CN86107584A - 用於色谱分离的磷酸钙型羟基磷灰石及其生产方法 - Google Patents

Abstract

用于色谱分离的磷酸钙型羟基磷灰石是具有平 均粒径为0.5—50微米，最好为1—10微米的球粒。球 粒主要是属六方晶系的针状微晶聚集体，对a轴的单 元晶格常数是9.58±0.08，对C轴为7.00±0.05。 羟基磷灰石是将胶状磷酸钙型磷灰石粒化，然后在 氧气或空气存在下，于400—700℃最好500—600℃ 下焙烧一给定时间而完成的。

Description

本发明涉及色谱分离用的磷酸钙型羟基磷灰石及其生产方法。

特别是，本发明涉及一种新的、具有特种晶体参数的磷酸钙型羟基磷灰石，並在生物聚合物的分离中可用作柱填充材料。

术语磷灰石-结构化合物，一般常常是指具有通式M₁₀（ZO₄）₆·X₂的一大组化合物，其中M代表一金属原子，如Ca、Ba、Sn、Mg、Na、K、pb、cd、Zn、Ni、Fe、Al……或诸如此类，ZO₄代表一种酸基团，如PO₄、A₅O₄、VO₄、SO₄或SiO₄，而X代表-OH或F原子（基团）。本发明是指具有上述通式的磷酸钙化合物，其中M主要是Ca，ZO₄主要是PO₄，而X主要是OH。

磷酸钙型羟基磷灰石，Ca₁₀（PO₄）₆（OH）₂（以下除了另有注明外，都称为“羟基磷灰石”），作为生物医学材料用，代表性的是人造牙和骨，在近年来日益受人注意。这是因为，就成分而言，它很相似於脊椎动物的牙和骨的无机组成，並且对有生命体具有很好的亲和力。对活生物体的亲和力使得它在色谱分离生物聚合物，如蛋白质、酶和核酸中可用作充填色谱柱的填充材料。

按常规，这种羟基磷灰石大都是按下面的方法合成：

（1）使用水溶液反应的湿法合成，其中，一种水溶性钙盐和磷酸盐在水溶液中进行反应;

（2）使用高温固相反应的干法合成，其中，磷酸钙和碳酸钙在900°～1400℃条件下，在有水蒸汽存在时进行反应;

（3）使用在高温、高压水蒸汽的条件下反应的水热合成，其中磷酸氢钙，例如在200℃和15个大气压条件下，就进行水解。

除此之外，例如在专利申请公告No    500447/1980年，还提出了一种新的合成方法。

在上述方法制得的羟基磷灰石是呈片状的、尤其在色谱分离中用作填充材料时，就必须很好地分碎。

这样，片状就分成不同形状，不同大小的小块。不规则块状的羟基磷灰石不能均匀地或致密地充填色谱分离用的色谱柱。这样得到的填充材料是难於设想能满足於可分离性和选择性两者的性能。

为努力克服一般羟基磷灰石，在色谱分离中，用作柱填充材料的困难，我们做了广泛的研究和实验。结果，现在发现，当这样一种羟基磷灰石在色谱分离中，用作填充材料时，很好分碎的产品结构的大小和形状是非常重要的因素，特别是，形状必须是球形的，粒度大小的分布也必须在狭小的范围内，此外，具有平均粒径为0.5～50微米，最好是1～10微米的球粒状羟基磷灰石能达到合适的可分离性和选择性。

本发明是根据这些新发现的事实。

由于到目前为止提供的羟基磷灰石在色谱分离生物聚合物中用作柱填充材料时，具有很不合适的可分离性和选择性，因此，本发明的目的是提供一种用於色谱分离的，具有同样形状和大小的，並擅长於可分离性和选择性的、新型磷酸钙型磷灰石。

简言之，本发明提供一种用於色谱分离、具有平均粒径为0.5～50微米，最好为1～10微米的球粒状磷酸钙型磷灰石。

这样一种羟基磷灰石能满意地如下生产：将胶体状的磷酸钙型羟基磷灰石粒化，然后在400°～700℃温度范围下将粒状磷灰石焙烧。

图1到图3是液体色谱图，指出了，按发明制备的羟基磷灰石比现有技术中的羟基磷灰石，在可分离性方面，是有明显的改进。

本发明是属於一种用於色谱分离的，具有平均粒径为0.5～50微米，最好为1～10微米的球粒状磷酸钙型羟基磷灰石。我们现在揭示的另一个研究是具有以下晶体参数的羟基磷灰石，即该晶体结构是属六方晶系，有P63/m的空间群，对a轴是9.58±0.08

的单元晶格常数，对c轴是7.00±0.05

，当在色谱分离，尤其是在生物聚合物分离中用作柱填充材料时，能经常不变地保持合适的可分离性和选择性。

具有所要求的，独特的晶体参数的羟基磷灰石现在将详细描述於下。

这里所用的，术语“单元晶格”意思是一个晶胞作为一个晶体最小的可重复的单元，其中原子，原子群和分子是有规则地按三维空间排列。晶胞的几何对称性是由晶系和空间群表示，而晶胞的大小由晶格常数表示。磷灰石结构化合物的晶胞是由六方晶系的晶格表示，例如，用Ca²⁺、PO^3- ₄或OH^-排列其中。

已揭示的磷灰石结构化合物的单元晶格常数，例如磷酸钙型羟基磷灰石，a轴是9.432

，c轴是6.881

。

作为本发明优选方案的羟基磷灰石，相形之下，a轴的单元晶格常数是9.58±0.08，而c轴是7.00±0.05。这样，根据本发明结构的羟基磷灰石，与现有技术的那些比较，在晶体参数方面是完全不相同的，而是一种新的，在现有技术中是未知的。

单元晶格常数可以用X-射线衍射技术测定，更具体地说，根据粉末X-射线衍射法测定衍射角（Bragg角）。衍射角可以由备有衍射计（用Cuk_αX-射线）的X-射线衍射仪所自动记录在图中的X-射线衍射花样来得到。此外，由布勒格（Bragg）方程式λ＝2α sinθ，其中λ是Cuk_α射线的波长（1.54184

），可以求得以埃表示的点阵间距d（

）。羟基磷灰石的晶系是六方晶系，当放在粉末X-射线衍射行列，JCPDS（粉末衍射标准联合委员会Joint Committee on powder Diffraction Standard）9-432上，对每个点阵间距d（ ）都给出密勒（Miller）指数。点阵间距d（ ），是由晶格常数a和c以及由密勒指数（hkl）按下式表示：

$\mathrm{d=}\frac{1}{\sqrt{{\mathrm{(4/3a}}^2{\mathrm{)(h}}^2{\mathrm{+k}}^2{\mathrm{+hk)+(l}}^2{\mathrm{/c}}^2)}}$

利用布勒格方程式，可以写成：

Sin²θ＝ 1/3 （ (λ)/(a) ）²（h²+k²+hk）+（ (λ)/(2c) ）²l²

作为本发明优选方案的羟基磷灰石，其单元晶格常数a和b，是由六方晶系的理论方程式，利用由X-射线衍射仪测得的各个衍射线的布勒格角和已知密勒指数求得的。单元晶格常数a和c的最概值和误差范围是由最小二乘法求得。表1列出了本发明的羟基磷灰石用X-射线衍射测得的点阵间距d（

）。

本发明优选方案的羟基磷灰石，对a轴的单元晶格常数是9.58±0.08

，对c轴是7.00±0.05

，它在生物聚合物，例如蛋白质的分离中具有特别优越的性能。当磷灰石的单元晶格常数不在上面给定的范围内，其分离性能是很低的。

具有特定范围的单元晶格常数（a和c）的本发明羟基磷灰石，尤其在生物聚合物分离中起优越作用的原因，尚待弄清楚。然而，可以说，通常在生物聚合物，例如，诸如DNA这样的核酸或蛋白质的分离中，在羟基磷灰石基质中存在的吸附点和在核酸分子中的磷酰基之间，或吸附点与蛋白质的氨基和羧基基团之间的相互作用起了重要的作用。

这里要指出，在羟基磷灰石的表面，主要呈现二个不同的面，一个平行於晶格ac或bc的面（各称为面b或a），该面在结晶学上是相当的，而一个面是平行於ab面（称为c面）。在晶体a面或b面上排列有吸附点（称为吸附点c），每个由2个带正电荷的钙原子构成，而在晶体的c面上，吸附点（称为点P），每个由6个氧原子构成，该氧原子来自带负电荷的磷酰离子。位於晶体的这些点是有规则地排列，並在单位面积上的存在数是一个常数。由此得出，单元晶格常数a和c（值）是不同的，吸附点c之间和吸附点P之间的距离也是不同的。

如上所述，对生物聚合物的色谱分离来说，羟基磷灰石的吸附点和生物聚合物的各种功能团之间的相互作用是重要的，显然，吸附点c之间和吸附点P之间或者这些吸附点之间的距离是影响诸如生物聚合物的吸附或解吸这样的相互作用。在这些吸附点之间必须具有适当的距离。认为，具有符合本发明单元晶格常数的羟基磷灰石是满足上述条件，並能出色地在生物聚合物分离中使用。

作为本发明优先方案的羟基磷灰石是具有这种独特的晶体参数，要求有这样的组成，即Ca对P的原子比，或Ca/p，是在1.5～1.9的范围内。

在色谱分离中，用作柱填充材料的本发明的羟基磷灰石具有特效的吡啶吸附，此外，还具有特定的，如上所定义的单元晶格常数。我们的研究还揭示了，羟基磷灰石在每克能吸附0.003～0.01毫摩尔的吡啶时，在生物聚合物的分离中能卓越地使用。这估计归因於酸量的控制，在功能团OH^-、Ca²⁺和PO^3- ₄中，尤其是OH^-功能团，在羟基磷灰石基质和核酸中的磷酰基之间的作用或在基质和蛋白的氨基和羧基之间的作用中，如上所述，起有极重要的作用。

吡啶吸附主要是通过基於上述功能团的固体酸量来表示。如果吡啶吸附少於0.003毫摩尔/克，则羟基磷灰石在实际使用中就具有太低的蛋白质分离能力。如果吡啶吸附超过0.01毫摩尔/克，则分离的实施又不合适。

作为本发明优选方案的羟基磷灰石，取主要由小针状晶体构成的微晶聚集体的形式。其尺寸是100～500

的宽和500～3000

的长度。根据本发明，针状微晶是易於粒化成球粒，该球粒具有平均粒径为0.5～50微米，最好是1～10微米的微晶聚集体。粒化成球粒使它具有增加机械强度的优点，並在分离柱内能更均匀地填充。

能用色谱法分离的蛋白质的例子是免疫球蛋白G、反式土曲酶酮、骨髓瘤免疫球蛋白D、血清白蛋白和卵清蛋白。

根据本发明的羟基磷灰石的生产方法，现将描述如下。

本发明的方法是将胶状或粉状的羟基磷灰石，在400～700℃的温度下焙烧而成，该胶状或粉状羟基磷灰石是由上面简述的，一般的，使用溶液反应的湿法，使用高温固相反应的干法或使用水解的水热法制得。最好的本发明方法是将胶状的羟基磷灰石粒化，然后在400～700℃温度下焙烧粒状的羟基磷灰石。

我们广泛地研究了有关磷灰石结构化合物的晶体参数和焙烧温度之间的关系。结果发现，磷灰石结构化合物的单元晶格常数随着焙烧温度的上升而增加，约在600℃的瞬间达到极大，然后转而随着温度超过该点继续上升而下降。本发明是根据这个发现的。

用於这里的“胶状磷灰石”的说法意思是指一种悬浮体或淤浆，羟基磷灰石的针状微晶是以水或含有钙离子，磷酸等的水溶液悬浮或成浆。这可以用任何上述的合成羟基磷灰石的方法制备。同时，胶状羟基磷灰石也可以用在水溶液中分散或混和粉末微晶而制得。

粒化羟基磷灰石胶体的一种合意的方法是用喷雾干燥。喷雾干燥是将羟基磷灰石的悬浮体或淤浆喷入高温空气流中、因而立即干燥。至於喷雾干燥的条件，悬浮体或淤浆的浓度是0.1～20%（重量），最好是1～10%（重量），高温空气流的温度是100～200℃，最好是110～170℃。喷咀的结构、空气的量和其他条件可以按要求适当选用。实验表明，粒化生产的产品的粒径，控制在约0.5～约50微米范围内，最好控制在约1～约20微米内。发现，合适的粒化可以给出甚至更狭范围约1～约10微米粒径的球粒。

在本发明的方法中，焙烧是将胶状或粉状羟基磷灰石在加热区内加热到予定温度，然后保持在同样温度而进行的。焙烧温度是在400～700℃的范围内，最好是在500～600℃，焙烧时间並不严格，但一般是0.1～20小时，最好是1～3小时。理想的焙烧是在有氧或空气存在的条件下进行。干燥条件没有特定的限制，但在80～120℃下加热0.1～10小时，一般可以得到好的结果。

用上述方法焙烧胶状的起始磷灰石所得到的这种羟基磷灰石在现有技术中是没有的化合物，它是新型的，具有下列特定的单元晶格常数和性质：

粒径，微米    0.5-50

Ca/p比    1.5-1.9

粒状    球形（针状微晶聚集体）

吡啶吸附，毫摩/克.    0.003-0.01

以下，本发明用下列实例进行说明。

例1

在一个一升的三颈瓶中加入氢氧化钙悬浮体（由15.6克的95%Ca（OH）₂和400克蒸馏水组成）。注入氮气並剧烈搅拌，慢慢加入磷酸水溶液（由13.8克85%H₃PO₄和400克蒸馏水组成），加完后，再加入含水磷酸以调节pH值到8.2。将混合液放置在油浴上，並在90℃保持约18小时。得到一种含产品的白色微晶或胶态羟基磷灰石。

冷却后，部分产品用喷雾干燥器制成粒径为约1～约10微米的球形颗粒或微晶聚集体。

产品在100℃进行干燥，並在580℃焙烧制成用於分离柱的颗粒。用颗粒的X-射线衍射测得的点阵间距列于表1。颗粒的参数值如下：

（1）用X-射线衍射测定的单元晶格常数：

a＝9.58

c＝7.01

（2）吡啶吸收＝0.0056毫摩尔/克

（3）Ca/p比＝1.67

X-射线衍射是用由Rigaku    Denki公司生产的“RAD-rD”型的仪器进行测定的。所用的测定条件如下：

功率输出＝40KV，30mA Cuk_α.

DS/RS/SS＝1/6℃/0.15毫米/1/6℃

给定时间间隔＝0.1秒

步距＝1/100

表1

密勒指数 点阵间距d（

）

h·K·l    实例1、    实例2、    实例3、

002    3.503    3.480    3.495

102    3.227    3.206    3.219

210    3.137    3.113    3.128

211    2.863    2.842    2.855

112    2.828    2.808    2.820

300    2.767    2.745    2.757

202    2.677    2.658    2.669

301    2.573    2.554    2.506

212    2.337    2.320    2.330

310    2.302    2.284    2.294

222    1.778    1.983    1.971

312    1.924    1.910    1.918

213    1.873    1.860    1.868

吡啶吸附是按下法测定：

将粒径为1～10微米的粒化的羟基磷灰石用一压力镇压器轻轻压实。压块在玛瑙研钵中磨成30～100筛孔大小的细粉。正确称取0.075克的磨过的磷灰石並装入柱式样品管，在氮气氛中，100℃条件下干燥。同时，将含有吡啶的扩散器浸入保持在15.5℃恒温的水浴中，鼓入氮气泡，使装在反应器中的羟基磷灰石在100℃吸附吡啶15分钟。然后，在氮气流中将温度慢慢增加到200℃，然后保持该温度以引起物理吸附的含量解吸，用氢离子监测型的气体色谱法，可以肯定不再有吡啶的解吸可检出。然后，按5℃/分的速度将温度由200℃升高到950℃。从而用气体色谱法测定了吡啶解吸量。测得的所除去的吡啶量可作为吡啶的吸附量。

例2

将例1所用的同样材料用於在同样反应条件下制备颗粒。颗粒产品在100℃干燥，然后在400℃焙烧3小时。用X-射线衍射测定焙烧过的颗粒的点阵间距列于表1。

产品的参数值如下：

（1）单元晶格常数：

a＝9.51

c＝6.96

（2）吡啶吸附＝0.0092毫摩尔/克

（3）Ca/p比＝1.67

例3

使用在例1中所用的同样材料和同样反应条件制备颗粒。产品在100℃干燥並在700℃焙烧3小时。用X-射线衍射测定颗粒的点阵间距列于表1

参数值如下：

（1）单元晶格常数：

a＝9.55

c＝6.99

（2）吡啶吸附＝0.0038毫摩尔/克

（3）Ca/p比＝1.67

参考例

将在例1-例3中所得到的羟基磷灰石用於细胞色素c，溶菌酶和牛的血清白蛋白的混合物的样品分离。色谱分离操作所用的条件如下：

液体色谱仪：

由Wafers公司生产的“LC244”型

溶剂（梯度溶液）

磷酸钠水溶液（pH6.8）

0.01-0.3摩尔/小时梯度。

流速：

0.8毫升/分

样品量：

各100微升（例2的羟基磷灰石是用50微升）

检测器：

由日本光谱公司（Specfroscopic    Co）生产的“UVDEC-100-Ⅲ”型

检测波长＝280毫微米

色谱记录：

自动记录图速率＝2.5毫米/分

结果用图示法列于图1-3。能清楚看到，根据本发明制备的羟基磷灰石具有比已知羟基磷灰石大得多的分离能力。

在细胞色素C的分离中求得理论塔板数以便测定分离能力。所得结果列于表2。对发明来说，术语“理论塔板数”是根据在色谱仪中的分辨时间（tR）和色谱图中的半宽度由以下方程式计算出来的：

N（理论塔板数）＝16（tR/ω）²

表2

例

1    2    3

Ca/p比    16.7

点阵空间常数

a（

） 9.58 9.51 9.55

c（

） 7.01 6.96 6.99

吡啶吸附    0.0056    0.0092    0.0038

（毫摩尔/克）

在细胞色素c分离    14000    13000    11000

的理论塔板数    ～20000

根据本发明的羟基磷灰石具有独特的形状、大小和晶体参数，並在色谱分离生物聚合物，如蛋白质中作为柱填充材料是十分有用的，在色谱分离性方面获得显著的改进。

Claims (10)

1、用於色谱分离的磷酸钙型羟基磷灰石是具有平均粒径为0.5-50微米的球粒。

2、按权利要求1的用於色谱分离的磷酸钙型羟基磷灰石，其特征在于，球粒的平均粒径是1-10微米。

3、按权利要求1或2的用於色谱分离的磷酸钙型羟基磷灰石，其特征在于，球粒各为主要是针状微晶的聚集体，微晶属六方晶系，並对a轴的单元晶格常数是9.58±0.08

，而对c轴为7.00±0.05

。

4、按权利要求1-3的任一项用於色谱分离的磷酸钙型羟基磷灰石，其特征在于，吡啶吸附是在0.003-0.01毫摩尔/克。

5、按权利要求1-3的任一项磷酸钙型羟基磷灰石，其特征在于，羟基磷灰石的Ca/p比是在1.50-1.90的范围内。

6、生产用於色谱分离的磷酸钙型羟基磷灰石的方法包括粒化胶状磷酸钙型羟基磷灰石，然后在400°-700℃的范围内焙烧粒状磷灰石。

7、按权利要求6的方法，其特征在于，焙烧温度是在500°-600℃的范围内。

8、按权利要求6或7的方法，其特征在于，焙烧粒状磷酸钙型羟基磷灰石是在有氧气或空气存在下，加热颗粒一给定的时间而实施的。

9、按权利要求6-8的任一项方法，其特征在于，颗粒的平均粒径为0.1-50微米。

10、按权利要求9的用於色谱分离的磷酸钙型羟基磷灰石，其特征在于，颗粒的平均粒径为1-10微米。

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