CN1934451B - 搅拌溶液的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的搅拌溶液的方法是一种使含有与选择结合性物质反应的被检物质的溶液与固定在载体表面的选择结合性物质接触，搅拌溶液的方法，其在含有被检物质的溶液中混合微粒或气泡，使微粒或气泡不与选择结合性物质的固定化面接触而移动。通过本发明的搅拌溶液的方法，促进固定在载体上的选择结合性物质与被检物质的反应，即使是微量的试样，也可以提供信号强度和S/N比良好的搅拌方法。通过本发明，使得采用DNA芯片等选择结合性物质固定化载体的临床现场的诊断和诊察成为可能。

Description

搅拌溶液的方法
技术领域
本发明涉及一种通过使含有被检物质的溶液与固定了选择性结合被检物质的物质(本说明书中称为“选择结合性物质”)的载体接触，在使被检物质与固定在载体上的选择结合性物质结合时，搅拌含有被检物质的溶液的方法。更具体的是，本发明涉及一种为了促进固定在载体上的选择结合性物质与被检物质的反应，搅拌含有被检物质的溶液的方法。
背景技术
现已开始了多种生物的基因信息分析的研究。以人类基因作为开端，目前已迅速了解了关于多种基因和其碱基序列，以及由基因序列编码的蛋白质以及由这些蛋白质接下来构成的糖链的信息。可以使用多种方法研究序列已经清楚的基因、蛋白质、糖链等高分子的功能。作为主要的，核酸利用Northern印迹或Southern印迹这样的各种核酸/核酸间的互补性，可以研究各种基因与其生物体功能表达之间的关系。蛋白质利用Western印迹为代表的蛋白质/蛋白质间的反应，可以对蛋白质的功能及其表达进行研究。
近年来，作为同时分析多种基因表达的方法，开发了称为DNA微阵列法(DNA芯片法)的新型分析法，并且该方法现受到关注。这些方法的任一种，在基于核酸/核酸间的杂交反应的核酸检测和定量法方面，在原理上都是与以往的方法相同的。这些方法，可以应用于基于蛋白质/蛋白质间或者糖链/糖链间或者糖链/蛋白质间的特异性反应的蛋白质或糖链的检测和定量。这些技术，其特征主要在于，使用称之为微阵列或DNA芯片的以高密度将多种DNA片段或蛋白质、糖链整列固定在玻璃平面基板上的装置。作为DNA芯片法的具体使用方法，可以例举有，例如，使研究对象细胞的表达基因等与经荧光色素等标识的试样在平面基板上杂交，使互补的核酸(DNA或RNA)之间结合，以高分辨度检测装置(Scanner)高速读取其位置的方法，以及基于电化学反应检测电流值等的应答的方法。这样一来，可以迅速测定试样中的各种基因量。并且，DNA芯片的应用领域不仅为推定表达基因的量的基因表达分析，而且也极有希望为检测基因的单碱基替代(SNP)的方法。
作为将核酸固定在基板上的技术，现已开发了将poly-L-赖氨酸、氨基硅烷等包被在载玻片等平坦的基板上，使用称之为点样器的点样装置，固定各种核酸的方法等(特表平10-503841号公报)。
此外，最近，DNA芯片中使用的核酸探针(固定在基板上的核酸)和以前的长度为数百-数千个碱基的cDNA及其片段不同，由于降低与试样杂交时的错误，并且可以用合成机容易地合成，因此使用寡DNA(所谓寡DNA是指碱基数为10-100个碱基的DNA)。此时，寡DNA与玻璃基板通过共价键结合(特开2001-108683号公报)。
现在，DNA芯片使数万至数千种的多个基因装载到芯片上，其多用于同时调查大量基因的表达的研究。今后，也期望在诊断用途中使用DNA芯片。在诊断中使用DNA芯片时，可预见一般可收集的试样的量非常少。由于现行的DNA芯片敏感度不够，因此预计这种试样的测定是不可能的。进而，现在的DNA芯片中，就表达量低的基因而言，在杂交后的荧光强度非常微弱，因此就存在无法实质上分析这种基因的问题。因此，在现行的DNA芯片中，试样的量少的情况以及表达量少的基因的情况下杂交后荧光的强度如何放大就是问题。为了解决这种问题，要点在于怎样使试样DNA与探针DNA高效反应。由于试样的自然扩散不充分，因此据信搅拌溶液，高效促进探针与试样的反应是使试样DNA与探针DNA高效反应的方法。
作为搅拌试样溶液的实例，特开2003-248008号公报，特开2003-339375号公报中公开了通过以磁力搅动试样溶液中的磁珠，搅拌试样溶液，提高与试样的反应效率的方法。此外，特开2003-339375号公报中公开了使混合了小珠的试样溶液与DNA芯片接触，用盖玻片等封闭溶液，通过转动芯片，使小珠沿重力方向下落，从而搅拌试样溶液，放大杂交后的信号的方法。
但是，特开2003-248008号公报，特开2003-339375号公报中公开的方法中存在以下问题。
也就是说，一般采用平板状的DNA芯片，用普通的盖玻片封闭试样溶液时，盖玻片与DNA芯片之间的间隙为10μm的高度左右。因此，即使混合大的微粒，微粒也会夹在DNA芯片与玻璃之间而无法移动，由此存在没有效果这样的问题。进而，对于大小数μm左右的微粒，即使使微粒通过重力等移动，由于溶液的抵抗，微粒也无法在试样溶液中充分移动，存在不能充分发挥搅拌效果的问题。此外，估计原因在于即使使微粒以重力移动，微粒也无法获得与固定了DNA探针的载体面接触的充分特性。此外，还存在用O-环等扩大盖玻片与DNA芯片之间的缝隙，扩大用于搅拌的微粒，通过重力和磁力搅动反应液中的微粒，从而搅拌溶液的方法。但是，由于用于封闭的盖玻片和DNA芯片这两者都呈平坦的形状，微粒在固定DNA探针的部位移动。因此，存在着微粒损伤了固定探针DNA的部分，这种损伤给数据分析带来障碍，由于微粒碰到探针固定面而剥落探针，存在信号强度反而变弱这样的问题。
发明的公开
本发明是一种使含有与选择结合性物质反应的被检物质的溶液与固定在载体表面的选择结合性物质接触，从而搅拌该溶液的方法，其是一种在含有被检物质的溶液中混合微粒或气泡，使微粒或气泡不与选择结合性物质的固定化面接触而移动从而搅拌溶液的方法。
附图的简要说明
图1：是本发明的实施方式的截面模式图。
图2：是本发明的实施方式的截面模式图。
图3：载体的模式图。
图4：载体的截面模式图。
图5：挡住DNA芯片的夹具的实例。
图6：以载体作为支撑体层/选择结合性物质固定化层时的概念图。
图7：PMMA表面上固定选择结合性物质时的反应图。
图8：实施例9中使用的夹具的概念图。
图9：使目标浓度变化时的荧光强度。
符号的说明
1固定在载体上的选择结合性物质(DNA)
2微粒(小珠)
3载体
4容纳反应溶液的容器
11平坦部
12凹凸部
13DNA芯片
14物镜
15激光激发光
16夹具中用于挡住微阵列的弹簧
31选择结合性物质固定化层
32支撑体层
41 PMMA
42 DNA
51磁石
52磁石的往返运动的方向
53基板
用于实施发明的最佳方式
以下，对本发明的搅拌方法进行说明。
本发明的第1种搅拌溶液的方法，是一种使含有与选择结合性物质反应的被检物质的溶液与固定在载体表面上的选择结合性物质接触，搅拌该溶液的方法，其在含有被检物质的溶液中混合微粒或气泡，使微粒或气泡不与选择结合性物质的固定化面接触而移动从而搅拌溶液。
在本发明的第1种搅拌溶液的方法中，需要在含有被检物质的溶液中混合微粒或气泡，通过移动微粒或气泡，搅拌溶液。
进而，在本发明的第1种搅拌溶液的方法中，使微粒或气泡不与选择结合性物质的固定化面接触而移动从而搅拌溶液。通过限制微粒或气泡的移动区域，可以防止微粒碰到探针固定面时，由微粒或气泡引起的对该面的伤害。
优选使用微粒或气泡不与选择结合性物质的固定化面接触的结构的载体。优选在载体上设置凹凸部，并且在凸部上面上固定选择结合性物质。
此外，优选使用微粒或气泡不与选择结合性物质的固定化面接触的结构的容纳溶液的容器。
进而本发明的第2种搅拌溶液的方法，是一种使含有与选择结合性物质反应的被检物质的溶液与固定在载体的凸部上面的选择结合性物质接触，从而搅拌溶液的方法，其在含有被检物质的溶液中混合微粒或气泡，使微粒或气泡移动从而搅拌溶液。
在本发明的第1种搅拌溶液的方法和第2种搅拌溶液的方法中使用了气泡或微粒。如果比较气泡和微粒，由于根据选择大小、材料，容易控制比重，因此本发明的第1种搅拌溶液的方法和第2种搅拌溶液的方法均可以优选使用微粒。
本发明的搅拌溶液的方法中，微粒的尺寸(微粒的最大直径)优选为10μm或10μm以上。当微粒的尺寸比10μm小时，就存在几乎无法获得由微粒产生的搅拌效果的情况。其原因是存在微粒的尺寸比10μm小时，由于溶液的抵抗，即使添加外场(磁场或重力或振动)微粒也几乎无法移动的情况。微粒的尺寸特别优选20μm或20μm以上。
本发明的搅拌溶液的方法中可以使用任意形状的微粒。特别优选的是，微粒的形状为球状，即小珠。如果微粒是小珠的话，由于通过其自身转动不会在反应液中停滞而可以顺利地移动，结果，试样溶液的搅拌良好地进行，因此而优选。作为微粒的形态，最优选的是可以使用直径为20μm-300μm的球状微粒(小珠)。如果小珠的直径在此范围内，以小珠自身的重量也具有反应液的抵抗力，通过重力和加速度等小珠可以容易地在液体中移动，液体的搅拌可以充分地进行，因此可以获得良好的结果。
在本发明的搅拌溶液的方法中，对作为微粒的材质没有特别的限定。微粒的材质，可以使用金属、玻璃、陶瓷、聚合物(聚苯乙烯、聚丙烯、尼龙等)。其中，优选比重比水大的材料(玻璃、石英、氧化锆陶瓷)的小珠，之所以优选是因为通过由重力和振动产生的加速度等可以容易在液体中移动。另外，也可使用磁珠。尤其是，因为由氧化锆陶瓷构成的小珠比重大，通过由重力和振动产生的加速度，小珠的移动容易进行，因此可以最优选使用。此外，玻璃、石英、氧化锆陶瓷由于在试样溶液中小珠成分溶出少而优选。
由氧化锆陶瓷(三氧化二钇稳定化氧化锆)构成的小珠，由于密度为6g/cm3，比石英玻璃的2.2g/cm3等大，因此可以发挥更好的搅拌效果，由于相对于容器中封闭时的溶液的移动，小珠因飞舞而移动的情况少，因此更容易进行设置，尤为优选。
本发明的搅拌溶液的方法中，优选的是，使微粒移动，搅拌溶液。本发明的搅拌溶液的方法中，更优选的是，通过重力、磁力、载体的振动中的任一种或是它们的组合，可以使微粒移动。其中，由于使载体沿垂直面旋转，可以通过重力简便地实施移动小珠的方法，可以获得充分的效果，因此被优选。作为此时的旋转速度，优选为0.1rpm-30rpm。如果旋转速度超过30rpm，微粒不能朝一个方向移动时，就存在对微粒的反向重力这样的情况。也就是说，微粒在试样液中往返运动的距离变小，就会存在无法充分发挥搅拌效果的情况。此外，如果旋转速度比0.1rpm更慢时，液体中的微粒移动的总时间变短，结果由于搅拌试样溶液的时间变短而无法获得充分的效果。鉴于以上观点，旋转速度的优选范围为0.5rpm-5rpm。可以优选采用通过左右振动载体、加上加速度，移动溶液中的微粒的方法。
在本发明的搅拌溶液的方法中，优选是用容纳溶液的容器。进而，在本发明的搅拌溶液的方法中，更优选的是，通过使微粒移动搅拌溶液，并且微粒的最小宽度比选择结合性物质的固定化面与容纳溶液的容器之间的最短距离更大。
在本发明的搅拌溶液的方法中，优选的是，微粒的最大宽度在10μm或10μm以上，凸部上面和凹部的高度差或高度差以下。
在本发明的搅拌溶液的方法中，优选的是，通过使微粒移动搅拌溶液，并且在载体上设置凹凸部，将选择结合性物质固定在凸部上面，微粒在凹部移动。
在本发明的搅拌溶液的方法中，优选的是，在载体上设置平坦部和凹凸部，将选择结合性物质固定在多个凸部上面，这些凸部上面的高度大致相同，并且平坦部分与凸部上面的高度差在50μm或50μm以下。
对固定了选择结合性物质的载体的优选形状进行描述。
本发明的搅拌方法中使用的固定了选择结合性物质的载体中有凹凸部，优选将选择结合性物质固定在凸部上面上。由于通过获得这种结构，检测时，不会检测到非特异性吸附的试样，因此噪声(noise)小，结果可以获得S/N更好的结果。噪声小的具体理由如下。也就是说，如果用称之为扫描仪的装置扫描在凸部上面固定了选择结合性物质的载体时，由于激光的焦点集中到凹凸部的凸部上面，在凹部，激光模糊，存在难以检测到非特异性吸附至凹部的试样的所不希望有的荧光(噪声)这样的效果。
关于凹凸部的凸部的高度，优选各个凸部上面的高度大致相同。其中，所谓高度大致相同，是指选择结合性物质固定在高度多少有些不同的凸部的表面上，使其与荧光标识的试样反应，然后，用扫描仪扫描时，其不会产生信号水平的强度差的问题的高度。具体的是，高度大致相同指的是高度差比50μm更小。高度差在30μm或30μm以下更为优选，如果高度相同则更优选。此外，本申请中所称相同高度，包括由于生产等中发生的质量参差不齐引起的误差。最高的凸部上面的高度和最低凸部上面的高度差比50μm更大时，高度偏离的凸部上面的激光就模糊了，就存在与固定在该凸部上面的选择结合性物质反应的试样发出的信号强度变弱的情况。
此外，凸部分的上面优选基本平坦。其中所谓凸部上面基本平坦是指没有20μm或20μm以上的凹凸。
进而本发明的搅拌方法中使用的载体优选设置平坦部。优选凹凸部的凸部上面的高度与平坦部分的高度大致相同。也就是说，平坦部的高度与凸部上面的高度差优选在50μm或50μm以下。凸部上面的高度与平坦部的高度差如果在50μm或50μm以上时，就存在可以检测的荧光强度变弱的情况。更优选的是，30μm或30μm以下，最优选的是平坦部的高度与凸部的高度相同。
本发明的搅拌方法中使用的载体的具体实例在图3、图4中举例说明。在凹凸部的周围有11所示的平坦部，并且12所示的凹凸部的凸部上面固定了选择结合性物质(如核酸)。使用这种平坦部，扫描仪的激发光的焦点就可以容易地集中到凸部的上面。也就是说，使扫描仪的激发光的焦点集中到载体的表面时，如图5所示，以夹具挡住载体，多预先将激光的焦点调整至该夹具的抵挡面的高度。通过以夹具的面挡住本发明的搅拌方法中使用的载体的平坦部，可以使扫描仪的激光的焦点容易地集中到载体的凸部上面。
在本发明的搅拌溶液的方法中，所谓固定了选择结合性物质的载体的固定了选择结合性物质的多个凸部，是指固定了作为信息的必要的选择结合性物质(例如核酸)的部分，排除仅仅固定虚假的选择结合性物质的部分。
在本发明的搅拌溶液的方法中，固定了选择结合性物质的载体优选凸部上面的面积大致相同。由于凸部上面的面积大致相同，固定多种选择结合性物质的部分的面积可以相同，因此有利于以后的分析。其中，所谓凸部的上部面积大致相同，是指凸部中最大的上面面积与最小的上面面积的比值为1.2或1.2以下。
在本发明的搅拌溶液的方法中，固定了选择结合性物质的载体对凸部的上面的面积没有特别的限定，但是从可以减少选择结合性物质的量和容易处理的方面考虑，优选1mm2或1mm2以下、10μm2或10μm2以上。
在本发明的搅拌溶液的方法中，优选使用的载体的凹凸部中的凸部的高度优选在10μm或10μm以上、500μm或500μm以下。根据下述理由，特别优选50μm或50μm以上、300μm或300μm以下。如果凸部的高度更低时，就会有检测出位点以外的部分的非特异性吸附的检测试样的情况，结果S/N变差。此外，如果凸部的高度在500μm或500μm以上时，就存在发生凸部容易折断破损等问题的情况。
在本发明的第1种搅拌溶液的方法中，限制微粒或气泡的移动区域。对于用于实现此目的的具体的载体和容纳溶液的容器的形状，以图1为例说明。
图1中，1表示探针DNA(选择结合性物质)。此外，2表示微粒(此时是小珠)，3表示固定了探针DNA的载体。也就是，这些1，2，3与含有目标DNA(被检物质)的溶液接触。然后，4是由例如载玻片、盖玻片或金属、塑料等材料构成的容纳液体的容器，也就是含有目标DNA的溶液被容纳在该容器与载体间。在图1的例子中，探针DNA被固定于载体的凸部。载体的凸部上面(固定选择结合性物质的面)与容纳溶液的容器之间的最短距离不到微粒的直径时，微粒不接触到固定探针DNA的面，以防微粒损伤该面。微粒，例如椭圆形的情况下，如果凸部上面与容器之间的最短距离不到微粒的最小宽度时，可以防止探针固定面与微粒的接触。
作为具体实现图1的状况的方法，在呈现凹凸形状的载体上，滴下含有试样DNA的溶液(试样溶液)，以使微粒不在凸部上面的方式将微粒放入该液体中，然后，在容器上覆盖与容器相当的盖玻片，为了其旋转不洒落试样溶液且不蒸发，用胶带和粘合剂等封闭。这样一来，盖玻片的面和凸部上面之间可以有填充数μm-数十μm左右的试样溶液的空间。微粒的尺寸如果比盖玻片的面与凸部上面之间的距离大时，微粒不损伤凸部上面。用这种形状的载体通过使载体在垂直面内旋转等，微粒仅在凹凸部的凹部移动，微粒可不接触凸部上面来搅拌试样溶液。为了可以确保凸部上面与容器之间的充满试样溶液的空间，优选，例如准备板面的角比其它面高5μm-100μm的板，准备中央部位5-100μm凹下的板，使该板的中央部和固定选择结合性物质的载体的凹凸部像二者相对那样合并。该板的例子示于图1的4。制备这种容器时，例如，可以氢氟酸处理玻璃，在平坦的板的2-4边贴薄膜和胶带，或者通过注射成型等制备图1的4的性状的板，或者用丝网印刷在板的角上印刷间隙状的隆起等。
在本发明的搅拌溶液的方法中，优选使用具有微粒或气泡不与选择结合性物质的固定面接触的结构而容纳溶液的容器。
图1中，载体具有凹凸形状。通过在容纳溶液的容器中设置凹凸形状，也可以获得同样的效果。其具体的例子示于图2中。这种情况，可以在容器的凸部的下方排列探针DNA。这种情况下，如果固定探针DNA的面与容器凸部之间的距离不到微粒的最小宽度是优选的。作为其它的实例，可以例举有载体与容器两者的结构为凹凸结构的情况。
如果使用如上所述的设置了凹凸部的载体或设置了凹凸部的容器，通过微粒搅拌含有目标DNA的试样溶液，就可以发挥以下效果，结果，杂交后的荧光强度比以往的技术更强。
也就是说，在一般的平板状DNA芯片上盖上盖玻片进行杂交时，盖玻片与DNA芯片间的间隙为10μm左右。即使混合较之大的微粒，微粒夹在盖玻片与DNA芯片之间，就存在微粒无法移动，没有混合微粒的效果这样的问题。另一方面，为了避免这种问题，混合不会夹在盖玻片与DNA芯片之间的直径数μm程度的微粒，即使要以重力和振动的加速度使微粒移动，由于微粒小，极大地受到溶液的抵抗力，试样溶液中的微粒无法充分移动。因此，存在用微粒无法充分发挥搅拌效果的问题。另外，用O-环等扩大盖玻片与载体间的距离，进而扩大用于搅拌的微粒，进行充分的搅拌时，存在着由于微粒损伤芯片表面，微粒与探针固定面碰撞，探针脱落这样的推测理由，因此杂交后的荧光强度不足够强这样的问题。
如本发明的优选实施方式所示，如果使用设置了凹凸部的载体或设置了凹凸部的容器，如图1和图2所示，可以将微粒的尺寸扩大至少到凹凸部的凹部和凸部的高度。因此，使用设置了凹凸部的载体或设置了凹凸部的容器，通过微粒搅拌含有目标DNA的试样溶液时，不但可以通过大微粒充分搅拌试样溶液，而且可以获得不会损伤探针DNA的固定化面这样的理想效果。
在本发明的搅拌溶液的方法中，优选使用的容器材料没有特别的限定。本发明中，作为优选使用的容器的材料，可以例举有玻璃和塑料等。如果容器的形状为平板时，可以优选使用盖玻片和载玻片等玻璃制的板，另一方面，容器的形状为凹凸形状时，出于可以注射成型的生产性方面的考虑，聚甲基丙烯酸甲酯和聚碳酸酯等塑料材料是优选的。
本发明中使用的载体的材料没有特别的限制。本发明中，优选使用的载体的材料是玻璃或各种聚合物(聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚碳酸酯)。
为了固定选择结合性物质，载体的材料为玻璃时，通过进行硅烷偶联处理可以在表面上生成官能团，据此可以在载体上固定DNA等选择结合性物质。例如，用氨烷基硅烷等，可以在玻璃表面生成氨基，如果是DNA时，通过由该氨基的正电荷和DNA的负电荷产生的静电力可以固定。
在本发明中，特别是，由于用于固定选择结合性物质的载体表面为具有含有下述通式(1)表示的结构单位的聚合物的固体时，杂交后的信号变得更大而优选。
[化1]
Figure S05809083X20060928D000111
(通式(1)的R1，R2，R3表示烷基、芳基或氢原子)
作为含有通式(1)表示的结构单位的聚合物，可以使用单聚物或共聚物。前述聚合物，在原料中使用至少一种类型的单体，这种单体以能参与聚合的双键和能参与缩聚的官能团、以及酮或羧酸或它们的衍生物的形态存在。此外，前述聚合物更优选具有通式(1)的结构。
含有通式(1)表示的结构单位的聚合物为共聚物时，优选含有通式(1)表示的结构单位在总单体单位的10％或10％以上。当通式(1)表示的结构单位的含有量在10％或10％以上时，通过如下说明的步骤，可以在表面生成多个羧基，可以固定多个探针核酸，因此结果S/N比提高。
在本发明中，所谓聚合物指的是数均聚合度为50或50以上的聚合物。这种聚合物的数均聚合度的优选范围为100-1万。特别优选的是200或200以上，5000或5000以下。此外，通过用GPC(凝胶渗透层析)的常规方法测定聚合物的分子量可以容易地测定数均聚合度。
在通式(1)中，R1和R2表示烷基、芳基或氢原子，无论它们相同还是不同都可以。前述烷基可以是直链状也可以是支链状，优选具有1-20个碳原子数。前述芳基优选具有6-18个碳原子数，更优选具有6-12个碳原子数。官能团X选自于O，NR3或CH2中的任一种。R3是与前述R1和R2相同定义的官能团。
在本发明中，用于固定选择结合性物质的载体表面的聚合物优选含有官能团的聚合物。含有官能团的聚合物中，作为优选的聚合物有，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸乙酯(PEMA)或聚甲基丙烯酸丙酯的聚甲基丙烯酸烷基酯(PAMA)等。这其中特别优选的是聚甲基丙烯酸甲酯。进而，还可以使用聚乙酸乙烯酯、聚甲基丙烯酸环己基酯或聚甲基丙烯酸苯酯等。此外，也可以使用组合了前述聚合物的成分或者前述聚合物的成分中加入了一种或多种其它聚合物的成分的结构的共聚物。作为前述其它的聚合物，有聚苯乙烯。
聚合物为共聚物时，各成分比的范围为含有羰基的单体例如甲基丙烯酸烷基酯的比例优选在10摩尔％或10摩尔％以上。这是因为，由于可以在表面生成多个羧基而能够固定多的探针核酸，结果S/N比提高。聚合物的结构单位中，更优选的该单体的比例在50摩尔％或50摩尔％以上。
为了在有具有至少1个通式(1)表示的结构单位的聚合物的载体上固定选择结合性物质，优选在其上实施预处理，在载体表面上形成羧基。作为在载体表面生成羧基的方法，可以例举有用碱、酸等处理，此外在温水中的超声波处理、将载体暴露于氧等离子体、氩等离子体、放射线的方法等，但是从载体的损伤少，此外可以容易实施这些方面考虑，优选通过将载体浸在碱或酸中使在表面上生成羧基。作为具体的实例，将载体浸在氢氧化钠或硫酸水溶液(优选浓度为1N-20N)中，优选可以以30℃-80℃的温度，保持1小时至100小时的时间。
作为聚合物，也可以使用具有酸酐单位的热塑性共聚物。这种热塑性共聚物优选具有(i)酸酐单位。其中所谓(i)酸酐单位是存在于(A)热塑性共聚物的主链或侧链的骨架中或末端中的单位。作为(i)酸酐单位的结构没有特别的限制，可以例举有(间)丙烯酸酐单位，戊二酸酐单位，马来酸酐单位，衣康酸酐单位，柠康酸酐单位，乌头酸酐单位等，但是优选马来酸酐单位，戊二酸酐单位，其中，优选下述通式(2)表示的戊二酸酐单位：
[化2]
(上述式中，R4，R5表示相同或不同的氢原子或碳原子数为1-5的烷基)
热塑性共聚物的结构如果含有(i)酸酐单位，则没有特别的限制，优选具有下述通式(3)表示的(ii)不饱和羧酸单位：
[化3]
Figure S05809083X20060928D000132
(但是，R6表示氢或碳原子数为1-5的烷基)
其中所谓(ii)不饱和羧酸单位是可以通过共聚不饱和羧酸单体获得的单位，对作为这时使用的不饱和羧酸单体没有特别的限定，也可以使用任意可以与其它的乙烯基化合物共聚的不饱和羧酸单体。作为优选的不饱和羧酸单体，可以例举有下述通式(4)
[化4]
Figure S05809083X20060928D000141
(但是，R6表示氢或碳原子数为1-5的烷基)
表示的化合物、马来酸、以及无水马来酸的水解物等，但是，尤其是，在热稳定性优良方面优选丙烯酸、甲基丙烯酸，更优选的是甲基丙烯酸。可以使用1种或2种或2种以上。
(A)热塑性共聚物如果含有(i)酸酐单位，则没有特别的限制，但是优选具有下述通式(5)
[化5]
(但是，R7表示氢或碳原子数为1-5的烷基，R8表示碳原子数为1-6的脂肪族或脂环族烃基或1个或1个以上的碳原子数以下的羟基或者以卤素取代的碳原子数为1-6的脂肪族或脂环族烃基)表示的(iii)不饱和羧酸烷基酯单位。其中所谓(iii)不饱和羧酸烷基酯单位是指可以通过共聚合不饱和羧酸烷基酯单体获得的单位。其中，作为不饱和羧酸烷基酯单体没有特别的限制，作为优选的实例，可以例举有下述通式(6)表示的单体。
[化6]
Figure S05809083X20060928D000151
在载体的表面如果有羧基或酸酐，就可以在载体表面上通过共价结合固定具有氨基或羟基的选择结合性物质。载体表面有羧基时，为了促进这些结合的反应，可以使用二环乙基碳二亚胺，N-乙基-5-苯基异唑
Figure 05809083X_1
-3’-磺酸等多种缩合剂。这其中，由于1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)毒性小，比较容易从反应系统中除去，因此其是选择结合性物质与载体表面的羧基之间的缩合反应中最有效的1种缩合剂。EDC等缩合剂可以与选择结合性物质的溶液混合使用，也可以将表面生成了羧基的载体预先浸在EDC溶液中，预先使表面的羧基活性化。缩合剂与选择结合性物质的溶液混合使用的方法使反应产率提高，可以在载体上固定多种选择结合性物质，因此可以优选使用。
使用这种缩合剂，使选择结合性物质的氨基与载体表面的羧基反应时，选择结合性物质就会通过酰胺键固定在载体表面；使选择结合性物质的羟基与载体表面的羧基反应时，选择结合性物质就会通过酯键固定在载体表面。使含有选择结合性物质的试样与载体作用时的温度优选为0℃-95℃，更优选15℃-65℃。处理时间通常为5分钟-24小时，优选在1小时或1小时以上。
另一方面，酸酐为表面上存在的聚合物时，可以加入上述缩合剂，即使不加入也可以，例如，可以进行选择结合性物质的氨基间的共价结合。
这样一来，优选地通过将选择结合性物质固定在聚合物表面，可以抑制非特异性的试样吸附，进而可以通过共价结合，强力且高密度地固定选择结合性物质，进而由于被固定的选择结合性物质的空间的自由度比玻璃高这样的推测理由，可以获得与试样的杂交效率高的载体。
在用含有由通式(1)和通式(2)表示的结构单位的聚合物制备载体时，通过使用注射成型法或热压法等，可以比玻璃、陶瓷、金属等更为简单地大量生产出设置有微细的凹凸形状的载体。尤其是，注射成型法由于容易大量生产，因此可以优选使用。
在本发明中，优选使用的载体为：通过前述的方法，通过将选择结合性物质固定在聚合物表面可以抑制非特异的试样吸附，进而可以通过共价结合，强力且高密度地固定选择结合性物质。进而由于被固定的选择结合性物质的空间的自由度比玻璃高这样的推测理由，因此可以获得与试样的杂交效率高的载体。
由上述方法获得的选择结合性物质固定化载体在固定选择结合性物质后，可以进行适当的处理。例如，还可以通过进行热处理、碱处理、表面活性剂处理等使被固定的选择结合性物质变性。
一般，选择结合性物质固定化载体使经荧光标识的试样与固定在载体上的选择结合性物质进行杂交反应，用称为扫描仪的装置读取荧光。扫描仪用物镜缩小作为激发光的激光，并聚集激光。但是，载体表面产生自身荧光时，其发光就与形成噪音的检测准确度降低相关。为了防止这种情况，使载体自身发出的自身荧光减少，优选具有通式(1)或通式(2)的结构单位的聚合物呈现黑色，并且使之含有通过激光照射不产生发光的物质而将表面制成黑色。通过使用这样的黑色载体，在检测时可以减少由载体发出的自身荧光。黑色的载体噪音小，结果形成S/N比良好的固定有选择结合性物质的载体。
其中，所谓载体是黑色是指在可见光范围(波长400nm-800nm)内，载体的黑色部分的光谱反射率不具有特定的光谱模式(spectrum pattern)(特定的峰等)，但是其一律为低值，并且载体的黑色部分的光谱透射率也不具有特定的光谱模式，但是其一律为低值。
本发明中，载体的可见光(波长400nm-800nm)的范围的光谱反射率在7％或7％以下，优选同波长范围的光谱透射率在2％或2％以下。其中所谓光谱反射率是指适应于JIS Z 8722条件C的照明·受光光学体系中吸收由载体发出的正反射光时的光谱反射率。
在本发明中，作为将载体制成黑色的方法，可以通过使载体含有黑色物质实现。如要列举优选的黑色物质，可以使用碳黑，石墨，钛黑，苯胺黑，Ru，Mn，Ni，Cr，Fe，Co和Cu的氧化物，Si，Ti，Ta，Zr和Cr碳化物等黑色物质。可以优选使载体含有这些黑色物质中的碳黑，石墨，钛黑，尤其是可以优选使用碳黑。
除了可以使载体含有这些黑色物质中的一种外，还可以使之含有2种或2种以上的黑色物质混合物。
本发明中，作为载体的形状，如果在玻璃、金属等难以热变形的材料构成的支撑体层上设置由具有至少1种由通式(1)表示的结构单位的多聚物构成的选择结合性物质固定化层，可以防止热和外力引起的载体的形状变化，因此优选。这种概念的一个实例适于图6中。作为支撑体层，优选聚丙烯或玻璃、或铁，铬，镍，钛，不锈钢等金属。此外，为了使该支撑体层与选择结合性物质固定化层之间的粘合性好，优选对支撑体层的表面实施使用氩气、氧气、氮气的等离子处理和使用硅烷偶联剂的处理。作为这种硅烷偶联剂，可以例举有3-氨基丙基三乙氧基硅烷，3-氨基丙基三甲氧基硅烷，3-氨基丙基二乙氧基甲基硅烷，3-(2-氨基乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷，3-(2-氨基乙基氨基丙基)二甲氧基甲基硅烷，3-巯基丙基三甲氧基硅烷，二甲氧基-3-巯基丙基甲基硅烷等。
作为在支撑体层上设置选择结合性物质固定化层的方法，可以使用将聚合物溶解于有机溶剂中的旋转涂覆(spin coat)和浸渍等公知的方法。更为简单的是，还可以用粘固剂粘到支撑体层上。
本发明中，所谓“选择结合性物质”意思是指能直接或间接地选择性结合被检物质的物质，作为代表例，可以例举有核酸，蛋白质，糖类和其它的抗原性物质。
作为“选择结合性物质”特别优选的是核酸。核酸可以是DNA或RNA，也可以是PNA。具有特定的碱基序列的单链核酸，由于通过与具有该碱基序列或与其一部分互补的碱基序列的单链核酸选择性杂交而结合，因此符合本发明中所称“选择结合性物质”。
此外，作为蛋白质，可以例举有抗体以及像Fab片段和F(ab’)2片段这样的抗体的抗原结合性片段，以及各种抗原。由于抗体及其抗原结合性片段与对应抗原选择性结合，抗原与对应抗体选择性结合，因此符合“选择结合性物质”。作为糖类，优选多糖类，可以例举有各种抗原。
此外，也可以固定蛋白质和糖类之外的具有抗原性的物质。
本发明中使用的选择结合性物质可以是市售的，此外也可以是从活细胞等中获得的。
本发明中使用的选择结合性物质中，核酸是优选的，之所以优选是因为核酸中称之为寡核酸的长度为10个碱基-100个碱基的核酸可以用合成机容易地人工合成，此外由于核酸末端的氨基端修饰容易，因此容易固定在载体表面上。进而，从不满20个碱基的杂交的稳定性低的观点考虑，20-100个碱基更为优选。为了保持杂交的稳定性，特别优选的是40-100个碱基的范围。
本发明的搅拌溶液的方法中，作为被检物质，可以例举有应当测定的核酸，例如，病原菌或病毒等的基因，遗传病的致病基因等以及它们的一部分，针对具有抗原性的各种生物体成分、病原菌和病毒等的抗体等，但不限于这些物质。
本发明的搅拌溶液的方法中，作为含有这些被检物质的溶液，可以例举有血液，血清，血浆，尿，粪便，脊髓液，唾液，各种组织液等体液，各种饮食物以及它们的稀释物等，但不限于这些物质。
成为被检物质的核酸可以对通过常规方法从血液或细胞中提取的核酸进行标识，也可以以该核酸为模板，通过PCR等核酸扩增法扩增。以核酸为模板，通过PCR等核酸扩增法扩增时，可以使测定敏感度大幅提高。核酸扩增产物成为被检物质时，通过在经荧光物质等标识的核苷三磷酸存在下进行扩增，可以标识扩增核酸。此外，被检物质为抗原或抗体时，可以通过常规方法直接标识作为被检物质的抗原或抗体。还可以使作为被检物质的抗原或抗体与选择结合性物质结合后，洗涤载体，使该抗原或抗体与抗原抗体反应标识的抗体或抗原反应，测定结合于载体的标识。
本发明的搅拌溶液的方法中，优选的是使选择结合性物质与被检物质反应。
本发明的搅拌溶液的方法中，使固定化物质与被检物质相互作用的过程，可以以与以往完全相同的方式进行。反应温度和时间可以根据杂交核酸的链长、参与免疫反应的抗原和/或抗体的种类等进行适当选择，但是核酸杂交时，通常是35℃-70℃左右进行1分钟-十几个小时，免疫反应时，通常是室温至40℃左右进行1分钟-几个小时。
本发明的搅拌溶液的方法中，清楚了不仅杂交后的信号提高，而且还存在以下优点。也就是说，在以往的DNA芯片的杂交方法中，存在杂交后的荧光强度弱，固定探针DNA的位点内的荧光强度的分布形成圆环(doughnut)状，给以后的数据分析带来障碍这样的问题。然而，本发明的搅拌溶液的方法中，知道了在大幅提高荧光强度上，存在着上述位点的圆环状的荧光强度分布减少的优点。
实施例
通过以下的实施例对本发明进行更详细地说明。本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
(DNA固定化载体的制备)
使用公知的方法LIGA(Lithographie Galvanoformung Abfomung)方法，制备注射成型用的类型，通过注射成型法获得具有后述形状的PMMA制的载体。并且，该实施例中使用的PMMA的平均分子量为5万，PMMA中含有比例为1重量％的碳黑(三菱化学制#3050B)，载体为黑色。测定这种黑色载体的光谱反射率和光谱透射率时，光谱反射率为可见光区域(波长400nm-800nm)的任意波长是5％或5％以下，此外，相同范围的波长下，透射率为0.5％或0.5％以下。光谱反射率和光谱透射率在可见光区域中均没有特定的光谱模式(峰等)，光谱一样平坦。并且，光谱反射率使用适应于JIS Z 8722条件C的装载了照明·受光光学系统的装置(Minolta Camera制，CM-2002)测定吸收由载体发出的正反射光时的光谱反射率。
载体的形状大小为纵76mm，横26mm，厚1mm，除了载体的中央部分外，表面是平坦的。载体的中央设有直径10mm，深0.2mm的凹部分，该凹部分中64(8×8)个位点设有直径0.2mm，高0.2mm的凸部。测定凹凸部分的凸部上面的高度(64个位点的凸部的高度平均值)与平坦部分之间的高度差时，为3μm或3μm以下。此外，测定64个凸部上面的高度的参差不齐(最高的凸部上面的高度与最低的凸部上面的高度差)，进而测定凸部上面的高度的平均值与平坦部上面的高度差时，分别为3μm或3μm以下。进而，凹凸部凸部的节距(pitch)(从凸部中央部到相邻的凸部中央部的距离)为0.6mm。
在65℃下将上述PMMA载体浸渍在10N的氢氧化钠水溶液中12小时。以纯水、0.1N的HCl水溶液、纯水的顺序洗涤该载体，在载体表面生成羧基。
(探针DNA的固定化)
合成序列号1(60个碱基，5’末端氨基化)的DNA。该序列号1的DNA的5’末端被氨基化。
以0.3nmol/μl的浓度将该DNA溶于纯水中，作为储液。点样在载体上时，用PBS(将8g NaCl，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2g KCl，0.2g KH2PO4溶于纯水中，使终体积为1升，加入了pH调整用的盐酸的溶液，pH5.5)将探针DNA的终浓度调整到0.03nmol/μl，并且为了使载体表面的羧酸和探针DNA末端的氨基缩合，加入1-乙基-3(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，其终浓度为50mg/ml。然后，用玻璃毛细管将这些混合溶液点样在载体凸部上面。然后，将载体装入密闭的塑料容器中，37℃，湿度100％的条件下温育20小时，用纯水洗涤。该反应系统示于图7中。
(试样DNA的制备)
作为试样DNA，使用具有可以与固定在上述DNA固定化载体上的探针DNA杂交的碱基序列的序列号4的DNA(968个碱基)。调制方法如下所示。
合成序列号2和序列号3的DNA。将其溶于纯水中，浓度为100μM。然后，准备pKF3质粒DNA(Takarabio(股份)产品编号：3100)(序列号5：2264个碱基)，以其作为模板，以序列号2和序列号3的DNA作为引物，通过PCR反应(聚合酶链反应)进行扩增。
PCR条件如下所示。也就是说，加入2μl ExTaq，40μl10×ExBuffer，32μl dNTP Mix(以上均由Takarabio(股份)制，附属于产品编号RR001A)，2μl序列号2的溶液，2μl序列号3的溶液，0.2μl模板(序列号5)，用纯水将终体积调整为400μl。将该混合液分装到4个微管中，用热循环仪进行PCR反应。通过乙醇沉淀纯化，溶解于40μl纯水中。以电泳确认PCR反应后的溶液的一部分时，确认了扩增的DNA的碱基长度大概为960个碱基的序列号4(968个碱基)被扩增。
然后，以6mg/ml的浓度溶解9个碱基的随机引物(Takarabio(股份)制，产品编号：3802)，向上述PCR反应后纯化的DNA溶液中加入2μl。在100℃加热这种溶液后，于冰上骤冷。向其中加入5μl随KlenowFragment(Takarabio(股份)制，产品编号：2140AK)提供的缓冲液，2.5μldNTP混合液(dATP，dTTP，dGTP的浓度各为2.5mM，dCTP的浓度为400μM)。进而，加入2μl Cy3-dCTP(Amersham Pharmacia Biotech制，产品编号PA53021)。向该溶液中加入10U的Klenow Fragment，在37℃温育20小时，获得经Cy3标识的试样DNA。并且，由于标识时使用随机引物因此试样DNA的长度参差不齐。最长的试样DNA为序列号4(968个碱基)。并且，取出试样DNA的溶液，通过电泳确认时，在与960个碱基相当区域附近出现最强的条带，在碱基长度较之短的区域对应的区域为不清晰成片条带。然后，通过乙醇沉淀纯化，干燥。
将这种标识化的DNA用1重量％BSA(牛血清白蛋白)、5×SSC(所谓5×SSC是用纯水将20×SSC(SIGMA)稀释4倍。此外，用纯水将20×SSC稀释2倍时表示为10×SSC，将20×SSC的2倍稀释液表示为10×SSC，100倍稀释液表示为0.2×SSC)、0.1重量％SDS(十二烷基硫酸钠)、0.01重量％鲑鱼精子DNA的溶液(各浓度均为终浓度)溶解至400μl，作为杂交用的储液。
在以下的实施例、比较例中，杂交时的试样溶液，除非特别指出，否则就使用以1重量％BSA，5×SSC，0.01重量％鲑鱼精子DNA，0.1重量％SDS的溶液(各浓度均为终浓度)将上述调制的储液稀释200倍的稀释液。并且，在测定该溶液的试样DNA的浓度时，浓度为1.5ng/μl。
(玻璃小珠的修饰)
将10g直径为150μm的玻璃小珠浸渍于10N NaOH溶液后，用纯水洗涤。接着，以2重量％的比例将APS(3-氨基丙基三乙氧基硅烷；信越化学工业(股份)制)溶解于纯水后，浸渍上述玻璃小珠1小时，从溶液中取出后于110℃干燥10分钟。这样一来，在玻璃小珠表面导入了氨基。
接着，使5.5g无水琥珀酸溶解于335ml 1-甲基-2-吡咯烷酮中。在上述琥珀酸溶液中加入1M的50ml的硼酸钠(加入3.09g硼酸和用于调整pH的氢氧化钠，用纯水加至50ml。pH8.0)。将上述玻璃小珠浸渍于这种混合液中20分钟。浸渍后，用纯水洗涤并干燥。这样一来，通过使玻璃小珠表面的氨基与无水琥珀酸反应，在玻璃小珠表面导入羧基。
(杂交)
使上述试样DNA与由上述获得的固定了探针DNA的载体杂交。具体的是，先向将制备的探针核酸固定在凸部的载体上滴下50μl杂交用的溶液，在载体凹部混合2mg实施了上述修饰的玻璃小珠，在其上盖上盖玻片。此外，用胶纸(paperbond)在盖玻片周围封闭，使杂交的溶液不干燥。该盖玻片面上，其4边中，相对的两边上通过光版印刷法形成厚度为8μm，宽度为1mm的光刻胶。这样一来在杂交时，载体凸部与盖玻片的距离(缝隙)可以为8μm。将其固定在设置于微管旋转器(アズワン制，商品编号：1-4096-01)的旋转面上的塑料容器中，在65℃，100％湿度条件下温育10小时。此时，旋转器的旋转数为3rpm，旋转器的旋转面与水平面成直角。进一步地，使载体的探针DNA固定面与旋转器的旋转面成直角。温育后，从载体剥离盖玻片后清洗载体，干燥。
(测定)
将上述处理后的载体置于DNA芯片用扫描仪(Axon Instrument公司的GenePix 4000B)中，激光输出33％，光电倍增管的电压设定为500的状态进行测定。其结果示于表1。其中，所谓荧光强度是指位点内的荧光强度的平均值。
并且，本实施例中，使用玻璃小珠，即使使用陶瓷小珠、特氟隆(注册商标)小珠也可以获得与表1大致相同的结果。
比较例1
进行不加入玻璃小珠时的实验。实验步骤除了在杂交时不混合玻璃小珠之外均以与实施例1相同方式进行。结果示于表1。
可以确认荧光强度比实施例1低。进而，对于比较例1，载体凸部的荧光强度分布不均一(圆环状分布)，相反，实施例1的结果是载体凸部的荧光强度几乎均一。
比较例2
进行在使用没有设置凹凸部的平坦PMMA载体情况下的实验。实验步骤除以下之外均以与实施例1相同方式进行：(1)使用平坦的载体，(2)用专用仪器(日本激光电子(股份)制，genestamp II)进行探针DNA的点样，(3)进而，在盖玻片面的四边上贴上厚度为200μm，宽度为1mm的聚酯薄膜，为了进行小珠搅拌在载体与盖玻片间设置缝隙，在该缝隙间混合小珠与试样溶液从而进行杂交。结果示于表1。清楚了荧光强度比实施例1低。进而，还确认了实施例1中没有发现的位点的损伤。我们推测原因在于杂交时小珠损伤了探针固定化面。
此外，在小珠的直径为1μm进行本比较例和实验时，荧光强度比1500左右更低。我们推测原因在于由于杂交溶液的抵抗，故观察到小珠难以移动的现象。
实施例2
进行了利用气泡的搅拌效果的实验。实验步骤除以下之外均与实施例1相同：杂交过程中盖上盖玻片时用微量注射器注入0.9μL气泡，不加入玻璃小珠。此外，固定载体以使倾斜于垂直方向的旋转器的旋转面与载体的探针固定化面平行，使之旋转，使气泡仅在封闭的试样溶液的周围移动。这样一来，使气泡不与探针的固定化面接触。结果示于表1。可以确认到与实施例相同的效果。
实施例3
使用图2所示的截面结构的容纳溶液的容器4代替盖玻片进行与比较例2相同的实验。也就是说，在盖中设置凹凸而不是在载体上，这种容器与平坦的PMMA载体的位置关系如图2所示小心配置。然后，如果一边使小珠移动一边进行杂交时，由于探针DNA的固定化面与容纳溶液的容器4之间的距离比玻璃小珠2的直径小，就可以使玻璃小珠不与探针DNA的固定化面1接触而移动。结果示于表1。关于荧光强度，可以获得与实施例1相同的结果。如果结合考虑比较例2的结果，可以认为小珠不与探针固定化面接触十分重要。在本实施例的方法中，正确进行盖的凸部和固定探针部分的位置相对应十分重要。
比较例3
进行了载体为不设置凹凸部的平坦PMMA载体，并且不进行通过小珠搅拌时的实验。除了在杂交溶液中不混合小珠，不进行旋转之外，其余均以与比较例2相同的操作和测定。结果示于表1。
[表1]
Figure 200580009083XA00800011
实施例4
选择5种实施例1中的玻璃小珠的尺寸进行实验。实验步骤与实施例1相同，以直径大小为10，20，50，100，200μm的玻璃小珠进行。结果示于表2中。
比较例4
除了以300μm，400μm作为玻璃小珠的直径尺寸之外，进行与实施例1相同的实验。其结果示于表2。
[表2]
根据上述内容，如果使用10-200μm的小珠就可以清楚地观察到搅拌效果，用比较例4的300，400μm的小珠无法获得显著的效果。这是因为，由于载体凹部与盖玻片之间的距离为208μm，在其中间强制地放置300，400μm的小珠，夹在盖玻片与载体间，无法移动。根据实施例和比较例，清楚了在小珠无法移动时，荧光强度弱。此外，根据实施例4，清楚了小珠尺寸的优选尺寸在10μm或10μm以上，更优选为20μm或20μm以上。
实施例5
用具有以下特征形状的载体进行与实施例1相同的实验。载体的中央设置有直径为10mm，深度为0.3mm的凹陷部分，在凹陷部分中，64个位点设置有直径为0.2mm，高度为0.3mm的凸部。载体的其它特征和实验步骤与实施例1相同。此外，玻璃小珠的直径为10，20，50，100，200，300μm。结果示于表3。
比较例5
除了以400μm作为玻璃小珠的直径尺寸之外，进行与实施例5相同的实验。其结果示于表3。
[表3]
根据上述内容，如果使用10-300μm的小珠就可以清楚地观察到搅拌效果，用400μm的小珠无法获得显著的效果。这是因为，由于载体凹部与盖玻片之间的距离为308μm，在其中间强制地放置400μm的小珠，夹在盖玻片与载体间的小珠无法移动。根据实施例和比较例，清楚了在小珠无法移动时，荧光强度弱。此外，根据实施例5，清楚了小珠尺寸的优选尺寸在10μm或10μm以上，更优选为20μm或20μm以上。
实施例6
对于凸部的高度参差不齐的情况进行实验。用包装纸(ラツピンクペ一パ一)削实施例1中使用的PMMA的注射成型品的凸部，给凸部上面的高度设置差距。也就是说，分别制备具有比其它的凸部上面(作为基准的凸部)低30μm的凸部(4个位点)的载体(载体1)，具有比其它的凸部上面低50μm的凸部(4个位点)的载体(载体2)。并且，这些载体的较低部分以外的凸部(作为基准的凸部)上面的高度与平坦部分的高度差为3μm或3μm以下。与实施例1相同方式进行点样探针DNA的调整。接着，在作为基准的凸部上面4个位点、在较低凸部上面的4个位点处以与实施例1相同方式进行探针DNA溶液的点样，而且与实施例1同样地进行杂交用试样DNA的调整。杂交和测定也以与实施例1相同方式进行。作为基准的凸部上面的荧光强度的平均值，高度低的凸部上面的荧光强度的平均值示于表4。
[表4]
Figure 200580009083XA00800031
这样，清楚了凸部的高度即使有差异(50μm或50μm以下)，也可以获得与实施例1、2相同的荧光强度。
实施例7
对凸部上面与平坦部存在高度差的情况进行研究。用包装纸削实施例1中使用的PMMA的注射成型品的平坦部，制备平坦部上面与凸部上面的高度差为30μm(载体3)，50μm(载体4)这两种载体。也就是说，载体3凸部的高度比平坦部的高度高30μm。实验步骤以与实施例1相同方式进行点样的探针DNA的调整，探针DNA溶液向凸部上面的点样，试样DNA的调整，玻璃小珠的修饰。杂交使用在实施例1中的盖玻片上贴硅片(厚度为60μm)来代替形成聚合物的方式进行。并且，对于各个载体，在上面点样DNA溶液的凸部为4个位点。然后，求出点样DNA的位点(4个位点)的荧光强度的平均值。其结果示于表5。
[表5]
Figure 200580009083XA00800041
这样，清楚了即使存在平坦部上面与凸部上面的高度差(50μm或50μm以下)，也可以获得与实施例1相同的荧光强度。
实施例8
将实施例1中的盖玻片和用胶纸(paperbond)封闭的基板置于Vortex(Scientific Industries，Inc.制)中，进行通过振荡使玻璃小珠移动从而搅拌杂交时的实验。实验步骤除了置于Vortex中以代替旋转器之外，其余以与实施例1相同方式进行。结果示于表6。显示出强荧光强度。
实施例9
进行在杂交时混合磁性小珠，通过使周围磁场改变使磁性小珠移动从而搅拌杂交溶液的实验。首先，制作如图8所示的磁石往返运动的机器。实验步骤(DNA固定化载体的制备)(探针DNA的固定化)(试样DNA的调整)(测定)以与实施例1相同方式进行。杂交除以下之外均以与实施例1相同方式进行：在载体凹部混合1mg直径为50μm的磁性小珠(Trial株式会社制)以代替玻璃小珠，置于前述制备的机器中以代替旋转器。结果示于表6。显示出强荧光强度。
比较例6
使用不设置凹凸部的平坦PMMA载体进行与实施例9相同的实验。实验步骤除以下之外均与实施例1相同：(1)使用平坦的载体，(2)用专用仪器(日本激光电子(股份)制，genestamp II)进行探针DNA的点样，(3)进而，在盖玻片面的四边上贴上厚度为200μm，宽度为1mm的聚酯薄膜，为了通过磁性小珠进行搅拌在载体与盖玻片间设置缝隙，在该缝隙间混合磁性小珠与试样溶液从而进行杂交，(4)在图8所示的制作的机器中的设置为将盖玻片面向下。可以预计的是，通过使盖玻片面向下，磁性小珠被吸引到盖玻片面上，不与对面的探针固定化面接触而搅拌溶液。结果示于表6。只获得比实施例9更弱的荧光强度。进而，确认了在实施例9中没有发现的位点的损伤。在比较例6中，被磁石吸引的磁性小珠凝聚到用聚酯薄膜设立的宽度为200μm的一周而聚成块，由于使其照块样移动，因此该块与探针固定化面接触。
[表6]
Figure 200580009083XA00800051
实施例10
除了使用直径为125μm的用三氧化二钇稳定化氧化锆(以2.5mol％的比例在氧化锆中混合三氧化二钇)制备的小珠之外，进行与实施例1相同的实验。其结果是，杂交后的荧光强度几乎相同。但是，混合2mg小珠，在其上盖上盖玻片时，即使溶液移动，小珠也难以移动，容易设定。这是因为氧化锆的比重为6.05g/cm3，其接近于玻璃的3倍。
实施例11
使用将试样DNA的浓度调制成0.73，0.29，0.15ng/μl的溶液进行与实施例1相同的实验。结果示于图9。图9中还结合记载了实施例1与比较例1的结果。
比较例7
使用将试样DNA的浓度调制成0.73，0.29，0.15ng/μl的溶液进行与比较例1相同的实验。结果示于图9。图9中还结合记载了实施例1与比较例1的结果。
在这样的4种条件的试样浓度下还可以确认出使用小珠搅拌的效果。
实施例12
通过DNA芯片进行SNP(单核苷酸多态性)的检测实验。实验步骤(DNA固定化载体的制备)(试样DNA的调制)(玻璃小珠的修饰)(杂交)(测定)以与实施例1相同方式进行。试样DNA的浓度为1.5ng/μl。但是，在42℃进行杂交。合成5’末端氨基化的序列号6，序列号7的DNA，用作探针DNA。序列号6和7仅1个碱基不同。两个探针的5’侧的10碱基T序列没有与试样DNA的互补性，序列号6中除去该段序列的部分(20个碱基)与试样DNA完全互补。用与实施例1相同的步骤将这两种DNA固定在载体凸部。结果示于表7。通过本发明的方法，可以检测出这两种探针DNA的一个碱基的差异。
[表7]
Figure 200580009083XA00800061
工业上利用的可能性
通过本发明，可以提供一种促进固定在载体上的选择结合性物质与被检物质的反应，即使在微量的试样中信号强度和S/N比也良好的搅拌方法。也就是说，通过使用本发明的搅拌方法，可以提高以DNA芯片为代表的选择结合性固定化载体的信号强度、S/N比(即，可以提高敏感度)，即使是微量的临床试样也可以测定。通过本发明，使用以DNA芯片为代表的选择结合性物质固定化载体可以在临床现场诊断和诊察。

Claims (6)

1.一种搅拌微量溶液的方法，其是一种使含有与选择结合性物质反应的被检物质的溶液与固定在载体表面的选择结合性物质接触，搅拌该溶液的方法，其在含有被检物质的溶液中混合微粒，使微粒不与选择结合性物质的固定化面接触而移动从而搅拌溶液，其中在载体上设置凹凸部，并将选择性结合物质固定在该凸部上面上，在载体的凹部内放置微粒，其中微粒的最小宽度比载体的凸部上面与容纳溶液的容器之间的最短距离大，通过重力、磁力、载体的振动中的任一种或是它们的组合使微粒移动。
2.一种搅拌微量溶液的方法，其是一种使含有与选择结合性物质反应的被检物质的溶液与固定在载体表面的选择结合性物质接触，搅拌该溶液的方法，其在含有被检物质的溶液中混合微粒，使微粒不与选择结合性物质的固定化面接触而移动从而搅拌溶液，其中在容纳溶液的容器上设置凹凸部，并将选择性结合物质固定在该凸部下的载体表面，在容纳溶液的容器的凹部内放置微粒，其中微粒的最小宽度比容纳溶液的容器的凸部上面与载体之间的最短距离大，通过重力、磁力、载体的振动中的任一种或是它们的组合使微粒移动。
3.根据权利要求1记载的搅拌微量溶液的方法，其在载体上设置平坦部和凹凸部，选择结合性物质被固定在多个凸部上面，所述凸部上面的高度大致相同，并且平坦部分和凸部上面的高度差为50μm或50μm以下。
4.根据权利要求1或2记载的搅拌微量溶液的方法，其中微粒的最大宽度为10μm或10μm以上，凸部上面和凹部的高度差之下。
5.根据权利要求1或2记载的搅拌微量溶液的方法，其中选择结合性物质是核酸。
6.根据权利要求1或2记载的搅拌微量溶液的方法，其使选择结合性物质与被检物质反应。
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