CN109803736A - 琼脂糖填充的陶瓷磷灰石 - Google Patents

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Abstract

提供了聚合物填充的陶瓷磷灰石及其用途。

Description

琼脂糖填充的陶瓷磷灰石
本申请要求2016年9月29日提交的美国临时申请62/401,560的权益，该申请通过引用整体并入本文。
背景技术
目前，从较小杂质中纯化病毒，与大颗粒偶联的蛋白质和其他生物大分子涉及使用多种分离方法，包括但不限于尺寸排阻色谱(SEC)，离子交换色谱(IEX)，疏水相互作用色谱(HIC)和/或离心。SEC要求填充昂贵的尺寸排阻树脂的大柱，低流速和有限的样品载量。IEX和HIC的选择性有限。离心仅可应用于与悬浮生物分子的培养基相比相对致密的生物大分子。
发明内容
本文提供包含不溶性多孔聚合物的陶瓷磷灰石珠。在一些实施方式中，聚合物是琼脂糖。在一些实施方式中，琼脂糖不是交联的。在一些实施方式中，琼脂糖的浓度范围为约1％至约8％。
在一些实施方式中，陶瓷磷灰石是陶瓷羟基磷灰石。
还提供了一种色谱柱，其包含含有不溶性多孔聚合物的多个陶瓷磷灰石珠，例如，如上文或本文其他地方所述。
还提供了制备含有不溶性多孔聚合物的陶瓷磷灰石珠的方法，例如，如上文或本文其他地方所述。在一些实施方式中，该方法包括在加热的聚合物溶液中孵育陶瓷磷灰石；并且将具有陶瓷磷灰石的加热的聚合物溶液冷却至约4℃至约30℃之间，以在陶瓷磷灰石的孔内形成不溶性多孔聚合物凝胶。在某些实施方式中，孵育步骤使聚合物吸收或以其他方式进入陶瓷磷灰石的孔中。在一些实施方式中，加热的聚合物溶液的温度为约100℃。在某些实施方式中，加热的聚合物溶液包含足够浓度的聚合物以进一步涂覆陶瓷磷灰石的外表面。在一些实施方式中，聚合物是琼脂糖，并且琼脂糖的浓度大于约1％，2％，3％或4％。在一些实施方式中，琼脂糖的浓度为约4％。在一些实施方式中，在冷却步骤之前除去过量的聚合物。在某些实施方式中，孵育步骤包括在搅拌下将加热的有机溶剂和非离子洗涤剂加入到加热的聚合物溶液中。在一些实施方式中，有机溶剂至少部分地与水不混溶并且相对于加热的聚合物溶液中的聚合物是化学惰性的。在一些实施方式中，有机溶剂是异链烷烃(例如Isopar H)。在一些实施方式中，加热的有机溶剂的温度为约60℃至约80℃。在一些实施方式中，非离子型洗涤剂选自脱水山梨糖醇衍生物，乙氧基化烷基酚和聚乙氧基化酯。在一些实施方式中，脱水山梨糖醇衍生物是脱水山梨糖醇酯(例如司盘80)或聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯。
还提供了进行色谱法的方法。在一些实施方式中，该方法包括使包含靶分子的样品在使该靶标不被陶瓷磷灰石珠捕获的条件下与包含不溶性多孔聚合物的多个陶瓷磷灰石珠接触，所述陶瓷磷灰石珠例如本文所述；并从陶瓷磷灰石珠中收集靶分子。在一些实施方式中，样品包含被陶瓷磷灰石珠捕获的污染物。在一些实施方式中，靶分子是蛋白质-纳米颗粒偶联物，并且污染物是游离的(未偶联的)蛋白质。在一些实施方式中，样品包含蛋白质-纳米颗粒偶联物，游离蛋白质和缓冲剂。在一些实施方式中，样品还包含表面活性剂(例如，聚亚烷基二醇或Pluronic F-68)。在某些实施方式中，收集步骤包括从陶瓷磷灰石珠中收集富含靶分子的一个或多个级分。在一些实施方式中，收集步骤包括向陶瓷磷灰石珠施加离心力或真空，并从陶瓷磷灰石珠中收集富含靶分子的一个或多个级分。在一些实施方式中，所述蛋白质是抗体。在一些实施方式中，所述蛋白质是IgG抗体。在某些实施方式中，蛋白质-纳米颗粒偶联物是蛋白质-聚合物点偶联物。在一些实施方式中，样品还包含游离纳米颗粒，并且陶瓷磷灰石珠将游离纳米颗粒与偶联物分离。
附图说明图1是显示标准陶瓷羟基磷灰石(CHT)和琼脂糖填充的CHT的相似选择性的重叠色谱图。
发明详述
本发明人已经发现了一种具有多模式特性的新型聚合物填充陶瓷磷灰石，即尺寸排阻模式和捕获模式。本发明人还发现可以将不溶性多孔聚合物引入陶瓷磷灰石中而不显著影响陶瓷磷灰石选择性或结合能力。
定义
术语“羟基磷灰石”是指包含结构式为Ca10(PO4)6(OH)2的不可溶的磷酸钙的羟基化矿物。羟基磷灰石色谱树脂被认为是多模式树脂，因为它具有与生物分子的多种相互作用模式。其相互作用的主要模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和性。羟基磷灰石可以各种形式商购获得，包括但不限于陶瓷羟基磷灰石，其是羟基磷灰石的化学纯形式，其在高温下烧结以将其从结晶形式改变为陶瓷形式。陶瓷羟基磷灰石的形状为球形，粒径为约10微米至约100微米，并且通常可以20微米，40微米和80微米的标称直径获得。陶瓷羟基磷灰石(或CHT)是大孔的，并且有两种类型：I型，具有中等孔隙率和相对高的结合容量，和II型，具有较大的孔隙率和较低的结合容量。该段中所有的磷灰石基树脂均可从生物辐射实验室公司(Bio-Rad Laboratories，Inc.)(美国加利福尼亚州赫尔克里斯(Hercules))获得。
术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段形式。该术语包括但不限于：源自人或其它哺乳动物细胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM型的多克隆或单克隆抗体，包括天然形式或遗传修饰形式，如人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、移接和体外生成的抗体。“抗体”包括复合形式，包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白。“抗体”也包括抗体片段，如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc和其它组合形式，无论它们是否保留抗原结合功能。
术语“蛋白质”用于指氨基酸聚合物或一组两种或更多种相互作用或结合的氨基酸聚合物。该术语可应用于某种氨基酸聚合物，在所述氨基酸聚合物中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人工化学模拟物，以及天然产生的氨基酸聚合物(含有经修饰的残基的聚合物)和非天然产生的氨基酸聚合物。
术语“样品”是指含有希望纯化的靶分子的任何组合物。在一些实施方式中，待纯化的靶分子是蛋白质-纳米颗粒偶联物(例如，抗体-纳米颗粒偶联物)或病毒。
术语“污染物”是指待从样品中除去的任何杂质。在一些实施方式中，样品是抗体-纳米颗粒偶联物和未反应组分的偶联反应混合物，并且污染物是未偶联的(未反应的或游离的)抗体(和任选地未偶联的纳米颗粒)。
文中所用的术语“一个”、“一种”和“该”是指“一个或多个”。如本文中所用，术语“约”是指所列的数字以及所列数字10％范围内的任何值。因此，“约5”是指在4.5-5.5之间的任何值，包括4.5和5.5。
聚合物填充的陶瓷磷灰石
可以使用各种聚合物填充陶瓷磷灰石。在一个实施方式中，聚合物是不可溶的，使得色谱的水性条件在色谱过程中不从陶瓷磷灰石中除去聚合物。在实施方式中，聚合物是足够多孔的，使得填充陶瓷磷灰石不会阻止大分子(例如，蛋白质，核酸等)与陶瓷磷灰石内的位点相互作用，从而基本上保持陶瓷磷灰石的选择性和结合容量。陶瓷磷灰石是多孔的并且允许靶分子至少部分地通过磷灰石中的孔与陶瓷磷灰石相互作用。因此，聚合物不应显著干扰这种相互作用。
在一些实施方式中，聚合物是琼脂糖。通过将琼脂糖加热至均匀密度并将加热的琼脂糖溶液与陶瓷磷灰石混合，可以将琼脂糖(例如1-8％)引入陶瓷磷灰石中。在一些实施方式中，将琼脂糖溶液加热至约100℃。在某些实施方式中，将琼脂糖溶液从约60℃加热至约100℃。
在一些实施方式中，将加热的有机溶剂和非离子型洗涤剂加入到加热的聚合物溶液中，同时搅拌以产生稳定的悬浮液并防止孔填充的陶瓷磷灰石颗粒聚集。在一些实施方式中，有机溶剂与水相对不混溶并且相对于加热的聚合物溶液中的聚合物是化学惰性的。在某些实施方式中，有机溶剂是异链烷烃(例如，Isopar C，Isopar E，Isopar G，Isopar H，Isopar K，Isopar L，Isopar M和/或Isopar V)。在一些实施方式中，非离子型洗涤剂是脱水山梨糖醇衍生物，乙氧基化烷基酚和/或聚乙氧基化酯。在某些实施方式中，脱水山梨糖醇衍生物是脱水山梨糖醇酯(例如，司盘20，司盘40，司盘60，司盘80，司盘83，司盘85和/或司盘120)和/或聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯(例如，吐温20，吐温40，吐温60，吐温65和/或吐温80)。
在一些实施方式中，加热的琼脂糖溶液中的琼脂糖具有足够的浓度(例如，大于约1％，2％，3％或4％的琼脂糖)以填充陶瓷磷灰石的孔并涂覆陶瓷磷灰石的外部。随后可以通过用正或负(例如真空)压力过滤除去过量的琼脂糖溶液。珠内的琼脂糖溶液在低于约40℃的温度下形成不溶性凝胶。
在一些实施方式中，琼脂糖将不是交联的。例如，如实施例中所述，琼脂糖以未交联的形式引入陶瓷磷灰石中。然而，在一些实施方式中，在琼脂糖填充陶瓷磷灰石后引入交联剂。因此，在一些实施方式中，陶瓷磷灰石内的琼脂糖将是交联的。
通常，琼脂糖将不被官能化。因此，在一些实施方式中，在色谱过程中琼脂糖将不被修饰以与样品的组分相互作用，从而提供与不含聚合物的陶瓷磷灰石基本相同的选择性。在其他实施方式中，琼脂糖将被官能化。例如，琼脂糖可以用例如混合模式配体，离子交换配体和/或亲和性官能团官能化。
适用于色谱法的各种磷灰石可用于本文所述的方法和组合物中。在一些实施方式中，可以使用1型或II型陶瓷磷灰石(即，可以使用任一孔隙率)。任何特定蛋白质分离或纯化的最佳孔隙率将随着蛋白质或源混合物的组成而变化。
聚合物填充的陶瓷磷灰石可以以填充床的形式用作色谱固相，并且可以构成整个填充床或填充床的主要部分，例如50％体积或更多。填充床可以保留在任何构造的容器中，并且在树脂中进行的纯化以及清洁和再生都可以间歇方法，连续方法或混合批次/连续方法进行。在一个实施方式中，容器是具有相对于宽度的适当长度的柱，并且合适的方法包括连续方法，例如连续流过柱。
珠具有尺寸排阻模式和捕获模式。尺寸排阻模式基于它们的尺寸或分子量来分离分子，复合物或颗粒。珠具有这样的孔，使得超过尺寸阈值的分子，复合物或颗粒无法进入孔中并被收集在空隙体积，排除体积或色谱柱流穿物中。较小的蛋白质和其他分子可以进入珠的孔并被珠捕获。如本文所用，珠的分子量截留尺寸是指能够进入孔的蛋白质或分子的大致尺寸。例如，分子量截留尺寸(或尺寸排阻限)为50000道尔顿(或50kDa)意味着大小约为50kDa或更小的分子可以进入介质的孔隙，而大约超过50kDa的分子将被排除在孔之外。随着填充陶瓷磷灰石珠的孔的琼脂糖的百分比增加，孔变小，导致较低的分子量截留尺寸。因此，4％琼脂糖填充珠的截留分子量将小于1％琼脂糖填充珠的截留分子量。
方法
如本文所述的聚合物填充的陶瓷磷灰石可用于色谱法。在一个实施方式中，该方法包括使包含靶分子的样品与如本文所述的多个琼脂糖填充的陶瓷磷灰石珠在使得靶标未被珠捕获的条件下接触。在一个实施方式中，样品包含被陶瓷磷灰石珠粒捕获的污染物。
在将样品施加到聚合物填充的陶瓷磷灰石上之前，基于磷灰石的树脂通常在用于加载样品的缓冲液或盐中平衡。通常，使用与标准陶瓷磷灰石基色谱相同的条件和试剂。可以使用多种缓冲剂或盐中的任何一种，包括具有阳离子如钠，钾，铵，镁和钙的那些，以及诸如氯离子，氟离子，乙酸根，磷酸根和柠檬酸根的阴离子。平衡溶液的pH通常为约6.0或更高，在许多情况下，pH在约6.5至约8.6的范围内或在约6.5至约7.8的范围内。在一些实施方式中，平衡可以在包含Tris或磷酸钠缓冲剂的溶液中进行。磷酸钠缓冲剂可以例如以约0.5mM至约50mM，或约10mM至约35mM的浓度存在。
如上所述，本文所述的色谱步骤可以在常规纯化配置中进行，包括但不限于填充柱和流化床或膨胀床柱，以及任何常规色谱方法，包括用于加载，洗涤和洗脱的分批模式，以及连续或流穿模式。在一些实施方式中，将介质填充在直径范围从小于0.5厘米到大于1米，并且柱高度范围从小于1厘米至大于30厘米的柱中。在一个实施方式中，树脂在旋转柱中提供。将样品施加到旋转柱的顶部并离心或真空迫使样品通过柱。在一些情况下，树脂在色谱柱中提供，将样品施加到柱的顶部并且重力迫使样品通过柱。该柱可以在有或没有压力的情况下从上到下或从下到上运行，并且在该过程中可以反转柱中流体的流动方向。在某些情况下，使液体流动逆转同时保持填充床的填充构造可能是有利的。
本文描述的方法可用于纯化许多类型的靶分子(例如，大靶分子)，包括病毒，天然存在的蛋白质和重组蛋白质。在一些实施方式中，靶分子偶联或附着于报告分子，例如纳米颗粒。在一些实施方式中，靶分子是与纳米颗粒偶联的抗体(例如，IgG)。纳米颗粒是尺寸为纳米级的颗粒，例如约1nm至约1000nm。在一些实施方式中，颗粒在1-300nm，5-500nm或10-50nm之间。许多纳米颗粒的形状大致为球形，形成球形颗粒的半径或直径尺寸。流体动力学半径或直径也可用于限定纳米颗粒尺寸。
在一些实施方式中，纳米颗粒是荧光半导体聚合物点(pdot)。此类pdot的示例描述于例如Wu，C.等，Chem.Mater.21：3816-3822(2009)；Rahim，N.A.A.等，Adv.Mater.21：3492-3496(2009)，Rong等，ACS Nano 7(1)：376-84(2013)；专利公开US 2013/0266957；WO2012/054525；和US 2012/0282632。通过将聚合物塌缩成稳定的亚微米尺寸的颗粒可以产生发色的pdot。本发明提供的pdot纳米颗粒可通过本领域用于塌缩聚合物的任何已知方法形成，包括但不限于，依赖沉淀的方法、依赖乳液(如细乳液(mini emulsion)或微乳液(micro emulsion))形成的方法和依赖缩聚的方法。pdot纳米颗粒尺寸取决于用于产生pdot的聚合物的分子量(参见，例如，Zhang，Y.等，Chem Sci.6(3)：2102-2109(2015)和美国专利9382473)。在一些实施方式中，每种pdot的分子量为约500,000道尔顿至约15,000,000道尔顿，或约1,800,000道尔顿至约7,000,000道尔顿。
可用于本文所述方法的其他示例性纳米颗粒包括但不限于磁性纳米颗粒，量子点和金纳米颗粒。磁性纳米颗粒是一类可以使用磁场梯度操纵的纳米颗粒。磁性纳米颗粒由磁性或顺磁性元素形成，包括但不限于铁，镍和钴及其化学化合物。量子点是由无机半导体材料形成的纳米颗粒。金纳米颗粒(例如，胶体金)具有有助于生物医学应用的光学性质，并且描述于例如Huang，X.等，Journal of Advanced Research 1(1)：13-28(2010)。
可以根据需要将纳米颗粒官能化以将纳米颗粒与蛋白质连接。纳米颗粒的示例性官能化描述于前述美国专利公开号2012/0282632中。作为示例，纳米颗粒可以被官能化以呈现一个或多个羧酸部分，其又可以用于将一个或多个接头连接至蛋白质。偶联物组分(例如，蛋白质和纳米颗粒)可以共价或非共价连接。非共价连接的示例是生物素-链霉亲和素亲和连接，其中偶联物的一个成员是生物素化的，而偶联物的另一个成员与链霉亲和素连接。连接选项的其他示例包括但不限于纳米颗粒与蛋白质胺的直接偶联；用马来酰亚胺修饰纳米颗粒并随后与具有暴露的巯基基团的蛋白质连接(例如通过用巯基乙胺或2-亚氨基硫杂环戊烷(特劳特(Traut′s)试剂)处理蛋白质产生)；用肼修饰纳米颗粒并与具有氧化聚糖(醛)的蛋白质连接；或使用点击化学(例如，用紧张的炔烃修饰纳米颗粒并与用叠氮化物修饰的蛋白质连接)。
可以使用任何类型的偶联方法将蛋白质偶联至纳米颗粒。通常，为了产生所需的偶联物产量，在偶联反应中提供过量的蛋白质。这可以在偶联反应后产生大量游离的(未偶联的)蛋白质。在一些实施方式中，在反应混合物中还存在一定量的游离未偶联纳米颗粒。本文描述的方法可用于从偶联反应的游离未偶联成员中纯化偶联物。在一些实施方式中，施加试剂，其将与剩余的反应性基团反应并防止进一步反应。作为示例，马来酰亚胺官能化的纳米颗粒与硫醇化或还原的蛋白质之间的偶联将用烷基化试剂停止或猝灭，所述烷基化试剂包括但不限于N-乙基马来酰亚胺。附加NHS的纳米颗粒和蛋白质之间的反应将用胺(包括但不限于乙醇胺)停止或猝灭。
一旦进行偶联，就调节所得的偶联混合物(例如，纳米颗粒/蛋白质偶联物，未反应的游离蛋白质和任选的游离纳米颗粒)以建立适当的pH，电导率和/或盐浓度。可以通过例如用色谱树脂平衡缓冲液交换偶联缓冲液来对偶联混合物(即待纯化的样品)进行调节。示例性缓冲化合物包括但不限于磷酸盐，HEPES，MES和Tris。在一些实施方式中，平衡缓冲液包含HEPES，其量为约10mM至约30mM(例如，10mM，20mM或30mM)。在一些实施方式中，平衡缓冲液包含的磷酸盐(PO43-)的量为约5mM至约50mM(例如，5mM，10mM，25mM)。在某些实施方式中，平衡缓冲液的pH范围为约5至约8(例如，约6，约7或约8)。在一些实施方式中，平衡缓冲液包含至少10至100mMNa+或K+(例如，10至150mM，20至200mM，或100至300mM)。在某些实施方式中，平衡缓冲液是pH 7.3的20mM HEPES-KOH。在一些实施方式中，平衡缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS＝10mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH 7.8)。
混合物中还可包含一种或多种表面活性剂。可以包括足够量的表面活性剂以防止偶联物在混合物中聚集和沉淀，特别是在引入高离子强度缓冲液时，否则可能导致偶联物的聚集或沉淀。在一些实施方式中，表面活性剂是非离子型聚亚烷基二醇表面活性剂，例如聚乙二醇。在一些实施方式中，表面活性剂是含聚氧丙烯的表面活性剂，例如泊洛沙姆表面活性剂。泊洛沙姆表面活性剂的特点是，其具有聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))中央疏水链，侧接两条聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链。因为聚合物嵌段的长度可以定制，所以存在许多不同的泊洛沙姆，其具有略微不同的性质。泊洛沙姆共聚物的常用命名采用″P″(表示泊洛沙姆)后跟三个阿拉伯数字，前两个阿拉伯数字×100即是聚氧丙烯芯的大致分子量，最末阿拉伯数字×10即是聚氧乙烯的含量百分比(例如，P407＝这样的泊洛沙姆，其具有4,000g/mol的聚氧丙烯分子量和70％的聚氧乙烯含量)。对于Pluronic和Synperonic泊洛沙姆的商品名，这些共聚物的编码以字母开始，以定义其在室温下的物理形式(L＝液体，P＝糊剂，F＝薄片(固体))，然后是两位或三位数。数字标记中的第一位数(三位数字中的两个数字)乘以300表示疏水链的近似分子量；最后一位数×10给出聚氧乙烯含量百分比(例如，F-68表示聚氧丙烯分子量为1800g/mol，聚氧乙烯含量为80％)。示例性泊洛沙姆表面活性剂包括但不限于Pluronic F-68。所用表面活性剂的浓度可凭经验确定(即，滴定使得不发生偶联物的沉淀)。在一些实施方式中，表面活性剂的浓度为0.02％-1％，例如0.05-0.2％，例如0.1％。
在将样品(例如，偶联物混合物)与琼脂糖填充的陶瓷磷灰石珠接触之前，可以平衡珠以建立适当的pH，电导率和/或盐浓度。
在将样品与琼脂糖填充的陶瓷磷灰石珠接触后，将靶分子(例如，蛋白质-纳米颗粒偶联物)从珠的填充琼脂糖的孔中排除，并在来自珠的流穿物中收集。污染物，例如游离抗体(和任选未偶联的纳米颗粒)被珠的孔中的陶瓷磷灰石基团捕获。
可以根据需要监测珠的输出物是否存在靶分子或样品的其他组分，以确定含有靶分子并且与原始样品相比无污染物或至少具有减少量的污染物的级分。在一些实施方式中，在所得纯化的靶分子级分中除去样品中至少90％，95％，99％的污染物。用于测量输出物的示例性方法包括监测靶分子的特征吸收波长。术语“级分”用于表示色谱输出物的一部分，并不旨在限制输出物的收集方式或输出物是部分收集还是连续收集。
实施例
实施例1-琼脂糖填充的陶瓷磷灰石(CHT)的选择性和结合容量
该实施例的目的是通过用琼脂糖填充CHT的孔来确定CHT的选择性和结合容量是否改变。
1％琼脂糖填充的CHT的制备
通过将0.5g琼脂糖(Hispanagar D5 High Gel Strength)溶解在100℃的50ml水中制备1％琼脂糖溶液。将10ml干燥CHT(Bio-Rad II型)和15ml热琼脂糖溶液在100ml烧瓶中混合，然后对混合物施加真空几秒钟以除去圈留在CHT珠内的空气。然后将混合物转移到色谱柱中，并施加空气压力或真空抽吸15分钟以从填充床中除去过量的琼脂糖溶液。然后将含有琼脂糖溶液的CHT转移到烧杯中并在4℃下储存以在陶瓷磷灰石的孔内形成不溶性凝胶。
为了确定在CHT珠中包含琼脂糖的效果，在含有肌红蛋白和细胞色素C的样品上测试含和不含琼脂糖的CHT的能力。测试的条件如下：
柱：0.7×5.6cm
流速：2ml/分钟(300cm/小时)
缓冲液A：10mM磷酸钠，pH 6.8
缓冲液B：400mM磷酸钠，pH 6.8
梯度：0-100％B 40ml
样品：肌红蛋白和细胞色素C(都购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))
蛋白质分离的结果显示在图1的重叠(显示两次运行)色谱图中。没有观察到含或不含琼脂糖的树脂的选择性(例如，蛋白质的保留时间)的显著差异，表明琼脂糖可能包埋在CHT内，并且不会干扰CHT的孔表面。
还测试了琼脂糖填充的CHT树脂对人IgG的动态结合能力，并在以下条件下与未处理的CHT进行比较：
柱：0.7×5.6cm
流速：2ml/分钟(1分钟停留时间)
1ml/分钟(2分钟停留时间)
上样缓冲液：10mM磷酸钠，pH 6.8
洗脱缓冲液：400mM磷酸钠，pH 6.8
样品：在10mM磷酸钠，pH 6.8中的5mg/ml人IgG
动态结合容量结果总结在下表1中。如表1所示，琼脂糖填充的CHT的人IgG结合容量仅略微降低，2ml/分钟下降17％，1ml/分钟下降14％。
表1
该实施例说明用琼脂糖填充CHT的孔没有显著影响CHT选择性和结合容量。
实施例2：琼脂糖填充的CHT与市售树脂的色谱性质的比较
该实施例的目的是确定用琼脂糖填充CHT的孔是否改变CHT的色谱性质。还将琼脂糖填充的CHT的色谱性质与Capto Core 700(GE医疗公司(GE Healthcare))进行比较。将IgG-pdot偶联物(其分子量大于500kDa)施加到每种树脂上以确定偶联物是否与每种树脂结合或被排除在空隙体积中。还将牛血红蛋白施加于4％琼脂糖填充的CHT，以确定填充琼脂糖的孔是否允许分子量为约64kDa的分子进入琼脂糖填充的CHT的孔中并被其捕获。
4％琼脂糖填充的CHT的制备
通过将2g琼脂糖(Hispanagar D5 High Gel Strength)溶解在100℃的50ml水中制备4％琼脂糖溶液。将5克干燥CHT(Bio-Rad II型)和20克热琼脂糖溶液在100ml烧瓶中混合，然后对混合物施加真空几秒钟以除去圈留在CHT珠内的空气。搅拌混合物，同时加入40ml热(约70℃)Isopar H(埃克森美孚化学公司(ExxonMobil Chemical))，然后加入0.5ml司盘80(西格玛奥德里奇公司)。将Isopar H和司盘80分别加入到溶液中以产生稳定的悬浮液并防止孔填充的CHT颗粒聚集。然后将混合物在冰浴中冷却，同时搅拌，以在陶瓷磷灰石的孔内形成不溶性凝胶。最后，将琼脂糖填充的CHT用水洗涤并用筛子筛分以产生直径为25μm-75μm的珠。通过琼脂糖填充的CHT以色谱方式从孔中排除IgG-pdot的能力证实了CHT孔中琼脂糖的存在(参见下面的色谱性质比较)。
色谱性质比较
用0.75ml表2中所述的树脂填充五个一次性柱(Bio-Rad Micro Bio-SpinTM色谱柱；用于重力模式)。用3-4ml含有10mM磷酸钠pH 7.8，150mM氯化钠，0.1％pluronic F68(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))和0.1％PEG 3350(西格玛奥德里奇公司)的PBS缓冲液平衡柱。将10μl在PBS缓冲液中纯化的山羊抗兔IgG-pdot偶联物样品或2mg/ml牛血红蛋白(西格玛奥德里奇公司)的样品施加于每个柱。通过用马来酰亚胺修饰pdot然后通过(通过用特劳特试剂处理抗体产生)巯基将pdot连接到IgG来制备偶联物。这些pdot在470纳米处吸收并具有红褐色；因此，偶联物具有红褐色。牛血红蛋白的溶液也具有红褐色。
施加样品后，用500μl PBS缓冲液洗涤柱。目视确定样品与树脂的结合，即在柱顶部的红色或分散在整个树脂中的红色表明样品与树脂结合。如果红色在流穿溶液中，则样品不与树脂结合(例如，样品未结合)。结果总结在表2中。
表2
表2中的结果表明IgG-pdot偶联物与CaptoTM Core 700，CHT和1％琼脂糖填充的CHT结合，但不与4％琼脂糖填充的CHT结合。血红蛋白也与4％琼脂糖-CHT结合。因此，填充孔并用4％琼脂糖涂覆CHT表面阻止大偶联物与CHT结合，同时允许较小分子(例如，血红蛋白)进入孔并结合CHT孔内的表面。不受特定理论的束缚，据信1％琼脂糖的琼脂糖浓度不足以完全涂覆CHT珠的外表面以防止偶联物与CHT珠的外表面结合。
应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。

Claims (33)

1.一种陶瓷磷灰石珠，其包含不溶性多孔聚合物。
2.如权利要求1所述的陶瓷磷灰石珠，其中所述聚合物是琼脂糖。
3.如权利要求2所述的陶瓷磷灰石珠，其中所述琼脂糖不是交联的。
4.如权利要求2或3所述的陶瓷磷灰石珠，其中所述琼脂糖的浓度为约1％至约8％。
5.如权利要求1-4中任一项所述的陶瓷磷灰石珠，其中所述陶瓷磷灰石是陶瓷羟基磷灰石。
6.一种色谱柱，其包含多个权利要求1-5中任一项所述的陶瓷磷灰石珠。
7.一种制备权利要求1-5中任一项所述的陶瓷磷灰石珠的方法，所述方法包括：
在加热的聚合物溶液中孵育陶瓷磷灰石；并且
将具有陶瓷磷灰石的加热的聚合物溶液冷却至约4℃至约30℃以在所述陶瓷磷灰石的孔内形成不溶性多孔聚合物凝胶。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述孵育步骤使聚合物吸收或以其他方式进入所述陶瓷磷灰石的孔中。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述加热的聚合物溶液包含足够浓度的聚合物以进一步涂覆陶瓷磷灰石的外表面。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述聚合物是琼脂糖并且所述琼脂糖的浓度超过1％。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述琼脂糖的浓度是约4％。
12.如权利要求7所述的方法，其中在冷却步骤之前去除过量的聚合物。
13.如权利要求7所述的方法，其中所述加热的聚合物溶液的温度为约100℃。
14.如权利要求7所述的方法，其中所述孵育步骤包括向所述加热的聚合物溶液添加加热的有机溶剂和非离子型洗涤剂。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述有机溶剂至少部分地与水不混溶并且相对于加热的聚合物溶液中的聚合物是化学惰性的。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述有机溶剂是异链烷烃。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述异链烷烃是Isopar H。
18.如权利要求14所述的方法，其中所述加热的有机溶剂的温度为约60℃至约80℃。
19.如权利要求14所述的方法，其中所述非离子型洗涤剂选自脱水山梨糖醇衍生物，乙氧基化烷基酚和聚乙氧基化酯。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述脱水山梨糖醇衍生物是脱水山梨糖醇酯或聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述脱水山梨糖醇酯是司盘80。
22.一种进行色谱的方法，所述方法包括：
将包含靶分子的样品与多个权利要求1-5中任一项所述的陶瓷磷灰石珠在使该靶标不被所述陶瓷磷灰石珠捕获的条件下接触；并且
从所述陶瓷磷灰石珠收集所述靶分子。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述样品包含被陶瓷磷灰石珠粒捕获的污染物。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述靶分子是蛋白质-纳米颗粒偶联物并且所述污染物是游离蛋白质。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述样品包含蛋白质-纳米颗粒偶联物、游离蛋白质和缓冲剂。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述样品还包含表面活性剂。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述表面活性剂是聚亚烷基二醇。
28.如权利要求22-27中任一项所述的方法，其中所述收集步骤包括从陶瓷磷灰石珠中收集富含靶分子的一个或多个级分。
29.如权利要求22-27中任一项所述的方法，其中所述收集步骤包括向陶瓷磷灰石珠施加离心力或真空，并从陶瓷磷灰石珠中收集富含靶分子的一个或多个级分。
30.如权利要求24-29中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是IgG抗体。
31.如权利要求24-30中任一项所述的方法，其中所述蛋白质-纳米颗粒偶联物是蛋白质-聚合物点偶联物。
32.如权利要求27所述的方法，其中所述表面活性剂是Pluronic F-68。
33.如权利要求22-32中任一项所述的方法，其中所述样品还包含游离纳米颗粒并且所述陶瓷磷灰石珠将游离纳米颗粒与偶联物分离。
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