アミノ酸がアルギニンである [7]から [9]のいずれかのラテック ス免疫比濁測定用検出試薬。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願特願 2003 - 094059号の明 細書および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 各抗体濃度における対照測定法における測定値と、 ラテックス凝集法 における測定値の相関を示す図である。
図 2は、 各抗体濃度における各表現型の検体の回帰直線からの乖離を示す図で ある。
図 3は、 各アルギニン濃度における対照測定法における測定値と、 ラテックス 凝集法における測定値の相関を示す図である。
図 4は、 各アルギニン濃度における各表現型の検体の回帰直線からの乖離を示 す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について詳細に説明する。
本発明は、 免疫比濁測定法を用いた多様な表現型を有する抗原の検出において、 抗原の表現型の違いに起因する測定値の変動を回避する方法である。 検出の対象 とする抗原は複数の表現型を有するタンパク質ならば限定されないが、 表現型の 違いにより分子量が異なるタンパク質が好ましく、 特にリポプ口ティン（a)が好 ましい。 リポプロテイン（a)には、 F、 B、 Sl、 S2、 S3、 S4の 6つの表現型が存在 することが知られている （日本臨床 57卷、 1999年増刊号、 p42 - 44) 。 これらの 表現型は Utermanらの方法 (Utermann, G et al.， Proc. Natl. Acad, Sci, USA 1989； 86： 4171-4174) によって決定できる。 即ち、 SDS-PAGEを行い移動度を ap o - Bを基準とし、 それより早い移動度を示す分子量の小さいものを F、 apo-Bと同 じ移動度のものを B、 遅い移動度のものを順に Sl、 S2、 S3および S4と分類する。 免疫比濁法とは、 測定試薬中に抗体を含有させておき、 生体試料中の抗原によ り抗原抗体反応を起こさせ、 凝集塊を形成させ凝集塊の形成を吸光度により測定 し、 生体試料中の抗原を定性または定量する方法であり、 例えば、 抗体を不溶性 担体に感作 （結合） させて使用する。 用いる担体は限定されず、 例えば、 ラテツ タス粒子、 ベントナイ ト、 コロジオン、 カオリン、 固定羊赤血球等を使用するこ とができるが、 ラテックス粒子を使用するのが好ましい。 ラテックス粒子を使用 する免疫比濁法をラテックス免疫比濁法といい、 ラテックス免疫比濁法は抗体を 感作 （結合） させたラテックス粒子を測定しょうとする生体試料中の抗原と混合 しラテックス粒子の凝集を形成させ、 該凝集の程度を吸光度により測定し、 抗原 を定性または定量する。 本発明で用いる生体試料は限定されないが、 血液、 血清、 血漿が好適に用いることができる。
ラテックス粒子としては、 例えば、 塩化ビエル、 アクリロニトリル、 酢酸ビニ ル、 アタリノレ酸エステル、 メタクリノレ酸エステノレ等のビニノレ系モノマーの単一重 合体及び 又は共重合体ポリスチレンラテックス粒子、 スチレン -ブタジエン共 重合体メチルメタクリレート一ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体ラ テックス粒子、 ポリビニルトルエンラテックス粒子等が挙げられる。 なかでも、 各種タンパク質、 又は、 ポリペプチド類等の吸着性に優れており、 かつ生物学的 活性を長期間安定に保持できる点で、 ポリスチレン系のラテックス粒子が好まし い。 上記ラテックス粒子の粒径は、 好ましくは 0. 01〜 1 μ ιηであり、 さらに好ま しくは 0. 1〜 1 μ ΐΗである。 粒径が 0. Οΐ ηι未満であると、 微凝集が多発し、 見か けの粒径が不均一となり、 同時再現性等に悪影響が及ぶことがあり、 また、 抗体 の数に対して充分な凝集が得られないことがある。 粒径が Ι μ πιを超えると、 自 己凝集が進み、 分散性が低下する。
ラテックス粒子の感作に使用する抗体はゥサギ、 ャギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥマ等 のポリクローナル抗体が望ましい。 該ポリクローナル抗体は精製したリポプロテ イン（a)を免疫原として動物を免疫し、 抗血清を得て抗血清から硫安塩析法、 DEA Eセルロース等の陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、 分 子量や構造によってふるいわける分子ふるいクロマトグラフィー、 ヒ ドロキシァ パタイトクロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィ一等の公知の方 法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製することによ り得ることができる。 この際、 免疫に用いるリポプロテイン（a)の表現型は限定 されない。 リポプロテイン（a)は、 例えば正常ヒ ト血清より超遠心により比重 1. 0
63〜1. 15の画分を分取し、 それらを Sepharose CL - 4B等のカラムを用いたクロマ トグラフィ一により精製することができる。
ラテックス粒子への抗体の感作方法は、 特に限定されない。 例えば、 抗体を担 体に物理的に吸着させてもよいし、 化学的に結合させてもよい。 より具体的には、 例えば、 抗体と担体とを混和した後、 30〜37°Cで 1〜2時間加温振盪することによ り、 抗体を担体に感作させることができる。 担体に感作する抗体の量は、 使用す る担体の粒径に応じて適宜設定することができる。 抗体を担体に感作した後、 担 体表面上の未感作部分をゥシ血清アルブミン、 ヒ ト血清アルブミン、 ゥサギ血清 アルブミン、 卵白アルブミン等でブロッキングするのが好ましい。 ポリクローナ ル抗体を感作した担体は、 生体試料と反応させる時まで媒体分散液として保持し ておくのが好ましい。 この際、 媒体としては、 例えば、 リン酸緩衝液、 グリシン 緩衝液等を使用することができる。 ポリクローナル抗体に感作した担体の含有量 は、 通常、 媒体分散液に対して 0. 05〜0. 5重量％とすることができるが、 0. 1〜0. 3重量％とするのが好ましい。 媒体中には、 必要に応じてゥシ血清アルブミン、 ゼラチン、 アラビアゴム等を添加してもよい。
抗体感作ラテックス粒子と生体試料を適当な緩衝液中で混合することによりラ テックス免疫比濁法を行なうことができる。 本発明においては、 抗体感作ラテツ タス粒子と生体試料を混合して凝集させるときの反応系に存在する抗体量を多く し、 さらに塩基性アミノ酸を存在させる。 通常ラテックス免疫比濁法において、 反応系に添加する最終抗体濃度は 0, 05〜0. lmg/mLであるのに対して、 本発明にお いては少なくとも、 0. 15mg/mL以上、 好ましくは 0· 16mg以上の濃度で添加する。 上限は、 表現型による測定値の変動を抑えるという効果の点では限定されないが、 ラテックス免疫比濁法を行い、 良好な凝集像を得るという観点から、 l mg/mL 以下が好ましく、 さらに 0. 3mg/mL以下が好ましく、 0. 23mg/mL以下で添加するの が特に好ましい。 添加する抗体量は、 反応系に添加する抗体で感作したラテック スの添加量を多くしてもよいし、 ラテックス粒子を抗体で感作するときの単位ラ テックス粒子当たりの感作量を多くしてもよい。 上述のように、 抗体で感作した ラテックス粒子は、 媒体分散液に対して 0. 05〜0, 5重量％の濃度で感作ラテック ス粒子として調製されるが、 この時の濃度を高くしておいてもよい。
塩基性アミノ酸としては、 アルギニン、 ヒスチジン、 グルタミン、 ァスパラギ ンまたはシトルリンが例示できるが、 この中でもアルギニンが望ましい。 塩基性 アミノ酸の添加量は、 抗体感作ラテックス粒子と生体試料を混合して凝集させる ときの反応系の最終濃度は、 12%以上、 好ましくは 15%以上である。 塩基性アミ ノ酸の濃度の上限は表現型による測定値の変動を抑えるという効果の点では限定 されず、 例えば、 アルギニンを用いる場合、 40%程度の濃度で用いることもでき るが、 良好な凝集像を得るという観点からは、 25%以下が好ましく、 20%以下が さらに好ましく、 17%以下が特に好ましい。
本発明によるラテックス凝集法は、 典型的には生体試料 1容、 緩衝液を含む第 1試薬 40容およぴ感作ラテックス粒子溶液 20容を混合して行なわれる。 但し、 こ の混合比率には限定されず、 生体試料中の抗原およぴ感作ラテックス粒子の存在 比が適切で、 良好な凝集像が得られる比率ならばどのような比率でもよい。 また、 第 1試薬と第 2試薬を一緒にしてもよい。 反応系に加える感作ラテックス粒子溶 液の反応系全容量に対する容量比に応じて感作ラテックス粒子溶液中の粒子濃度 を適宜調節すればよい。 第 1試薬を構成する緩衝液としては、 例えばリン酸緩衝 液 pH7、 グリシン緩衝液 pH7が用いられる。 また、 塩基性アミノ酸は上記第 1試薬 に添加しても、 第 2試薬に添加しても、 両方に添加しても、 最終濃度が前記濃度 になればよい。 前記典型例において、 感作ラテックス粒子溶液中の好ましい濃度 は、 0. 5mg/mL以上 0. 7mg/mL以下である。 また、 例えば塩基性アミノ酸を第 1試薬 およぴ第 2試薬の両方に添加する場合第 1試薬に 7〜10%添加し、 第 2試薬に 3 0%添加すればよい。 これらの試薬中の抗体または塩基性アミノ酸の好ましい濃 度は、 上記の最終反応系における最終濃度おょぴそれぞれの試薬の容量比から容 易に換算することができる。
反応は、 生体試料、 第 1試薬および第 2試薬を混合することにより行なわれる。 混合の順番は限定されないが、 最初に生体試料と第 1試薬を混合し、 数分間、 好 ましくは 1〜5分間、 さらに好ましくは 5分間攪拌混合し、 次いで第 2試薬を混 合しさらに攪拌混合すればよい。 凝集反応は 1〜4分行ない、 凝集の程度を調べ る。 この際の温度は限定されないが、 37°Cで行なうのが望ましい。 プラスチック セル若しくはガラスセル内で行なうこともできる。 この場合、 セル外部より可視 光から近赤外域の光、 例えば、 通常 400〜2400nm、 好ましくは 550〜800nmの波長 の光を照射し、 吸光度変化又は散乱光の強度変化を検出して担体粒子の凝集の程 度を測定する。 この場合、 予め作成した検量線を用いれば、 試料内のリポプロテ イン（a)量 （濃度） が算出できる。 このとき検量線の作成に用いるリポプロティ ン（a)の表現型は限定されない。 凝集の測定は、 例えば三菱化学株式会社の LPIA - S500ラテックス凝集全自動測定器、 （株）東芝の TBA- 200FR自動分析装置及ぴ日立 製作所の日立 7170形自動分析装置等を用いて行なうことができる。
凝集反応は、 生理的食塩水、 pH5. 0〜； 10の適当な緩衝液、 例えば、 リン酸緩衝 液、 ホウ酸緩衝液、 トリス緩衝液等の溶液中で行なわせればよい。
本発明の方法により、 各フエノタイプの種類による測定値の変動を回避し、 生 体試料中のリポプロテイン（a)を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関を 有する測定値を得られる。 ここで、 生体試料中のリポプロテイン（a)を分子単位 で測定した場合の測定値とは、 例えば特定の条件下で行なう酵素免疫測定法 （EL ISA) で測定した値を指す。
ELISA (ェンザィム ' リンク ト 'ィムノ一ソルベント ·ァッセィ ： Enzyme Link ed Immuno-Sorbent Assay) 法は、 抗体を酵素で標識し、 該抗体と結合する物質 (抗原） を検出する方法であり、 特に抗原蛋白質の検出方法として、 抗原抗体反 応を利用して検体中の抗原蛋白質或いは逆に特定の抗原蛋白質に結合する抗体を 検出する分析方法として広く用いられている。 ELISA法は、 測定対象とする抗原 と反応する抗体を、 予めペルォキシダーゼやガラクトシダーゼ等の酵素を化学的 に結合させた第 2の抗体で検出方法であり、 反応系内に酵素反応によって発色す る基質を加えて、 その発色度合から目的とする抗原の有無や量を検出する方法で ある。
ELISA法では、 一般的にポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体同士、 或いはポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とを組み合わせ抗原を固相化抗 体およぴ標識化抗体ではさむサンドィッチ抗体法による目的蛋白質の検出が現在 主流となっている 〔 「生化学実験法 11ェンザィムィムノアツセィ」 、 1989年 11月 15日東京化学同人発行〕 。
ELISA法においては、 通常 1分子の固相化抗体一 1分子の抗原一 1分子の標識 抗体という結合が成立し、 標識抗体の認識するェピトープ （抗原決定基） がーつ の抗原分子上に複数存在しない限り多彩な表現型が存在する抗原であってもいず れの表現型の抗原に対しても上述の結合が成立するので、 分子単位での測定が可 能となる。 すなわち、 標準物質としてどの表現型の分子を用いても、 他の表現型 の分子が分子単位で正確に測定できる。
例えば、 リポプロテイン（a)の場合、 構成蛋白のひとつである apo (a)分子中に k ringle4と呼ばれる繰り返し構造が存在し、 typelから typelOまでの 10の異なるタ イブに分類されている。 このうち、 kringle4 type 1および type3から typelOは、 総ての apo (a)において一つだけ存在するのに対して、 kringle4 type2は apo (a)分 子ごとに複数が繰り返し存在し、 その数は 3から 40であると言われている。 すな わち、 リポプロテインの表現型の違いによる分子量の違いは専ら kringle4 type2 の繰り返し数に起因している。 この各 kringle4の各タイプの繰り返し数から、 EL ISAを用いてリポプロテイン（a)を測定する場合、 kringle 4 type 2に対する抗体 が固相抗体おょぴ標識抗体の双方に含まれると正確に分子単位での測定ができな いことを示す（Clin Chem 1995 ; 41 : 245 - 255)。 また、 異なるタイプのドメイン上 に、 同一のまたは類似したェピトープも存在する。 このことは逆に固相化抗体と 標識抗体として kringle4 typelおよび kringle4 type3から 10のいずれかと結合し 得る抗体であって、 異なるタイプに共通して存在しないェピトープを認識する抗 体の中から選択し、 固相化抗体と標識抗体が結合するタイプを別のものにすれば. 必ず 1分子の固相化抗体一 1分子の抗原一 1分子の標識抗体という結合が成立す るので、 分子単位での測定が可能になる。 また、 kringle4以外のドメインに存在 するェピトープであっても、 apo (a)中に、 複数存在しないェピトープを認識する 抗体を少なくとも標識抗体として、 好ましくは標識抗体と固相化抗体の両方に用 いてもよい。 本発明において、 リポプロテイン（a)を分子単位で測定した場合の 測定値とは、 このように 1分子の固相化抗体一 1分子の抗原一 1分子の標識抗体 という結合が成立する条件で行われる ELISAを指す。 このような ELISAとして例え ば、 Clin Chem 1995； 41： 246-255 に記載の ELISAが挙げられる。 このような ELISA 法による測定値と本発明の方法による測定値の相関をとつた場合、 相関係数（R2) は、 0. 97以上、 好ましくは 0. 98以上、 さらに好ましくは 0. 99以上である。
また、 本発明の各フエノタイプの種類による測定値の変動を回避し、 生体試料 中のリポプロテイン（a)を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関を有する 測定値を得られる免疫比濁法とは、 IFCC (International Federation of Clinic al Chemistry and Laboratory Mdeicme, V ia Carlo Farini 81， 20159 Milano,
Italy) により認証されたリポプロテイン（a)の標準物質 （PRM; IFCC proposed reference material) を試料として生理的塩類溶液により段階的に希釈したもの を前記免疫比濁法により測定した場合、 理論濃度と吸光度変化量として表される 測定値の関係をグラフで示すことにより作成される検量線に対して、 いかなる表 現型のリポプロテイン（a)を試料として同様な測定を行った場合に作成される検 量線とも実質的に平行性を示す免疫比濁法である。 また、 本発明の方法によれば各フエノタイプの種類による測定値の変動を回避 し、 生体試料中のリポプ口ティン（a)を分子単位で測定した場合の測定値と高い 相関を有する測定値を得られるが、 これは標準物質として用いる表現型の分子を 変えても、 常にほぼ同一の測定値が得られることを意味する。 従って、 本発明の 方法は、 標準物質として用いる分子の表現型にかかわらず一定の測定値が得られ る方法である。 以下、 本発明の実施例に基づき具体的に説明する。 もっとも本発明は下記実施 例に限定されるものではない。
〔実施例 1〕 ラテックス濃度 （抗体量） を変えた試薬での測定値の変化 （対照 法（ELISA)との相関）
ゥサギ抗ヒ トリポプ口ティン（a)ポリクローナル抗体 （DAK0社より入手） をラ テックス粒子 （積水工業株式会社から入手） に混和し、 室温にて 60分間、 その後 60°Cの恒温槽中で 50分間加温を行った後、 冷水中で 20分間冷却することにより感 作した。 感作量は、 ラテックス粒子 lmg当たりポリクローナル抗体 0. 14mgであつ た。 感作ラテックス粒子を 0· 17Mダリシン緩衝液 pH7に 0. 5重量％の濃度で分散し 抗ヒ トリポプ口ティン（a)ゥサギポリクローナル抗体分散液とした。
抗ヒ トリポプ口ティン（a)ゥサギポリクローナル抗体を感作したラテックス粒 子の分散浮遊液において、 第 2試薬中の抗体の終濃度がそれぞれ約 0. 3、 0. 4、 0. 5、 0. 7mg/mLとなるように調製し、 第 2試薬とした。 第 1試薬として 0. 1Mの NaCl および 0· 05Mの EDTA、 1%の BSA、 非特異反応の回避を目的として正常ゥサギグロ ブリンを 25mg/mLを加えたグリシン緩衝液を用いた。 塩基性アミノ酸としてアル ギニンを第 1試薬に 10%、 第 2試薬に 30%添加した。 反応液中の終濃度としては 16. 7%であった。
測定する試料として、 それぞれ表現型の異なるリポプロテイン （a ) を含むヒ ト血清を 20検体用いた。 20検体中、 表現型が B、 Sl、 S3、 S4および S5のものをそ れぞれ 4検体ずつ用いた （Technoclone社より入手） 。
反応は試料となる血清 4 μ Lに対して第 1試薬 160 μ Lを加え攪拌し、 5分後に 第 2試薬 80 を添加攪拌し、 凝集反応を行なった。 測定は日立 7170形自動分析 装置を使用し、 この際約 1分後から 4分間の 37°Cにおける凝集反応を波長 570 η mの吸光度変化量として測定するよう設定した。 吸光度変化量から濃度を算出す るために、 あらかじめ既知濃度の標準 （Technoclone社より入手） を試料として 同条件で測定し、 濃度と吸光度変化量の関係を表す検量線を作成しておいた。 また、 上記 20検体を対照法として以下のように酵素免疫測定法で測定した。 用 いるモノクローナル抗体は Clin Chem 1995； 41： 246-255 に記載の方法により入手 することができる。 Nunc社製の 96ウェルマイクロタイタ一プレートに、 抗ヒ トリ ポプ口ティン（a)モノクローナル抗体 （kringle4 type2に結合するが、 kringle t ypelおよび type3から 10には結合しないモノクローナル抗体） を 0. 5 / g/wellで固 相化した （0. 1M重炭酸ナトリゥム緩衝液 ΡΗ9· 6中 5 g/mLの抗体溶液を lOO ^u Lゥ エルに入れ 1時間室温で攪拌した後一夜 4 °Cでインキュベート） 。 PBS p H7. 4 を用いてゥヱルを 3回洗浄し、 30g/Lの BSAを含む PBSSOO ^ Lをゥヱルに入れ 1時 間室温でインキュベートしブロッキングを行った。 ブロッキング後、 PBS pH7. 4 を用いてゥエルを 3回洗浄し該ゥヱル中に前記検体を ΙΟΟ μ ί添加し、 1時間 28°C で攪拌した。 この際、 検体は lg/L BSA、 0. 5mL/L Tween 20を含む PBSを用いて適 宜希釈した。 PBS pH7. 4を用いてゥヱルを 3回洗浄し、 HRPで標識した抗ヒトリポ プロテイン（a)モノクローナル抗体 (kringle4 type2以外の kringle4ドメインに 結合する） 溶液を I OO L添加し、 1時間 28°Cで攪拌した。 その後、 0PDおよび H202 を添加し、 発色反応を行い、 15分後に l mol/L硫酸 100 Lを添加し反応を停止し た。 反応停止後反応液の 495nmにおける吸光度を測定した。 この際、 吸光度から 濃度を算出するために、 あらかじめ既知濃度の標準を試料として同条件で測定し、 濃度と吸光度の関係を表す検量線を作成しておいた。
結果、 第 2試薬中の抗体濃度が 0. 3mg/mLおよび 0. 4mg/raLの試薬による測定では、 酵素免疫測定法との相関性より求めた回帰直線から乖離する検体が認められるカ S、 抗体濃度 0. 5mg/mLおよび 0. 6mg/mLの試薬による測定では、 酵素免疫測定法との相 関性より求めた回帰直線から乖離する検体は見られなかった。 図 1に各抗体濃度 における対照測定法における測定値と、 ラテックス凝集法における測定値の相関 を示す。 また図 2には、 各表現型の検体の回帰直線からの乖離を示す。
試薬中の抗体濃度を調整することにより、 対照となる酵素免疫測定法と測定値 がー致させることが可能であることを確認した。 〔実施例 2〕 アルギニン濃度を変えた試薬での測定値の変化 （対照法（ELISA) との相関）
抗ヒ トリポプ口ティン（a)ゥサギポリクローナル抗体を感作したラテックス粒 子の分散浮遊液は、 実施例 1と同様にして作製した。
抗ヒ トリポプ口ティン（a)ゥサギポリクローナル抗体を感作したラテックス粒 子の分散浮遊液において、 第 2試薬中の抗体の終濃度が約 0. 7mg/mLとなるように 調製した。 また、 塩基性アミノ酸としてアルギニンを反応液中の終濃度としてそ れぞれ 10、 15、 17%となるように第 1試薬中に添加した （第 2試薬中濃度は 30%) 。
測定条件および測定する試料は実施例 1と同様であった。
結果、 反応液中のアルギニン濃度が 10%の場合、 酵素免疫測定法との相関性よ り求めた回帰直線から乖離する検体が認められるが、 15%および 17%の場合、 酵 素免疫測定法との相関性より求めた回帰直線から乖離する検体は見られなかった。 図 1に各アルギニン濃度における対照測定法における測定値と、 ラテックス凝集 法における測定値の相関を示す。 また図 2には、 各表現型の検体の回帰直線から の乖離を示す。
試薬中のアルギニン濃度を調整することにより、 酵素免疫測定法と測定値を一 致させることが可能であることを確認した。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。 産業上の利用可能性
実施例に示すように、 ラテックス免疫比濁法において、 反応系に添加する抗体 量を多くし、 さらに反応系に一定濃度の塩基性ァミノ酸を添加することにより、 多彩な表現型が存在するヒ トリポプ口ティン（a)の表現型の違いによる測定値の 変動を回避することができる。
本発明により、 多様な表現型を有する抗原を測定する場合に、 酵素免疫測定法と 測定値の相関性に優れ、 かつ自動分析装置で迅速 ·簡便に測定することが可能と なる。

Claims

請求の範囲
1 . 複数のフヱノタイプが存在するリポプ口ティン（a)の抗原抗体反応を利 用したラテックス免疫比濁測定法を用いた検出において、 測定系に添加するリポ プロテイン（a)に対する抗体量を調節し、 かつ測定系に塩基性アミノ酸を添加す ることにより、 各フエノタイプの種類による測定値の変動を回避し、 生体試料中 のリポプ口ティン（a)を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関
を有する測定値を得られる、 抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定法。
2 . 添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において 0. 16mg/mL以上 である請求項 1記載の方法。
3 . 添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において 0. 16mg/mL以上 0. 23mg/mL以下である請求項 2記載の方法。
4 . 添加する塩基性ァミノ酸量が抗原抗体反応時の反応溶液において 15重 量％以上である請求項 1から 3のいずれか 1項に記載の方法。
5 . 塩基性ァミノ酸の添加量が抗原抗体反応時の反応溶液において 15重量％ 以上 17重量％以下である請求項 4記載の方法。
6 . 塩基性アミノ酸がアルギニンである請求項 1から 5のいずれか 1項に記 載の方法。
7 . フエノタイプが存在するリポプロテイン（a)の抗原抗体反応を利用した ラテックス免疫比濁測定法を用いた検出試薬であって、 試薬中に抗原抗体反応時 の反応溶液中の抗体量が 0. 16mg/mL以上となる分だけのリポプロテイン（a)に対す る抗体、 および試薬中に抗原抗体反応時の反応溶液中の塩基性アミノ酸量が 15重 量％以上となる分だけの塩基性アミノ酸を含む、 各フヱノタイプの種類による測 定値の変動を回避し、 生体試料中のリポプロテイン（a)を分子単位で測定した場 合の測定値と高い相関を有する測定値を得られる、 抗原抗体反応を利用したラテ ックス免疫比濁測定用検出試薬。
8 . 添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において 0. 16mg/mL以上 0. 23mg/mL以下である請求項 7記載のラテックス免疫比濁測定用検出試薬。
9 . 添加する塩基性ァミノ酸量が抗原抗体反応時の反応溶液において 15重 量％以上 17重量％以下である請求項 7または 8に記載のラテックス免疫比濁測定 用検出試薬。
1 0 . 塩基性アミノ酸がアルギニンである請求項 7から 9のいずれか 1項に 記載のラテツクス免疫比濁測定用検出試薬。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011034678A1 (en) * 2009-09-21 2011-03-24 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Use of superhydrophobic surfaces for liquid agglutination assays
CN101833010B (zh) * 2010-03-29 2013-02-13 上海太阳生物技术有限公司 纤维蛋白(原)降解产物(fdp)测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)
CN103604930B (zh) * 2013-11-07 2015-11-18 北京利德曼生化股份有限公司 一种脂蛋白(a)检测试剂盒
JP6277099B2 (ja) * 2014-09-09 2018-02-07 富士フイルム株式会社 試薬キット、測定キット及び被検物質の測定方法。
CN105675872A (zh) * 2014-11-21 2016-06-15 上海科华生物工程股份有限公司 脂蛋白(a)定量测定试剂盒及其使用方法和应用
CN104407154B (zh) * 2014-12-05 2016-03-30 重庆中元生物技术有限公司 一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法试剂盒
CN105675891A (zh) * 2016-01-26 2016-06-15 宁波天康生物科技有限公司 脂蛋白a(Lp(a))测定试剂盒
EP3574324A2 (en) 2017-01-27 2019-12-04 Roche Diagnostics GmbH Methods for modulating signal intensity in interaction assays

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1073595A (ja) * 1996-09-02 1998-03-17 Masao Karube 免疫学的反応性物質の存在を検出又は測定する方法及びそれに用いる試薬
JPH11108929A (ja) * 1997-08-11 1999-04-23 F Hoffmann La Roche Ag 微粒子増強光分散凝集測定法
JP2002048796A (ja) * 2000-08-04 2002-02-15 Shima Kenkyusho:Kk 免疫学的反応性物質の存在を検出又は測定する方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU543007B2 (en) * 1980-04-15 1985-03-28 Technicon Instruments Corportion Agglutination immunoassay
JPS57182169A (en) * 1981-05-02 1982-11-09 Mitsubishi Chem Ind Ltd Measuring method for antigen-antibody reaction
DE3734015A1 (de) * 1987-10-08 1989-04-20 Behringwerke Ag Diagnostisches mittel und verfahren zur bestimmung von apolipoprotein b
ES2258870T3 (es) * 1998-11-18 2006-09-01 Zlb Behring Gmbh Preparados proteicos estabilizados para un adhesivo para tejidos.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1073595A (ja) * 1996-09-02 1998-03-17 Masao Karube 免疫学的反応性物質の存在を検出又は測定する方法及びそれに用いる試薬
JPH11108929A (ja) * 1997-08-11 1999-04-23 F Hoffmann La Roche Ag 微粒子増強光分散凝集測定法
JP2002048796A (ja) * 2000-08-04 2002-02-15 Shima Kenkyusho:Kk 免疫学的反応性物質の存在を検出又は測定する方法

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