CN1899272A - 还原型辅酶q水溶液的稳定组合物 - Google Patents

Abstract

本发明通过使用具有疏水性且容易氧化、不稳定的还原型辅酶Q，提供一种含有对氧化更加稳定的还原型辅酶Q的水溶液。通过本发明得到的含有还原型辅酶Q的水溶液，是一种含有还原型辅酶Q以及维生素C等抗氧化剂和/或乙二胺四乙酸等螯合剂的水溶液，可长期、稳定地保持还原型辅酶Q。

Description

还原型辅酶Q水溶液的稳定组合物

本申请是申请日为2002年10月10日，申请号为02819884.0，发明名称为“还原型辅酶Q水溶液的稳定组合物”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种以还原型辅酶Q为组成成分的溶液，特别涉及为了稳定维持还原型辅酶Q的氧化而添加抗氧化剂和/或螯合剂的水溶液。

背景技术

辅酶Q是广泛分布于细菌至哺乳动物有机体的必需成分，众所周知，辅酶Q在生物有机体内的细胞中作为线粒体电子信息传递系统的组成成分。已知辅酶Q除了在线粒体内循环进行氧化还原反应，在电子传递系统中作为传递成分而起的作用外，还原型辅酶Q还具有抗氧化作用。在人体内，辅酶Q的侧链具有10个重复结构，其主要成分为辅酶Q₁₀，在生物体内，通常以40～90％左右的还原型形式存在。作为辅酶Q的生理作用，包括由线粒体活化作用而产生的能量生产的活化、心脏机能的活化、细胞膜的稳定性作用、由抗氧化作用而起到保护细胞的作用等等。

已知辅酶Q在很多用途上使用，例如，从对心脏的效果来看，氧化型辅酶Q₁₀用作充血性心力衰竭的药物。除了医药用途之外，它还用作经口服的维生素类、营养制剂、营养辅助剂。但是，辅酶Q脂溶性强，难溶于水，所以，在实际应用中，仅知道它作为口服剂和皮肤用剂。

近年来，有很多报道由于血液中的氧化胁迫增加而导致疾病恶化。其中，具有代表性的例子有，动脉硬化、糖尿病并发症等。在这些疾病中，由于血液中存在的各种氧化胁迫而导致脂质变性等，由此引起疾病的发生或恶化。为减少这种氧化胁迫的影响，通过给与抗氧化剂药物而活化抗氧化能力是行之有效的。维生素E被认为是抑制脂质过氧化最有效的脂溶性抗氧化物质的典型化合物，它广泛用于疾病的预防等等。

近年来，为使维生素E能充分地发挥抗氧化活性，有人提出了还原型辅酶Q₁₀与维生素E共存的重要性(Bowry等，1993，J.American ChemicalSociety，115，6029-6044)，辅酶Q作为脂溶性抗氧化物质的重要性正逐渐地被明确。

还原型辅酶Q本身也具有很强的抗氧化作用，因此，通过溶化可把足够量的还原型辅酶Q输入到血液中，就有可能有效地提高血液中的抗氧化活性。所述提高血液中的抗氧化活性被认为是针对缺血性再回流时的血管障碍、防止动脉硬化的再次狭窄、防止脑梗塞后的血管障碍、预防动脉硬化、预防糖尿病并发症等活性酶种而显示很多恶化的疾病，它具有广泛的实用性。还有，新的补充形式是通过点滴输入到体内，由此可以对无法通过口服摄取的重症患者或脑疾病患者提供辅酶Q。因此，可以想像使辅酶Q溶液化会带来很多好处。

已知辅酶Q有氧化型和还原型，关于使氧化型辅酶Q₁₀(泛癸利酮或泛醌)溶液化的方法，已经有很多的研究。

所述氧化型辅酶Q₁₀的溶液化方法，已经报道了很多方法，如用脂质体包覆、用表面活性剂或油脂的悬浊等(特开平5-186340号公报、特开平7-69874号公报、特表2000-510841号公报)，但是，把它们实际应用的例子却很少。其理由之一就是，为了使氧化型辅酶Q₁₀显示抗氧化活性，必须由还原酶等转化为还原型，然而，在血液中不存在还原酶，所以通过注射等进行给与，无法期待对血液中的氧化胁迫显示抗氧化活性。

另一方面，还原型辅酶Q₁₀本身具有抗氧化活性，对上述之类疾病的有用性可以报有很大的希望，但是，其缺点为易氧化不稳定，无法实际应用。有研究报告说，为了研究氧化还原酶等而制成还原型辅酶Q₁₀的脂质体包覆物(Kishi等，1999，BioFactors，10，131-138)，其所用的脂质体的例子是每次实验时现用现制备，它如何能够稳定地维持成为还原型辅酶Q的溶液方法，至今还完全不清楚。

发明内容

本发明的目的是提供一种还原型辅酶Q氧化稳定性改进的水溶液。

本发明人为了解决上述技术问题，研究结果发现有利于提高还原型辅酶Q稳定性的水溶液的组成，从而完成了本发明。

即，本发明涉及的水溶液是一种含有还原型辅酶Q的水溶液，其特征在于，在该水溶液中含有抗氧化剂和/或螯合剂。

本发明的水溶液是一种含有用下式(1)表示的还原型辅酶Q的水溶液，其特征在于，在该水溶液中含有抗氧化剂和/或螯合剂：

(其中，n表示1～12的整数)。

辅酶Q包括由下式(1)和(2)表示的：

(其中，n表示1～12的整数)，和

(其中，n表示1～12的整数)。式(1)为还原型辅酶Q，式(2)为氧化型辅酶Q。

在本发明中，辅酶Q如上述式(1)和式(2)表示的那样，侧链的重复单元(式中n)，可以使用1～12，但是侧链的重复单元为10，也就是说，特别优选使用辅酶Q₁₀。

在本发明中，还原型辅酶Q也可以含有氧化型辅酶Q。此时，在辅酶Q的总量中，还原型辅酶Q优选为20重量％或20重量％以上，更优选含有40重量％或40重量％以上，最优选含有60重量％或60重量％以上。

作为获得上述还原型辅酶Q的方法没有特别的限定，可采用公知方法，如合成、发酵、从天然物质中提取等得到辅酶Q后，通过层析法把洗提液中的还原型辅酶Q的组分加以浓缩的方法。此时，根据需要，对所述辅酶Q添加一般性的还原剂如氢硼化钠、亚二硫代酸钠(连二亚硫酸钠)等，也可以按照常规方法，把上述辅酶Q中所含的氧化型辅酶Q进行还原，作为还原型辅酶Q后，再用层析法进行浓缩。还可以通过使上述还原剂作用于已有的高纯度辅酶Q而得到。

作为获得本发明水溶液的方法没有特别的限定，例如(1)把还原型辅酶Q和适当的抗氧化剂和/或螯合剂用适当的基剂加以被覆，进行脂质体化而得到。或者(2)在含有还原型辅酶Q的脂质体中添加适当的抗氧化剂和/或螯合剂的水溶液而得到。或者(3)把还原型辅酶Q和适当的抗氧化剂及/或螯合剂用适当的表面活性剂加以可溶化或乳化而得到。

本发明的水溶液只要含有还原型辅酶Q和抗氧化剂和/或螯合剂即可，而没有特别限制。如上述(1)，(2)用脂质体制备时，脂质体分散在水溶液中成为水溶液，又如上述(3)使用表面活性剂制备时，还原型辅酶Q成为可溶化或乳化的水溶液。

对本发明中使用的抗氧化剂未作特别限制，可以举出，柠檬酸、柠檬酸衍生物、维生素C、维生素C衍生物、普罗布丁、番茄红素、维生素A、类胡萝卜素类、维生素B、维生素B衍生物、黄酮类、多酚类、谷胱甘肽、硒、硫代硫酸钠、维生素E、维生素E衍生物、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶、谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化酶以及它们的混合物等。

其中，优选柠檬酸、柠檬酸衍生物、维生素C、维生素C衍生物、谷胱甘肽、硫代硫酸钠，更优选维生素C、柠檬酸等，最优选维生素C。

另外，对所述螯合剂未作特定限制，例如，乙二胺四乙酸及其盐、乙二胺二乙酸及其盐、肟基二乙酸及其盐、羟乙基乙二胺四乙酸及其盐、二亚乙基三胺五乙酸及其盐、氮基三乙酸及其盐、三亚乙基四胺六乙酸及其盐、二羧甲基谷氨酸四钠盐、二羟甲基甘氨酸、1，3-丙二胺四乙酸及其盐、1，3-二氨基-2-羟基丙烷四乙酸及其盐、葡糖酸钠盐、羟基亚乙基二膦酸(ヒドロキシエチルイデンジホスホン酸)、亚烷基膦酸、亚磷酸基丁烷三羧酸以及它们的混合物等。

其中，优选乙二胺四乙酸及其盐、羟乙基乙二胺四乙酸及其盐、二亚乙基三胺五乙酸及其盐、葡糖酸钠盐、羟基亚乙基二膦酸，更优选乙二胺四乙酸及其盐。

当在本发明水溶液中使用脂质体时，作为脂质体中所用的基本制剂，例如有纯化大豆卵磷脂、磷脂酰胆碱等的磷脂质，或二半乳糖苷甘油酯等的糖脂质等，从对还原型辅酶Q的氧化的稳定性考虑，优选纯化大豆卵磷脂、磷脂酰胆碱。

当在本发明水溶液中使用表面活性剂时，作为表面活性剂没有特别的限制，例如有，羧酸盐型阴离子类表面活性剂等，从还原型辅酶Q的氧化稳定性的观点考虑，优选聚山梨酸酯80、聚氧化乙烯硬化蓖麻油等。

在本发明水溶液中，还原型辅酶Q的浓度没有特别的限制，从氧化稳定性、在水溶液中的溶解性等方面考虑，还原型辅酶Q对水溶液的体积的重量比例，优选0.001w/v％至5w/v％，更优选0.05w/v％至1w/v％。另外，对抗氧化剂的浓度也未作特别的限制，但从其有效性观点考虑，以水溶液的总量计，优选0.01w/v％至50w/v％，更优选0.05w/v％至10w/v％。还有，螯合剂的浓度也未作特别的限制，但从其有效性观点考虑，以水溶液的总量计，优选0.001w/v％至10w/v％，更优选0.005w/v％至5w/v％。所述抗氧化剂以及螯合剂的各自浓度，单独使用或并用时也适用。

对本发明的水溶液的pH未作特定的限制，因其用途的不同而不同，但从辅酶Q稳定性的观点考虑，优选pH为1.0至8.0，更优选pH为2.0至7.6。

如上所述，在制备的水溶液中，可根据常规方法适当地添加混合药剂学所允许的其他制剂原材料。对所述允许添加的制剂原材料未作特别的限制，例如乳化剂、紧张化剂、缓冲剂、助溶剂、溶解助剂、防臭剂、防腐剂、稳定剂等。还有，可以根据用途，加入其他有效成分，例如药剂、营养辅助成分等。

所述本发明水溶液组合物的保存方法，未作特别的限制，可以进行低温保存(例如，-80℃至4℃)、密闭容器厌氧保存、遮光保存等。

如上制备的本发明水溶液，可以对氧化更加稳定的保持还原型辅酶Q。

含有本发明还原型辅酶Q的水溶液可以广泛地用于医疗、化妆、食品、园艺、奶酪畜牧业等。其具体形态是，注射剂、输液、液剂、点眼剂、内服用液剂、洗涤剂、生发香水、化妆用奶液、喷雾液、喷雾剂、饮料液、液体肥料、保存溶液等，作为医疗用，还可以用作器官移植时的保存溶液等。另外，还可作为动物饲料等。作为抗氧化溶液，还可用于肉、鱼等生鲜食品的保存。

具体实施方式

下面，将以实施例更详细地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1用脂质体包覆的抗氧化剂赋予还原型辅酶Q₁₀的氧化稳定性

为了评价脂质体中的还原型辅酶Q₁₀的氧化稳定性，在40℃的保存条件下，选择以氧化稳定性差的卵黄磷脂(磷脂，和光纯药工业公司生产)作为脂质体的基本制剂，对提高还原型辅酶Q₁₀(含有0.005w/v％)氧化稳定性的物质进行了评价。

通过以下方法制备含有还原型辅酶Q₁₀的脂质体。即，把还原型辅酶Q₁₀的粉末溶解在甲醇中，制成0.1mg/ml的溶液。然后以同样的方法，制得溶解在甲醇中的磷脂溶液(3.2mg/ml)，同时彼此混合1ml。在该混合液中添加2ml氯仿，然后减压除去溶剂。待溶剂完全除去后，加入2ml的50mMHEPES缓冲液(pH7.4)，用搅拌器使脂质膜分散，制得乳白色的悬浊液。该悬浊液在氮气流、4℃的条件下，超声波处理30分钟，使之形成脂质体后，以3000rpm，进行20分钟离心，沉淀巨大分子并将其除去。离心分离没有被沉淀的部分，作为还原型辅酶Q₁₀的脂质体溶液。

此外，如下所述，制成含有0.05w/v％抗氧化剂或螯合剂的脂质体。当含有维生素E时，制备10mg/ml的乙醇溶液，在上述含有还原型辅酶Q₁₀的脂质体制作过程中添加氯仿之前，添加至还原型辅酶Q₁₀及磷脂的混合液中，按下列同样操作，制得脂质体。当含其他水溶性的抗氧化剂或螯合剂时，在上述HEPES缓冲液中溶解抗氧化剂或螯合剂使之达到0.05w/v％，制得脂质体。

因此，制成含有多种抗氧化剂(乙酸维生素E、硫代硫酸钠、柠檬酸、维生素C、维生素E(α-生育酚)的脂质体，用还原型辅酶Q₁₀的保持率来评价在空气40℃保存下的氧化稳定性.。

为了求得还原型辅酶Q₁₀的保持率，首先将己烷1ml加入0.05ml的脂质体溶液中，搅拌30秒后，离心分离(3000rpm，1分钟)，使己烷层和水层分离。然后，吸取己烷层，在氮气下干燥固化后，用0.2ml的乙醇溶解，用HPLC进行定量。在公知的分析条件下，使用电化学检测仪分别对氧化型辅酶Q₁₀和还原型辅酶Q₁₀进行定量。还原型辅酶Q₁₀的保持率以制备脂质体时的还原型辅酶Q₁₀的量作为100％而求出。

其结果表明，在没有添加抗氧化剂的脂质体中，由于氧化，保存1～2天后保持率在10％或10％以下，而在添加有乙酸维生素E的脂质体中，保存2天后其保持率为63％，在添加有硫代硫酸钠的脂质体中，保存3天后其保持率为76％，在添加有柠檬酸的脂质体中，保存8天后其保持率为54％，在添加有维生素C的脂质体中，保存15天后其保持率为68％。但是，在添加维生素E(α-生育酚)的脂质体中，没有看到明显的效果。

由此可知，取决于抗氧化剂的种类，对脂质体中的还原型辅酶Q₁₀的稳定性，既有明显效果的也有一般效果的。具体地来说，维生素C的效果最明显，下面以此类推，柠檬酸、硫代硫酸钠、乙酸维生素C、维生素E。

实施例2用脂质体包覆的螯合剂赋予还原型辅酶Q₁₀的氧化稳定性

与实施例1相同，评价了螯合剂对还原型辅酶Q₁₀的保持率的效果。用与实施例1同样的方法，制备含有0.05w/v％乙二胺四乙酸的脂质体，在40℃、空气中保存，评价螯合剂的稳定性效果。

在没有添加螯合剂的脂质体中的还原型辅酶Q₁₀由于氧化，保存1～2天后、其保持率在10％或10％以下，而在添加有乙二胺四乙酸的脂质体中，保存43天后其保持率为76％。

虽然人们知道作为螯合剂的乙二胺四乙酸对易氧化的物质具有保护作用，但像这次试验的结果所示，超出强氧化剂的保护效果是完全没有想到的结果。

实施例3抗氧化剂对表面活性剂溶液的效果(1)

在含有0.005w/v％的还原型辅酶Q₁₀的0.1％聚山梨酸酯80水溶液中，添加作为抗氧化剂的维生素C使之达到0.05w/v％，在40℃保存下，评价抗氧化剂的效果。

在没有添加抗氧化剂的溶液中，保存6天后保持率为27％。而在添加有维生素C的溶液中，即使保存6天后仍保持原有的88％还原型。

实施例4抗氧化剂对表面活性剂溶液的效果(2)

在含有0.005w/v％的还原型辅酶Q₁₀的0.1％聚氧化乙烯硬化蓖麻油溶液(HCO-60：日光ケミカルズ公司产品)中，添加作为抗氧化剂的维生素C或柠檬酸使之达到0.05w/v％，在40℃保存下，评价抗氧化剂的效果。

在没有添加抗氧化剂的溶液中，保存7天后保持率为17％。而在添加有维生素C的溶液中，即使保存14天后仍保持原有的73％还原型。在添加有柠檬酸溶液中，即使保存71天后的还原型保持率仍为61％。

实施例5螯合剂对表面活性剂溶液的效果(1)

除了使用作为螯合剂的乙二胺四乙酸来代替抗氧化剂以外，其他均与实施例3相同，评价了螯合剂的效果。

在没有添加螯合剂的溶液中，保存6天后维持率为27％。而在添加有乙二胺四乙酸的溶液中，发现与脂质体同样强的保护效果，即使保存78天后，还原型仍保持在80％。

实施例6螯合剂对表面活性剂溶液的效果(2)

除了使用作为螯合剂的乙二胺四乙酸来代替抗氧化剂以外，其他均与实施例4相同，评价了螯合剂的效果。

在没有添加螯合剂的溶液中，保存7天后保持率为17％。而在添加有乙二胺四乙酸的溶液中，即使保存167天后还原型仍保持在74％。因此，在40℃高温条件下，经过近半年长时间的保存，还原型辅酶Q₁₀仍保持很高的比例，这是完全没有想到的结果。

产业上的实用性

根据本发明，可以提供一种更加稳定的作为抗氧化物质或营养辅助成分的有很大实用性的还原型辅酶Q的溶液。

Claims (3)

1.一种水溶液，它是一种含有用下式(1)表示的还原型辅酶Q的水溶液，在该水溶液中包含螯合剂：

式中，n表示1～12的整数。

2.如权利要求1所述的水溶液，其中还原型辅酶Q为还原型辅酶Q₁₀。

3.如权利要求1或2所述的水溶液，所述螯合剂为乙二胺四乙酸或其盐、羟乙基乙二胺四乙酸或其盐、二亚乙基三胺五乙酸或其盐、葡糖酸钠盐或羟基亚乙基二膦酸。