CN105837550A - 天然不对称环丁烷衍生物和其药物组合物 - Google Patents

天然不对称环丁烷衍生物和其药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种天然来源的不对称环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和B，分子式均为C38H54O5，英文名分别为Scopariusicide A和Scopariusicide B，它们的制备方法和在制备免疫抑制药物中的应用。该类化合物是从自然界中发现的罕见的具有对映‑克罗烷型二萜片段和苯丙素片段的不对称环丁烷衍生物。以唇形科香茶菜属植物帚状香茶菜[Isodon scopariusC.Y.Wu et H.W.Li(Dunn)Kudo]的茎叶为原料，通过有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析、高压液相色谱分离、结构鉴定等步骤而分离鉴定。经抑制抗CD3和CD28单克隆抗体诱导的人T细胞增殖活性测试表明，本发明的化合物结构新颖，且具有生物活性，对T细胞株表现了抑制活性，作为免疫抑制剂的先导化合物。

Description

天然不对称环丁烷衍生物和其药物组合物
技术领域
本发明属于天然有机化学领域，具体涉及一种天然不对称环丁烷衍生物和其提取分离的方法和应用，特别是涉及一种天然环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和B，其药物组合物和其制备方法和应用。
背景技术
香茶菜属植物是我国的地区药用植物资源，常作为草药在我国民间广泛使用。它们大都具有清热解毒、抗炎抗菌、抗肿瘤等功效。该属植物富含结构多样的活性二萜化合物，部分二萜化合物具有良好的抗肿瘤、细胞毒性、抗菌和免疫抑制等活性，如毛萼乙素和旱生香茶菜乙素具有显著的抗肿瘤活性，部分香茶菜属植物的有效成分已在临床上应用。帚状香茶菜[Isodon scoparius C.Y.Wu et H.W.Li(Dunn)Kudo]是分布在云南的一种香茶菜属植物，主要用于治疗人和牲畜的消化系统炎症以及外部感染等。研究表明，该种植物含有丰富的结构新颖的二萜化合物。目前，现有技术中未见有天然提取的不对称环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和B及其活性的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新颖的不对称环丁烷衍生物，以该不对称环丁烷衍生物为活性成分的药物组合物，该不对称环丁烷衍生物的制备和鉴定方法，该不对称环丁烷衍生物在制备免疫抑制药物中的应用。
本发明的上述目的是通过下述的技术方案加以实现的：
如下结构式所示的天然不对称环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和B，
所述的天然不对称环丁烷衍生物是以唇形科香茶菜属植物帚状香茶菜的茎叶为原料，通过有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析、高压液相色谱分离、结构鉴定步骤进行分离和鉴定所 得。
该两个化合物分子式均为C38H54O5，英文名分别为scopariusicide A和scopariusicide B，是具有对映-克罗烷型二萜片段和苯丙素片段的不对称环丁烷衍生物。
所述的不对称环丁烷衍生物的制备方法：以唇形科香茶菜属植物帚状香茶菜的茎叶为原料，通过有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析、高压液相色谱分离、结构鉴定步骤进行分离和鉴定：
A、萃取物的制备：将帚状香茶菜茎叶的粉末加入提取罐中，加入有机溶剂，在超声辅助下提取2～5次，每次30～60分钟，过滤后合并提取液，减压浓缩得到提取液；将该提取液分散在水中，分别用水体积1～2倍的乙酸乙酯萃取2～4次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩得到萃取物a；其中所述的有机溶剂为体积含量为80～100％的乙醇、70～100％的丙酮、80～100％的甲醇或乙酸乙酯中任意一种；
B、硅胶柱层析：将A步骤所得的萃取物a用重量比为1.5-3倍量的甲醇或者丙酮中的任意一种溶解，用萃取物重量比为1～1.5倍的80～100目硅胶拌样，挥发干溶剂后装入硅胶柱，装柱硅胶为200～300目，用量为萃取物a重量的6～10倍；用体积比为1:0～0:1的混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液并减压浓缩，经TLC或分析型HPLC监测，合并组分相同的洗脱液，得到粗品b；其中所述的混合有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、或石油醚中任意的一种和甲醇、乙酸乙酯或丙酮中任意的一种，其体积配比为19:1，9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，1:2和0:1；
C、反相柱层析：将步骤B得到的粗品b上反相柱层析，反相柱是用反相材料C-18、Rp-18或者MCI中任意一种填充，用体积含量为50～100％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并含有环丁烷衍生物的部分，得到粗品c；
D、高效液相色谱纯化：将步骤C中得到的粗品c经半制备高效液相色谱分离纯化，即得所述的不对称环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和帚状香茶菜内酯B，英文名分别为scopariusicide A和scopariusicide B；其中所述的半制备高效液相色谱分离条件是以体积含量为80～90％的甲醇或体积含量为70～90％乙腈中任意一种为流动相，流速为2～3mL/min，以9.4×250mm，5μm的Zorbax SB-C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为201～280nm，每次进样10～100μL，分别收集10～40min的色谱峰，多次累加后蒸干得到两种纯的白色粉末；
E、结构鉴定：通过测定D步骤所得的2种白色粉末状化合物的一维、二维核磁共振、常规和高分辨质谱波谱数据，得到该化合物的图谱，经结构解析确定其分子结构，确定为新的不对称环丁烷衍生物，分别命名为帚状香茶菜内酯A和B。
药物组合物，其包含所述的不对称环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和B和至少一种药学上可接受的载体。
所述的不对称环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和B在制备免疫抑制药物中的应用。
所述的不对称环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和B在制备抗免疫力低下的相关疾病的药物中的应用。
本发明的不对称环丁烷衍生物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1–99％，优选为0.5–90％的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体或赋形剂。
所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、超填料以及药物制品辅剂。将所述的有效提取物或有效部位以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服和口腔喷雾两种形式给药。
口服可用其固体或液体制剂，如粉剂、片剂、糖衣片剂、胶囊、酊剂、糖浆、滴丸剂等。
口腔喷雾可用其固体或液体制剂。
与现有技术相比，本发明具备如下的优益性：
本发明以唇形科香茶菜属植物帚状香茶菜[Isodon scoparius C.Y.Wu etH.W.Li(Dunn)Kudo]的茎叶为原料，经有机溶剂提取、硅胶柱层析、高压液相色谱进行分离，得到一类新颖的不对称环丁烷衍生物，该类化合物是从自然界中首次发现的一类罕见的具有对映-克罗烷型二萜片段和苯丙素片段的不对称环丁烷衍生物，以帚状香茶菜内酯A和B为原料，经抑制抗CD3和CD28单克隆抗体诱导的人T细胞增殖活性测试表明，在无细胞毒活性浓度下，帚状香茶菜内酯A显示了一定的活性，其IC50值为20.7μM。说明这类化合物具有一定的免疫抑制活性，能在免疫抑制药物中具有一定研究价值和应用。因此，制备并开发该类新颖类型天然产物在医药上的应用具有重要的意义。
附图说明
图1为帚状香茶菜内酯A的核磁共振碳谱(13C NMR)；
图2为帚状香茶菜内酯A的核磁共振氢谱(1HNMR)；
图3为帚状香茶菜内酯B的核磁共振碳谱(13C NMR)；
图4为帚状香茶菜内酯B的核磁共振氢谱(1H NMR)；
图5为帚状香茶菜内酯A的关键HMBC相关；
图6为帚状香茶菜内酯A和B的结构示意图；
图7为不对称环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和B的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发 明所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
实施例1
本发明的不对称环丁烷衍生物是以唇形科香茶菜属植物帚状香茶菜[Isodonscoparius C.Y.Wu et H.W.Li(Dunn)Kudo]的茎叶为原料，通过有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析、高压液相色谱分离、结构鉴定等步骤进行分离和鉴定，其结构式分别为：
该类化合物命名为帚状香茶菜内酯A和B，分子式为C38H54O5，英文名分别为scopariusicide A和scopariusicide B，该两个化合物是从自然界中发现的一类具有对映-克罗烷型二萜片段和苯丙素片段的不对称环丁烷衍生物。
所述的不对称环丁烷衍生物的制备方法，是以唇形科香茶菜属植物帚状香茶菜[Isodon scoparius C.Y.Wu et H.W.Li(Dunn)Kudo]的茎叶为原料，通过有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析、高压液相色谱分离、结构鉴定等步骤进行分离和鉴定，本发明所述的唇形科香茶菜属帚状香茶菜不受地区和品种限制，均可以实现本发明。具体为：
A、帚状香茶菜萃取物的制备：将帚状香茶菜茎叶的粉碎加入提取罐中，加入有机溶剂，在超声辅助下提取2～5次，每次30～60分钟，过滤后合并提取液，减压蒸除有机溶剂，将所得浓缩液分散在水中，分别用水体积1～2倍的乙酸乙酯萃取2～4次，合并乙酸乙酯层，浓缩得到萃取物a。其中该步骤所述的有机溶剂为体积含量为80～100％的乙醇、70～100％的丙酮、80～100％的甲醇或乙酸乙酯中任意的一种。
B、硅胶柱层析：将A步骤所得的萃取物a用重量比为1.5～3倍量的甲醇或者丙酮溶解，用萃取物重量比为1～1.5倍的80～100目硅胶拌样，挥发干溶剂后装入硅胶柱，装柱硅胶为200～300目，用量为萃取物a重量的6～10倍；用体积比为1:0～0:1的混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液、减压浓缩，经TLC或分析型HPLC监测，合并组分相同的洗脱液，得到粗品b。其中该步骤所述的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿或石油醚中任意的一种和甲醇、乙酸乙酯或丙酮中任意的一种，其体积配比为19:1，9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，1:2和0:1。
C、反相柱层析：将以有机溶剂进行洗脱得到的粗品b用反相层析柱分离。反相柱是用反相材料C-18、MCI或Rp-18中任意一种填充；用体积含量为50～100％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并含有不对称环丁烷衍生物的部分，得到粗品c。
D、高效液相色谱分离：将以体积含量为70～90％甲醇水溶液洗脱得到的粗品c经半制备高效液相色谱分离纯化，即得所述的不对称环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和帚状香茶菜内酯B，英文名分别为scopariusicide A和scopariusicide B。在D步骤中，高效液相色谱分离纯化是以体积含量为80～90％的甲醇或体积含量为70～90％的乙腈中的任意一种为流动相，流速2～3mL/min，以9.4×250mm，5μm的Zorbax SB-C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为201～280nm，每次进样10～100μL，分别收集10～40min的色谱峰，多次累加后蒸干得到两种纯的白色粉末。
E、结构鉴定：通过测定D步骤所得的白色粉末状化合物的一维、二维核磁共振、常规和高分辨质谱等波谱数据，得到该化合物的图谱。经结构解析，确定其分子结构为新的不对称环丁烷衍生物，分别命名为帚状香茶菜内酯A和B，并用单晶衍射的方法确证了化合物帚状香茶菜内酯A的绝对构型。
实施例2
将4kg帚状香茶菜[Isodon scoparius C.Y.Wu et H.W.Li(Dunn)Kudo]茎叶的粉末加入提取罐中，加入20L体积含量为70％的乙醇水溶液，在25℃下浸泡3天，共浸泡3次，过滤合并滤液，减压浓缩得到混合溶液。将该混合液分散在2L水中，分别用2L乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩得到萃取物a 250g。
往萃取物a中加入600mL甲醇溶解，用400g 80～100目硅胶拌样，用4kg 200～300目硅胶装柱，用体积比分别为1:0、19:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液并减压浓缩，经TLC监测，合并组分相同的洗脱液，得到8个部分，体积比19:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂洗脱所得的粗品b为78g；用反相材料C-18装柱，粗品b上反相柱，以体积含量为40～90％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并含有不对称环丁烷衍生物的部分，减压浓缩得到粗品c 600mg，再以体积含量为88％的甲醇为流动相，流速3mL/min，以9.4×250mm，5μm的Zorbax SB-C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为230nm，每次进样15μL，分别收集26.0min和28.4min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的不对称环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和B，英文名分别为scopariusicide A和scopariusicide B。
实施例3
将4kg帚状香茶菜[Isodon scoparius C.Y.Wu et H.W.Li(Dunn)Kudo]茎叶的粉末加入提取罐中，加入20L体积含量为70％的甲醇水溶液，在25℃下浸泡3天，共浸泡3次，过滤合并滤液，减压浓缩得到混合溶液。将该混合液分散在2.5L水中，分别用2.5L乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩得到萃取物a 335g。
往萃取物a中加入750mL甲醇溶解，用500g 80～100目硅胶拌样，用4.5kg 200～300目硅胶装柱，用体积比分别为1:0、19:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-乙酸乙酯混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液并减压浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到8个部分，体积比8:2的氯仿-甲醇混合有机溶剂洗脱所得的粗品b为64g；用反相材料RP-18装柱，粗品b上反相柱，以体积含量为40～90％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并含有不对称环丁烷衍生物的部分，减压浓缩得粗品c 710mg，再以80％的乙腈为流动相，流速3mL/min，以9.4×250mm，5μm的Zorbax SB-C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为230nm，每次进样11μL，分别收集23.5min和24.9min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的不对称环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和B，英文名分别为scopariusicide A和scopariusicide B。
实施例4
将4kg帚状香茶菜[Isodon scoparius C.Y.Wu et H.W.Li(Dunn)Kudo]茎叶的粉末加入提取罐中，加入20L体积含量为70％的丙酮水溶液，在25℃下浸泡3天，共浸泡3次，过滤合并滤液，减压浓缩得到混合溶液。将该混合液分散在2.0L水中，分别用2.0L乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩得到萃取物a 220g。
往萃取物a中加入450mL丙酮溶解，用300g 80～100目硅胶拌样，用4kg 200～300目硅胶装柱，用体积比分别为1:0、19:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液并减压浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到8个部分，体积比9:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂洗脱所得的粗品b为75g；用反相材料C-18装柱，粗品b上反相柱，以体积含量为40～90％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并含有不对称环丁烷衍生物的部分，减压浓缩得粗品c 470mg，再以体积含量为88％的甲醇为流动相，流速3mL/min，以9.4×250mm，5μm的Zorbax SB-C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为230nm，每次进样15μL，分别收集26.0min和28.0min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的不对称环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和B，英文名分别为scopariusicide A和scopariusicide B。
实施例5
实施例1-4制备的化合物帚状香茶菜内酯A和B，均为白色粉末；所得产品分别用1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、1H-1H ROESY、HSQC、HMBC、IR、HREIMS、UV进行结构鉴定。
化合物帚状香茶菜内酯A的紫外光谱(溶剂为甲醇)为λmax(logε)：200(0.32)。红外光谱(溴化钾压片)为νmax 3447,3431,2930,2972,1740,1723,1516,1253,1189,1035,996,921cm-1。HRESIMS显示该化合物准分子离子峰m/z 613.3872[M+Na]+(calcd for C38H54O5Na,613.3869)。结合13C和1H NMR谱(图1和图2，碳谱氢谱数据归属见表1)，推出分子式为C38H54O5，并用单晶衍射的方法确证了化合物的绝对构型(图6)，命名为帚状香茶菜内酯A。
表1 帚状香茶菜内酯A和B的13C和1H NMR数据(溶剂为Pyridine-d5)
化合物帚状香茶菜内酯B的紫外光谱(溶剂为甲醇)为λmax(logε)：200(0.43)。红外光谱(溴化钾压片)为νmax 3439,2956,2930,1734,1613,1514,1459，1251,1180,1034cm-1。HRESIMS显示该化合物准分子离子峰m/z 613.3866[M+Na]+(calcd for C38H54O5Na,613.3869)。结合13C和1H NMR谱(图3和图4，碳谱氢谱数据归属见表1)，推出分子式为C38H54O5，命名为帚状香茶菜内酯B。
所有波谱数据证实，所纯化得到的帚状香茶菜内酯A和B的化学结构式如下：
实施例6
取实施例2～4所制备的帚状香茶菜内酯A或/和B进行抗CD3和CD28单克隆抗体诱导的人T细胞增殖活性测试，具体方法为：
刺激后脾细胞增殖检测：取分离出的Bal b/c小鼠/人脾脏，制备单细胞悬液，细胞密度调整为1×106·mL-1。使用2μmol·L-1羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE，Eugene，OR，USA)，37℃避光染色细胞10min，加入冰冷的RPMI 1640完全培养基终止染色。使用2mg·L-1 anti-CD3/1mg·L-1 anti-CD28刺激脾细胞(1×106·mL-1)。加入不同浓度筛选药物后，于37℃，5％CO2中培养72小时。流式细胞仪检测细胞增殖。以细胞增殖系数(Proliferation Index，PI)评价抑制强度，PI越低，抑制强度越高。
静息脾细胞活力检测：取Bal b/c小鼠/人脾脏，制备单细胞悬液，细胞密度调整为1×106·mL-1。加入不同浓度筛选药物后，于37℃，5％CO2中培养72小时。使用CellCounting Kit-8(CCK-8，Dojindo，Kumamoto，Japan)检测细胞活力。具体为：在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(37℃,5％CO2)。向每孔加入10μLCCK溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。将培养板在培养箱内孵育1至4小时。用酶标仪SpectraMax M5 microplate reader(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)测定在450nm处的吸光度。可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCl溶液或者1％w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
实验结果发现，化合物帚状香茶菜内酯A表现了一定的免疫抑制活性，抑制人体T细胞增殖活性的IC50为20.7μM(BD750为阳性对照)。
实施例7：
取实施例2-4所制备的帚状香茶菜内酯A或/和B，按其与赋形剂重量比1:1的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例8：
取实施例2-4所制备的帚状香茶菜内酯A或/和B，按其与赋形剂重量比1:2的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例9
取实施例2-4所制备的帚状香茶菜内酯A或/和B，按常规胶囊制剂方法制成胶囊。
实施例10：
取实施例2-4所制备的帚状香茶菜内酯A或/和B，再按下述方法制成片剂：
实施例11：
胶囊剂：取实施例2-4所制备的帚状香茶菜内酯A或/和B 100mg
淀粉 适量
硬脂酸镁 适量
制备方法：将化合物与助剂混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊。
实施例12：
制备方法：搅拌下于适当体积的重蒸馏水中每次加入一种成分，直至完全深解，然后再加入另一种成分。加水至2ml后，将该溶液在无菌过滤器上过滤，装入瓶中并按照适当的剂量分隔。
实施例13：
滴丸：取实施例2-4所制备的帚状香茶菜内酯A或/和B 1g
聚乙二醇6000 9g
制法：取实施例2～4所制备的帚状香茶菜内酯A或/和B，与聚乙二醇6000熔融液的制备：按上述处方量称取，加入适量无水乙醇，微热溶解后，加入处方量的聚乙二醇熔融液中(60℃水浴保温)，搅拌混合均匀，直至乙醇挥尽为止，静置于60℃水浴中保温30分钟，待气泡除尽，然后将除尽气泡的上述混匀熔融液转入贮液筒内，在保温80-85℃的条件下，控制滴速，一滴滴地滴入冷凝液中，等冷凝完全，倾去冷凝液，收集滴丸，沥净和用滤纸除去丸上的冷凝液，放置硅胶干燥器中或自然干燥即可。

Claims (7)

1.如下结构式所示的天然不对称环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和B，
2.如权利要求1所述的天然不对称环丁烷衍生物，其特征在于其是以唇形科香茶菜属植物帚状香茶菜的茎叶为原料，通过有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析、高压液相色谱分离、结构鉴定步骤进行分离和鉴定所得。
3.根据权利要求1所述的天然不对称环丁烷衍生物，其特征在于该两个化合物分子式均为C38H54O5，英文名分别为scopariusicide A和scopariusicide B，是具有对映-克罗烷型二萜片段和苯丙素片段的不对称环丁烷衍生物。
4.权利要求1所述的不对称环丁烷衍生物的制备方法，其特征在于以唇形科香茶菜属植物帚状香茶菜的茎叶为原料，通过有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析、高压液相色谱分离、结构鉴定步骤进行分离和鉴定：
A、萃取物的制备：将帚状香茶菜茎叶的粉末加入提取罐中，加入有机溶剂，在超声辅助下提取2～5次，每次30～60分钟，过滤后合并提取液，减压浓缩得到提取液；将该提取液分散在水中，分别用水体积1～2倍的乙酸乙酯萃取2～4次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩得到萃取物a；其中所述的有机溶剂为体积含量为80～100％的乙醇、70～100％的丙酮、80～100％的甲醇或乙酸乙酯中任意一种；
B、硅胶柱层析：将A步骤所得的萃取物a用重量比为1.5-3倍量的甲醇或者丙酮中的任意一种溶解，用萃取物重量比为1～1.5倍的80～100目硅胶拌样，挥发干溶剂后装入硅胶柱，装柱硅胶为200～300目，用量为萃取物a重量的6～10倍；用体积比为1:0～0:1的混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液并减压浓缩，经TLC或分析型HPLC监测，合并组分相同的洗脱液，得到粗品b；其中所述的混合有机溶剂为二氯甲烷、氯仿或石油醚中的任意一种和甲醇、乙酸乙酯或丙酮中的任意一种，其体积配比为19:1，9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，1:2和0:1；
C、反相柱层析：将步骤B得到的粗品b上反相柱层析，反相柱是用反相材料C-18、Rp-18或者MCI中任意一种填充，用体积含量为50～100％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并含有环丁烷衍生物的部分，得到粗品c；
D、高效液相色谱纯化：将步骤C中得到的粗品c经半制备高效液相色谱分离纯化，即得所述的不对称环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和帚状香茶菜内酯B，英文名分别为scopariusicide A和scopariusicide B；其中所述的半制备高效液相色谱分离条件是以体积含量为80～90％的甲醇或体积含量为70～90％乙腈中任意一种为流动相，流速为2～3mL/min，以9.4×250mm，5μm的Zorbax SB-C18反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为201～280nm，每次进样10～100μL，分别收集10～40min的色谱峰，多次累加后蒸干得到两种纯的白色粉末；
E、结构鉴定：通过测定D步骤所得的2种白色粉末状化合物的一维、二维核磁共振、常规和高分辨质谱波谱数据，得到该化合物的图谱，经结构解析确定其分子结构，确定为新的不对称环丁烷衍生物，分别命名为帚状香茶菜内酯A和B。
5.药物组合物，其包含权利要求1所述的不对称环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和B和至少一种药学上可接受的载体。
6.权利要求1所述的不对称环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和B在制备免疫抑制药物中的应用。
7.权利要求1所述的不对称环丁烷衍生物帚状香茶菜内酯A和B在制备抗免疫力低下的相关疾病的药物中的应用。
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