CN1931230A - 一种狭基线纹香茶菜提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种狭基线纹香茶菜提取物,该提取物可由下述方法获得:将10目以上的狭基线纹香茶菜粉末,用不少于3倍的水,在10~60兆帕压力差的条件下提取,浓缩,得到狭基线纹香茶菜提取物。本发明提取物制备成临床上可接受的治疗乙型肝炎、免疫性肝炎、酒精性肝炎和肝纤维化的各种口服制剂。本发明所述的提取物采用超微粉碎、高压提取工艺,不仅提取率高,而且把狭基线纹香茶菜中的有效药物成分充分的提取出来,从而提高了治疗乙型肝炎、免疫性肝炎、酒精性肝炎和肝纤维化的效果,尤其是对免疫性肝炎的疗效有很大的提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种中草药提取物,具体涉及一种狭基线纹香茶菜提取物。
背景技术
狭基线纹香茶菜是香茶菜属植物,是溪黄草的一种,主要出产于广东地区,具有清热利湿、退黄、凉血散瘀之功能;临床上用于治疗湿热黄疸、黄疸性肝炎、急性胆囊炎,有显著疗效。
国家知识产权局于2003年03月26日公开了一项“一种治疗肝炎的天然药物溪黄草提取物”(公开号为CN1405177)的发明专利申请,该申请采用三种提取工艺——醇提法、水提法和超临界二氧化碳流体萃取法,提取出一种含有2-羟基熊果酸、2,3一二羟基熊果酸以及抗氧化活性成分迷迭香酸等抗病毒活性成分的提取物。将该提取物作为活性成分,与适宜的赋形剂相结合,制成各种药物制剂,包括颗粒剂、片剂、胶囊、口服液等口服剂型,以及注射剂型,用于各种病毒性肝炎尤其是乙型肝炎的治疗。虽然该提取物具有抑制乙肝病毒复制、保护免疫性肝损伤、提高细胞免疫力、增加免疫低下实验动物的脾脏和胸腺重量和增加胆汁排泄等作用,但该提取物的得率较低,其保护免疫性肝损伤的药物活性作用不够理想。
发明内容
鉴于上述技术的不足,本发明要解决的技术问题是进一步提高狭基线纹香茶菜提取物保护免疫性肝损伤的药物活性作用。
本发明解决上述技术问题的技术方案是:
一种狭基线纹香茶菜提取物,该提取物由下述方法提取得到:将10目以上的狭基线纹香茶菜粉末,用不少于3倍的水,在10~60兆帕压力下提取,得到狭基线纹香茶菜提取物。
本发明所述的一种狭基线纹香茶菜提取物的制备方法,该方法由以下步骤组成:取狭基线纹香茶菜干品,粉碎至10目以上,加3~50倍水常温浸泡0.5~2小时后,用高压差连续提取器在压力为10~60兆帕下提取,所得提取液先经膜滤过进行固液分离,再经膜浓缩至膏状即可。
本发明所述的狭基线纹香茶菜提取物的制备方法,其中较佳的工艺参数是:将狭基线纹香茶菜干品粉碎至30目以上,加5~15倍水,浸泡1~1.5小时,高压差连续提取器内的工作压力为30兆帕。
上述制备方法中所用的提取设备是广州泽力医药科技有限公司生产的Zlp-1000型高压差连续提取器。
所述的膏状物还可以根据需要经过干燥成固体,其方法是常规的干燥方法,如常温干燥、冷冻干燥或真空干燥。
本发明提取物可采用中药制剂的常规制备方法加入口服制剂的辅料,制备成临床上可接受的治疗乙型肝炎、免疫性肝炎、酒精性肝炎和肝纤维化的各种口服制剂,如片剂、胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、滴丸剂、颗粒剂等。
本发明所述的口服制剂由本发明所述的狭基线纹香茶菜提取物和各种口服制剂的所需辅料混合制得。
本发明所述的狭基线纹香茶菜提取物采用超微粉碎、高压提取工艺,不仅得率远高于普通水提、醇提以及超临界提取方法,还把狭基线纹香茶菜中的有效药物成分充分的提取出来。本发明提取物具有抑制病毒复制和炎症介质释放、调节免疫功能、减少自由基损伤等作用,能有效治疗乙型肝炎、免疫性肝炎、酒精性肝炎和肝纤维化,尤其是对免疫性肝炎的疗效,与现有技术所得的狭基线纹香茶菜提取物相比有很大的提高。
下面将通过实验来证明本发明所述的狭基线纹香茶菜提取物具有的技术效果。
1.实验材料:
1.1本发明提取物:狭基线纹香茶菜干品粗粉20kg,超微粉碎,药粉可过60目筛,加水10倍常温浸泡1.5小时后用高压差连续提取器提取,压力30兆帕,提取液经膜滤过进行固液分离及膜浓缩,真空干燥成固体3.52kg。
1.2狭基线纹香茶菜甲醇提取物:取狭基线纹香茶菜干品粗粉4kg,用10倍量60%甲醇回流提取3次,每次2小时,过滤,合并滤液减压蒸除甲醇,残留物(甲醇总提取物)加入适量水,用石油醚(bp 60-90℃)充分提取,回收溶剂得石油醚可溶物与石油醚不溶物,不溶物经减压浓缩、冷冻干燥除尽溶剂,得固体564.1g。
1.3狭基线纹香茶菜水提物:取狭基线纹香茶菜干品4kg,加水,煎煮2次,第1次2小时,第2次1小时,合并提取液,高速(15000rpm)离心除去不溶物。上清液经减压浓缩、喷雾干燥的固体528.4g。
1.4狭基线纹香茶菜超临界提取物:取狭基线纹香茶菜干品粗粉4kg,用超临界二氧化碳流体(内含5%乙醇作为夹带剂),在40℃、压力10Mpa的条件下,在超临界二氧化碳流体萃取釜内进行循环提取,提取2小时后,在室温下,调整解析釜温度压力释放出二氧化碳,然后加石油醚充分脱脂脱色,将石油醚不溶解的部分经减压蒸馏、冷冻干燥除尽溶剂,得固体508.2g。
2.提取物得率对比
上述四种提取物的提取率如表1所示,本发明提取物的浸膏得率最大,为17.6%。与醇提物比较,提取率高出25%;与水提物比较,提取率高出33%;于超临界提取物比较,浸膏得率高出38%。
表1不同提取工艺所得狭基线纹香茶菜提取物的浸膏得率
项目 | 不同提取工艺所得狭基线纹香茶菜提取物的浸膏得率 | |||
甲醇提取物 | 水提取物 | 超临界提取物 | 本发明提取物 | |
浸膏得率(%) | 14.1% | 13.2% | 12.7% | 17.6% |
3.本发明提取物的抗病毒实验
3.1体外抗乙肝病毒实验
3.1.1材料:本发明提取物、三氮唑核苷(Ribavirin,病毒唑,由湖北省医药工业研究所提供);HepG2肝癌细胞株,引自北京302医院病毒室,置于DMEM培养液(购自GBICO公司)中,培养液添加10%小牛血清,100u/ml青霉素,100u/ml链霉素,G418 100ug/ml(购自GBICO公司),0.03%谷氨酰氨,用0.238%Hepes调pH至6.8。
3.1.2方法:用0.6%胰蛋白酶将HepG2肝癌细胞分散成单个细胞悬液,按3×104细胞/孔分种于96孔板,3-4d后换用含药培养液,每个浓度加四孔,药物与细胞作用四天后,再加10%DMEM(含G418)0.1ml/孔,第八天吸上清做ELISA测定HBsAg、HBeAg,余下细胞用MTT法测定药物细胞毒性,实验另设培养液空白对照组四孔,加100%DMSO 0.1ml/孔。细胞存活率(%)=(实验孔A值/对照孔A值)×100%,50%毒性浓度(TC50)为实验孔存活细胞为对照孔50%时的药物浓度。治疗指数(TI)为评价药物临床应用前景的参数,TI=TC50/IC50。
3.1.3HBsAg、HBeAg的检测:采用华美公司ELISA测定盒检测。抑制率(%)=[(对照孔P/N值-实验孔P/N值)/(对照孔P/N值-2.1)]×100%,50%抑制浓度(IC50)为HBsAg或HBeAg抑制率为50%时的药物浓度。
3.1.4评价标准
TI>2为有效低毒,1<TI<2为低效有毒,TI<1为毒性作用。
3.1.5结果
如表2所示,本发明提取物对HBsAg和HBeAg的分泌有明显抑制作用,且TI>2属有效低毒。
表2:药物对HBsAg和HBeAg的抑制效果及其细胞毒性
药物 | TC50 | HBsAg | HBeAg | ||
IC50 | TI | IC50 | TI | ||
本发明提取物 | >100 | 5.29 | >18.90 | 8.51 | >11.75 |
3.2体内抗鸭乙肝病毒实验
3.2.1材料
药物:本发明提取物,无环鸟苷(ACV,由湖北省医药工业研究所提供)。
动物:雄性一日龄广州麻鸭,购自广州辛村孵化场,批号96-4-17及97-12-4,体重40-50克/只,每组5-11只。
病毒:鸭乙型肝炎病毒DHBV-DNA强阳性血清,采自上海麻鸭,-70℃保存。
试剂:鸭乙型肝炎病毒(DHBV)DNA质粒引自中国医学院医药生物技术研究所;NC膜购自Amersham公司;缺口翻译药盒为Promega公司产品;缺口翻译药盒购自promega公司;α-32p-dCTP,购自北京亚辉公司;Sephadex G-50,购自Pharmacia公司。
3.2.2方法
一日龄广州麻鸭,经腿静脉注射上海麻鸭DHBV-DNA阳性血清,每只0.2ml,在感染后13天取血,分离血清,-70℃保存待检。DHBV感染雏鸭13天后随机分组进行药物治疗试验,每组5-11只不等:(1)本发明提取物治疗组,10g/kg/天;(2)病毒对照组,以生理盐水代替药物;(3)无环鸟苷治疗组200mg/kg/天,1天2次。共给药14天一疗程,在感染后第13天即用药前(T0),用药第7天(T7)用药第14天(T14)和停药后第3天(P3),自鸭腿胫静脉取血,分离血清-70℃保存待检。
3.2.3DHBV-DNA检测方法:取上述鸭血清,每批同时点膜,测定鸭血清中DHBV-DNA水平的变化,按缺口翻译试剂盒说明书方法,用32P标记DHBV-DNA探针,并作鸭血清斑点杂交,放射自显影膜片斑点,在酶标检测仪上测定490nm处OD值,计算血清DHBV-DNA密度。
3.2.4结果
如表3所示,本发明提取物10g/kg/天剂量组给药14天(T14)时有显著体内降低DHBV感染鸭血清DHBV-DNA水平作用,给药7天(T7)亦能降低DHBV感染鸭血清DHBV-DNA水平,停药3天(P3)后病毒水平稍有反跳。
表3本发明提取物在鸭体内对DHBV-DNA的抑制作用
组别 | 鸭数(只) | OD490值(X±SD) | |||
T0 | T7 | T14 | P3 | ||
病毒对照组 | 5 | 1.53±0.11 | 1.37±0.43 | 1.36±0.21 | 1.10±0.33 |
本发明提取物治疗组 | 11 | 1.36±0.29 | 1.24±0.33 | 0.97±0.35*△ | 1.13±0.41 |
无环鸟苷治疗组 | 5 | 1.75±0.22 | 1.66±0.47 | 1.19±0.24** | 1.75±0.20 |
注:*与自身给药前(T0)对比P<0.05,**与自身给药前(T0)对比P<0.01,△与同期对照组比较P<0.05;△△与同期对照组比较P<0.01。
4.本发明提取物对免疫性肝损伤的保护作用
4.1对卡介苗加脂多糖所致小鼠免疫性肝损伤的保护作用
4.1.1药物:本发明提取物,狭基线纹香茶菜水提物、狭基线纹香茶菜甲醇提物、狭基线纹香茶菜超临界提取物,制备方法见第1节;卡介苗为市售。
4.1.2方法:将实验小鼠随机分组,造模组及用药组(15g/Kg体重)每只尾静脉各注射卡介苗(BCG,含菌量约5×106/只)0.2ml,对照组注射等容积生理盐水0.2ml。12天后每只尾静脉注射脂多糖(LPS,浓度约10ug/鼠)0.2ml,用药组每日给药1次,感染BCG后12天,末次给药2h后,静脉注射脂多糖10ug/鼠,16h后测血清转氨酶水平。
4.1.3结果
如表4所示,本发明提取物对小鼠有很好的保护作用,在给药量总量大致相同条件下,本发明提取物的降酶药效明显强于其它提取物的药效。
表4狭基线纹香茶菜不同提取物对BCG+LPS诱导的小鼠免疫肝损伤的保护作用(x±s)
组别 | 动物数(只) | 剂量(g/Kg) | ALT(U/L) | AST(U/L) |
BCG+LPS对照组溶媒对照组狭基线纹香茶菜水提物治疗组狭基线纹香茶菜甲醇提取物治疗组狭基线纹香茶菜超临界提取物治疗组本发明提取物治疗组 | 1112101098 | --21.91.91.8 | 29.2±4.98**19.61±8.2122.21±4.0123.60±3.9820.35±4.2521.60±4.78 | 78.36±10.38**38.07±7.5555.37±9.42*54.14±8.46*60.33±6.07*48.25±5.69* |
注:*与BCG+LPS对照组比较,**p<0.01;*p<0.05。
4.2对刀豆蛋白所致小鼠免疫性肝损伤的保护作用
4.2.1药品:本发明提取物、狭基线纹香茶菜水提物、狭基线纹香茶菜醇提物、狭基线纹香茶菜超临界提取物,制备方法见第1节,刀豆蛋白(Con A),购于晶美公司。
4.2.2方法:将实验小鼠随机分组,造模组及用药组(15g/Kg体重)连续给药三天,第四天早上除对照组外每只小鼠尾静脉注射刀豆蛋白16mg/kg,于造模后及当天下午、第二天下午继续给药。末次给药后4h,模型组和给药组各鼠一次性尾静脉注射刀豆蛋白16mg/kg。12h后检测小鼠血清/肝组织中AST、ALT、SOD、MDA、NO含量。
4.2.3.结果
如表5所示,本发明提取物能显著降低血清ALT、AST水平及肝组织中MDA、NO的水平,并提高SOD活性,且接近溶媒对照组,对Con A所致免疫性肝损伤有很好的保护作用。在给药量大致相同条件下,本发明提取物的降酶及提高SOD活性的药效明显强于其它提取物的药效。
表5狭基线纹香茶菜对Con A所致免疫性肝损伤小鼠血清/肝组织中
AST、ALT、SOD、MDA、NO含量的影响(X±SD,n=12)
组别 | 动物数(只) | 剂量(g/Kg) | ALT(U/L) | AST(U/L) | MDA(nmol/L) | SOD(U/mg) | NO(nmol/L) |
Con A对照组溶媒对照组狭基线纹香茶菜水提物狭基线纹香茶菜醇提物狭基线纹香茶菜超临界提取物本发明提取物 | 111212121212 | --21.91.91.8 | 97.832±12.21943.059±5.54370.574±17.521**68.384±15.220**72.031±18.065**59.670±5.818** | 121.846±28.85654.775±13.72188.354±13.254*87.558±15.111*90.348±18.144*77.566±13.406** | 7.743±1.9834.132±1.0004.235±0.404**4.5211±0.427**4.314±0.517**4.182±0.421** | 83.01±26.12130.36±12.0698.751±16.23399.258±18.02297.645±15.245107.12±7.72 | 15.697±1.44412.470±1.61313.004±1.528**12.978±1.457**12.680±1.324**12.266±0.804** |
注:*与Con A对照组比较,**p<0.01;*p<0.05。
5.本发明提取物对酒精性肝损伤的保护作用
5.1本发明提取物对急性酒精中毒的保护的保护作用
5.1.1药品:本发明提取物、狭基线纹香茶菜水提物、狭基线纹香茶菜醇提物、狭基线纹香茶菜超临界提取物,制备方法见第1节,北京红星二锅头为市售。
5.1.2方法:将实验小鼠随机分组,造模组及用药组(15g/Kg体重)。连续给药7天,第七天动物禁食不禁水,并于最末1次给药后2小时,除对照组灌服等容量的生理盐水外,其余各组均灌服60%酒精溶液20mL/kg,继续禁食。12小时后眼眶静脉丛采血,分离血清检测ALT、AST的含量。
5.1.3结果
如表6所示,用酒精诱导的急性酒精中毒肝损伤模型小鼠血清ALT、AST活性明显升高,本发明提取物能显著降低血清ALT、AST水平,说明本发明提取物对急性酒精中毒肝损伤模型有保护作用;在给药量大致相同条件下,本发明提取物的药效略强于其它提取物的药效。
表6狭基线纹香茶菜对急性酒精中毒的保护作用(x±s)
组别 | 动物数(只) | 剂(g/Kg) | ALT(U/L) | AST(U/L) |
酒精对照组溶媒对照组狭基线纹香茶菜水提物狭基线纹香茶菜醇提物狭基线纹香茶菜超临界提物本发明提取物 | 101210101011 | --21.91.91.8 | 68.4±22.928.3±6.5**41.1±9.2*43.5±8.0*42.4±8.7*41.0±7.6* | 150.5±25.478.5±10.1**145.7±13.1*150.1±18.4*142.6±12.4*137.0±13.1 |
注:*与酒精对照组比较,**p<0.01;*p<0.05。
5.2本发明提取物对酒精性脂肪肝的保护作用
5.2.1药品:本发明提取物,酒精、猪油为市售。
5.2.2将实验大鼠随机分组,造模组上午灌服55°乙醇溶液10ml/kg,下午灌服10ml/kg饮用水;各给药组每天上午灌服55°乙醇溶液10ml/kg,下午灌服药液10g/kg。造模组、给药组饲以自制20%的高脂饲料,自由饮水。对照组每天上、下午分别灌服10ml/kg饮用水;饲以正常饲料,自由饮水。造模3周后处死各组动物。测体重,取肝称重,计算肝脏器系数,并作病理切片观察。
5.2.3结果
如表7所示,用酒精及高脂饲料诱导的酒精性脂肪肝损伤模型大鼠肝脏肿大严重病理损伤程度明显,而本发明提取物能显著降低肝脏的肿大程度及减轻病理损伤,说明本发明提取物对大鼠酒精性脂肪肝有保护作用。
表7狭基线纹香茶菜对酒精性脂肪肝损伤的保护作用(x±s)
组别 | 动物数(只) | 剂量(g/Kg) | 肝脏系数(%) | 病理损伤程度 |
酒精+猪油对照组溶媒对照组联苯双酯组本发明提取物组 | 812910 | --0.601.8 | 4.5±0.553.5±0.46**4.7±0.493.9±0.36* | ++++++++++++ |
注:*与酒精+猪油对照组比较,**p<0.01;*p<0.05。
6.本发明提取物抗四氯化碳所致大鼠肝纤维化的作用
6.1药物:本发明提取物如第一节所述;四氯化碳,广州化学试剂厂提供。
6.2动物:Wistar大鼠,清洁级,雌雄各半,体重为160~180g;均由广州中医药大学动物中心提供。
6.3方法:取Wistar大鼠,随机分为正常组、模型组、狭基线纹香茶菜给药组。模型组及狭基线纹香茶菜给药组动物饲每隔3天皮下注射30%CCl4花生油溶液3ml/kg。各组动物均给予全颗饲料并自由饮水;狭基线纹香茶菜给药组给药剂量为10g/kg/d。造模8周后,处死各组动物,取血分离血清,检测AST,并取肝组织作病理切片检查。
6.4结果
如表8所示,在化学毒物所致的慢性肝损伤的药效实验中本发明提取物可显著抑制四氯化碳慢性肝损伤大鼠和胸腺萎缩有作用,减轻肝肿大及纤维化程度。
表8药物对CCl4所致大鼠慢性肝纤维化的主要脏器系数、
AST含量、肝组织的影响(
x±s)
组别 | 肝脏系数(%) | 胸腺系数(%0) | AST(IU/L) | 损伤程度 |
空白组模型组本发明提取物 | 3.68±0.475.00±0.27##4.77±0.14## | 1.32±0.210.66±0.19##0.89±0.25##* | 166±42.9515±86.1##494±74.8## | -/+(正常)++++(纤维化)+++(纤维化) |
注:与正常对照组比较:#P<0.05##P<0.01;与模型组比较:*P<0.05**P<0.01
具体实施方式
一、制备例:
例1:
取狭基线纹香茶菜干品20kg,超微粉碎成10目以上的粉末,加3倍水常温浸泡1.5小时后用高压差连续提取器提取,压力10兆帕。提取液经真空浓缩至1倍量体积,即可。
例2:
取狭基线纹香茶菜干品20kg,超微粉碎成20目以上的粉末,加10倍水常温浸泡1.5小时后用高压差连续提取器提取,压力10兆帕,提取液经膜固液分离浓缩,常温干燥成固体3.26kg。
例3:
取狭基线纹香茶菜干品20kg,超微粉碎成100目以上的粉末,加10倍水常温浸泡1.5小时后用高压差连续提取器提取,压力10兆帕,提取液经膜浓缩至1倍量体积,真空干燥成固体3.40kg。
例4:
取狭基线纹香茶菜干品20kg,超微粉碎成20目以上的粉末,10倍量水常温浸泡1.5小时后用高压差连续提取器提取,压力40兆帕。提取液经膜浓缩至1倍量体积,冷冻干燥成固体3.47kg。
例5:
取狭基线纹香茶菜干品20kg,超微粉碎成60目以上的粉末,加10倍水提取,常温浸泡1.5小时后用高压差连续提取器提取,压力30兆帕。提取液经固液分离,常压干燥,即得固体3.52kg。
例6:
取狭基线纹香茶菜干品20kg,超微粉碎成100目以上的粉末,加3倍量水常温浸泡1.5小时后用高压差连续提取器提取,压力60兆帕。提取液经膜滤过进行固液分离及膜浓缩,真空干燥成固体2.92kg。
二、应用例
例1:(片剂)
取实施例1所得浸膏每20g加淀粉至250g,混匀,制成颗粒,60℃以下干燥,压制成1000片(0.25g/片),包薄膜衣,即得。服用剂量为:每天2次,每次2丸。
例2:(胶囊剂)
取实施例1所得浸膏每20g加淀粉至370g,混匀,制成颗粒,60℃以下干燥,过筛,装入1号胶囊,制成硬胶囊1000粒(0.37g/粒)。服用剂量为:每天2~3次,每次1~2粒。
例3:(软胶囊剂)
取实施例1所得浸膏每20g加入花生油至250g,混匀,制成软胶囊1000粒(0.25g/粒)。服用剂量为:每天2~3次,每次1~2粒。
例4:(丸剂)
取实施例6所得浸膏加适量水调为膏状,每20g加淀粉炼蜜至1000g,泛丸,制成丸剂1000丸(1g/丸)。服用剂量为:每天2~3次,每次1~2粒。
例5:(滴丸剂)
取实施例6所得浸膏加适量水调为膏状,每20g加聚乙二醇,混匀,滴入冷却的二甲硅油中,制成滴丸1000丸(0.21g/丸)。服用剂量为:每天2次,每次2丸。
例6:(颗粒剂)
取实施例6所得浸膏加适量水调为膏状,每20g加淀粉至250g,混匀,制成颗粒,60℃以下干燥,分装成500袋(1g/袋)。服用剂量为:每天1~2次,每次1袋。
Claims (5)
1、一种狭基线纹香茶菜提取物,该提取物由下述方法提取得到:将10目以上的狭基线纹香茶菜粉末,用不少于3倍的水,在10~60兆帕压力的条件下提取,浓缩,得到狭基线纹香茶菜提取物。
2、权利要求1所述的狭基线纹香茶菜提取物的制备方法,该方法由以下步骤组成:取狭基线纹香茶菜干品,粉碎至10目以上,加3~50倍量水常温浸泡0.5~2小时后,用高压差连续提取器在压力为10~60兆帕的条件下提取,提取液先经膜滤过进行固液分离,再经膜浓缩至膏状即可。
3、根据权利要求2所述的狭基线纹香茶菜提取物的制备方法,其特征是其中所述的工艺参数是:将狭基线纹香茶菜干品粉碎至30目以上,加5~15倍水,浸泡1~1.5小时,高压差连续提取器内的工作压力为30兆帕。
4、权利要求1所述的狭基线纹香茶菜提取物可制备成临床上可接受的治疗乙型肝炎、免疫性肝炎、酒精性肝炎和肝纤维化的口服制剂。
5、根据权利要求5所述的口服制剂,其特征是所述的口服制剂是片剂、胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、滴丸剂或颗粒剂。
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