CN110496103A - 一种多西他赛棕榈酸酯脂质体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，提供一种多西他赛棕榈酸酯脂质体及其制备方法，以多西他赛棕榈酸酯为主药，还包括螯合剂、卵磷脂以及DSPE‑PEG2000。其特征是，将多西他赛制备成多西他赛棕榈酸酯脂溶性前药，解决了由于多西他赛脂溶性差而无法开发成脂质体的缺陷；本发明的脂质体处方中含有螯合剂，收到了更好的实质性效果，延长了药物在体内的作用时间，提高了抗肿瘤效果，制备也更加顺畅，故处方中含有螯合剂是本发明的核心技术特征。本发明的目的是开发了一种更加高效的、不含增溶剂的、制备工艺简单的多西他赛棕榈酸酯脂质体，为多西他赛的深入研究与应用奠定基础。

Description

一种多西他赛棕榈酸酯脂质体及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种多西他赛棕榈酸酯脂质体及其制备方法。
背景技术
多西他赛(Docetaxel，DTX)又名多西紫杉醇，是以10-脱乙酰基浆果赤霉素Ⅲ为母核 骨架经修饰得到的紫杉烷类抗肿瘤药，其化学结构式如下式所示，化学名称为： [2aR-(2aα,4β,4aβ,6β,9α,(aR*,βS*),11a,12a,12aα,12bα)]-β-[[(1,1二甲基乙氧基)羰基]氨基]-α-羟 基苯丙酸[12b-乙酰氧-12-苯甲酰氧-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-十二氢-4,6,11-三羟基 -4a,8,13,13-四甲基-5-氧代-7,11-亚甲基-1H-环癸五烯并[3,4]苯并[1,2-b]氧杂丁环-9-基]酯，分 子式C43H53NO14，分子量807.88，不溶于水，易溶于乙醇、丙酮、乙醚以及苯等有机溶剂。 多西他赛的抗肿瘤活性是紫杉醇的1.3-12倍，疗效确切，FDA已批准其用于乳腺癌、卵巢 癌、非小细胞肺癌以及胰腺癌等癌症的治疗，是迄今发现最有价值的抗癌药物之一。
目前，应用于临床的多西他赛制剂为其注射液，即多西他赛注射液，系多西他赛的临 床唯一制剂。该注射液是由多西他赛的吐温80溶液与13％的乙醇溶液两部组成，临用时将 13％乙醇溶液注入在多西他赛的吐温80溶液中摇匀，然后再用5％葡萄糖溶液或生理盐水 稀释，方可静脉滴注。由此可见，该注射液临床应用过程繁琐、使用不便、易二次污染。多西他赛注射液虽然疗效显著，但不良反应尤为突出，其骨髓抑制毒性是首要不良反应，在其说明书中已明确记载。多西他赛单独治疗时，骨髓抑制发生率高达76.4％，当与其他化疗药物联合使用时骨髓抑制毒性更加严重，发生率更高，严重影响化疗进程，削弱患者的治疗效果(多西他赛注射液产品说明书；朱琨,周灿,闫融,等.多西他赛常规剂量化疗后Ⅳ度骨髓抑制患者白细胞计数波动规律及治疗策略[J].现代肿瘤医学,2012, 20(1):000159-161.；曹建伟,耿明飞,朱东山,等.多西他赛化疗所致食管癌患者骨髓抑制的 特点及对策[J].中国民康医学,2016,28(11):10-11.；沙红玉,郑文文,郭晨煜,等.多西他 赛所致不良反应报告分析[J].中国医院药学杂志,2015,35(6):536-539.)，再加上其处方中 含具有溶血性与过敏性的吐温80，给临床用药带来了严重的安全隐患，严重限制了多西他 赛抗肿瘤药效的发挥，故迫切需要开发一种更加高效的、低骨髓抑制毒性的、不含增溶剂 的多西他赛注射液应用于临床，为多西他赛的深入研究与应用奠定基础。
鉴于多西他赛注射液存在的不足，其新制剂的研究报道屡见不鲜，尝试将多西他赛开 发成脂质体、胶束、纳米粒等纳米包裹制剂(程树仓,庞鑫,翟光喜.多烯紫杉醇纳米制剂的 研究进展[J].药学研究,2013,32(1):45-48.)，遗憾的是迄今为止还没有一种新的多西他赛 纳米制剂上市。从降低毒性提高疗效的角度来看，脂质体作为抗肿瘤药物的载体研究与应 用较为广泛，特别是已应用于临床的阿霉素脂质体以及伊立替康脂质体，在降低毒性与提 高疗效方面效果尤为突出，故广大医药工作者拟将多西他赛开发成脂质体，拟达到安全高 效的目的。现有文献研究了一种多西他赛脂质体，其载药量仅为0.75mg/mL，且稳定性差， 无法长期保存，无法应用于临床(Immordino M L,Brusa P,Arpicco S,etal.Preparation, characterization,cytotoxicity and pharmacokinetics ofliposomes containing docetaxel[J].Journal of Controlled Release,2003,91(3):417.)；现有文献研究的多西他赛脂质体，载药量最多不超 过1mg/mL，且稳定性差，制备工艺复杂，不利于产业化(Patel K,Doddapaneni R,Chowdhury N,et al.Tumor stromaldisrupting agent enhances the anticancer efficacy of docetaxel loadedPEGylated liposomes in lung cancer[J].Nanomedicine,2016,11(11):1377-1392.)；中国专利(专 利号：CN101584663A)提供了一种新型的注射用多西他赛脂质体及其制备方法，利用乳化 挥散法制备多西他赛脂质体，制备工艺复杂不可控，且处方中含有胆固醇硫酸酯钠、十二 烷基苯磺酸钠等离子型的增溶剂，该类增溶剂具有较强的溶血性(崔福德.药剂学[M].北 京:人民卫生出版社,2011:42)；中国专利(专利号：CN103830181A)公开了一种多西他赛 冻干脂质体及其制备方法，是通过添加具有溶血性的环糊精来达到提高多西他赛水溶性、 提高包封率、提高脂质体稳定性的目的，即便如此脂质体的载药量也仅为0.5mg/mL，无法 满足临床用药的要求；中国专利(专利号：CN102379849A)提供一种具有pH敏感的多西他赛脂质体及其制备方法，载药量依然较低，且脂质体粒径偏大。由此可见，直接将多西 他赛制备成脂质体的可实施性较差，主要原因是多西他赛脂溶性很差，与脂质材料的相容 性不匹配所致，制备的脂质体存在载药量低、包封率低、稳定性差等一系列问题。总而言 之，多西他赛脂质体的成药性很差，故研发一种真正意义上高效低毒、质量稳定、制备工 艺简单的多西他赛脂质体尤为重要，这将为多西他赛在抗肿瘤领域的研究与应用奠定坚实 的基础。
发明内容
本发明提供一种多西他赛棕榈酸酯脂质体。为了解决多西他赛脂溶性差以及脂质体成 药性差的问题，我们拟通过结构改造来提高多西他赛的脂溶性，即将多西他赛与棕榈酸进 行成酯反应，得到多西他赛的脂溶性前药，即多西他赛棕榈酸酯。试验证明，将多西他赛 棕榈酸酯通过特定的处方工艺制备的脂质体成药极佳，载药量居然高达10mg/ml(见实施例 10)，小鼠体内抗肿瘤效果好于市售的多西他赛注射液(见实施例19)，故本发明将多西他 赛结构改造成多西他赛棕榈酸酯，是本发明收到显著效果的关键技术特征之一。
在中国专利CN201610301096.4(公开号CN105853403A)中明确记载了一种紫杉醇的 脂溶性前药紫杉醇棕榈酸酯，且成功开发成了脂质体，体内抗肿瘤效果以及安全性亦显著 提高，故通过合成脂溶性前药来解决原药脂质体成药性差的方案，以及收到高效低毒的动 物体内效果已不足为奇。另外，多西他赛与紫杉醇同属紫杉烷类化合物，理论上讲多西他 赛棕榈酸酯脂质体可完全受上述专利的启发即可达到预期的目的，而事实上也正如所述， 抗肿瘤效果的确优于市售的多西他赛注射液(见实施例19)。但在研究过程中，意外发现当 处方中引入螯合剂后，会延长药物的体内作用时间(见实施例20)，同时抗肿瘤效果也更好； 另外，添加螯合剂后，在脂质体相关质量指标等方面也收到了更好的效果，如粒径分布将 更窄、除菌过滤更加顺畅，有利于产业化批量生产，大大提高了本发明的适用性(见实施 例21)。故本发明提供的一种多西他赛棕榈酸酯脂质体中含有螯合剂是本发明最为核心的技 术特征。
金属原子或离子与含有两个或连两个以上配位原子的配位体作用，生成具有环状结构 的螯合物，能生成螯合物的这种配体物质叫螯合剂。在药物制剂中，螯合剂广泛使用，但 基本上均是为了提高活性成分的化学稳定性而添加的，特别是作为抗氧化剂使用效果较好， 但能够在制剂的药效以及延长体内作用时间等方面表现出更好的效果则少见。通过对国内 外文献检索，亦未见有相关报道，本脂质体中的螯合剂到底是对药物产生作用还是对脂质 体微粒本身有某种结合，机理暂时不明，后续我们将进一步深入予以探讨研究。出于好奇， 我们开展了系列对比试验，发现在多西他赛棕榈酸酯脂质体中添加螯合剂后，药物在体内 的循环明显延长，曲线下面积AUC∞也大于不加螯合剂的脂质体(见实施例20)。我们知道， 药物在体内缓慢代谢，不易失活，故药效自然提高。故本发明要想达到更好的实质效果， 仅凭中国专利CN105853403A的启发是远远不够的，因为本发明提供的一种多西他赛棕榈 酸酯脂质体，其创新技术特征就是含有螯合剂，同时也收到了实质性的效果。
本发明的第一目的，是提供一种多西他赛棕榈酸酯脂质体。
本发明提供一种多西他赛棕榈酸酯脂质体，以多西他赛棕榈酸酯为主药。多西他赛棕 榈酸酯用量为0.1-2％(重量体积百分比)。
本发明提供一种多西他赛棕榈酸酯脂质体，以多西他赛棕榈酸酯为主药，还包括螯合 剂。多西他赛棕榈酸酯用量为0.1-2％；螯合剂用量0.001-1％(重量体积百分比)。
本发明提供一种多西他赛棕榈酸酯脂质体，以多西他赛棕榈酸酯为主药，还包括螯合 剂、卵磷脂以及DSPE-PEG2000。多西他赛棕榈酸酯用量为0.1-2％；螯合剂用量0.001-1％； 卵磷脂用量1-10％，DSPE-PEG2000用量0.05-1％(重量体积百分比)。
本发明的第二个目的，是提供一种多西他赛棕榈酸酯脂质体，是冻干粉针剂，也可以 是注射用脂质体溶液。
本发明的第三个目的，是提供一种多西他赛棕榈酸酯前药，所述的多西他赛棕榈酸酯 前药以多西他赛为母药，以酯键链接一分子棕榈酸而形成前药，是一种稳定性好、功能性 强的脂溶性前药。
所述的多西他赛棕榈酸酯前药的结构如下：
所述的多西他赛棕榈酸酯前药，其特征在于，棕榈酸与多西他赛侧链2’位相连，其制 备过程如下：多西他赛10.00g、棕榈酸3.81g、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC) 2.43g和4-二甲氨基吡啶(DMAP)1.82g，置于反应容器中，用50mL无水二氯甲烷使溶解，在氮气保护条件下，室温搅拌反应4-24h，得反应溶液；将反应溶液用5％柠檬酸水溶 液洗涤两遍，再用饱和氯化钠溶液洗涤一遍，旋转蒸发减压去除无水二氯甲烷；分离纯化， 即得到多西他赛棕榈酸酯。反应合成路线如下所示：
本发明提供一种多西他赛棕榈酸酯脂质体，所述的脂质体是一种含有螯合剂的注射剂； 所述含有螯合剂的注射剂也可以是注射用溶液，也可以是一种冻干粉针；含有螯合剂是本 发明的核心技术特征。
所述的一种多西他赛棕榈酸酯脂质体，具体由下列配方配制而成：
制备注射用溶液时，冻干保护剂为0；
制备注射用冻干粉针时，冻干保护剂为0.1-40％克/毫升
较优的，所述的一种多西他赛棕榈酸酯脂质体，具体由下列配方配制而成：
较优的，所述的一种多西他赛棕榈酸酯脂质体，具体由下列配方配制而成：
其中，上述配方中所述的卵磷脂，选自高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)、氢化大豆卵磷脂(HSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、磷脂酰 丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂中的一种 或两种以上合用；优选高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)、氢化大豆卵磷脂(HSPC)中的一种或两 种以上合用。
上诉配方中所述的螯合剂选自柠檬酸、柠檬酸二钠、柠檬酸三钠、乳酸、乳酸钠、苹果酸、苹果酸钠、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠中的一种或者两 种以上的混合物，优选柠檬酸、柠檬酸二钠、柠檬酸三钠、乳酸、乳酸钠中的一种或两种 以上合用。
上述配方中所述的冻干保护剂为海藻糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、苏氨酸中的一种或两种以上；优选甘露醇、海藻糖、蔗糖中的 一种或两种以上合用。
上述配方中所述的pH调节剂为氢氧化钠、盐酸中的一种或两种以上。
本发明的第四个目的，是提供所述的一种多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备方法。
所述的一种多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备方法为注入法。
所述的一种多西他赛棕榈酸酯脂质体由如下步骤制备而成：
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂酯、胆固醇、磷脂、DSPE-PEG2000、螯合剂，置于注入用有机溶媒中，在25～70℃下加热使溶解，得有机相；称取注射用水适量，加热至25～70℃， 得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，即得脂质体粗品；将脂质体粗品进行 乳化，可将其置于高压均质机中进行均质乳化，或将其置于挤出器中依次通过不同孔径的 挤出膜挤出，或高压均质后再进行挤出，得脂质体溶液；称取配方量冻干保护剂，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至全量；用pH调节剂调节pH值；过0.22μm滤膜除菌、分装、封口，即得多西他赛棕榈酸酯脂质体；也可冻干制备成多西他赛棕榈酸 酯脂质体冻干粉针。
其中，所述的注入用有机溶媒，选自丙二醇、无水乙醇、叔丁醇中的一种或两种以上 合用，用量为1-8％克/毫升；优选无水乙醇，用量优选为2-5％克/毫升。
所述的注入用有机溶媒，可保留在脂质体中，也可在脂质体粗品乳化后再通过超滤去 除，也可通过冷冻干燥去除。
所述的将脂质体粗品进行乳化，优选挤出乳化法，得到的脂质体粒径分布将更均一； 挤出膜孔径选自0.8μm、0.6μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm，选用一种或两种以上依次通过大孔径到小孔径的挤出，优选0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm。
所述的螯合剂可以溶解在油相中，也可以溶解在水相中，也可以溶解在脂质体溶液中。
所述的冻干保护剂溶解在脂质体溶液中，也可以溶解在水相中。
发明的一种多西他赛棕榈酸酯脂质体，粒径为50-150nm。
本发明的一种多西他赛棕榈酸酯脂质体，含有螯合剂是本发明的核心技术特征，螯合 剂的添加使得多西他赛体内作用时间更长、抗肿瘤效果更佳、制剂相关特性更好，这是本 发明实质性效果的根本体现。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发 明而非用于限定本发明的范围。
实施例1：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂0.5g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)3g、0.3g DSPE-PEG2000，置于4g无水乙醇中，在50℃下加热使溶解，得有机相；称取乙二胺四乙 酸二钠0.05g，置于90g注射用水中，在50℃下加热搅拌使溶解，得水相；将有机相在搅 拌条件下注入水相中，混匀，即得脂质体粗品；将脂质体粗品分别用孔径为0.4μm、0.1μm、 0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；用注射用水定容至100ml；用盐酸调节剂调节pH值 4.5；过0.22μm滤膜除菌、分装、封口，即得多西他赛棕榈酸酯脂质体溶液。
经测定，平均粒径为92.4nm。
实施例2：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂0.3g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)3g、0.2g DSPE-PEG2000、柠檬酸0.1g，置于4g丙二醇中，在60℃下加热使溶解，得有机相；称取 注射用水70g，加热至60℃，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，即得脂 质体粗品；将脂质体粗品分别用孔径为0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得 脂质体溶液；称取蔗糖15g、甘露醇5g，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射 用水定容至100ml；用氢氧化钠调节pH值为5.5；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口， 即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为86.6nm。
实施例3：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂0.7g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)6g、0.5g DSPE-PEG2000、乳酸0.3g，置于6g无水乙醇中，在45℃下加热使溶解，得有机相；称取 注射用水65g，加热至45℃，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，即得脂 质体粗品；将脂质体粗品分别用孔径为0.6μm、0.4μm、0.1μm的挤出膜挤出，得脂质体溶 液；称取海藻糖20g，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至100ml； 用氢氧化钠调节pH值为6.2；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸 酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为120.7nm。
实施例4：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂0.3g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)5g、0.3g DSPE-PEG2000、苹果酸0.1g、柠檬酸0.2g，置于5g无水乙醇中，在65℃下加热使溶解， 得有机相；称取注射用水70g，加热至65℃，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中， 混匀，即得脂质体粗品；将脂质体粗品用高压均质机均质乳化，再分别用孔径为0.1μm、 0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；称取蔗糖10g、海藻糖5g，置于上述脂质体溶液中， 搅拌使溶解，并用注射用水定容至100ml；用氢氧化钠调节pH值为6.0；过0.22μm滤膜除 菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为50.36nm。
实施例5：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂0.2g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)3g、0.2g DSPE-PEG2000、柠檬酸0.01g，置于3g无水乙醇中，在50℃下加热使溶解，得有机相； 称取注射用水75g，加热至50℃，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，即 得脂质体粗品；将脂质体粗品用高压均质机均质乳化，得脂质体溶液；称取蔗糖10g、甘露 醇5g，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至100ml；用氢氧化钠调 节pH值为7.0；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干 粉。
经测定，平均粒径为60.7nm。
实施例6：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂0.7g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)6g、0.7g DSPE-PEG2000、胆固醇0.5g、柠檬酸0.5g，置于6g无水乙醇中，在55℃下加热使溶解， 得有机相；称取注射用水80g，加热至55℃，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中， 混匀，即得脂质体粗品；将脂质体粗品用高压均质机均质乳化，得脂质体溶液；用注射用 水定容至100ml；用氢氧化钠调节pH值为4.8；过0.22μm滤膜除菌、分装、封口，即得紫 杉醇棕榈酸酯脂质体溶液。
经测定，平均粒径为80.4nm。
实施例7：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂0.7g、蛋黄卵磷脂2g、氢化大豆卵磷脂(HSPC)1g、 0.5g DSPE-PEG2000、胆固醇0.1g，置于4g无水乙醇中，在55℃下加热使溶解，得有机相； 称取柠檬酸三钠0.2g、海藻糖10g、甘露醇12g、葡萄糖8g，置于60g注射用水中，加热至55℃，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，即得脂质体粗品；将脂质体粗 品分别用孔径为0.8μm、0.4μm、0.2μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；用注射用水定容至100ml；用盐酸调节pH值为4.5；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕 榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为150.0nm。
实施例8：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂0.8g、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)3g、磷脂酰胆碱 3g、蛋黄卵磷脂1g、0.8g DSPE-PEG2000，置于8g丙二醇中，在70℃下加热使溶解，得有机相；称取注射用水80g，加热至55℃，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中， 混匀，即得脂质体粗品；将脂质体粗品分别用孔径为0.8μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm的挤出 膜挤出，得脂质体溶液；用超滤仪超滤去除丙二醇；称取柠檬酸三钠0.8g，置于超滤后的 脂质体溶液中，搅拌溶解；用注射用水定容至100ml；用盐酸调节pH值为9.0；过0.22μm 滤膜除菌、分装、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体溶液。
经测定，平均粒径为145.2nm。
实施例9：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂0.1g、大豆卵磷脂2g，0.1g DSPE-PEG2000，置于 6g无水乙醇中，在25℃下搅拌使溶解，得有机相；称取乙二胺四乙酸三钠0.5g、柠檬酸二钠0.5g，置于注射用水80g中，在25℃下加热搅拌使溶解，得水相；将有机相在搅拌条件 下注入水相中，混匀，即得脂质体粗品；将脂质体粗品分别用孔径为0.6μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；用注射用水定容至100ml；用盐酸调节pH值为3.5； 过0.22μm滤膜除菌、分装、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体溶液。
经测定，平均粒径为118.8nm。
实施例10：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂1.0g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)10g、1.0g DSPE-PEG2000、胆固醇1g，置于10g无水乙醇中，在60℃下加热使溶解，得有机相；称 取注射用水74g，加热至60℃，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，即得 脂质体粗品；将脂质体粗品用高压均质机均质乳化，得脂质体溶液；用超滤仪超滤去除无 水乙醇；称取乳酸钠0.5g、苹果酸钠0.5g，置于超滤后的脂质体溶液中，搅拌使溶解；用 注射用水定容至100ml；用盐酸调节pH值为5.0；过0.22μm滤膜除菌、分装、封口，即得 紫杉醇棕榈酸酯脂质体溶液。
经测定，平均粒径为130.2nm。
实施例11：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂0.1g、二硬脂酰磷脂酰胆碱1g、0.05g DSPE-PEG2000，置于1g无水乙醇中，在55℃下加热使溶解，得有机相；称取注射用水 95g，加热至55℃，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，即得脂质体粗品； 将脂质体粗品用高压均质机均质乳化，得脂质体溶液；称取乳酸钠0.001g，置于上述脂质 体溶液中，搅拌使溶解；用注射用水定容至100ml；用氢氧化钠调节pH值为8.0；过0.22μm 滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉针剂。
经测定，平均粒径为90.7nm。
实施例12：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂0.1g、磷脂酰乙醇胺1g、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱1g、 0.5g DSPE-PEG2000、乙二胺四乙酸0.005g，置于4g无水乙醇中，在55℃下加热使溶解， 得有机相；称取海藻糖5g，置于70g注射用水中，加热至55℃，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，即得脂质体粗品；将脂质体粗品分别用孔径为0.8μm、0.6μm、 0.4μm、0.1μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；用注射用水定容至100ml；用氢氧化钠调节 pH值为7.5；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为104.3nm。
实施例13：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂0.2g、磷脂酰丝氨酸1g、鞘磷脂1g、0.2g DSPE-PEG2000、柠檬酸0.01g，置于2g无水乙醇与4g丙二醇的混合溶剂中，在70℃下加 热使溶解，得有机相；称取注射用水50g，加热至70℃，得水相；将有机相在搅拌条件下 注入水相中，混匀，即得脂质体粗品；将脂质体粗品用高压均质机均质乳化，得脂质体溶 液；称取蔗糖15g、甘露醇15g、赤藓糖醇5g、苏氨酸5g，置于上述脂质体溶液中，搅拌 使溶解，并用注射用水定容至100ml；用氢氧化钠调节pH值为6.0；过0.22μm滤膜除菌、 分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为78.4nm。
实施例14：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂0.4g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)5g、0.5g DSPE-PEG2000、柠檬酸0.01g，置于5g无水乙醇中，在50℃下加热使溶解，得有机相； 称取注射用水50g，加热至50℃，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，即 得脂质体粗品；将脂质体粗品用高压均质机均质乳化，再分别用孔径为0.2μm、0.1μm、0.05μm 的挤出膜挤出的，得脂质体溶液；称取木糖醇10g、山梨醇15g、甘露醇10g，置于上述脂 质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至100ml；用氢氧化钠调节pH值为6.0；过 0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为140.7nm。
实施例15：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂0.3g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)3g、0.1g DSPE-PEG2000，置于5g叔丁醇中，在45℃下加热使溶解，得有机相；称取注射用水80g， 加热至45℃，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，即得脂质体粗品；将脂 质体粗品用高压均质机均质乳化，得脂质体溶液；称取柠檬酸三钠0.1g、蔗糖13g、甘露醇 5g，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解；用注射用水定容至100ml；用盐酸调节pH值为 5.5；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉针剂。
经测定，平均粒径为105.3nm。
实施例16：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂0.3g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)1.5g、氢化大豆卵 磷脂(HSPC)0.5g、0.1g DSPE-PEG2000，置于6g无水乙醇中，在55℃下加热使溶解， 得有机相；称取注射用水60g，加热至55℃，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中， 混匀，即得脂质体粗品；将脂质体粗品用高压均质机均质乳化，得脂质体溶液；用超滤仪 超滤去除无水乙醇；称取乙二胺四乙酸二钠0.3g、海藻糖19g、乳糖5g，置于超滤后的脂 质体溶液中，搅拌使溶解；用注射用水定容至100ml；用氢氧化钠调节pH值为7.0；过0.22μm 滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉针剂。
经测定，平均粒径为89.4nm。
实施例17：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂0.3g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)3g、0.7g DSPE-PEG2000、柠檬酸0.1g，置于4g丙二醇中，在70℃下加热使溶解，得有机相；称取 蔗糖10g、海藻糖5g，置于70g注射用水中，加热至70℃，得水相；将有机相在搅拌条件 下注入水相中，混匀，即得脂质体粗品；将脂质体粗品分别用孔径为0.8μm、0.6μm、0.4μm、 0.1μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；用注射用水定容至100ml；用氢氧化钠调节pH值为 6.0；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为113.6nm。
实施例18：多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂脂0.3g、高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)3g、0.5g DSPE-PEG2000、柠檬酸0.01g，置于4g丙二醇中，在60℃下加热使溶解，得有机相；称 取蔗糖17g、甘露醇5g，置于65g注射用水中，加热至70℃，得水相；将有机相在搅拌条 件下注入水相中，混匀，即得脂质体粗品；将脂质体粗品分别用孔径为0.6μm、0.4μm、0.1μm、 0.05μm的挤出膜挤出，得脂质体溶液；用注射用水定容至100ml；用氢氧化钠调节pH值为 6.7；过0.22μm滤膜除菌、分装、冻干、封口，即得紫杉醇棕榈酸酯脂质体冻干粉。
经测定，平均粒径为106.3nm。
实施例19：螯合剂对多西他赛棕榈酸酯脂质体抗肿瘤效果的影响
处方中含有螯合剂，是本发明的多西他赛棕榈酸酯脂质体现实质性效果的关键所在。 为了进一步验证螯合剂在本发明中的优越性，采取多次平行对比的方式，在相同处方工艺 下分别制备含螯合剂与不含螯合剂的脂质体，以小鼠S180肉瘤作为肿瘤模型，分别对含螯 合剂与不含螯合剂的多西他赛棕榈酸酯脂质体进行抗肿瘤效果比较，试验设计与结果如下 所示。
1.样品来源
取市售多西他赛注射液，作为阳性对照药；取实施例1制备的含螯合剂多西他赛棕榈 酸酯脂质体，作为含螯合剂供试制剂；完全按照实施例1的处方工艺，平行制备不含螯合剂的脂质体，作为不含螯合剂对照制剂。
2.小鼠S180肿瘤模型的建立与给药方案的设计
小鼠腹水瘤S180细胞，培养于DMEM培养液中，37℃，5％CO2下常规培养，平均每 两天传代一次，至对数生长期时用培养基调整细胞浓度5×107个/mL，在无菌条件下注射于小鼠腹腔内，待一周左右后可见明显腹水时，无菌条件下取荷瘤小鼠腹水，用生理盐水以1:5适量稀释，接种0.2mL于小鼠腹腔内。待一周左右可见明显二代腹水时，无菌条件下取荷瘤小鼠二代腹水，用生理盐水1:5适量稀释，于小鼠左侧腋窝皮下注射S180细胞悬液， 每只0.2mL。
将接种24h后的ICR小鼠称重，随机分为4组，每组8只。分别设定空白组、市售多 西他赛注射液组、不含螯合剂对照组、含螯合剂对照组。采用小鼠尾静脉注射方式给药， 剂量为每次10mg/kg(按多西他赛计)，空白组给于0.2ml生理盐水，隔一天给一次药，总 共给药4次。停药第三日处死小鼠，称取小鼠体重，剥离瘤体称重，计算抑瘤率。
抑瘤率＝(生理盐水组瘤重-给药组瘤重)/生理盐水组瘤重×100％
3.抗肿瘤效果
以小鼠S180肉瘤为模型，考察含螯合剂与不含螯合剂的多西他赛棕榈酸酯脂质体以及 市售多西他赛注射液的抗肿瘤效果，结果如表1所示。
表1含螯合剂与不含螯合剂的多西他赛棕榈酸酯脂质体以及 市售多西他赛注射液抗肿瘤效果对比结果
组别 平均瘤重(g) 抑瘤率
空白组 1.17±0.49 /
市售多西他赛注射液组 0.44±0.21 62.39％
不含螯合剂多西他赛棕榈酸酯脂质体对照组 0.30±0.11 74.36％
含螯合剂多西他赛棕榈酸酯脂质体供试组 0.21±0.06 82.05％
结果分析：
①含螯合剂与不含螯合剂的多西他赛棕榈酸酯脂质体抗肿瘤效果，均显著好于市售多 西他赛注射液，说明将多西他赛开发成前药多西他赛棕榈酸酯脂质体后，抗肿瘤效果明显 提高，是本发明实质性效果的重要方面。
②平行对比含螯合剂与不含螯合剂的多西他赛棕榈酸酯脂质体抗肿瘤效果。结果显示， 含螯合剂脂质体抗肿瘤效果要好于不含螯合剂组。
终上所述，处方中含有螯合剂，多西他赛棕榈酸酯脂质体的抗肿瘤效果将更好，这是 本发明实质性效果的体现，故含有螯合剂是本发明的核心技术特征。
实施例20：螯合剂对多西他赛棕榈酸酯脂质体体内药代动力学的影响
1.样品来源
取市售的多西他赛注射液，作为参比制剂；取实施例1制备的多西他赛棕榈酸脂质体， 作为含螯合剂多西他赛棕榈酸脂质体样品；完全按照实施例1的处方工艺制备得不含螯合 剂的多西他赛棕榈酸脂质体，作为不含螯合剂的多西他赛棕榈酸脂质体样品。
2.药代动力学试验设计
取SD雄性大鼠18只，随机分为三组，每组6只，实验前禁食过夜，自由饮水。分别 设定市售多西他赛注射液组、不含螯合剂多西他赛棕榈酸脂质体、含螯合剂多西他赛棕榈 酸脂质体组。采用大鼠尾静脉注射方式给药，剂量为每次10mg/kg(按多西他赛计)，分别 于给药后0.033h、0.083h、0.167h、0.25h、0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、 8h、10h、12h、24h经眼眶静脉丛取血0.5mL，置于含有肝素钠的离心管并摇匀，4500r/min 离心10min，取血浆150μl，于-20℃下冻存。按常规方法进行血浆样品的处理，用高效液 相色谱法测定血浆中多西他赛的浓度。
3.结果与分析
采用DAS 2.0软件进行模型拟合，计算得药动学参数。市售多西他赛注射液组、含螯 合剂多西他赛棕榈酸脂质体组、不含螯合剂多西他赛棕榈酸酯脂质体的体内药代动力学结 果如表2所示。
表2含螯合剂与不含螯合剂多西他赛棕榈酸酯脂质体以及市售多西他赛注射液多西他 赛大鼠药代动力学主要参数的比较
结果分析：
1.多西他赛棕榈酸酯脂质体，AUC∞与T1/2明显比市售多西他赛棕榈酸酯注射液大。该 实验结果，说明将多西他赛制备成前药脂质体后，明显延缓药物在体内的代谢，使作用时 间更长。
2.含螯合剂的多西他赛棕榈酸酯脂质体，与不含螯合剂的多西他赛棕榈酸酯脂质体比， AUC∞增大，T1/2延长。从药效来看，含螯合剂的脂质体抗肿瘤效果更好，也许就是因为 其具有体内相对较长的作用时间，故抗肿瘤效果更好。
终上所述，在多西他赛棕榈酸酯脂质体的处方中添加螯合剂后，延长了药物的体内作 用时间，提高了抗肿瘤作用。由此可见，处方中含有螯合剂，对本发明的多西他赛棕榈酸 酯脂质体优越性的体现尤为重要，是关键技术特征。
实施例21：螯合剂对多西他赛棕榈酸酯脂质体制剂特性的影响
研究的是一种无菌脂质体，而脂质体在生产过程中无法高温灭菌，故人们通常用0.22μm 的滤膜进行除菌过滤，达到无菌的效果。而在实际生产过程中，往往由于脂质体粒径较大 或者是粒径分布不均匀导致除菌过滤不顺畅，严重影响生产效率。就多西他赛棕榈酸酯脂 质体而言在研究过程中，我们特别关注除菌过滤的顺畅程度，发现螯合剂的添加能够使过 滤性更顺畅。通过检测，加螯合剂的脂质体，粒径略小，粒径分布PDI更小，故过滤更加 顺畅。试验设计与结果如下所示。
以实施例1为例，完全按照实施例1记载的处方工艺分别制备含螯合剂与不含螯合剂 的多西他赛棕榈酸酯液体脂质体1000ml，分别用直径11mm的板式滤器，0.22μm的聚醚砜滤膜过滤，记录过滤体积；分别测定含螯合剂与不含螯合剂的多西他赛棕榈酸酯液体脂质体的粒径与粒径分布PDI，试验结果见表3所示：
表3本发明的多西他赛棕榈酸酯脂质体制剂相关特性的比较
指标 不含螯合剂多西他赛棕榈酸酯脂质体 含螯合剂多西他赛棕榈酸酯脂质体
平均粒径 102.1nm 92.4nm
PDI 0.237 0.124
过滤量 625ml 867ml
结果分析：
本发明的多西他赛棕榈酸酯脂质体粒径更小、分布更窄、除菌过滤更顺畅。由此可见， 添加螯合剂后，制剂基本特性明显改善，生产实施将更加顺畅。进一步体现了处方中含螯 合剂的优越性。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施 例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型 或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (17)

1.一种多西他赛棕榈酸酯脂质体，以多西他赛棕榈酸酯为主药，还包括螯合剂、卵磷脂以及DSPE-PEG2000；且多西他赛棕榈酸酯用量为0.1-2％，螯合剂用量为0.001-1％，卵磷脂用量为1-10％，DSPE-PEG2000用量为0.05-1％。
2.根据权利要求1所述的多西他赛棕榈酸酯脂质体，其特征在于，该脂质体为一种冻干粉针剂。
3.根据权利要求1所述的多西他赛棕榈酸酯脂质体，其特征在于，该脂质体是一种注射用脂质体溶液。
4.根据权利要求1、2或3所述的多西他赛棕榈酸酯脂质体，其特征在于，具体由下列配方配制而成：
5.根据权利要求1、2或3所述的多西他赛棕榈酸酯脂质体，其特征在于，具体由下列配方配制而成：
6.根据权利要求1或2或3所述的多西他赛棕榈酸酯脂质体，其特征在于，具体由下列配方配制而成：
7.根据权利要求1-6任一项所述的多西他赛棕榈酸酯脂质体，其特征在于，所述的卵磷脂选自高纯蛋黄卵磷脂(EPCS)、氢化大豆卵磷脂(HSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂中的一种或两种以上。
8.根据权利要求1-6任一项所述的多西他赛棕榈酸酯脂质体，其特征在于，所述的螯合剂选自柠檬酸、柠檬酸二钠、柠檬酸三钠、乳酸、乳酸钠、苹果酸、苹果酸钠、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠中的一种或者两种以上。
9.根据权利要求4-6任一项所述的多西他赛棕榈酸酯脂质体，其特征在于，所述的冻干保护剂选自海藻糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、苏氨酸中的一种或两种以上。
10.根据权利要求4-6任一项所述的多西他赛棕榈酸酯脂质体，其特征在于，所述的pH调节剂为氢氧化钠、盐酸中的一种或两种以上。
11.根据权利要求1-10任一项所述的多西他赛棕榈酸酯脂质体，其特征在于，脂质体的粒径为50-150nm。
12.如权利要求1所述的多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法如下：
称取处方量的多西他赛棕榈酸脂酯、胆固醇、磷脂、DSPE-PEG2000、螯合剂，置于注入用有机溶媒中，在25～70℃下加热使溶解，得有机相；称取注射用水适量，加热至25～70℃，得水相；将有机相在搅拌条件下注入水相中，混匀，即得脂质体粗品；将脂质体粗品进行乳化，可将其置于高压均质机中进行均质乳化，或将其置于挤出器中依次通过不同孔径的挤出膜挤出，或高压均质后再进行挤出，得脂质体溶液；称取配方量冻干保护剂，置于上述脂质体溶液中，搅拌使溶解，并用注射用水定容至全量；用pH调节剂调节pH值；过0.22μm滤膜除菌、分装、封口，即得多西他赛棕榈酸酯脂质体；也可冻干制备成多西他赛棕榈酸酯脂质体冻干粉针。
13.根据权利要求12所述的多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备方法，其特征在于，所述的注入用有机溶媒，选自丙二醇、无水乙醇、叔丁醇中的一种或两种以上，用量为1-10％克/毫升。
14.根据权利要求12所述的多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备方法，其特征在于，所述的注入用有机溶媒，可保留在脂质体中，也可在脂质体粗品乳化后再通过超滤去除，也可通过冷冻干燥去除。
15.根据权利要求12所述的多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备方法，其特征在于，所述的将脂质体粗品进行乳化，挤出膜孔径选自0.8μm、0.6μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm，选用一种，或两种以上依次通过大孔径到小孔径的挤出。
16.根据权利要求12所述的多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备方法，其特征在于，所述的螯合剂溶解在油相中、水相中或者脂质体溶液中。
17.根据权利要求12所述的多西他赛棕榈酸酯脂质体的制备方法，其特征在于，所述的冻干保护剂溶解在脂质体溶液中，或者溶解在水相中。
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