CN1890567A - 血管发生抑制分子及其在癌症治疗和诊断中的用途 - Google Patents

血管发生抑制分子及其在癌症治疗和诊断中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN1890567A
CN1890567A CNA2004800340309A CN200480034030A CN1890567A CN 1890567 A CN1890567 A CN 1890567A CN A2004800340309 A CNA2004800340309 A CN A2004800340309A CN 200480034030 A CN200480034030 A CN 200480034030A CN 1890567 A CN1890567 A CN 1890567A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
treatment
fragment
jam
diagnosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2004800340309A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1890567B (zh
Inventor
B·A·伊姆霍夫
M·奥兰德-莱恩斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Serono SA
Original Assignee
Laboratoires Serono SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US10/738,123 external-priority patent/US7642341B2/en
Application filed by Laboratoires Serono SA filed Critical Laboratoires Serono SA
Publication of CN1890567A publication Critical patent/CN1890567A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1890567B publication Critical patent/CN1890567B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及血管发生抑制分子，即单克隆抗体H33或其片段或衍生物，它们在癌症治疗特别是实体瘤治疗中的用途、以及包含它们的治疗和诊断组合物。本发明具体涉及H33人源化衍生物或具有H33特异性的人单克隆抗体。

Description

血管发生抑制分子及其在癌症治疗和诊断中的用途
本发明涉及能够抑制血管发生的分子、包含一种或多种所述分子的治疗或诊断组合物、以及这些分子在医学中的用途，特别是在治疗或诊断癌症(特别是实体瘤)中的用途。还公开了用于提供这些分子的方法。
血管发生(即由原有脉管系统形成新的血管)是创伤愈合、生殖和胚胎发育的基础。血管发生对于肿瘤的发生也是至关重要的。肿瘤中的新血管提供养分，容许细胞进行不受控制的有丝分裂。
在血管发生过程中，内皮细胞增殖，迁移到新组织中，并形成内皮间连接，导致管的形成。这个过程是由血管生成因子起始和驱动的。VEGF和促血管生成素(angiopoietin)的信号作用导致外膜细胞-内皮接触放松，从而容许新内皮细胞增殖并通过整联蛋白的介导与胞外基质相互作用。αvβ3和αvβ5整联蛋白已被描述经由与血管生成因子的信号交叉对话(crosstalk)而参与血管发育和血管发生。
除了内皮细胞与胞外基质之间的相互作用以外，内皮间接触的调节对于管的形成也是重要的。例如，粘附分子VE-钙粘着蛋白在血管重建(remodelling)中发挥作用，且维持血管的完整性。
在产生本发明的研究中，发现了连接粘附分子JAM-B和JAM-C。这些分子是在血管细胞-细胞接触中发现的，且牵涉白细胞跨内皮迁移。现在发现JAM-B和JAM-C之间的相互作用在血管发生中也发挥重要作用。
根据这项发现，发明人试图寻找能够抑制血管发生的新分子。为此，他们使用了包括下列步骤的方法：
a)提供一系列分子；
b)测试这些分子是否能够防止JAM-B和JAM-C之间的相互作用；
c)对阳性分子测试它们在体内阻断血管发生的能力；并
d)选择在体内测试中呈阳性的分子作为血管发生抑制分子。
对分子测试它们在体内阻断血管发生的能力可以如实施例4中所述通过视网膜测试进行。
依照本发明发现并非所有能够防止JAM-B和JAM-C之间相互作用的分子也能够抑制血管发生。因此，额外的上述步骤d)的测试是寻找期望分子所必需的。
根据本发明，为了寻找特别适合的分子，该方法还可以包括对阳性分子测试它们在体内抑制肿瘤生长的能力的步骤。在体内抑制肿瘤生长的测试是例如实施例5中描述的测试方法。
通过分离或生成血管发生抑制分子的步骤可以实际获得期望的分子。
可以在这种方法中测试的一系列分子可以是不同的。合适地，所述的一系列分子可以是例如针对JAM-B或JAM-C的一群抗体。抗体制备是不需要创造性技能的简单技术，例如在khler和Milstein，Nature 256：495-497(1975)中所描述的。因此，技术人员将能够在没有过度负担下提供该系列分子。
测试分子是否能够防止JAM-B和JAM-C之间的相互作用是通过例如在存在所述分子的条件下分别将在表面表达JAM-B或JAM-C的细胞与标记的可溶性JAM-C或JAM-B温育并记录相对于不含所述分子进行的对照温育的细胞标记减少而进行的。选择与表达JAM-C或JAM-B且具有标记的JAM-B或JAM-C但没有被测试分子结合到其表面的对照细胞相比诱导标记物显现数量减少的分子作为阳性分子。
合适的标记物有本领域众所周知的基于荧光、放射性或生物素的标记物。用于显现标记物及其消失或减少的合适技术有流式细胞术、生物化学或酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
然后对发现抑制3AM-B和JAM-C之间相互作用的分子进一步测试它们在体内抑制血管发生的能力。为此可以采用多种选择。然而，实施例4中描述的视网膜测试是非常适合的，因为血管系统的重建本质上依赖内皮细胞而非微环境因素。另外的测试方法有绒毛膜尿囊膜测定法(chorio allantois membrane assay)、缺血性再灌注(ischemicreperfusion)或由荷载了血管生成因子的基底膜基质(matrigel)移植物诱导的血管发生。这些测试方法在本领域是众所周知的。
除了测试在体内抑制血管发生的能力以外，还/或者可以测试分子在体内抑制肿瘤生长的能力。这种测试的合适实例如实施例5中所述。
上述方法最终导致鉴定了由杂交瘤13H33生成的抗体H33作为本发明血管发生抑制分子，所述杂交瘤13H33于2003年10月22日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，保藏编号DSM ACC2622。证明了针对JAM-C的抗体H33能够在体外和在体内阻断血管发生且在体内防止肿瘤生长。它减少巨噬细胞进入肿瘤的募集。它还阻断JAM-C与JAM-B的相互作用。H33不影响增殖和凋亡。
因此，本发明涉及用作药物，特别是用于治疗癌症，更具体的说就是用于治疗实体瘤的抗体H33。另外，本发明涉及用作药物的与H33具有相同特异性的H33片段和衍生物。具体而言，这些片段和衍生物就是Fab片段、Fv片段、单个结构域抗原结合片段、具有H33特异性的重组抗体、scFv及其聚集体、VHHs、H33的人源化衍生物、至少包含H33特异性的嵌合抗体或具有H33特异性的人单克隆抗体。后者适于在转基因小鼠或其它动物中生成(下文将进行解释)。
本发明还涉及同样保留完整抗体的抗原结合能力的抗体片段和抗体衍生物。本领域从未描述过H33的这些片段和衍生物，因而它们是新颖的。
可以通过对抗体的蛋白水解(木瓜蛋白酶消化、胃蛋白酶消化或其它酶促方法)改造功能性抗原结合抗体片段，产生Fab、Fv或单个结构域。
或者，可以重组生产片段。Fab片段(“抗原结合片段”)是抗体分子的抗原结合结构域，包含VH+CH1和CL+VL。CL和CH1之间存在一个链间二硫键。该异二聚体的分子量通常是大约50kDa。可以通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体来制备Fab片段。
仍然包含完整IgG抗体的完整抗原结合位点的最小片段(～30kDa)由重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)二者组成。称为Fv片段(“可变片段”)的这种异二聚体仍然能够结合抗原。
另一种片段是单个结构域抗原结合片段(dAbs)或VHs。
可以重组生成单链Fv片段。在scFv片段中，VH和VL结构域以亲水性且柔性肽接头相连。scFv能够复合形成二聚体(二体，diabody)、三聚体(三体，triabody)或更大聚合物，其中单体单元可以具有相同或不同的特异性。
另一种类型的抗体片段是包含最小可用完整抗原结合片段的VHHs。可以通过经免疫骆驼(immunised camelid)重链抗体的蛋白水解或重组技术生成VHHs。
在使用重组DNA技术时，基本上可以将编码H 33抗体H链或L链V结构域的多核苷酸与编码优选人H或L链恒定区的多核苷酸融合。为了表达以这种方式获得的完整H和L链，还可以添加编码容许蛋白质分泌的信号肽的序列。
为了生成本发明的血管发生抑制分子，使用了表达盒，其中将本发明的融合多核苷酸与容许在选定宿主细胞中调控其转录和翻译的适当控制序列以及包含多核苷酸或这种表达盒的重组载体相连。
因此，不但可以通过众所周知重组DNA技术的方法也可以通过化学DNA合成容易地获得本发明的多核苷酸，即具有H33特异性的血管发生抑制分子。
可以通过重组DNA和遗传工程的众所周知的技术获得重组DNA构建体并导入宿主细胞。
在本发明中有用的宿主细胞可以是原核或真核细胞。在合适的真核细胞中，可以提到例如植物细胞、酵母细胞(诸如酵母属(Saccharomyces))、昆虫细胞(诸如果蝇属(Drosophila)或夜蛾属(Spodoptera))和哺乳动物细胞(诸如HeLa、CHO、3T3、C127、BHK、COS等)。
有几种方法可用于用包含编码嵌合Ig链的核酸构建体的载体转染原核或真核细胞。将载体导入淋巴样细胞的一种优选方法是球芽融合(见例如Gillies等，1989，Biotechnol.7：798-804)。另外的方法包括电穿孔或磷酸钙沉淀。用于生成免疫缀合物的其它有用方法包括制备编码构建体的RNA序列并在适当的体内或体外系统中进行翻译。
一旦表达，可以通过标准蛋白质纯化过程收获本发明的蛋白质(见例如美国专利号5,650,150)。
在将重链和轻链组合在本发明的分子中时，优选在相同的细胞中与相应轻链共表达抗体可变区的重链。对于包含多个多肽链的融合蛋白，可以使用一种以上的表达载体。使用例如两种表达载体的共转染方法常常导致将两种载体都投递到靶细胞中。或者，使用编码多个多肽的单一载体在相同细胞中进行共表达有时是有效的。
另外，可以方便地将本发明的蛋白质表达成单链分子。例如，可以将抗体可变区表达成单链抗体或sFv，任选与非免疫球蛋白的蛋白质融合。在另一个实施方案中，将重链(含有或不含融合的细胞因子)与轻链(或重链)配对物(含有或不含融合的细胞因子)组合在一起而形成单价和二价免疫缀合物。
根据VL和VH区的核酸序列是如何构建的，它们可以通过二硫键或肽键相连。一般而言，当V区的序列是在分开的DNA构建体上编码时，它们通过二硫键相连。相反，当V区的序列是在单链DNA构建体上编码时，它们通常通过肽键相连。
在本发明的某些实施方案中，轻链可变区和重链可变区可以分别与免疫球蛋白的轻链恒定区和重链恒定区结合。可以使用免疫球蛋白轻链恒定区的κ或λ链。
可以通过分子生物学的标准技术来进行本发明表达载体的构建和宿主细胞的转化。
可以通过使用蛋白A Sepharose的亲和层析由细胞或培养物上清液纯化由这些原核或真核细胞生成的本发明血管发生抑制分子，并通过众所周知的竞争性ELISA技术通过测量它们针对H33结合包被在微量滴定板上的可溶性JAM-C的抑制活性来评估它们的JAM-C结合活性。
剩余的大鼠可变结构域在人体中可能仍然具有免疫原性，从而能够削弱基于抗体疗法的功效。可以应用众所周知的方法来降低免疫原性，诸如“镶饰术(veneering)”和“人源化”，它们牵涉如专利WO 2004055056中所述引入氨基酸替代。然后可以如上所述通过针对H33的抑制活性来进行对结合亲和力的筛选。
或者，可以突变非人T细胞表位，使得它们符合人类抗体中存在的人类自身表位(见例如美国专利号5,712,120)。H33抗体是本发明的一部分，其具有包括至少一个人源化序列的VL和VH区，从而在施用于人时降低免疫原性。
然后可以如上所述进行宿主细胞中的抗体生成和纯化。
依照本发明的另一方面，可以将H33的抗体可变区或类似分子与非免疫球蛋白部分相连，其中含有或不含插入Fc部分。具体而言，非免疫球蛋白部分可以是细胞因子(诸如白细胞介素)、造血因子、淋巴因子、干扰素或趋化因子。白细胞介素可以是例如白细胞介素-2或白细胞介素-12。造血因子和淋巴因子可以分别是例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和淋巴毒素。干扰素可以是例如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-γ。
在本发明的有些实施方案中，融合蛋白包含另一非免疫球蛋白部分，诸如另一细胞因子。
本发明还提供了H33抗体或其片段或衍生物用于制备用于在患者中防止JAM-B/JAM-C相互作用的药物的用途。
这种防止作用可以包括通过对患者施用具有本发明可变区的抗体而靶向表面具有JAM-C的细胞。在一个实施方案中，被靶向的细胞是肿瘤细胞。
依照本发明的其它方面，防止JAM-C/JAM-B相互作用可以通过对患者施用编码抗体可变区的核酸或包含该核酸的细胞之任一来实现。
对于人体临床应用，修饰大鼠来源的抗体H33以降低抗体的免疫原性或将其降至最低可能是有用的。作为降低鼠源抗体免疫原性的手段，文献中已经报告了多种方法。这些方法包括生成包含鼠或大鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体、生成包含来自鼠或大鼠抗体的可变结合序列的单链抗体、生成鼠或大鼠的抗原结合片段(因为它们较小，所以可能免疫原性较低)、生成人单克隆抗体和生成“人源化”抗体。
人源化理想地提供了没有免疫原性且完全保持亲本非人抗体分子的抗原结合特性的抗体。没有免疫原性容许施用多个剂量而不会产生不利的免疫原性反应。文献中已经报告了用于生成人源化抗体的多种方法。例如，可以如下生成人源化抗体：(a)只将非人CDR移植到人构架和恒定区上(Jones等，Nature 321：522-25，1986；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536，1988)；或者(b)移植整个非人可变结构域(以保持配体结合特性)但也通过对暴露残基的替代用人样表面“掩饰”它们以降低免疫原性(也称为“镶饰”抗体)(Padlan，Molec.Immun.28：489-498，1991；Padlan，Molec.Immun.31(3)：169-217，1994)。
据报道，在人可变区构架结构域中保持非人(鼠或大鼠)残基有助于保持产生的人源化抗体的适当结合功能。据报道，人源化抗体潜在降低或消除抗体在宿主接受者中的免疫原性，从而容许提高生物利用度并降低不利免疫反应的可能性，从而潜在能够进行多次抗体施用。同样，上述衍生自具有期望结合特异性的抗体的scFv和诸如Fv、Fd、Fab、Fab′和F(ab)′2片段等抗体片段的合成构成了生成免疫原性比完整抗体低的靶向部分的另一种已知方法。本质上，单链抗体和抗体片段因为较小，所以免疫原性可能比完整抗体低。
还知道，重组蛋白(例如抗体)在用于表达的不同宿主细胞中发生的糖基化不同。对于H33抗体的临床应用，糖基化可以延长它的半衰期和/或降低它的免疫原性。
抗体H33还可用于竞争性筛选以分离与H33具有相同或相似特异性的“人单克隆抗体”或“重组人抗体”。基本上，由此分离的人抗体可以在能够通过进行V-D-J重组和同种型转换而生成针对JAM-C的多种同种型人单克隆抗体(例如IgG、IgA和/或IgE)的杂交瘤、转染瘤或非人转基因动物(例如转基因小鼠)中生成(例如专利EP1471938和US 2004208873)。这种转基因动物还可以是用于生成多克隆抗体的转基因兔，诸如US 2003/0017534中所述。
术语“人单克隆抗体”指具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区且展示单一结合特异性的抗体。在一个实施方案中，通过包含由转基因非人动物(例如转基因小鼠)(具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组)获得的B细胞与无限增殖化细胞融合的杂交瘤生成了与H33具有相同特异性的人单克隆抗体。
用于制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。小鼠中杂交瘤的产生是已经完善建立的方法。免疫方案和分离用于融合的经免疫脾细胞的技术在本领域是已知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合流程也是已知的。
在一个优选的实施方案中，可以使用携带人免疫系统部分而非小鼠系统的转基因小鼠即所谓的“HuMAb”小鼠(Lonberg等，1994，Nature368(6474)：856-859)来生成针对JAM-C且具有H33特异性的人单克隆抗体。因此，在该小鼠中，小鼠IgM或[κ]轻链的表达降低，而且导入的人重链和轻链转基因应答免疫而进行类型转换和体细胞突变，生成高亲和力的人IgG[κ]单克隆抗体(Lonberg，N.等，1994，见上文；综述见Lonberg，N.，1994，Handbook of ExperimentalPharmacology 113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.，1995，Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93；以及Harding，F.和Lonberg，N.，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。下列参考文献详细描述了HuMAb小鼠的制备：Taylor，L.等，1992，Nucleic AcidsResearch 20：6287-6295；Chen，J.等，1993，InternationalImmunology 5：647-656；Tuaillon等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3720-3724；Choi等，1993，Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等，1993，EMBO J.12：821-830；Tuaillon等，1994，J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg，N.等，1994，Nature 368(6474)：856-859；Lonberg，N.，1994，Handbook of Experimental Pharmacology113：49-101；Taylor，L.等，1994，International Immunology 6：579-591；Lonberg，N.和Huszar，D.，1995，Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93；Harding，F.和Lonberg，N.，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546；Fishwild，D.等，1996，Nature Biotechnology14：845-851。还可参阅美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299和5,770,429(都是授予Lonberg，N.和Kay，R.M.以及GenPharn International的)；授予Surani等的美国专利号5,545,807；1998年6月11日公布的国际公布号WO 98/24884；1994年11月10日公布的WO 94/25585；1993年6月24日公布的WO 93/1227；1992年12月23日公布的WO 92/22645；以及1992年3月19日公布的WO 92/03918。
优选的HuMAb小鼠在它们的内源轻链(κ)基因中具有JKD破坏(disruption)(如Chen等，1993，EMBO J.12：821-830所述)、在它们的内源重链基因中具有CMD破坏(如Korman等的WO 01/14424的实施例1所述)、具有KCo5人κ轻链转基因(如Fishwild等，1996，Nature Biotechnology 14：845-851所述)、且具有HCo7人重链转基因(如Lonberg，N.和Kay，R.M.的美国专利号5,770,429所述)和/或HCo12人重链转基因(如Korman等的WO 01/14424的实施例2所述)。
或者，可以使用在转染色体(transchromosomic)片段上携带人免疫球蛋白基因的小鼠来生成具有H33特异性的抗JAM-C抗体。这种转染色体小鼠的制备描述于Tomizuka等的WO97/07671。在优选的小鼠中，在转基因上携带某些人免疫球蛋白基因，而在转染色体上携带其它人免疫球蛋白基因，诸如Ishida等的WO 02/43478中详细描述的携带人轻链转基因(例如KCo5κ链转基因)和人重链转染色体(例如SC20转染色体)的小鼠。
为了生成完全人的具有H33特异性的JAM-C单克隆抗体，可以如Lonberg，N.等，1994，Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等，1996，Nature Biotechnology 14：845-851；以及WO 98/24884所述，用JAM-C抗原和/或生成JAM-C的细胞和/或重组JAM-C的纯化或富集制备物免疫HuMAb小鼠。优选的是，小鼠在第一次输注时是6-16周龄。例如，可以用重组JAM-C腹膜内免疫HuMAb小鼠。
为了生成JAM-C的人单克隆抗体，可以分离小鼠脾细胞，并根据标准方案用PEG与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后通过众所周知的技术对由此产生的杂交瘤筛选抗原特异抗体的生成。
还可以通过例如重组DNA技术与本领域众所周知的基因转染方法(Morrison，S.，1985，Science 229：1202)的联合，在宿主细胞转染瘤中生成具有H33特异性的本发明人抗体。
H33及其具有防止JAM-B和JAM-C之间相互作用且在体内抑制血管发生的能力的片段或衍生物可用于本发明。抗体片段和抗体融合蛋白的生成综述于Joosten，V.等，Microb Cell Fact 2(1)：1，2003。用于制备抗体片段和衍生物的技术是众所周知的，而且本领域技术人员可以无需过度负担下进行。
例如，为了表达H33抗体或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如PCR扩增、定点诱变)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且插入表达载体使得基因可操作连接转录和翻译控制序列。在本文中，术语“可操作连接”意指将抗体基因连接到载体中使得载体中的转录和翻译控制序列发挥它们预计的功能，即调控抗体基因的转录和翻译。选择的表达载体和表达控制序列应当与所用表达宿主细胞相容。
可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入分开的载体，或者更常见的是将两种基因插入相同的表达载体。通过标准方法(例如抗体基因片段和载体上的互补限制位点的连接，或是如果没有限制位点的话平端连接)将抗体基因插入表达载体。
可以使用本文所述抗体的轻链和重链可变区通过将它们插入已经编码目的同种型重链恒定区和轻链恒定区的表达载体使得VH区段与载体中的CH区段可操作连接且VL区段与载体中的CL区段可操作连接来产生任何抗体同种型的全长抗体基因。
另外/或者，重组表达载体可以编码促进宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中使得信号肽符合读框地与抗体链基因的氨基末端相连。信号肽可以是免疫球蛋白的信号肽，或是异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因以外，本发明的重组表达载体还携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调控序列。术语“调控序列”意图包括启动予、增强子和控制抗体链基因转录或翻译的其它表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。这些调控序列见例如Goeddel，Gene ExpressionTechnology.Me thods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA，1990。
本领域技术人员将领会，表达载体的设计(包括调控序列的选择)可能取决于诸如待转化宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等因素。
用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白质表达的病毒元件，诸如衍生自巨细胞病毒(CMV)、猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子AdMLP)和多形瘤的启动子和/或增强子。或者，可以使用非病毒调控序列，诸如泛素启动子或β-球蛋白启动子。
除了抗体链基因和调控序列以外，用于表达本发明血管发生抑制分子的重组表达载体还可以携带其它序列，诸如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因便于选择导入了载体的宿主细胞(见例如美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017，都授予Axel等)。例如，选择标记基因通常赋予导入了载体的宿主细胞以药物(诸如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞的氨甲蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。各种形式的术语“转染”意图涵盖常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染。虽然理论上有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的分子，优选在真核细胞中进行表达，最优选哺乳动物宿主细胞，因为这些真核细胞(特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更有可能组装和分泌正确折叠且有免疫学活性的抗体、其片段或衍生物。
用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，与DHFR选择标记配合使用，如例如R.J.Kaufman和P.A.Sharp，1982，Mol.Biol.159：601-621所述)、NS/0骨髓瘤细胞、COS细胞、HEK293细胞和SP2.0细胞。特别是在使用NS/0骨髓瘤细胞时，另一种优选的表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338 841中公开的GS(谷氨酰胺合成酶)基因表达系统。在将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞后，通过将宿主细胞培养足以容许宿主细胞表达产物或更优选的是将产物分泌到宿主细胞所生长的培养基中的时间来生成表达产物。可以使用标准蛋白质纯化方法由培养物的培养基回收表达产物。
或者，可以在其它表达系统中表达克隆的抗体基因，包括原核细胞，诸如微生物，例如用于生成scFv抗体的大肠杆菌(E.coli)、藻类(algi)、以及昆虫细胞。另外，可以在转基因非人动物(诸如在绵羊和兔的乳汁中或鸡的卵中)或者是转基因植物中生产抗体。见例如Verma，R.等，1998，Antibody engineering：Comparison ofbacterial，yeast，insect and mammalian expression systems.J.Immunol.Meth.216：165-181；Pollock等，1999，Transgenicmilkas a method for the production of recombinant antibodies.J.Immunol.Meth.231：147-157；以及Fischer，R.等，1999，Molecularfarming of recombinant antibodies in plants.Biol.Chem.380：825-839。
抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，CDR内的氨基酸序列在各个抗体之间比CDR以外的序列变化更多。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以有可能通过构建表达载体来表达模拟特异天然存在抗体的特性的重组抗体，所述的表达载体包含来自该特异天然存在抗体(在这种情况中，具体的说就是H33)的CDR序列，其被移植到来自具有不同特性的不同抗体的构架序列上(见例如Riechmann，L.等，1998，Nature 332：323-327；Jones，P.等，1986，Nature 321：522-525；以及Queen，C.等，1989，Proc.Natl.Acad.参见U.S.A.86：10029-10033)。这些构架序列可以由包含种系抗体基因序列的公共DNA数据库获得。这些种系序列与成熟抗体基因序列有所不同，因为它们不包含B细胞成熟过程中通过V(D)J连接形成的完全组装好的可变基因。种系基因序列还与高亲和力次级全套(repertoire)抗体的序列有所不同，后者在整个可变基因包含突变，但突变通常簇集在CDR中。例如，体细胞突变在构架区1的氨基末端部分和构架区4的羧基末端部分中相对稀有。另外，许多体细胞突变不显著改变抗体的结合特性。
为此，为了重建与特定抗体具有相似结合特性的完整重组抗体，不必获得该原始抗体的完整DNA序列(见WO 99/45962)。为此目的，跨越CDR区域的部分重链和轻链序列通常就已足够。使用部分序列来确定哪些种系可变和连接基因区段有助于重组抗体可变基因。然后使用种系序列填充可变区中的缺失部分。重链和轻链前导序列在蛋白质成熟过程中切除，无助于最终抗体的特性。为了添加缺失的序列，可以将克隆的cDNA序列与合成寡核苷酸通过连接或PCR扩增组合在一起。或者，可以将整个可变区合成为一套短的、交叠的寡核苷酸，并通过PCR扩增组合在一起，产生完全合成的可变区克隆。这种方法具有某些优点，诸如消除或包含特定限制位点、或是优化特定密码子。
在本申请中，术语“血管发生抑制分子”指H 33及其如本文所述保持相同或相似特异性的所有可能的片段和衍生物。
本发明还涉及血管发生抑制分子诸如H33及其片段和衍生物用于制备用于治疗或诊断癌症特别是实体瘤的治疗或诊断组合物的用途。
本发明还涉及用于治疗或诊断癌症特别是实体瘤的治疗或诊断组合物，其包含治疗或诊断有效量的一种或多种本发明血管发生抑制分子以及合适的赋形剂、载体、稀释剂或其它添加剂。癌症治疗领域的技术人员将能够确定治疗或诊断有效量。
组合物还可以包含多种(例如两种或多种)本发明血管发生抑制分子的组合。
还可以在联合疗法中施用本发明的药物组合物，即联合其它药剂。例如，联合疗法可以包含至少一种化疗剂、至少一种抗炎剂、或至少一种免疫抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明的血管发生抑制分子可以连同放疗一起施用。
在另一个实施方案中，本发明的血管发生抑制分子可以联合一种或多种其它抗体一起施用，例如一种或多种人抗体，诸如抗VEGF抗体。
调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如治疗反应)。例如，可以单次大剂量施用，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的急需适当减少或增加剂量。配制剂量单位形式的肠胃外组合物以便于施用和剂量的一致是尤其有利的。剂量单位形式在用于本文时指适于以单一剂量用于待治疗受试者的物理上离散单位；每个单位包含根据计算产生期望治疗效果的预定数量的活性化合物以及所需药物载体。本发明剂量单位形式的规格由下列各项规定和直接决定：(a)活性化合物的独特特征和有待实现的特定治疗效果；和(b)将这种活性化合物复合的技术对于在个体中的治疗敏感性的内在限制。
短语“肠胃外施用”在用于本文时指肠和局部施用以外的施用模式，通常通过注射或输注，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外和胸骨内注射和输注。
本发明的血管发生抑制分子可以连同合适的赋形剂、载体或稀释剂一起包含在药物组合物中。
可用于本发明药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。
这些组合物还可以包含诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂等添加剂。通过灭菌过程和包含多种抗细菌和抗真菌剂可以确保预防微生物的存在，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。还可能希望在组合物中包含等渗剂，诸如糖、氯化钠等。另外，可以通过包含延迟吸收剂诸如单硬脂酸铝和明胶来实现对可注射药物形式的延长吸收。
在将本发明的化合物作为药物施用于人和动物时，可以单独给药或是以包含例如0.01-99.5％(更优选0.1-90％)的活性成分连同药物可接受载体的药物组合物给药。
无论选择的给药途径，通过本领域技术人员已知的常规方法将可以以合适水合形式使用的本发明血管发生抑制分子和/或本发明的药物组合物配制成制药学可接受剂量形式。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化以获得对特定患者、组合物和给药模式有效实现期望治疗反应且对患者无毒的活性成分量。选择的剂量水平将取决于多种药动学因素，包括所采用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、所采用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所采用的特定组合物联合使用的其它药物、化合物和/或材料、接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和以前的病史、以及医学领域众所周知的类似因素。具有本领域普通技术水平的医师或兽医能够容易地确定并开处所需药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可能由低于实现期望治疗效果所需水平的药物组合物中所采用的本发明化合物剂量开始并逐渐提高剂量直至实现期望效果。一般而言，本发明组合物的合适每日剂量将是产生治疗效果的最低有效剂量的化合物的量。这种有效量通常将取决于上述因素。
合适的是，给药可以是静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下，优选接近目标部位给药。如果需要，可以在一天之中以合适间隔时间分开给药两个、三个、四个、五个、六个或更多亚剂量来施用治疗组合物的有效每日剂量，任选采取单位剂量形式。尽管有可能单独施用本发明的化合物，然而优选以药物制剂(组合物)施用化合物。
例如，在使用H33作为血管发生抑制分子时，可以利用针对H33抗体的抗独特型抗体或使用检测H33抗体的其它特异方法(例如使用JAM-C进行包被的ELISA测定法)通过在施用后不同时间点测量生物学样品中的循环H33抗体量来确定或调整剂量。
还可以使用本领域已知的医学装置来施用治疗组合物。例如，在一个优选实施方案中，可以使用无针皮下注射装置来施用本发明的治疗组合物，诸如美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的众所周知的植入物和组件(module)的实例包括：美国专利号4,487,603，它公开了用于以受控速率分配药物的可植入微型输注泵；美国专利号4,486,194，它公开了用于穿过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，它公开了用于以精确输注速率投递药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，它公开了用于连续投递药物的变速流可植入输注装置；美国专利号4,439,196，它公开了具有多室隔室的渗透药物投递系统；以及美国专利号4,475,196，它公开了渗透药物投递系统。本领域技术人员知道许多这样的其它植入物、投递系统和组件。
在某些实施方案中，可以配制本发明的血管发生抑制分子以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排斥许多高亲水性化合物。为了确保本发明的治疗化合物能够穿过BBB(如果需要的话)，可以将它们配制成例如脂质体。关于制造脂质体的方法见例如美国专利号4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂质体可以包含一种或多种部分，它们选择性转运进入特定细胞或器官，由此增强靶向药物投递(见例如V.V.Ranade，1989，J.Clin.Pharmacol.29：685)。例示性靶向部分包括叶酸或生物素(见例如授予Low等的美国专利号5,416,016)、甘露糖苷(Umezawa等，1988，Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)、抗体(P.G.Bloeman等，1995，FEBS Lett.357：140；M.Owais等，1995，Antimicrob.Agents Chemother.39：180)、表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等，1995，Am.J.Physiol.1233：134，其不同种类可能构成本发明的制剂以及所发明分子的成分)、p120(Schreier等，1994，J.Biol.Chem.269：9090)；还参见K.Keinanen、M.L.Laukkanen，1994，FEBS Lett.346：123；J.J.Killion、I.J.Fidler，1994，Immunomethods 4：273。
在本发明的一个实施方案中，将本发明的血管发生抑制分子配制成脂质体；在一个更优选的实施方案中，脂质体包含靶向部分。在一个最优选的实施方案中，通过接近期望部位(例如肿瘤部位)的快速推注来递送脂质体中的治疗化合物。组合物的流动性必须达到易于进行注射的程度。它在制造和贮藏条件下必须是稳定的，而且必须针对微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用进行防护。
本发明血管发生抑制分子的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或状况，而且可以由本领域技术人员决定。
可以通过或是完全或是部分的客观肿瘤反应来衡量用于治疗肿瘤的“治疗有效剂量”。完全反应(CR)定义为没有疾病的临床、放射学或其它迹象。部分反应(PR)源自总的肿瘤大小减小超过50％。中值进展时间是表征客观肿瘤反应持续时间的一种度量。
还可以通过它稳定疾病进展的能力来测定治疗肿瘤的“治疗有效剂量”。可以在预测在人肿瘤中的功效的动物模型系统中评估化合物抑制癌症的能力。治疗化合物的治疗有效量能够缩小肿瘤大小，或者改善受试者中的症状。本领域普通技术人员将能够根据诸如受试者的体型、受试者症状的严重程度和选择的特定组合物或给药途径来决定这些量。
因此，用本发明组合物治疗的患者可以额外施用(在施用本发明分子之前、同时或之后)另一种治疗剂，它增强或提高本发明分子的治疗效果。
此外，本发明还涉及本发明的化合物在诊断中的用途。例如，经标记抗体可用于在体内定位肿瘤。用放射性、顺磁性或其它标记抗体是本领域众所周知的技术。
在一个具体实施方案中，本发明提供了通过离体或在体外检测样品(例如组织样品、体液样品或细胞样品)中的JAM-C来诊断JAM-C相关疾病的方法。这可以这样来实现，例如在容许H33与JAM-C之间形成复合物的条件下使待测样品(任选与对照样品一起)接触H33抗体或其衍生物或片段。然后可以检测复合物的形成，例如使用ELISA。在与测试样品一起使用对照样品时，可以在这两种样品中检测复合物，而且样品之间复合物形成的任何统计学显著差异指示测试样品中存在JAM-C。
下面的实施例将进一步描述本发明。这些实施例只是出于例示目的，而非意图以任何方式限制本发明。在实施例中涉及下列附图。
图1显示了在人肝肿瘤中血管表达JAM-C。对一组血管发生性肿瘤分析JAM-C表达。正常肝中不存在编码人JAM-C的转录本。用抗JAM-C抗体对冷冻切片的免疫染色显示一个血管子群(箭头)的表达。右图显示了针对PECAM-1的多克隆抗体的染色以显现血管结构，而且以αvβ3染色(插图)作为肿瘤血管发生特征的对照。
图2显示了JAM-C在VEGF刺激后在HUVEC的内皮间接合处的募集。(A)将HUVEC用重组VEGF-165刺激，用甲醛固定，并用抗JAM-C单克隆抗体显现JAM-C定位。进行JAM-A染色作为对照。JAM-C分子在VEGF-165刺激后在细胞-细胞接触处富集，然而对JAM-A没有看到作用。(B)FACS分析揭示了JAM-C在细胞-细胞接触处的富集是由于该分子的重新定位，因为表达水平在VEGF处理后保持不变(细线，阴性对照；虚线，未处理细胞；粗线，VEGF处理细胞)。
图3显示了抗JAM-C单克隆抗体在体外消除血管发生。将来自小鼠的主动脉环在存在或缺乏抗JAM-C抗体(50μg/ml)的条件下在两层Matrigel之间进行培养，并在12天后显现新血管形成。图片是代表性的未处理(A，n＝11)或用抗JAM-C单克隆抗体H33(B，n＝11)和D33(C，n＝6)或同种型匹配对照抗体Me114(D，n＝6)进行处理的主动脉环微血管的光学显微照片。只有H33阻断血管发生的萌发。
图4显示了抗JAM-C抗体H33降低肿瘤生长和肿瘤血管形成。给小鼠皮下注射LLC1肿瘤细胞，并隔天用抗JAM-C抗体或独特型匹配对照抗体(150μg)进行处理。(A)在对照小鼠(PBS和同种型匹配对照抗体)或用H33抗JAM-C抗体处理的小鼠中生长的12日龄LLC1肿瘤的宏观外观。根据肿瘤体积(B)和肿瘤重量(C)的测量，用H 33抗JAM-C抗体处理的小鼠显示肿瘤生长降低。通过PECAM-1免疫染色检测微血管(D)并通过计算机分析进行定量(E)。*p＜0.01。每条柱代表十只测试动物的平均值±sem。
图5显示了H33抗JAM-C抗体在体内没有毒性。为了确保H33抗JAM-C抗体对肿瘤生长的作用不是由于一般体内毒性作用，如图4中所述处理小鼠，并解剖和分析器官。(A)用Schiff氏高碘酸(PAS)染色的来自这些小鼠的肾没有显示肾小球肾炎发生的任何迹象。作为对照，用来自患自身免疫病NZBxBXSB小鼠的肾切片进行比较(Merino，R.等，J Clin Inyest.94(2)：521-5，1994)。(B)使用伊文思蓝(Evans blue)透性测定法评估体内血管透性。H33抗体在代表性器官心、肺、肾和脑中对血管透性没有影响。每条柱代表七只测试动物的平均值±sem。
图6显示了视网膜血管再形成过程中血管小球的定量。对血管小球的数目计数，并将H33处理和对照抗体处理小鼠中的视网膜新血管形成进行比较。与对照小鼠(ctrl)或用同种型匹配对照抗体(9B5)处理的小鼠相比，在H33处理小鼠(13H33)中观察到血管小球数目减少。这指示H33处理动物的视网膜中新血管形成降低。
图7显示了抗JAM-C抗体H33降低了肿瘤中的巨噬细胞数目。将来自PBS、对照抗体或H33处理小鼠的LLC1肿瘤冷冻切片对酸性磷酸酶进行染色以检测巨噬细胞(A，箭头)。通过对肿瘤内每mm2被标记巨噬细胞数目进行计数来定量微血管密度(B)。与对照动物相比，来自H33处理动物的肿瘤显示浸润的巨噬细胞减少。每条柱代表由每组n只小鼠的四个切片获得的平均值±SEM(PBS，n＝6；对照抗体，n＝6；H33，n＝9)。**p＜0.01。刻度尺，(A)160mm，(B)20mm。
图8显示了H33抗体既不影响内皮细胞的增殖，也不影响它的凋亡。每个孔以1.25×104至5×104个细胞的范围接种内皮细胞(A)或LLC1肿瘤细胞(B)，并在存在或缺乏H33抗体或对照抗体的条件下进行培养。使用MTT测定法测定增殖速率。H33抗体不影响内皮和肿瘤细胞的增殖。(C)将来自同种型匹配对照或H33处理小鼠的LLC1肿瘤冷冻切片对PECAM-1进行免疫染色(绿色)，并对凋亡细胞进行TUNEL染色(红色，箭头)。在用H33抗体处理小鼠后，与对照相比，内皮细胞没有显示凋亡增加。相反，根据肿瘤内凋亡细胞的定量证明，肿瘤细胞显示凋亡增加(D)。
                      实施例
实施例1：一组针对JAM-B或JAM-C的抗体的制备
有待在本发明的方法中测试的一组抗体是依照Khler和Milstein，Nature 256：495-497，1975制备的。用于获得这组抗体的抗原的来源是如实施例2所述制备的重组可溶性JAM-B或JAM-C。
实施例2：可溶性JAM-B和JAM-C的制备
本发明人发现，JAM-C通过它的V结构域与JAM-B嗜异性(heterophilically)相互作用，而且可溶性JAM-C V结构域足以结合JAM-B。
使用相同的克隆策略通过PCR获得可溶性JAM-B和可溶性JAM-C V结构域。引物是由Microsynth(Microsynth GmbH，Balgach，Switzerland)获得的，用于克隆策略添加的限制位点标有下划线。使用编码鼠JAM-C全长序列的质粒、Pfu聚合酶、T7和(5′-gc tctagacagtgttgccgtcttgcctacag-3′)作为正向和反向引物，扩增编码JAM-C胞外V结构域的cDNA。用HindIII和XbaI消化PCR产物，然后克隆到含FLAG标签序列的pcDNA 3中。
如下制备可溶性JAM-B：使用(5′-tcagctaggcagccagct-3′)和(5′-gc tctagaatctacttgcattcgcttcc-3′)作为正向和反向引物通过PCR获得编码可溶性JAM-B的cDNA。然后将用XbaI消化的PCR产物，使用EcoRI/平端和XbaI位点符合FLAG标签序列读框地克隆到pcDNA3中。
实施例3：对防止JAM-B和JAM-C之间相互作用的能力的测试
如Aurrand-Lions等，J Biol chem 276：2733-41，2001a；Aurrand-Lions等，Blood 98：3699-707，2001b；以及Johnson-Leger等，Blood 100：2479-2486，2002所述获得在表面表达JAM-B或JAM-C的细胞。
用Alexa 488的磺基琥珀酰亚胺酯(Molecular Probes Inc.)或磺基-NHS-生物素(Pierce)依照制造商的流程标记如实施例2中所述获得的可溶性JAM-B和JAM-C。
在存在待测试分子的条件下，分别使表达JAM-B或JAM-C的细胞接触经标记的可溶性JAM-C或JAM-B。通过流式细胞术监测荧光，荧光强度相对于未处理对照的降低指示可溶性JAM-C或可溶性JAM-B的结合降低。
实施例4：对在体内阻断血管发生的能力的测试
将出生后7天(P7)的小鼠置于75％氧气中达五天，引起视网膜的中央驱血(central avascularization)(Reynolds等，NatureMedicine 8：27-34，2002)。在此培育后，将小鼠在含氧量正常的条件下再饲养五天(直至P17)。在P12、P14和P16给小鼠腹膜内注射50μg单克隆抗体。通过用不扩散的荧光素-葡聚糖溶液灌注整个血管系统来检测新血管形成。在平整固定的视网膜中检测到新血管形成和血管小球的区域。血管小球是应答血管发生性刺激而生成的且突入内界膜的高度增殖性弯曲血管丛。对血管小球的数目计数，对用待测试分子处理的小鼠和对照小鼠中的视网膜新血管形成进行比较。
测试的一种分子是引起新血管形成减少的单克隆抗体H33。
实施例5：针对JAM-C的单克隆抗体H 33是血管发生和肿瘤生长的抑制物
1.材料和方法
抗体
针对人和小鼠JAM-C的大鼠单克隆抗体(CRAM)(H33、H36和D33)和针对小鼠PECAM-1/CD31(GC51)和L选择蛋白/CD62L(Me114)的大鼠单克隆抗体见先前的描述(Aurrand-Lions等，2001a，见上文；Gallatin等，Nature 330：30-34，1983；Piali等，Eur J Immunol.23：2464-71，1993；Springer等，Eur.J.Immunol.9：301，1979)。用作无关抗体对照大鼠IgG2a的抗人CD44(9B5)是由B.Engelhardt博士馈赠的(Laschinger和Engelhardt，2000)。任何其它无关抗体可用作阴性对照。针对人JAM-B的多克隆抗体是依照Palmeri等，JBiol Chem.275：19139-45，2000制备的。单克隆小鼠抗人整联蛋白αvβ3(LM609)购自Chemicon(Temecula，CA)。
内皮细胞
通过脐静脉的胶原酶处理分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(WallRT等，J Cell Physiol 96：203-213，1978)。在补充了20％胎牛血清(PAA Laboratories)、25mM HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸)、非必需氨基酸、丙酮酸钠、内皮细胞生长补充物(ECGS，15μg/ml；Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY)和肝素(4μg/ml；Sigma，Buchs，Switzerland)的M199中维持HUVEC。使用第3代和第5代之间的细胞。
VEGF刺激
将1×105个HUVEC置于生长因子减少的Matrigel(BectonDickinson，Bedford，MA，USA)上。48小时后，将细胞与100ng/ml重组人VEGF-165(PeproTech House，London，UK)一起温育15分钟(免疫细胞化学)或15分钟至24小时(流式细胞术)。
流式细胞术
将HUVEC与H36抗JAM-C单克隆抗体一起在冰上温育。用PBS、BSA 0.2％清洗后，使用偶联了藻红蛋白的抗大鼠抗体(JacksonImmunoresearch Laboratories公司，West Grove，PA，USA)检测H36抗体的结合。省略一抗作为对照。使用FACSCalibur和Cellquest软件(Becton Dickinson，Mountain View，CA，USA)进行分析。
免疫染色
为了用单克隆抗体抗JAM-C(H 36)和针对JAM-B/VE-JAM的多克隆抗体进行免疫组织化学，将冷冻切片用1∶1的丙酮/甲醇于-20℃固定5分钟，干燥，并在PBS、0.2％明胶、0.05％吐温20中再水合。为了进行免疫细胞化学，将细胞用4％低聚甲醛PBS固定15分钟，然后用0.01％Triton X100的PBS透化10分钟。用PBS、0.2％BSA清洗细胞，并与一抗一起温育一小时，在清洗后再与偶联了德州红(TexasRed)、FITC或过氧化物酶的二抗(Jackson ImmunoresearchLaboratories公司，West Grove，PA，USA)一起温育。使用共聚焦显微镜Zeiss LSM510获取照片。通过Schiff氏高碘酸(PAS)对肾的染色检测肾小球肾炎。
离体主动脉环测定法
如Nicosia，R.F.和Ottinetti，In Vitro Cell Dev Biol.26(2)：119-28，1990所述进行小鼠主动脉环测定法。简而言之，将1mm胸主动脉环置于两层任选含有待测试抗体的50μl生长因子减少的Matrigel(Becton Dickinson，Bedford，MA，USA)之间，并覆盖100μl补充了20U/ml肝素(Sigma-Aldrich公司，Saint-Louis，MO，USA)和ECGS(Upstate biotechnology，Lake Placid，NY，USA)的DMEM。使用Zeiss Axioskop显微镜通过相差显微镜检术显现微血管的长出。
肿瘤移植
给雌性8至10周龄C56BL6/J小鼠(Charles River laboratories，L′Arbresle，France)皮下接种1×106个鼠Lewis氏肺癌细胞(LLC1)。然后隔天给小鼠腹膜内注射150μg单克隆抗体H33、同种型匹配对照抗体Me114或PBS。当对照肿瘤(注射PBS的小鼠)达到1-1.5cm3时，处死动物，并切除和分析肿瘤。
血管定量
如免疫染色一章中所述用单克隆抗PECAM-1抗体对肿瘤冷冻切片染色。使用Zeiss Axioskop显微镜获取整个冷冻切片(每个肿瘤四个冷冻切片)的照片。使用Zeiss KS400软件对PECAM-1染色和肿瘤总面积定量。
伊文思蓝透性测定法
将150μg抗JAM-C或同种型匹配对照抗体注射到经麻醉小鼠的眼眶后静脉中。15分钟后，以与抗体相同的方式注射100μl 30mg/kg伊文思蓝染料(Sigma-Aldrich公司，Saint-Louis，MO，USA)的盐水溶液，并循环一小时。然后给小鼠灌注柠檬酸盐缓冲的1％低聚甲醛(pH4.2、37℃)，将染料清除出血管腔。灌注后立即解剖器官(肾、肺、心和脑)。将组织干燥(Speed-Vac)后，测量干重。随后将组织在500μl甲酰胺中于70℃温育18小时以提取伊文思蓝。将提取液离心，并用分光光度计测量上清液在620nm处的吸光度。根据伊文思蓝在甲酰胺中的标准曲线计算提取液中的染料浓度，并相对组织干重进行标准化。
统计学分析
使用Mann-Whitney氏t检验分析血管密度计数、肿瘤体积和肿瘤重量。使用统计学软件StatView(Abacus Concepts公司，Berkeley，CA，USA)计算分析项。
结果
JAM-C由肿瘤血管表达而且接受血管发盐性刺激
在人肝的血管发生性肿瘤中，抗JAM-C抗体H36将血管染色(图1)。相反，正常肝中不存在编码JAM-C的转录本。用VEGF处理HUVEC在15分钟内导致JAM-C在内皮细胞-细胞接触中的立即且大量积聚(图2A)。这一短期表现是JAM-C重新定位的结果，而表达水平不受这种处理的改变(图2B)。在用TNF-α或凝血酶刺激HUVEC后观察到相同结果。
体外血管长出受到抗JAM-C单克隆抗体的抑制
使用离体主动脉环测定法进行体外新血管形成。将新鲜解剖的小鼠主动脉切成小环，并包埋在含有或不含抗JAM-C抗体的Matrigel中。12天后评估由主动脉环长出的内皮血管。尽管对照抗JAM-C或同种型匹配抗体的存在不影响主动脉萌芽，然而H33抗JAM-C抗体完全阻断新血管形成(图3)。
抗JAM-C单克隆抗体在体内降低肿瘤生长和血管发生
考虑到H33抗JAM-C抗体能够阻断体外血管发生，我们研究了该抗体是否影响肿瘤血管发生和肿瘤生长。给小鼠皮下注射Lewis氏肺癌细胞。然后隔天腹膜内注射抗JAM-C和对照抗体。当对照肿瘤达到1-1.5cm3时处死动物并切除肿瘤。与对照同种型匹配抗体或PBS相比，在用H33抗JAM-C抗体处理的小鼠中，肿瘤大小(图4A)、体积(图4B)和重量(图4C)显著降低。
切除肿瘤的代表性实例显示于图4A。Lewis氏肺癌细胞不表达JAM-C(未显示的数据)。H33抗体对肿瘤生长的作用是由于对血管发生的抑制。为了显现肿瘤的血管系统，用针对内皮标志物PECAM-1的抗体将冷冻切片免疫染色(图4D)。通过对肿瘤区域的PECAM-1染色百分率计数而对血管密度定量(图4E)。与对照相比，H33抗体降低了肿瘤中的血管数目。
H33抗JAM-C单克隆抗体在体内没有毒性
已知体内注射抗体可能是有毒的。为了检验所观察到的H 33抗JAM-C抗体的作用不是由于在小鼠中的一般毒性作用，研究了注射了抗体的动物是否发展病理学情况。因为JAM-C由肾的内皮表达，所以首先分析抗体是否产生肾小球肾炎。为此，将经处理的小鼠的肾切片用Schiff氏高碘酸染色。没有检测到蛋白质在肾小球中的异常积聚(图5A)。
由于JAM-C参与控制血管透性，还检验了抗体是否诱导血管渗漏。幸运的是，在所分析的代表性器官心、肺、肾或脑中并非如此(图5B)。
与对照小鼠(ctrl)或用同种型匹配对照抗体处理的小鼠相比，在用H33处理的小鼠的视网膜中观察到血管小球的数目减少。这指示在H33处理动物的视网膜中新血管形成降低(图6)。
实施例6：抗JAM-C抗体H33减少肿瘤中的巨噬细胞数目但既不影响内皮细胞的增殖也不影响它的凋亡
材料和方法
肿瘤中血管密度、凋亡细胞和巨噬细胞含量的组织学和定量
为了用单克隆抗体抗PECAM-1(GC51)对肿瘤冷冻切片进行免疫组织化学，将切片用1∶1的丙酮/甲醇于-20℃固定5分钟，干燥，并在PBS/0.2％明胶/0.05％吐温20中水合。将切片与抗体一起于室温温育1小时，在PBS中清洗3次，与偶联了过氧化物酶的二抗(JacksonImmunoresearch Laboratories公司，West Grove，PA，USA)一起温育。
为了用针对PECAM-1和JAM-C的多克隆抗体对低聚甲醛固定且石蜡包埋的眼切片进行免疫组织化学，依照经典流程将切片脱蜡。然后将组织切片用0.3％H2O2的甲醇溶液处理10分钟，在PBS中清洗，并用PBS/3％BSA/0.1％吐温20封闭30分钟。将切片与多克隆抗体一起于室温温育1小时，并在PBS中清洗后，与EnVisionTM系统(DakoCytomation AG，Zg，Switzerland)一起温育30分钟。
使用先前描述的方法(Kindler，V.等，Cell，56：731-740，1989)对肿瘤冷冻切片检测酸性磷酸酶活性。对肿瘤冷冻切片检测凋亡细胞是基于对DNA链断裂的标记(TUNEL荧光法)，并使用末端转移酶和生物素-16-dUTP依照制造商(Roche diagnostics AG，Rotkreuz，Switzerland)的指示进行的。
用偶联了德州红染料的链霉亲和素(Jackson ImmunoresearchLaboratories公司，West Grove，PA，USA)检测结合的生物素-16-dUTP。
使用配备了Axiocam彩色CCD相机的Zeiss LSM510共聚焦显微镜或Zeiss Axiophot 1显微镜获取照片。记录图像，并使用AxioVisionTM软件(Zeiss，Oberkochen，Germany)进行处理。
为了对肿瘤中酸性磷酸酶阳性细胞(巨噬细胞)的数目和TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)的数目定量，使用Zeiss KS400或Openlab软件(Zeiss，Oberkochen，Germany)分析整个冷冻切片(每个肿瘤4个冷冻切片)的照片。
用于测定细胞增殖的MTT测定法
使用如Hansen，MB等，J Immunol Methods 119：203-210，1989中所述的MTT(3，(4，5-二甲基噻唑-2-基)2，5-二苯基-四唑溴化物)法测定鼠原代内皮细胞(LMEC)和肿瘤细胞(LLC1)的增殖指数。简而言之，以1.25×104至1×105个细胞/孔的密度一式三份将细胞置于96孔板中，并在含有或不含50mg/ml抗JAM-C抗体H33或对照抗体9B5的完全培养基中进行培养。培养24小时后，向每个孔中加入25ml MTT溶液(5mg/ml，溶于无菌PBS)，并于37℃温育2小时后，加入100ml萃取缓冲液(20％w/v SDS，溶于DMF和脱矿质水的溶液；通过添加2.5％的80％乙酸和2.5％的1N HCl将pH调至4.7)。于37℃温育过夜后，使用微量滴定板读板仪(Molecular devices公司，CA，USA)测量570nm处的光密度。
结果
H33抗JAM-C抗体降低巨噬细胞进入肿瘤的募集
肿瘤血管发生常常伴随着炎症，而巨噬细胞代表主要的肿瘤相关炎症细胞(Crowther，M等，J Leukoc Biol 70：478-490，2001)。事实上，巨噬细胞通过分泌血管生成因子诸如VEGF而参与血管发生，主要在含氧量低的条件下(Murdoch，C等，Blood 104(8)：2224-34，2004)。JAM-C参与白细胞粘附和迁移通过内皮和上皮细胞(Zen，K等，Mol Biol Cell 15：3926-3937，2004；Chavakis，T等，J BiolChem，2004；Johnson-Leger，CA等，Blood 100：2479-2486，2002；Cunningham，SA等，J Biol Chem 275：34750-34756，2000)。
因此研究了H33抗体是否影响巨噬细胞进入肿瘤的募集。如图7B和7D所示，与对照小鼠相比，用H33抗体处理的小鼠显示肿瘤中的巨噬细胞含量降低。这指示H33对血管发生的作用是部分由其对巨噬细胞募集的作用介导的。
H33抗JAM-C抗体不影响内皮细胞增殖或凋亡
血管发生是一个复杂的过程，伴随着内皮细胞在血管发生性刺激后的增殖和结构重组。首先测试了H33抗体是否在体外通过抑制内皮细胞增殖而阻断血管发生，发现没有作用(图8A)。为了避免H 33处理对肿瘤细胞增殖的任何直接后果，还在体外用肿瘤细胞进行了实验，没有检测到任何作用(图8B)。
这些结果指示施用H33后观察到的血管发生降低不是由对血管或肿瘤细胞生长的防止引起的。对凋亡的刺激将是H33处理诱导血管发生降低的另一种解释。通过凋亡细胞的标准标记方案(TUNEL)鉴定凋亡，由此对肿瘤切片检验了这种假设。结果揭示了H33抗体在体内和在体外对内皮细胞凋亡没有效果(图8C和未显示的数据)。然而，肿瘤细胞显示体内TUNEL标记增加，说明由于抗体介导血管形成降低而发生了凋亡(图8C和D)。

Claims (25)

1.用作药物的血管发生抑制分子，其选自由杂交瘤13H33生成的抗体H33及其片段和衍生物，所述杂交瘤13H33于2003年10月22日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，保藏编号DSM ACC2622。
2.权利要求1的血管发生抑制分子，用于癌症治疗或诊断。
3.权利要求2的血管发生抑制分子，用于实体瘤治疗或诊断。
4.权利要求1-3任一项中的血管发生抑制分子，其中所述分子是选自下组的H33片段：Fab片段、Fv片段、单个结构域抗原结合片段、scFv及其聚集体、VHHs。
5.权利要求1-3任一项中的血管发生抑制分子，其中所述抗体H33衍生物是与H33具有相同特异性的人单克隆抗体。
6.权利要求5的血管发生抑制分子，其中所述人单克隆抗体是在转基因小鼠中生成的。
7.权利要求1-3任一项中的血管发生抑制分子，其中所述分子是选自下组的衍生物：与抗体H33具有相同特异性的重组抗体、基于抗体H33的人源化抗体和基于抗体H33的嵌合抗体。
8.权利要求1-7任一项中的血管发生抑制分子用于制备治疗癌症的治疗或诊断组合物的用途。
9.权利要求1-7任一项中的血管发生抑制分子用于制备治疗实体瘤的治疗或诊断组合物的用途。
10.用于治疗癌症特别是治疗实体瘤的治疗组合物，包含治疗有效量的一种或多种权利要求1-7任一项中的血管发生抑制分子以及赋形剂、载体或稀释剂。
11.用于诊断癌症特别是诊断实体瘤的诊断组合物，包含诊断有效量的一种或多种权利要求1-7任一项中的血管发生抑制分子以及赋形剂、载体或稀释剂。
12.由杂交瘤13H33生成的抗体H33用于制备实体瘤治疗或诊断的药物组合物的用途，所述杂交瘤13H33于2003年10月22日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，保藏编号DSM ACC2622。
13.用于治疗癌症特别是治疗实体瘤的治疗组合物，包含治疗有效量的由杂交瘤13H33生成的抗体H33以及赋形剂、载体、或稀释剂，所述杂交瘤13H33于2003年10月22日保藏于Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，保藏编号DSM ACC2622。
14.用于诊断癌症特别是检测人或动物体中的实体瘤的诊断组合物，包含诊断有效量的由杂交瘤13H33生成的抗体H33、其片段或衍生物以及赋形剂、载体或稀释剂，所述杂交瘤13H33于2003年10月22日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，保藏编号DSM ACC2622。
15.由杂交瘤13H33生成的抗体H33的片段，所述杂交瘤13H33于2003年10月22日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，保藏编号DSM ACC2622，所述片段具有H33的特异性。
16.权利要求15的片段，其选自：Fab片段、Fv片段、单个结构域抗原结合片段、scFv及其聚集体、VHHs。
17.由杂交瘤13H33生成的抗体H33的衍生物，所述杂交瘤13H33于2003年10月22日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，保藏编号DSM ACC2622，所述衍生物具有H33的特异性。
18.权利要求17的衍生物，其为与H33具有相同特异性的人单克隆抗体。
19.权利要求18的衍生物，其中所述人单克隆抗体是由转基因小鼠生成的。
20.权利要求17的衍生物，其选自与抗体H33具有相同特异性的重组抗体、基于抗体H33的人源化抗体和基于抗体H33的嵌合抗体。
21.权利要求15-20任一项中的单克隆抗体H33的片段或衍生物，用作药物。
22.权利要求15-20任一项中的单克隆抗体H33的片段或衍生物，用作于癌症治疗或诊断。
23.权利要求15-20任一项中的单克隆抗体H33的片段或衍生物，用于实体瘤治疗或诊断。
24.权利要求15-20任一项中的抗体H33的片段或衍生物用于制备用于癌症治疗或诊断的药物组合物的用途。
25.权利要求15-20任一项中的抗体H33的片段或衍生物用于制备用于实体瘤治疗或诊断的药物组合物的用途。
CN2004800340309A 2003-11-19 2004-11-19 血管发生抑制分子及其在癌症治疗和诊断中的用途 Expired - Fee Related CN1890567B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03026629.0 2003-11-19
EP03026629A EP1533617A1 (en) 2003-11-19 2003-11-19 Angiogenesis inhibiting molecules, their selection, production and their use in the treatment and diagnosis of cancer
US10/738,123 US7642341B2 (en) 2003-12-18 2003-12-18 Angiogenesis inhibiting molecules, their selection, production and their use in the treatment of cancer
US10/738,123 2003-12-18
PCT/EP2004/013247 WO2005050213A1 (en) 2003-11-19 2004-11-19 Angiogenesis inhibiting molecules and their use in the treatment and diagnosis of cancer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1890567A true CN1890567A (zh) 2007-01-03
CN1890567B CN1890567B (zh) 2012-12-12

Family

ID=34621557

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2004800340309A Expired - Fee Related CN1890567B (zh) 2003-11-19 2004-11-19 血管发生抑制分子及其在癌症治疗和诊断中的用途

Country Status (19)

Country Link
US (1) US7790863B2 (zh)
EP (2) EP1533617A1 (zh)
JP (1) JP2007515159A (zh)
KR (1) KR101135834B1 (zh)
CN (1) CN1890567B (zh)
AT (1) ATE493657T1 (zh)
AU (1) AU2004291989B2 (zh)
BR (1) BRPI0415541B8 (zh)
CA (1) CA2546406C (zh)
DE (1) DE602004030819D1 (zh)
EA (1) EA009037B1 (zh)
ES (1) ES2358905T3 (zh)
HK (1) HK1097908A1 (zh)
IL (1) IL175686A (zh)
MX (1) MXPA06005523A (zh)
NO (1) NO20062793L (zh)
SG (1) SG148190A1 (zh)
WO (1) WO2005050213A1 (zh)
ZA (1) ZA200603069B (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA01009110A (es) * 1999-03-11 2002-08-20 Rmf Dictagene Sa Moleculas de adhesion vascular y modulacion de su funcion.
US7642341B2 (en) 2003-12-18 2010-01-05 Merck Serono S.A. Angiogenesis inhibiting molecules, their selection, production and their use in the treatment of cancer
US8007797B2 (en) 2006-09-28 2011-08-30 Merck Serono S.A. Junctional adhesion molecule-C (JAM-C) binding compounds and methods of their use
EP2626435B1 (en) 2008-03-21 2016-06-01 MDxHealth S.A. Detection and prognosis of cervical cancer
EP2401383B1 (en) 2009-02-27 2013-09-18 Novartis AG Methods for selecting eukaryotic cells expressing a heterologous protein
US9107936B2 (en) 2011-02-02 2015-08-18 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Antagonists of GRASP55 for use as a medicament
WO2012160031A1 (en) * 2011-05-24 2012-11-29 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Method for prognosing solid tumor outcome
WO2014066590A1 (en) * 2012-10-24 2014-05-01 Research Development Foundation Jam-c antibodies and methods for treatment of cancer
GB201415367D0 (en) * 2014-08-29 2014-10-15 Iles Raymond K And Docherty Suzanne M E And Abban Thomas And Naase Mahmoud And Iles Jason K Methods for detecting abnormalities in haemoglobin
US20180105882A1 (en) * 2015-03-31 2018-04-19 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Mediale) New biomarker for outcome in aml
RU2599545C1 (ru) * 2015-11-06 2016-10-10 государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ подавления роста опухоли основе in vitro репрограммирования макрофагов на м1 фенотип с повышенной способностью к продукции оксида азота в эксперименте

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8823869D0 (en) * 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5874299A (en) * 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) * 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) * 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) * 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) * 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) * 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) * 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) * 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) * 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
CA2113113A1 (en) 1991-07-08 1993-01-21 Simon W. Kantor Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
CU22615A1 (es) * 1994-06-30 2000-02-10 Centro Inmunologia Molecular Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos
KR100308764B1 (ko) 1995-08-29 2001-12-17 마나배게이사꾸 키메라동물및그의제작법
EP0938505B1 (en) * 1996-05-31 2002-03-06 Health Research, Inc. Anti-endoglin monoclonal antibodies and their use in anti-angiogenesis therapy
MXPA01009110A (es) * 1999-03-11 2002-08-20 Rmf Dictagene Sa Moleculas de adhesion vascular y modulacion de su funcion.
ES2282133T3 (es) 1999-08-24 2007-10-16 Medarex, Inc. Anticuerpos frente a la ctla-4 humano y sus usos.
AU8470301A (en) * 2000-08-03 2002-02-18 Wim-Van Schooten Production of humanized antibodies in transgenic animals
CA2430013C (en) 2000-11-30 2011-11-22 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
WO2003006673A2 (en) * 2001-07-11 2003-01-23 Texas Biotechnology Corporation A nucleic acid encoding a human junctional adhesion protein (jam3)
EP1513867A4 (en) * 2001-07-16 2006-02-08 Lilly Co Eli EXTRACELLULAR JUNCTIONAL ADHESION MOLECULES
US20030035802A1 (en) * 2001-08-14 2003-02-20 Dewan Zeng Localization of A2B AdoR on human normal and diseased tissue: the use of anti-A2B antibody to diagnose and treat human tumors
NZ534174A (en) 2002-01-09 2007-03-30 Medarex Inc An isolated human monoclonal antibody which binds to human CD30
ES2373947T3 (es) * 2002-12-16 2012-02-10 Genmab A/S Anticuerpos monoclonales humanos contra interleucina 8 (il-8).
ATE471946T1 (de) 2002-12-17 2010-07-15 Merck Patent Gmbh Humanisierter antikörper (h14.18) des maus antikörpers 14.18, der gd2 bindet und seine fusion mit il-2
US7642341B2 (en) * 2003-12-18 2010-01-05 Merck Serono S.A. Angiogenesis inhibiting molecules, their selection, production and their use in the treatment of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
US20070202110A1 (en) 2007-08-30
WO2005050213A1 (en) 2005-06-02
EP1685405B1 (en) 2010-12-29
NO20062793L (no) 2006-08-18
JP2007515159A (ja) 2007-06-14
ES2358905T3 (es) 2011-05-16
CA2546406A1 (en) 2005-06-02
IL175686A0 (en) 2006-09-05
SG148190A1 (en) 2008-12-31
AU2004291989A1 (en) 2005-06-02
CA2546406C (en) 2013-04-09
DE602004030819D1 (de) 2011-02-10
EP1533617A1 (en) 2005-05-25
BRPI0415541B1 (pt) 2018-11-27
HK1097908A1 (en) 2007-07-06
BRPI0415541A (pt) 2006-12-26
EA009037B1 (ru) 2007-10-26
MXPA06005523A (es) 2006-12-14
EP1685405A1 (en) 2006-08-02
KR20060130562A (ko) 2006-12-19
BRPI0415541B8 (pt) 2021-05-25
US7790863B2 (en) 2010-09-07
IL175686A (en) 2012-02-29
AU2004291989B2 (en) 2009-08-06
EA200600995A1 (ru) 2006-10-27
KR101135834B1 (ko) 2012-04-16
CN1890567B (zh) 2012-12-12
ATE493657T1 (de) 2011-01-15
ZA200603069B (en) 2007-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101918447B (zh) 人ox40受体的结合分子
CN101124244B (zh) 抗cd25的人单克隆抗体
CN103380145B (zh) 人类抗-sod1抗体
JP5936818B2 (ja) 細胞傷害活性抗ｌａｇ−３モノクローナル抗体および臓器移植拒絶および自己免疫疾患の治療または予防における該抗体の使用方法
CN1202864C (zh) Cd40:cd154结合阻断物在制备预防逆适应性免疫应答,特别是移植物排斥反应的药物中的用途
CN1452636B (zh) 抗树突细胞的人单克隆抗体
CN110382531A (zh) Il-11抗体
WO2018071777A1 (en) Innate immune cell trispecific binding proteins and methods of use
AU2002346369A1 (en) Anti-IL-6 antibodies, compositions, methods and uses
BRPI0619118A2 (pt) composições e métodos para o tratamento de doenças e desordens associadas com a sinalização de citocina
CN1307590A (zh) 用fc受体配基治疗和诊断巨噬细胞介导的疾病
CN101351478A (zh) 抗cd40抗体的应用
CN103408661A (zh) 提供疾患特异性结合分子和靶的方法
HU229476B1 (en) Antibodies against obm
WO2001078708A1 (en) Treating graft rejection with cxcr3 inhibitors
JP2015502340A (ja) ｉＮＫＴに対するヒト化抗体
IL175686A (en) Molecules inhibit angiogenesis and their use in the treatment and diagnosis of cancer
JP6150734B2 (ja) 同種移植片の生存を長期化するための抗ｃｄ２００抗体の使用
KR20120090931A (ko) 심혈관 및 대사성 질환, 예컨대 제2형 당뇨병의 치료를 위한 ｎｋｇ2ｄ 억제제의 용도
JP6198742B2 (ja) 肺高血圧症
CN116333150B (zh) 一种eno1抗体及其在治疗肿瘤中的应用
TW202128752A (zh) 抗ｉｌ﹘２７抗體及其用途
CN116745325A (zh) Bcma靶向抗体、嵌合抗原受体及其应用
CN1736483A (zh) 应用cd40：cd154结合阻断物预防反适应性免疫应答,特别是移植物排斥反应

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1097908

Country of ref document: HK

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: MERCK SERONO CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: XILUONUO LABORATORIES CO.,LTD.

Effective date: 20100322

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: AUBONNE, SWITZERLAND TO: COINSINS, SWITZERLAND

TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20100322

Address after: Swiss Coyne Hince

Applicant after: Merck Serono S. A.

Address before: Swiss Ou Bone

Applicant before: Serono Lab

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1097908

Country of ref document: HK

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20121212

Termination date: 20201119