KR101135834B1

KR101135834B1 - 혈관신생 저해 분자 및 암의 치료와 진단에서 이들의 용도

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Publication number: KR101135834B1
Application number: KR1020067009463A
Authority: KR
Inventors: 비트 에이. 임호프; 마이클 아울란드-리온스
Original assignee: 메르크 세로노 에스. 에이.
Priority date: 2003-11-19
Filing date: 2004-11-19
Publication date: 2012-04-16
Also published as: US20070202110A1; WO2005050213A1; EP1685405B1; NO20062793L; JP2007515159A; ES2358905T3; CA2546406A1; IL175686A0; SG148190A1; AU2004291989A1; CA2546406C; DE602004030819D1; EP1533617A1; BRPI0415541B1; CN1890567A; HK1097908A1; BRPI0415541A; EA009037B1; MXPA06005523A; EP1685405A1

Abstract

본 발명은 단클론 항체 H33 또는 이의 단편이나 유도체인 혈관신생 저해 분자; 암의 치료, 특히, 고형 종양의 치료에서 이들의 용도; 이들을 함유하는 치료 조성물과 진단 조성물에 관한다. 본 발명은 특히, H33의 특이성을 보유하는 H33의 인간화 유도체 또는 인간 단클론 항체에 관한다.

단클론 항체 H33

Description

혈관신생 저해 분자 및 암의 치료와 진단에서 이들의 용도{ANGIOGENESIS INHIBITING MOLECULES AND THEIR USE IN THE TREATMENT AND DIAGNOSIS OF CANCER}

본 발명은 혈관신생을 저해할 수 있는 분자; 이와 같은 한가지이상의 분자를 함유하는 치료 또는 진단 조성물; 의약 분야, 구체적으로, 암의 치료, 특히, 고형 종양의 치료에서 이들의 용도에 관한다. 더 나아가, 이들 분자를 제공하는 방법을 개시한다.

기존의 맥관구조(vasculature)로부터 새로운 혈관의 형성인 혈관신생은 상처 치유, 재생, 배아 발생에 매우 중요하다. 혈관신생은 또한, 종양의 발달에도 중요하다. 종양에서 신생 혈관은 세포가 무절제한 유사분열(mitosis)을 할 수 있도록 영양분을 제공한다.

혈관신생동안, 내피 세포는 증식하고 새로운 조직으로 이동하며 내피 세포간 접점을 형성하여 튜브 형성을 유도한다. 이런 과정은 혈관신생 인자에 의해 시작되고 주도된다. VEGF와 안지오포이에틴(angiopoietin)의 신호전달은 혈관주위세포(pericyte)-내피 세포 접촉을 약화시켜 새로운 내피 세포의 증식 및 인테그린(integrin)에 의해 매개된 이들 내피 세포와 세포외 매트릭스의 상호작용을 가능하게 한다. αvβ3과 αvβ5 인테그린은 혈관신생 인자와 신호전달 응 수(signalling crosstalk)를 통하여 혈관 발달과 혈관신생에 참여하는 것으로 보고되었다.

내피 세포와 세포외 매트릭스 사이의 상호작용 이외에, 내피 세포간 접점의 조절이 튜브 형성에 중요하다. 가령, 유착 분자 VE-cadherin은 혈관 리모델링에서 일정한 역할을 수행하고, 혈관의 완전성(integrity)을 유지시킨다.

본 발명을 결과한 연구에서, 접점 유착 분자 JAM-B와 JAM-C가 발견되었다. 이들 분자는 혈관 세포-세포 접점에서 발견되고, 백혈구 내피세포사이 이동(transendothelial migration)에 관여한다. 최근에, JAM-B와 JAM-C 사이의 상호작용 역시 혈관신생에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다.

이런 발견에 기초하여, 본 발명자들은 혈관신생을 저해할 수 있는 새로운 발견하기 위하여 노력하였다.

이를 위하여, 본 발명자들은 아래의 단계를 포함하는 방법을 이용하였다:

a) 일정한 범위의 분자를 제공하고;

b) 이들 분자가 JAM-B와 JAM-C 사이의 상호작용을 예방할 수 있는 지를 검사하고;

c) 양성 분자에서 생체내에서 혈관신생을 차단하는 이들의 능력을 검사하고;

d) 생체내 검사에서 양성인 분자를 혈관신생 저해 분자로서 선택한다.

이들 분자에서 생체내에서 혈관신생을 차단하는 이들의 능력을 검사하는 단계는 실시예 4에 기술된 바와 같은 망막 검사로 수행될 수 있다.

본 발명에 따라, JAM-B와 JAM-C 사이의 상호작용을 예방할 수 있는 모든 분자가 혈관신생 역시 저해할 수 있는 것은 아닌 것으로 밝혀졌다. 이런 이유로, 목적하는 단백질을 찾기 위하여, 상기 단계 d)의 부가적인 검사가 필요하다.

본 발명에 특히 적합한 분자를 찾기 위하여, 상기 방법에는 양성 분자에서 생체내에서 종양 성장을 저해하는 이들의 능력을 검사하는 단계가 추가로 포함될 수 있다. 생체내에서 종양 성장 저해에 대한 검사는 예로써 실시예 5에 기술된 바와 같은 검사이다.

혈관신생 저해 분자를 분리하거나 생산하는 단계에서 목적하는 분자를 실제로 획득한다.

상기 방법에서 검사될 수 있는 분자의 범위는 다양하다. 분자의 범위는 예로써 JAM-B 또는 JAM-C에 대한 항체 집단일 수 있다. 항체 준비는 발명적 숙련을 요하지 않는 통상적인 기술이며, 예로써 Kohler & Milstein, Nature 25 6:495-497(1975)에서 기술한다. 이런 이유로, 당업자는 과도한 부담없이 이런 범위를 제공할 수 있다.

분자가 JAM-B와 JAM-C 사이의 상호작용을 예방할 수 있는 지를 검사하는 단계는 상기 분자의 존재하에, 표면에 JAM-B 또는 JAM-C를 발현하는 세포와 표식된 가용성 JAM-C 또는 JAM-B 각각을 함께 배양하고, 상기 분자없는 대조 배양과 비교하여 이들 세포의 라벨링(labelling)에서 감소를 기록함으로써 수행된다. JAM-C 또는 JAM-B를 발현하고 표식된 JAM-B 또는 JAM-C를 보유하지만 표면에서 검사 분자를 보유하지 않는 대조 세포에 비하여 가시화된 표식의 양에서 감소를 유도하는 분자는 양성 분자로서 선택된다.

적절한 표식은 당분야에 널리 공지된 형광, 방사성 또는 비오틴 기초된 표식이다. 표식 및 이의 소멸이나 감소를 가시화시키는데 적합한 기술은 유세포분석법, 생화학, 또는 효소 결합된 면역흡착 검사(ELISA)이다.

이후, JAM-B와 JAM-C 사이의 상호작용을 저해하는 것으로 밝혀진 분자는 생체내에서 혈관신생을 저해하는 능력을 추가로 검사한다. 이를 위하여, 다양한 옵션이 가능하다. 하지만, 실시예 4에 기술된 바와 같은 망막 검사가 가장 적합한데, 그 이유는 맥관구조의 리모델링이 본질적으로 미소-환경 인자(micro-environmental factor)가 아닌 내피 세포에 의존하기 때문이다. 대안적 검사는 융모막요막 검사(chorio allantois membrane assay), 허혈성 재관류(ischemic reperfusion), 또는 혈관신생 인자가 적하된 Matrigel의 이식에 의해 유도된 혈관신생이다. 이들 검사는 당분야에 널리 공지되어 있다.

생체내에서 혈관신생을 저해하는 능력을 검사하는 단계에 추가하여 또는 상기 단계 대신에, 생체내에서 종양 성장을 저해하는 분자의 능력을 검사할 수 있다. 이런 검사의 적절한 실례는 실시예 5에서 기술한다.

상기 방법은 최종적으로, 2003년 10월 22일자로 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 수탁 번호 DSM ACC2622하에 본 발명의 혈관신생 저해 분자로서 기탁된 하이브리도마 13H33에 의해 생산되는 항체 H33의 확인을 결과하였다. JAM-C를 길항하는 항체 H33은 시험관내와 생체내에서 혈관신생을 차단하고 생체내에서 종양 성장을 예방할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이는 대식세포의 종양으로의 동원을 감소시킨다. 이는 또한, JAM-C와 JAM-B의 상호작용을 차단할 수 있다. H33은 증식 및 아폽토시스에 영향을 주지 않는다.

따라서, 본 발명은 암의 치료, 특히 고형 종양의 치료를 위한 약물로서 이용되는 항체 H33에 관한다. 이에 더하여, 본 발명은 약물로서 이용되는 항체 H33과 동일한 특이성을 보유하는 H33의 단편과 유도체에 관한다. 이들 단편과 유도체는 특히, Fab 단편, Fv 단편, 단일 도메인 항원 결합 단편, H33의 특이성을 보유하는 재조합 항체, scFv와 이의 응집체, V_HHS, H33의 인간화된 유도체, H33의 특이성을 적어도 보유하는 키메라 항체, 또는 H33의 특이성을 보유하는 인간 단클론 항체이다. 후자는 아래에 상술된 바와 같이 외래유전자도입 생쥐 또는 다른 동물에서 적절히 생산된다.

또한, 본 발명은 전체 항원의 항원 결합 능력을 유지하는 항체 단편과 항체 유도체에 관한다. H33의 이들 단편과 유도체는 선행 기술에서 보고된 바 없으며 신규하다.

기능성 항원-결합 항체 단편은 항체의 단백분해(파파인 절단, 펩신 절단 또는 다른 효소 방식)에 의해 가공되고, Fab, Fv 또는 단일 도메인을 산출할 수 있다.

대안으로, 단편은 재조합 방식으로 생산될 수 있다. Fab 단편(“단편 항원 결합”)은 V_H + C_H1 및 C_L + V_L을 보유하는 항체 분자의 항원-결합 도메인이다. C_L과 C_H1 사이에 사슬간 이황화 결합이 존재한다. 이런 이형이량체의 분자량은 일반적으로 대략 50 kDa이다. Fab 단편은 전체 항체의 파파인 절단으로 제조될 수 있다.

전체 IgG 항체의 전체 항원-결합 부위를 여전히 보유하는 최소 단편(~30 kDa)은 가변 중쇄(V_H)와 가변 경쇄(V_L) 도메인 모두로 구성된다. Fv 단편(“가변 단편”의 경우)이라고 하는 이런 이형이량체는 여전히 항원에 결합할 수 있다.

다른 단편은 단일 도메인 항원 결합 단편(dAbs) 또는 VHS이다.

단일-사슬 Fv 단편은 재조합 방식으로 제조될 수 있다. scFv 단편에서, V_H와 V_L 도메인은 친수성과 유연성 펩티드 링커에 의해 연결된다. scFv는 이량체(diabody), 삼량체(triabody), 또는 동일하거나 상이한 특이성을 보유할 수 있는 단량체 단위로 구성되는 이보다 큰 응집체로 복합될 수 있다.

또 다른 유형의 항체 단편은 최소의 가능 원형 항원-결합 단편을 포함하는 V_HHS이다. V_HHS는 면역된 카멜리드(camelid)의 단백분해된 중쇄 항체로부터 또는 재조합 기술을 통하여 생산될 수 있다.

재조합 DNA 기술을 이용하는 경우에, 기본적으로, H33 항체의 H 사슬 또는 L 사슬의 V 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 가급적 인간 H 또는 L 사슬의 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 융합된다. 이런 방식으로 획득된 완전 H와 L 사슬을 발현하기 위하여, 상기 단백질의 분비를 가능하게 하는 신호 펩티드를 코딩하는 서열이 추가될 수 있다.

본 발명의 혈관신생 저해 분자를 생산하기 위하여, 발현 카세트가 이용되는데, 여기서 본 발명의 융합된 폴리뉴클레오티드는 선택된 숙주 세포에서 이의 전사와 번역을 가능하게 하는 적절한 조절 서열; 및 폴리뉴클레오티드 또는 이런 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터에 연결된다.

따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 다시 말하면, H33의 특이성을 보유하는 혈관신생 저해 분자는 재조합 DNA 기술의 널리 공지된 방법 및 화학적 DNA 합성으로 용이하게 수득될 수 있다.

재조합 DNA 구조체는 재조합 DNA와 유전자 조작의 널리 공지된 기술에 의해 수득되고 숙주 세포에 도입될 수 있다.

본 발명에 적합한 숙주 세포는 원핵이나 진핵 세포일 수 있다. 적절한 진핵 세포는 예로써 식물 세포, 사카로마이세스(Saccharomyces)와 같은 효모 세포, 초파리(Drosophila) 또는 파밤나방(Spodoptera)과 같은 곤충 세포, HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS 등과 같은 포유동물 세포이다.

키메라 Ig 사슬을 인코딩하는 핵산 구조체를 보유하는 벡터로 원핵이나 진핵 세포를 트랜스펙션시키는 여러 방법이 존재한다. 벡터를 림프성 세포로 도입하는데 선호되는 방법은 원형질체(speheroplast) 융합이다(참조: Gillies et al.(1989) Biotechnol. 7: 798-804). 대안적 방법은 전기천공(electroporation) 또는 인산칼슘 침전(calcium phosphate precipitation)이다. 면역공액체(immnoconjugate)를 생산하는 다른 유용한 방법은 구조체를 인코딩하는 RNA 서열의 제조 및 적절한 생체내 또는 시험관내 시스템에서 이의 번역이다.

본 발명의 단백질은 일단 발현되면, 표준 단백질 정제 절차로 수확될 수 있다(참조: U.S. Patent No. 5,650,150).

중쇄와 경쇄가 본 발명의 분자에 결합되는 경우에, 항체 가변 영역의 중쇄는 가급적, 상응하는 경쇄와 함께 동일한 세포에서 동시-발현된다. 복수의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 융합 단백질의 경우에, 하나이상의 발현 벡터가 이용될 수 있다. 예로써 2개의 발현 벡터를 이용한 동시-트랜스펙션 방법은 빈번하게, 양 벡터를 표적 세포에 전달한다. 대안으로, 동일한 세포에서 동시-발현을 위한 복수의 폴리펩티드를 인코딩하는 단일 벡터를 이용하는 것이 유용하다.

더 나아가, 본 발명의 단백질을 단일-사슬 분자로서 발현하는 것이 편의할 수 있다. 가령, 항체 가변 영역이 비-면역글로불린 단백질에 선택적으로 융합된 단일 사슬 항체 또는 sFv로서 발현될 수 있다. 다른 구체예에서, 중쇄(융합된 사이토킨과 함께 또는 융합된 사이토킨 없이)는 경쇄(또는 중쇄) 대응물(융합된 사이토킨과 함께 또는 융합된 사이토킨 없이)과 결합되어 일가와 이가 면역공액체를 형성한다.

V_L과 V_H 영역은 이들의 핵산 서열이 어떻게 구성되는 지에 따라, 이황화 결합 또는 펩티드 결합으로 연결될 수 있다. 일반적으로, V 영역은 이들의 서열이 별개의 DNA 구조체에 인코딩되는 경우에 이황화 결합으로 연결된다. 대조적으로, V 영역은 이들의 서열이 단일-사슬 DNA 구조체에 인코딩되는 경우에 펩티드 결합으로 연결된다.

본 발명의 특정 구체예에서, 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역은 각각, 면역글로불린의 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역에 결합될 수 있다. 면역글로불린 경쇄 불변 영역의 카파(kappa) 또는 람다(lambda) 사슬이 이용될 수 있다.

본 발명의 발현 벡터의 작제 및 숙주 세포의 형질전환은 분자 생물학의 표준 기술로 달성될 수 있다.

이들 원핵이나 진핵 세포에 의해 생산된 본 발명의 혈관신생 저해 분자는 단백질 A 세파로스를 이용한 친화성 크로마토그래피로 세포 또는 배양 상층액으로부터 정제되고, 마이크로역가 평판에 코팅된 가용성 JAM-C에 H33의 결합에 대한 이들의 저해 활성을 널리 공지된 경쟁 ELISA 기술로 측정함으로써 이들의 JAM-C 결합 활성을 사정할 수 있다.

남아있는 쥐 가변 도메인이 인간에서 여전히 면역원성(immunogenicity)을 유발함으로써 항체-기초된 치료의 효능을 손상시킬 수 있다. 면역원성을 감소시키는 널리 공지된 방식, 예를 들면, “은폐(veneering)”와 “인간화(humanization)”가 적용될 수 있는데, 이들 방식은 특허 W02004055056에 기술된 바와 같이 아미노산 치환의 도입을 수반한다. 결합 친화성에 대한 후속 스크리닝(screening)은 H33에 대한 저해 활성으로 상기한 바와 같이 수행될 수 있다.

대안으로, 비-인간 T 세포 에피토프가 인간 항체에 존재하는 인간 자가 에피토프에 상응하도록 상기 비-인간 T 세포 에피토프를 돌연변이시킨다(참조: U.S. Patent No. 5,712,120). 본 발명의 H33 항체는 적어도 하나의 인간화된 서열을 보유하는 V_L과 V_H 영역을 포함하고, 따라서 인간에 투여되는 경우에 면역원성이 감소한다.

숙주 세포에서 후속 항체 생산 및 정제는 상기한 바와 같이 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, H33 또는 유사 분자의 항체 가변 영역은 개재성 Fc 부분으로 또는 이런 부분 없이, 비-면역글로불린 부분에 연결될 수 있다. 구체적으로, 비-면역글로불린 부분은 사이토킨, 예를 들면, 인터루킨, 조혈 인자, 림포카인, 인터페론, 또는 케모킨일 수 있다. 인터루킨은 예로써 인터루킨-2 또는 인터루킨-12이다. 조혈 인자와 림포카인은 예로써 각각 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)와 림포톡신(lymphotoxin)이다. 인터페론은 예로써 인터페론-α, 인터페론-β, 또는 인터페론-γ이다.

본 발명의 일부 구체예에서, 융합 단백질은 이차 사이토킨과 같은 이차 비-면역글로불린 부분을 보유한다.

또한, 본 발명은 환자에서 JAM-B/JAM-C 상호작용을 예방하기 위한 약물의 제조를 위한 H33 항체 또는 이의 단편이나 유도체의 용도를 제시한다.

이런 예방은 가변 영역을 보유하는 본 발명의 항체를 환자에 투여함으로써 표면에 JAM-C를 보유하는 세포를 표적하는 과정을 포함한다. 한 구체예에서, 표적된 세포는 종양 세포이다.

본 발명의 다른 측면에서, JAM-C/JAM-B 상호작용의 예방은 항체 가변 영역을 인코딩하는 핵산 또는 상기 핵산을 보유하는 세포를 환자에 투여함으로써 달성될 수 있다.

인간에서 임상적 적용을 위하여, 쥐-유래된 항체 H33을 변형하여 상기 항체의 면역원성을 감소시키거나 최소화시키는 것이 바람직하다. 뮤린 항체의 면역원성을 감소시키기 위한 수단으로서, 기존 문헌에서 다양한 방법이 보고되었다. 이들 방법에는 뮤린이나 쥐 가변 영역과 인간 불변 영역을 보유하는 키메라 항체의 생산; 뮤린이나 쥐 항체로부터 유래된 가변 결합 서열을 포함하는 단일 사슬 항체의 생산; 작아진 크기로 인하여 잠재적인 면역원성이 감소된 뮤린이나 쥐 항체의 항원-결합 단편의 생산; 인간 단클론 항체의 생산; “인간화” 항체의 생산 등이 포함된다.

인간화는 이상적으로, 근원 비-인간 항체 분자의 항원-결합 특성을 완전히 유지하면서 비-면역원성인 항체를 제공한다. 비-면역원성은 유해한 면역 반응 없이 복수 투약을 가능하게 한다. 인간화 항체를 생산하는 다양한 방법이 기존 문헌에서 보고되었다. 가령, 인간화 항체는 (a) 비-인간 CDR 만을 인간 골격과 불변 영역으로 이식함으로써(Jones et al., Nature 321:522-25(1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536(1988)) 또는 (b) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하고(리간드-결합 특성을 보존하기 위하여), 또한 면역원성을 감소시키는 노출된 잔기의 치환으로 이들을 인간-유사 표면으로 “은폐”함으로써(“은폐된” 항체) 잠재적으로 생산될 수 있다(Padlan, Molec. Immun. 28:489-498(1991); Padlan, Molec. Immun. 31(3):169-217(1994)).

인간 가변 영역 골격 도메인 내에서 비-인간(뮤린이나 쥐) 잔기의 유지는 생성된 인간화 항체의 적절한 결합 기능을 유지하는데 도움을 주는 것으로 생각된다. 인간화 항체는 숙주 수용체에서 항체의 면역원성을 잠재적으로 감소시키거나 제거하여 생체이용효율에서 증가 및 유해한 면역 반응의 가능성 감소를 유도하고, 따라서 복수의 항체 투여를 잠재적으로 가능하게 하는 것으로 보고되었다. 또한, 원하는 결합 특성을 보유하는 항체로부터 유래된 상기한 scFv 및 항체 단편, 예를 들면, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab)'2 단편은 원형 항체보다 줄어든 면역원성을 보유하는 표적화 부분을 생산하는 다른 공지된 수단을 포함한다. 본질적으로, 단일 사슬 항체 및 항체 단편은 작아진 크기로 인하여, 원형 항체보다 면역원성이 덜하다.

또한, 재조합 단백질, 예를 들면, 항체는 발현에 이용되는 상이한 숙주 세포에서 상이하게 당화(glycosylation)되는 것으로 알려져 있다. H33 항체의 임상적 적용에서, 당화는 이의 반감기를 증가시키거나 이의 면역원성을 감소시킨다.

항체 H33은 H33과 동일하거나 유사한 특이성을 보유하는 “인간 단클론 항체” 또는 “재조합 인간 항체”를 분리하는 경쟁 스크리닝(competition screening)에도 이용될 수 있다. 기본적으로, 이렇게 분리된 인간 항체는 V-D-J 재조합 및 아이소타입 바꾸기(switching)(가령, patent EP1471938, US2004208873)가 진행됨으로써 JAM-C에 대한 복수 아이소타입의 인간 단클론 항체(가령, IgG, IgA 및/또는 IgE)를 생산할 수 있는 하이브리도마, 이입세포(transfectoma) 또는 비-인간 외래유전자도입 동물, 예를 들면, 외래유전자도입 생쥐에서 생산될 수 있다. 이들 외래유전자도입 동물은 US 2003/0017534에 기술된 바와 같이 다클론 항체를 생산하는 외래유전자도입 토끼일 수도 있다.

“인간 단클론 항체”는 인간 생식세포주(germline) 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변과 불변 영역을 보유하고 단일 결합 특이성을 보이는 항체를 의미한다. 한 구체예에서, H33과 동일한 특이성을 보유하는 인간 단클론 항체는 영속화된 세포에 융합된 인간 중쇄 외래유전자(transgene)와 경쇄 외래유전자를 포함하는 게놈을 보유하는 외래유전자도입 비-인간 동물, 예를 들면, 외래유전자도입 생쥐로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.

하이브리도마를 제조하는데 선호되는 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 생쥐에서 하이브리도마 생산은 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜 및 면역화된 융합용 비세포(splenocyte)의 분리 기술은 당분야에 공지되어 있다. 융합 상대(가령, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차 역시 공지되어 있다.

바람직한 구체예에서, JAM-C에 길항하고 H33의 특이성을 보유하는 인간 단클론 항체는 "HuMAb" 생쥐와 같은 공지된 생쥐 시스템보다는 인간 면역계의 일부분을 보유하는 외래유전자도입 생쥐를 이용하여 산출될 수 있다(Lonberg, et al.(1994) Nature 368(6474) :856-859). 따라서, 이들 생쥐는 생쥐 IgM 또는 [kappa] 경쇄의 감소된 발현을 보이고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄와 경쇄 외래유전자는 종류 바꾸기(class switching)와 체세포 변이(somatic mutation)가 진행되어 고친화성 인간 IgG[kappa] 단클론 항체를 산출한다(Lonberg, N. et al.(1994), supra; reviewed in Lonberg, N.(1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D.(1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93; Harding, F. and Lonberg, N.(1995) Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546). HuMAb 생쥐의 제조는 Taylor, L. et al.(1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al.(1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al.(1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al.(1993) EMBO J. 12:821-830i Tuaillon et al.(1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg, N. et al.,(1994) Nature 368(6474):856-859; Lonberg, N.(1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. et al.(1994) International Immunology 6:579-591; Lonberg, N. and Huszar, D.(1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93; Harding, F. and Lonberg, N.(1995) Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild, D. et al.(1996) Nature Biotechnology 14:845-851; U.S. Pat. No. 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,789,650, 5,877,397, 5,661,016, 5,814,318, 5,874,299, 5,770,429(Lonberg, N. and Kay, R. M. and GenPharn International); U.S. Pat. No. 5,545,807(Surani et al.); International Publication No. WO 98/24884(published on Jun. 11, 1998), WO 94/25585(published Nov. 10, 1994), WO 93/1227(published Jun. 24, 1993), WO 92/22645(published Dec. 23, 1992), WO 92/03918(published Mar. 19, 1992)에서 상술한다.

선호되는 HuMAb 생쥐는 내인성 경쇄(kappa) 유전자에서 JKD 파괴(Chen et al.(1993) EMBO J. 12: 821-830), 내인성 중쇄 유전자에서 CMD 파괴(WO 01/14424의 실시예 1, Korman et al.), KCo5 인간 kappa 경쇄 외래유전자(Fishwild et al.(1996) Nature Biotechnology 14:845-851), HCo7 인간 중쇄 외래유전자(U.S. Pat. No. 5,770,429, Lonberg, N. and Kay, R. M.) 및/또는 HCo12 인간 중쇄 외래유전자(WO 01/14424의 실시예 2, Korman et al)를 보유한다.

대안으로, 트랜스-염색체(transchromosomic) 단편에서 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 생쥐를 이용하여, H33의 특이성을 보유하는 항-JAM-C 항체를 산출할 수 있다.

이런 트랜스-염색체 생쥐의 제조는 WO 097/07671(Tomizaka et al.)에서 기술한다. 선호되는 생쥐는 W002/43478(Ishida et al.)에 기술된 바와 같이 특정 인간 면역글로불린 유전자가 외래유전자에 의해 전달되고 다른 유전자가 트랜스-염색체에 의해 전달되는 생쥐, 예를 들면, 인간 경쇄 외래유전자(가령, KCo5 kappa 사슬 외래유전자) 및 인간 중쇄 트랜스-염색체(가령, SC20 트랜스-염색체)를 보유하는 생쥐이다.

H33의 특이성을 보유하는 JAM-C에 대한 완전한 인간 단클론 항체를 산출하기 위하여, HuMAb 생쥐는 Lonberg, N. et al.(1994) Nature 368(6474):856-859; Fishwild, D. et al.(1996) Nature Biotechnology 14:845-851; W098/24884에 기술된 바와 같이 JAM-C 항원 및/또는 JAM-C를 생산하는 세포 및/또는 재조합 JAM-C의 정제되거나 농축된 제조물로 면역할 수 있다. 적절하게는, 생쥐는 첫 주입이후 6 내지 16주령이다. 가령, 재조합 JAM-C를 이용하여 HuMAb 생쥐를 복강내 면역할 수 있다.

JAM-C에 대한 인간 단클론 항체를 생산하기 위하여, 생쥐 비세포는 표준 프로토콜에 따라 분리하고 PEG로 생쥐 골수종 세포주에 융합할 수 있다. 이후, 생성된 하이브리도마는 널리 공지된 기술로 항원-특이적 항체의 생산을 스크리닝한다.

H33의 특이성을 보유하는 본 발명의 인간 항체는 예로써 당분야에 널리 공지된 재조합 DNA 기술과 유전자 트랜스펙션 방법의 조합으로 숙주 세포 이입세포에서 생산될 수도 있다(Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

생체내에서 JAM-B와 JAM-C 사이의 상호작용을 예방하고 혈관신생을 저해하는 능력을 보유하는 H33, 이의 단편이나 유도체가 본 발명에 이용될 수 있다. 항체 단편과 항체 융합 단백질의 생산은 Joosten, V. et al., Microb Cell Fact. 2(l):l(2003)에서 개관한다. 항체 단편과 유도체를 제조하는 기술은 널리 공지되어 있고, 과도한 부담없이 당업자에 의해 수행될 수 있다.

가령, H33 항체, 또는 이의 항체 단편을 발현하기 위하여, 부분- 또는 전체-길이 경쇄와 중쇄를 인코딩하는 DNA는 표준 분자 생물학 기술(가령, PCR 증폭, 특정 부위 돌연변이유발)로 수득되고, 유전자가 전사와 번역 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 “작동가능하게 연결된”은 벡터 내에서 전사와 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사와 번역을 조절하는 의도된 역할을 수행하도록 항체 유전자가 벡터에 결찰된다는 것을 의미한다. 발현 벡터와 발현 조절 서열은 이용된 발현 숙주 세포와 양립하도록 선택된다.

항체 경쇄 유전자와 항체 중쇄 유전자는 개별 벡터에 삽입되고, 더욱 전형적으로는, 양 유전자가 동일한 발현 벡터에 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법(가령, 항체 유전자 단편과 벡터에서 상보성 제한 부위의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 평활 말단 결찰)으로 발현 벡터에 삽입된다.

본 명세서에 기술된 항체의 경쇄와 중쇄 가변 영역은 VH 분절이 벡터 내에서 CH 분절에 작동가능하게 연결되고 VL 분절이 벡터 내에서 CL 분절에 작동가능하게 연결되도록 원하는 아이소타입의 중쇄와 경쇄 불변 영역을 이미 인코딩하는 발현 벡터에 상기 경쇄와 중쇄 가변 영역을 삽입함으로써 임의의 항체 아이소타입의 전장 항체 유전자를 산출하는데 이용될 수 있다.

부가적으로 또는 대안으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체의 분비를 조장하는 신호 펩티드를 인코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 상기 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 인-프레임(in-frame)으로 연결되도록 상기 벡터에 클론될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이질성 신포 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터 유래된 신호 펩티드)일 수 있다.

항체 사슬 유전자에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 보유한다. “조절 서열”은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 조절하는 프로모터, 인헨서, 다른 발현 조절 요소(가령, 폴리아데닐화 신호)를 포괄한다. 이들 조절 서열은 예로써 Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990)에서 기술한다.

당업자가 인지하는 바와 같이, 조절 서열의 선택을 비롯한 발현 벡터의 설계는 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 목적 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 좌우된다.

포유동물 숙주 세포 발현에 적합한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 바이러스 요소, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(CMV), 유인원 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스(가령, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)), 폴리오마(polyoma)로부터 유래된 프로모터 및/또는 인헨서이다. 대안으로, 비-바이러스 조절 서열, 예를 들면, 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터가 이용될 수 있다.

항체 사슬 유전자와 조절 서열에 더하여, 본 발명의 혈관신생 저해 분자를 발현하기 위한 재조합 발현 벡터는 부가적인 서열, 예를 들면, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(가령, 복제 기점) 및 선별가능 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선별가능 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다(참조: U.S. Pat. No. 4,399,216, 4,634,665, 5,179,017, Axel et al.). 가령, 전형적으로, 선별가능 마커 유전자는 약물, 예를 들면, G418, 하이드로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 벡터가 도입된 숙주 세포에 공여한다. 선호되는 선별가능 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(dhfr-숙주에서 메토트렉세이트 선별/증폭에 이용됨) 및 neo 유전자(G418 선별에 이용됨)이다.

경쇄와 중쇄의 발현을 위하여, 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 발현 벡터는 표준 기술에 의해 숙주 세포로 트랜스펙션된다. 다양한 형태의 “트랜스펙션”은 외인성 DNA의 원핵이나 진핵 숙주 세포로의 도입에 통상적으로 이용되는 여러 다양한 기술, 예를 들면, 전기천공(electroporation), 인산칼슘 침전(calcium-phosphate precipitation), DEAE-덱스트란 트랜스펙션 등을 포괄한다. 본 발명의 분자를 원핵이나 진핵 숙주 세포에서 발현하는 것이 이론적으로 가능하긴 하지만, 진핵 세포, 특히 포유동물 숙주 세포에서 발현이 가장 선호되는데, 그 이유는 이들 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 원핵 세포보다 적절하게 접혀진 면역학적 활성 항체, 이의 단편이나 유도체를 조합하고 분비할 가능성이 높기 때문이다.

본 발명의 재조합 항체를 발현하는데 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포(예로써 R. J. Kaufman and P. A. Sharp(1982) Mol. Biol. 159:601-621에 기술된 DOER 선별가능 마커와 함께 이용되는 Urlaub and Chasin,(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220에 기술된 dhfr-CHO 세포 포함), NS/O 골수종 세포, COS 세포, HEK293 세포, SP2.0 세포이다. 특히, NS/O 골수종 세포와 함께 이용되는 다른 적합한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036, EP 338 841에 기술된 GS(글루타민 합성효소) 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 인코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되는 경우에, 발현 산물은 숙주 세포에서 산물의 발현, 적절하게는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로 산물의 분비가 가능할 만큼 충분한 기간동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 발현 산물은 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.

대안으로, 클론된 항체 유전자는 원핵 세포, 예를 들면, 미생물, 특히 scFv 항체의 생산을 위한 대장균(E. coli) 및 곤충 세포를 비롯한 다른 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 더 나아가, 이들 항체는 외래유전자도입 비-인간 동물, 예를 들면, 양과 토끼로부터 모유 또는 닭으로부터 계란, 또는 유전자도입 식물에서 생산될 수 있다(참조: Verma, R., et al.(1998). Antibody engineering: Comparison of bacterial, yeast, insect and mammalian expression systems. J.Immunol.Meth. 216:165-181; Pollock, et al.(1999). Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies. J.Immunol.Meth. 231:147-157; Fischer, R., et al.(1999). Molecular farming of recombinant antibodies in plants. Biol.Chem. 380:825-839).

항체는 주로 6개의 중쇄와 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통하여 표적 항원과 상호작용한다. 이런 이유로, CDR 내에서 아미노산 잔기는 개별 항체간에 CDR 외부의 서열보다 더욱 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담담하기 때문에, 상이한 특성을 지닌 상이한 항체로부터 유래된 골격 서열에 이식된 특정 자연 발생 항체, 본 발명의 경우에 H33으로부터 CDR 서열을 보유하는 발현 벡터를 작제함으로써 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다(참조: Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986, Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad.; U.S.A. 86:10029-10033). 이런 골격 서열은 생식세포주 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스로부터 입수될 수 있다. 이들 생식세포주 서열은 성숙 항체 유전자 서열과 구별되는데, 그 이유는 이들이 B 세포 성숙동안 V(D) J 접합에 의해 형성되는 완전히 조합된 가변 유전자를 보유하지 않기 때문이다. 생식세포주 유전자 서열은 가변 유전자에 돌연변이를 보유하지만 CDR에 전형적으로 밀집된 고친화성 이차 레퍼토리 항체의 서열과도 구별된다. 가령, 체세포 돌연변이는 골격 영역 1의 아미노 말단 부분 및 골격 영역 4의 카르복시-말단 부분에서 상대적으로 드물다. 더 나아가, 대부분의 체세포 돌연변이는 항체의 결합 특성에 별다른 영향을 주지 않는다.

이런 이유로, 최초 항체에서와 유사한 결합 특성을 보유하는 완전 재조합 항체를 재현하기 위하여 특정 항체의 전체 DNA 서열을 획득하는 것은 불필요하다(참조: WO 99/45962). 전형적으로, CDR 영역에 걸쳐있는 부분 중쇄와 경쇄 서열이면 이런 목적에 충분하다. 상기 부분 서열은 어떤 생식세포주 가변과 접합 유전자 분절이 재조합된 항체가변 유전자에 기여하는 지를 결정하는데 이용된다. 이후, 생식세포주 서열을 이용하여 가변 영역의 불분명 부분을 채워 넣는다. 중쇄와 경쇄 리더 서열은 단백질 성숙동안 절단되어 최종 항체의 특성에 기여하지 않는다. 불분명 서열을 추가하기 위하여, 클론된 cDNA 서열은 결찰 또는 PCR 증폭으로 합성 올리고뉴클레오티드와 결합시킬 수 있다. 대안으로, 전체 가변 영역을 일단의 짧고 중복되는 올리고뉴클레오티드로서 합성하고 PCR 증폭으로 결합시켜 전체 합성 가변 영역 클론을 산출할 수 있다. 이런 과정은 특정 제한 부위의 제거 또는 포함, 또는 특정 코돈의 최적화와 같은 이점을 제공한다.

본 명세서에서, “혈관신생 저해 분자”는 H33 및 본 명세서에 기술된 바와 같이 동일하거나 유사한 특이성을 보유하는 이의 모든 가능한 단편과 유도체를 의미한다.

또한, 본 발명은 암, 특히, 고형 종양의 치료 또는 진단을 위한 치료 또는 진단 조성물의 제조를 위한 혈관신생 저해 분자, 예를 들면, H33, 이의 단편과 유도체의 용도에 관계한다.

또한, 본 발명은 암, 특히, 고형 종양의 치료 또는 진단을 위한 치료 또는 진단 조성물에 관계하는데, 이들 조성물은 본 발명에 따른 하나이상의 혈관신생 저해 분자의 치료 또는 진단 효과량 및 적절한 부형제, 담체, 희석제 또는 다른 첨가제를 함유한다. 암 치료 분야에 평균적인 지식을 가진 자는 치료 또는 진단 효과량을 확립할 수 있다.

조성물은 본 발명에 따른 복수(가령, 2개 이상의) 혈관신생 저해 분자의 조합을 함유할 수도 있다.

본 발명의 제약학적 조성물은 복합 요법으로, 다시 말하면, 다른 약물과 동시에 투여될 수도 있다. 가령, 복합 요법은 적어도 한가지 화학치료제, 적어도 한가지 소염제, 또는 적어도 한가지 면역억제제를 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 혈관신생 저해 분자는 방사선요법과 공동으로 투여될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 혈관신생 저해 분자는 하나이상의 다른 항체, 예를 들면, 항-VEGF 항체와 같은 하나이상의 인간 항체와 공동으로 투여될 수 있다.

투약 섭생은 최적 반응(가령, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 가령, 단일 거환이 투여되거나, 여러 분량이 시차를 두고 투여되거나, 또는 용량이 긴급한 치료 상황에 맞게 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 특히, 용이한 투여 및 투약의 균일성을 위한 투약 단위 형태(dosage unit form)로 장관외 조성물을 조제하는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 투약 단위 형태는 치료되는 개체에 대한 단위 투약에 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미한다; 각 단위는 요구되는 제약학적 담체와 연관하여 목적되는 치료 효과를 달성하기 위하여 산정된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 함유한다. 본 발명의 투약 단위 형태를 위한 명세는 (a) 활성 화합물과 달성되는 특정 치료 효과의 독특한 특징 및 (b) 개체에서 민감성의 치료를 위한 활성 화합물과 같은 화합물 합성 분야에 내재된 한계에 의해 지배되고 직접적으로 의존한다.

본 명세서에서 “장관외 투여”와 “장관외 투여되는”은 장과 국소 투여를 제외한 투여 양식, 일반적으로, 주사 또는 주입을 의미하는데, 여기에는 제한없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 지주막하(intrathecal), 관절강내(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내, 피내, 복강내(intraperitoneal), 경기관내(transtracheal), 피하(subcutaneous), 표피하(subouticular), 관절내(intraarticular), 수정체낭하(suboapsular), 거미막하(subarachnoid), 척수내(intraspinal), 경막외(epidural), 흉골내(intrasternal) 주사와 주입이 포함된다.

본 발명의 혈관신생 저해 분자는 적절한 부형제, 담체 또는 희석제와 함께 제약학적 조성물에 포함될 수 있다.

본 발명의 제약학적 조성물에 사용될 수 있는 적절한 수성과 비-수성 담체의 실례는 물, 에탄올, 폴리올(가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 적절한 이들의 혼합물, 식물성 오일(가령, 올리브 기름), 주입가능 유기 에스테르(가령, 에틸 올레에이트)이다.

이들 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제, 분산제와 같은 첨가제를 함유할 수도 있다. 미생물의 예방은 멸균화 절차 및 다양한 항생제와 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산 등의 함입으로 담보될 수 있다. 또한, 등장제, 예를 들면, 당, 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직하다. 이에 더하여, 주입가능한 제약학적 형태의 장기적인 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트와 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 약물의 함입으로 달성될 수 있다.

본 발명의 화합물은 약물로서 인간과 동물에 투여되는 경우에, 단독으로, 또는 예로써 제약학적으로 수용가능한 담체와 공동으로 0.0l 내지 99.5%(더욱 바람직하게는, 0.l 내지 90%)의 활성 성분을 함유하는 제약학적 조성물로서 제공될 수 있다.

선택된 투여 경로에 상관없이, 적절한 수화된 형태 및/또는 본 발명의 제약학적 조성물에 사용될 수 있는 본 발명의 혈관신생 저해 분자는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 제약학적으로 수용가능한 약형(dosage form)으로 조제된다.

본 발명의 제약학적 조성물에서 활성 성분의 실제 투약 수준은 환자에 독성없이 특정 환자, 조성, 투여 양식에 대한 목적하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 달성하기 위하여 변화된다. 선택된 투약 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물 도는 이의 에스테르, 염이나 아마이드의 활성, 투여 경로, 투여 시점, 사용되는 특정 화합물의 배출율, 치료 기간, 사용된 특정 조성물과 공동으로 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적인 건강, 병력 및 의학 분야에 널리 공지된 유사 인자를 비롯한 다양한 약동학 인자에 좌우된다. 당분야에 평균적인 지식을 가진 의사 또는 수의사는 요구되는 제약학적 조성물의 효과량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 가령, 의사 또는 수의사는 원하는 치료 효과를 달성하기 위하여 요구되는 수준보다 낮은 수준으로 제약학적 조성물에 사용되는 본 발명의 화합물의 투약을 시작하고, 원하는 치료 효과가 달성될 때까지 용량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적절한 일일량은 치료 효과를 달성하는데 효과적인 최저 용량이 되는 화합물의 양이다. 이런 효과량은 일반적으로, 상기한 인자에 좌우된다.

투여는 가급적 표적 부위에 근접하여 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하 투여이다. 원하는 경우, 치료 조성물의 일일 효과량은 하루동안 적절한 간격으로 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 그 이상의 분량, 선택적으로 단위 약형(unit dosage form)으로 개별적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 단독으로 투여될 수 있긴 하지만, 제약학적 조성물로서 투여하는 것이 바람직하다.

가령, H33을 혈관신생 저해 분자로 사용하는 경우에, 용량은 H33 항체를 표적하는 항-이디오타입 항체를 이용하거나, 또는 예로써 JAM-C를 코팅으로 이용하는 ELISA 검사로 H33 항체를 검출하는 다른 특이적인 방법을 이용함으로써 생물학적 샘플에서 투여이후 상이한 시점에서 순환 H33 항체의 양을 측정함으로써 결정되거나 조정될 수 있다.

치료 조성물은 또한, 당분야에 공지된 의료 장치로 투여될 수도 있다. 가령, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 치료 조성물은 U.S. Pat. No. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 기술된 장치와 같은 바늘없는 피하주사 주입 장치로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 널리-공지된 이식물과 모듈의 실례에는 조절된 속도로 약물을 분산하기 위한 이식가능 마이크로-주입 펌프를 기술하는 U.S. Pat. No. 4,487,603; 피부를 통하여 약물을 투여하는 치료 장치를 기술하는 U.S. Pat. No. 4,486,194; 정확한 주입 속도로 약물을 전달하는 약물 주입 펌프를 기술하는 U.S. Pat. No. 4,447,233; 연속 약물 전달을 위한 가변 유동 이식가능 주입 장치를 기술하는 U.S. Pat. No. 4,447,224; 복수=챔버 구획을 보유하는 삼투 약물 전달 시스템을 기술하는 U.S. Pat. No. 4,439,196; 삼투 약물 전달 시스템을 기술하는 U.S. Pat. No. 4,475,196 등이 포함된다. 많은 다른 이식물, 전달 시스템, 모듈이 당업자에게 공지되어 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 혈관신생 저해 분자는 생체내에 적절한 분산을 담보하도록 조제될 수 있다. 가령, 뇌-혈관 장벽(EBB)은 많은 고도 친수성 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 치료 화합물이 BBB를 통과할 수 있도록 하기 위하여(원하는 경우), 이들은 예로써 리포좀 형태로 조제될 수 있다. 리포좀을 제조하는 방법은 U.S. Pat. No. 4,522,811; 5,374,548; 5,399,331을 참조한다. 리포좀은 특정 세포 또는 기관을 통하여 선택적으로 전달되는 하나이상의 부분을 포함함으로써 표적된 약물 전달을 강화시킬 수 있다(참조: V. V. Ranade(1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). 전형적인 표적화 부분은 엽산염 또는 비오틴(참조: U.S. Pat. No. 5, 416,016, Low et al.); 만노사이드(Umezawa et al.,(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체(P. G. Bloeman et al.(1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al.(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체(Briscoe et al.(1995) Am. J. Physiol. 1233:134), 본 발명의 조성물 및 발명된 분자의 성분을 포함하는 상이한 종류; p120(Schreier et al.(1994) J. Biol. Chem. 269:9090); K. Keinanen; M. L. LauLkanen(1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler(1994) Immunomethods 4:273)이다.

본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 혈관신생 저해 분자는 리포좀 형태로 조제된다; 더욱 바람직한 구체예에서, 리포좀은 표적화 부분을 보유한다. 가장 바림직한 구체예에서, 리포좀에서 치료 화합물은 원하는 부위, 예를 들면, 종양 부위에 근접한 부위에 거환 주사로 전달된다. 조성물은 용이하게 주사될 만큼 액성(liquid)이어야 한다. 이는 제조와 보관 조건하에 안정하고, 박테리아와 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보호되어야 한다.

본 발명의 혈관신생 저해 분자의 효과량과 투약 섭생은 치료되는 질환이나 이상에 좌우되고, 당업자에 의해 결정될 수 있다.

종양 치료를 위한 “치료 효과량”은 완전하거나 부분적인 객관적인 종양 반응으로 결정될 수 있다. 완전 반응(complete response)은 질병의 임상적 증거, 방사선 증거 또는 다른 증거의 부재로 정의된다. 부분 반응(partial response)은 50% 이상의 전체 종양 크기에서 감소에 기인한다. 진행까지 평균 시간(median time to progression)은 객관적인 종양 반응의 지속성을 특성화하는 척도이다.

종양 치료를 위한 “치료 효과량”은 질병의 진행을 안정시키는 능력으로 측정될 수도 있다. 암을 저해하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능을 전조하는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 치료 화합물의 치료 효과량은 개체에서 종양 크기를 감소시키거나, 또는 증상을 완화시킬 수 있다. 당업자는 개체 크기, 개체 증상의 심각도, 선택된 특정 조성물이나 투여 경로와 같은 인자에 기초하여 치료 효과량을 결정할 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물로 치료받는 환자는 본 발명의 분자의 치료 효과를 강화시키거나 증폭하는 다른 치료제가 부가적으로 투여될 수 있다(본 발명의 분자의 투여에 앞서, 동시에, 또는 이후에).

또한, 본 발명은 진단에서 본 발명의 화합물의 용도에 관계한다. 표식된 항체는 예로써 체내에서 종양의 위치를 확인하는데 사용될 수 있다. 방사성물질, 자성 물질, 또는 다른 물질로 항체의 표식은 당분야에 널리 공지된 기술이다.

특정 구체예에서, 본 발명은 샘플, 예를 들면, 조직 샘플, 체액 샘플 또는 세포 샘플에서 JAM-C의 탈체 또는 시험관내 검출로 JAM-C와 연관된 질환을 진단하는 방법을 제시한다. 이는 예로써 H33과 JAM-C간 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건하에, 선택적으로 대조 샘플과 함께 검사 샘플을 H33 항체 또는 이의 단편이나 유도체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 이후, 복합체 형성을 검출할 수 있다(예로써, ELISA를 이용하여). 검사 샘플과 함께 대조 샘플을 이용하는 경우에, 복합체는 양 샘플에서 검출될 수 있고, 양 샘플간 복합체 형성에서 통계학적으로 유의한 차이는 검사 샘플에서 JAM-C의 존재를 지시한다.

본 발명은 아래의 실시예에 의해 더욱 상세하게 기술된다. 이들 실시예는 설명을 목적으로 하며, 본 발명을 제한하지 않는다. 실시예에서는 아래의 도면을 인용한다.

도 1에서는 JAM-C가 인간 간 종양에서 혈관에 의해 발현되는 것을 보여준다. JAM-C 발현은 한 패널의 혈관신생 종양으로 분석하였다. 인간 JAM-C를 인코딩하는 전사체는 정상 간에 존재하지 않는다. 항-JAM-C 항체로 동결 절편의 면역염색은 혈관의 부차 집단(화살표)에 의한 발현을 보여준다. 맥관구조를 가시화시키는 PECAM-l에 대한 다클론 항체로 염색은 우측 패널에 도시하고, 종양의 혈관신생 특성은 αVβ3 염색으로 제어하였다(삽입물).

도 2에서는 JAM-C가 VEGF 자극직후 HUVEC의 내피세포내 접점(inter-endothelial junction)에 동원되는 것을 보여준다.

(A) HUVEC는 재조합 VEGF-165로 자극되고 포름알데히드로 고정되며, JAM-C 국지화(localization)는 항-JAM-C 단클론 항체로 가시화시켰다. 대조로서, JAM-C 염색을 수행하였다. JAM-C 분자는 VEGF-l65 자극직후 세포-세포 접점에서 농축된 반면, JAM-A에서는 어떤 효과도 관찰되지 않았다. (B) FACS 분석에서, 세포-세포 접점에서 JAM-C의 농축은 상기 분자의 재국지화(relocalization)에 기인하는 것으로 밝혀졌는데, 그 이유는 VEGF 처리이후에 발현 수준이 변하지 않았기 때문이다( 점선: 처리되지 않은 세포, 실선: VEGF 처리된 세포).

도 3에서는 항-JAM-C 단클론 항체가 시험관내에서 혈관신생을 소멸시키는 것을 보여준다. 생쥐로부터 얻은 대동맥 환(aortic ring)은 항-JAM-C 항체(50 ㎍/㎖)의 존부하에 2개의 Matrigel 층 사이에서 성장시키고, 12일후 신혈관형성(neovascularization)을 가시화시켰다. 사진은 처리되지 않거나(A, n=11), 또는 항-JAM-C 단클론 항체 H33(B, n=11)과 D33(C, n=6) 또는 아이소타입-정합된 대조 항체 Mell4(D, n=6)로 처리된 대표적인 대동맥 환 미세혈관(microvessel)의 광 현 미경사진이다. H33만 혈관신생 시작을 차단하였다.

도 4에서는 항-JAM-C 항체 H33이 종양 성장과 종양 혈관형성(vascularization)을 감소시키는 것을 보여준다. 생쥐는 LLC1 종양 세포를 피하 주입하고 격일마다 항-JAM-C 항체 또는 아이소타입-정합된 대조 항체(150 ㎍)로 처리하였다. (A) 대조 생쥐(PBS와 아이소타입-정합된 대조 항체) 또는 H33 항-JAM-C 항체로 처리된 생쥐에서 성장된 12일령 LLC1 종양의 현미경적 양상. H33 항-JAM-C 항체로 처리된 생쥐는 종양 체적(B)과 종양 중량(C)의 측정에서 감소된 종양 성장을 보였다. 미세혈관은 PECAM-1 면역염색(D)으로 검출하고 컴퓨터 분석(E)으로 정량하였다. *p< 0.01. 각 막대는 검사된 10마리 동물의 평균 수치 ± sem을 나타낸다.

도 5에서는 H33 항-JAM-C 항체가 생체내에서 비-독성임을 보여준다. 종양 성장에 대한 H33 항-JAM-C 항체 효과가 생체내에서 전신 독성 효과에 기인하지 않도록 담보하기 위하여, 생쥐는 도 4에 기술된 바와 같이 처리하고 기관을 절개하고 분석하였다. (A) PAS(과요오드산-Schiff)로 염색된 이들 생쥐로부터 얻은 간은 사구체신염 발생의 징후를 전혀 보이지 않았다. 대조로서, 자가면역 질환 NZBxBXSB 생쥐로부터 얻은 신장의 절편을 비교하였다(Merino R. et al., J Clin Invest. 94(2):521-5(1994). (B) 생체내 혈관 투과성(blood vessel permeability)은 에번스 블루 투과성 검사(Evans blue permeability assay)로 평가하였다. H33 항체는 대표적인 기관인 심장, 폐, 간, 뇌에서 혈관 투과성에 어떤 영향도 주지 않았다. 각 막대는 검사된 7마리 동물의 평균 수치 ± sem을 나타낸다.

도 6에서는 망막의 혈관재형성(revascularization)동안 사구체(glomeruli)의 정량을 도시한다. 사구체 총수를 계수하여 H33-처리된 생쥐와 대조 항체-처리된 생쥐에서 망막 신혈관형성을 비교하였다. 대조 생쥐(ctrl) 또는 아이소타입 정합된 대조 항체(9B5)로 처리된 생쥐와 비교하여 H33 처리된 생쥐(13H33)에서 사구체 수의 감소가 관찰되었다. 이는 H33 처리된 동물에서 망막의 감소된 신혈관형성을 암시한다.

도 7에서는 항-JAM-C 항체 H33이 종양에서 대식세포의 수를 감소시키는 것을 보여준다. PBS-, 대조 항체- 또는 H33-처리된 생쥐로부터 얻은 LLC1 종양 냉동절편(cryosection)은 산 포스파타아제(acid phosphatase)로 염색하여 대식세포(A, 화살표)를 검출하였다. 미세혈관 밀도는 종양 내에서 ㎟당 표식된 대식세포의 수를 계수함으로써 정량하였다(B). H33-처리된 동물로부터 얻은 종양은 대조 동물에 비하여 침윤된 대식세포가 감소하였다. 각 막대는 군당 n마리 생쥐의 네 절편으로부터 획득된 평균 수치 ± SEM을 나타낸다(PBS, n=6; 대조 항체, n=6; H33, n=9). **p< 0.01. 눈금 막대, (A) 160 ㎜, (B) 20 ㎜.

도 8에서는 H33 항체가 내피 세포의 증식과 아폽토시스에 영향을 주지 않는다는 것을 보여준다. 내피 세포(A) 또는 LLC1 종양 세포(B)는 웰당 1.25x10⁴ 내지 5x10⁴ 세포로 접종하고 H33 항체 또는 대조 항체의 존부하에 배양하였다. 증식률(proliferation rate)은 MTT 검사를 이용하여 결정하였다. H33 항체는 내피 세포와 종양 세포의 증식에 영향을 주지 않는다. (C) 아이소타입-정합된 대조-처리된 생쥐 또는 H33-처리된 생쥐로부터 얻은 LLC1 종양 냉동절편은 PECAM-1(녹색) 및 아폽토시스 세포(적색, 화살표)에 대하여 TUNEL 염색으로 면역염색하였다. 생쥐를 H33 항체로 처리하면, 내피 세포는 대조와 비교하여 아폽토시스에서 증가를 보이지 않는다. 대조적으로, 종양 세포는 종양 내에서 아폽토시스 세포의 정량에 의한 측정에서 증가된 아폽토시스를 보인다(D).

실시예 1

JAM-B 또는 JAM-C에 대한 항체 군의 준비

본 발명의 방법에서 검사되는 항체 군은 Kohler & Milstein, Nature 256:495-497(1975)에 따라 준비한다. 이런 항체 군을 획득할 수 있는 항원의 출처는 실시예 3에 기술된 바와 같이 준비된 재조합 가용성 JAM-B 또는 JAM-C이다.

실시예 2

가용성 JAM-B와 JAM-C의 준비

본 발명자들은 JAM-C가 V 도메인을 통하여 JAM-B와 이호성으로 상호작용하고, 가용성 JAM-C V 도메인이 JAM-B에 결합할 만큼 충분하다는 것을 발견하였다.

가용성 JAM-B와 가용성 JAM-C V 도메인은 동일한 클로닝 전략을 이용한 PCR로 획득하였다. 프라이머는 Microsynth(Microsynth GmbH, Balgach, Switzerland)로부터 구입하고, 클로닝 전략을 위하여 추가된 제한 부위는 밑줄로 표시한다. JAM-C의 세포외 V 도메인을 인코딩하는 cDNA는 뮤린 JAM-C의 전장 서열을 인코딩하는 플라스미드, Pfu 중합효소, T7(전방)과 (5'-gctctagacagtgttgccgtcttgcctacag-3')(후 방) 프라이머를 이용하여 증폭하였다. PCR 산물은 FLAG-tag 서열을 보유하는 pcDNA3에 클로닝하기에 앞서, HindIII과 XbaI로 절단하였다.

가용성 JAM-B는 아래와 같이 준비한다: 가용성 JAM-B를 인코딩하는 cDNA는 (5'-tcagctaggcagccagct-3')(전방)과 (5'-gctctagaatctacttgcattcgcttcc-3')(후방) 프라이머를 이용한 PCR로 획득하였다. 이후, XbaI로 절단된 PCR 산물은 EcoRI/blunt와 XbaI 부위를 이용하여 pcDNA3에서 FLAG Tag 서열과 인-프레임(in-frame)으로 클론하였다.

실시예 3

JAM-B와 JAM-C 사이의 상호작용을 예방하는 능력에 대한 검사

표면에서 JAM-B 또는 JAM-C를 발현하는 세포는 Aurrand-Lions et al., J Biol Chew 276:2733-41(2001a); Aurrand-Lions et al., Blood 98:3699-707(2001b); Johnson-Leger et al., Blood 100:2479 2486(2002)에 기술된 바와 같이 획득하였다.

실시예 2에 기술된 바와 같이 획득된 가용성 JAM-B와 JAM-C는 제조업자의 절차에 따라, Alexa 488의 설포숙시니미딜 에스테르(Molecular Probes Inc.) 또는 설포-NHS-비오틴(Pierce)으로 표지하였다.

JAM-B 또는 JAM-C를 발현하는 세포는 검사 분자의 존재하에, 표식된 가용성 JAM-C 또는 JAM-B와 각각 접촉시킨다. 형광은 유세포분석법으로 모니터하고, 처리되지 않은 대조에 비하여 형광 강도에서 감소는 가용성 JAM-C 또는 가용성 JAM-B의 감소된 결합을 암시한다.

실시예 4

생체내에서 혈관신생을 차단하는 능력에 대한 검사

7일령(P7) 생쥐는 5일동안 75% 산소하에 위치시켜 망막의 중심 구혈(central avascularization)을 유발한다(Reynolds et al., Nature Medicine 8: 27-34(2002)). 이들 생쥐는 이와 같은 보육이후, 정상산소분압 조건하에 추가로 5일(P17까지)동안 사육한다. 생쥐는 P12, P14, P16에 50 ㎍의 단클론 항체를 복강내 주입한다. 신혈관형성은 확산불가능 플루레신-덱스트란 용액으로 전체 맥관구조의 관류로 검출한다. 플랫-고정된(flat-mounted) 망막에서, 신혈관형성과 맥관 사구체 부위가 검출된다. 맥관 사구체는 혈관신생 자극에 반응하여 생산되고 내경계막(inner limiting membrane)을 통하여 돌출되는 꼬인 혈관의 고도 증식성 클러스터이다. 사구체 수는 계수함으로써, 검사 분자로 처리된 생쥐와 대조 생쥐에서 망막 신혈관형성을 비교한다.

검사 분자중 하나는 혈관형성의 감소를 유도하는 단클론 항체 H33이다.

실시예 5

JAM-C에 대한 단클론 항체 H33은 혈관신생과 종양 성장의 저해물질이다.

1. 재료와 방법

항체

인간과 생쥐 JAM-C에 대한 쥐 단클론 항체(CRAM)(H33, H36, D33), PECAM-1/CD31에 대한 쥐 단클론 항체(GC51), Lselectin/CD62L에 대한 쥐 단클론항체(Mell4)는 기존 문헌(Aurrand-Lions et al., 2001a, supra; Gallatin et al., Nature 330:30-34(1983); Piali et al., Eur J Immunol. 23:2464-71(1993); Springer et al., Eur. J. Immunol. 9:301(1979))에 기술된 바와 같이 준비하였다. 무관한 항체 대조 쥐 IgG2a로서 이용되는 항-인간 CD44(9B5)는 Dr B. Engelhardt(Laschinger and Engelhardt, 2000)로부터 입수하였다. 임의의 다른 무관한 항체는 음성 대조로서 이용될 수 있다.

인간 JAM-B에 대한 다클론 항체는 Palmeri et al., J Biol Chem. 275:19139-45(2000)에 따라 준비하였다. 단클론 생쥐 항-인간 인테그린 αvβ3(LM609)은 Chemicon(Temecula, CA)으로부터 구입하였다.

내피 세포

인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC)는 배꼽 정맥의 콜라게나제 처리로 분리하였다(Wall RT et al., J Cell Physiol. 96:203-213(1978)). HUVEC는 20% 소 태아 혈청(PAA Laboratories), 25 mM HEPES(N-2-하이드록에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산), 비필수 아미노산, 소디움 피루베이트, 내피 세포 성장 보충물(EGGS, 15 ㎍/㎖; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), 헤파린(4 ㎍/㎖; Sigma, Buchs, Switzerland)로 보충된 M199에 유지시켰다. 세포는 계대배양 3과 5 사이에 이용하였다.

VEGF 자극

1.10⁵ HUVEC는 성장 인자 감소된 Matrigel(Becton Dickinson, Bedford, MA, USA)에 도말하였다. 48시간후, 세포는 100 ng/㎖ 재조합 인간 VEGF-165(PeproTech House, London UK)와 함께 15분(면역세포화학검사) 또는 15분 내지 24시간(유세포분석법)동안 배양하였다.

유세포분석

HUVEC는 얼음 위에서 H36 항-JAM-C 단클론 항체와 함께 배양하였다. PBS, BSA 0.2%로 세척한 이후, 홍조소(phycoerythrin)-결합된 항-쥐 항체(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA)를 이용하여 H36 항체의 결합을 검출하였다. 대조로서, 일차 항체는 생략하였다. 분석은 FACSCalibur와 Cellquest 소프트웨어(Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA)를 이용하여 수행하였다.

면역염색

JAM-B/VE-JAM에 대한 단클론 항체 항-JAM-C(H36)와 다클론 항체를 이용한 면역조직화학검사를 위하여, 동결 절편은 -20℃에서 5분간 아세톤/메탄올 1:1로 고정시키고 건조시키며 PBS, 젤라틴 0.2%, Tween 20 0.05%에서 재수화시켰다. 면역세포화학검사를 위하여, 세포는 PBS에 녹인 TritonX100 0.01%로 10분간 투과화(permeabilization)에 앞서, PBS에 녹인 파라포름알데히드 4%로 15분간 고정시켰다. 세포는 PBS, BSA 0.2%로 세척하고 1시간동안 일차 항체와 함께 배양하며 세척하고, 이후 Texas Red, FITC 또는 페록시다아제(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA)에 결합된 이차 항체와 함께 추가로 배양하였다. 공초점 현미경 Zeiss LSM510을 이용하여 사진을 촬영하였다. 사구체신염은 과요오드산- Schiff(PAS)를 이용한 신장 염색으로 검출하였다.

탈체 대동맥 환(aortic ring) 검사

생쥐 대동맥 환 검사를 수행하였다(Nicosia, R.F. & Ottinetti, In Vitro Cell Dev Biol. 26(2): 119-28(1990)). 간단히 말하면, 1-㎜ 흉부 대동맥 환은 검사되는 항체를 선택적으로 보유하는 50 ㎕의 성장 인자-감소된 Matrigel(Becton Dickinson, Bedford, MA, USA)의 두 층 사이에 위치시키고, 20 U/㎖ 헤파린(Sigma-Aldrich corporation, Saint-Louis, MO, USA)과 ECGS(Upstate biotechnology, Lake Placid, NY, USA)로 보충된 100 ㎕의 DMEM으로 덮었다. 미세혈관 성장(microvessel outgrowth)은 Zeiss Axioskop 현미경을 이용한 위상 현미경법(phase microscopy)으로 가시화시켰다.

종양 이식

8 내지 10주령 암컷 C56BL6/J 생쥐(Charles River laboratories, L'Arbresle, France)는 1x10⁶ 뮤린 Lewis 폐 암종 세포(LLC1)를 피하 접종하였다. 이후, 생쥐는 150 ㎍의 단클론 항체 H33, 아이소타입 정합된 대조 항체 Mell4 또는 PBS를 격일로 복강내 주입하였다. 대조 종양(PBS 주입된 생쥐)이 1-1.5 cm³에 도달하면, 동물은 희생시키고 종양을 절제하고 분석하였다.

혈관 정량

종양 냉동절편은 면역염색 장(章)에서 기술된 바와 같이 단클론 항-PECAM-1 항체로 염색하였다. 전체 냉동절편(종양당 4개의 냉동절편)의 사진은 Zeiss Axioskop 현미경을 이용하여 촬영하였다. 종양의 PECAM-1 염색과 전체 면적은 Zeiss KS400 소프트웨어를 이용하여 정량하였다.

에번스 블루(Evans blue) 투과성 검사

150 ㎍의 항-JAM-C 또는 아이소타입-정합된 대조 항체를 마취된 생쥐의 눈뒤(retro-orbital) 정맥에 주입하였다. 15분후, 염수에 녹인 100 ㎕의 30 ㎎/㎏ 에번스 블루(Evans blue) 염료(Sigma-Aldrich corporation, Saint-Louis, MO, USA) 용액을 항체와 동일한 방식으로 주입하고 1시간동안 순환시켰다. 이후, 생쥐는 37℃에서, 구연산염-완충된 1% 파라포름알데히드, pH 4.2로 관류시켜 용기 루미나(lumina)로부터 염료를 제거하였다. 관류 직후에, 기관(신장, 폐, 심장, 뇌)은 절제하였다. 조직의 건조(Speed-Vac)이후, 건조 중량을 측정하였다. 에번스 블루는 70℃에서 18시간동안 500 ㎕의 포름아마이드에서 조직을 배양함으로써 추출하였다. 추출액은 원심분리하고 620 nm에서 분광광도계로 상층액의 흡광도를 측정하였다. 추출액에서 염료 농도는 포름아마이드에 담긴 에번스 블루의 표준 곡선으로부터 산정하고 건조 조직 중량(dry tissue weight)으로 정규화시켰다.

통계학적 분석

혈관 밀도 계수(Vessel density count), 종양 체적, 종양 중량은 Mann-Whitney t-검증을 이용하여 분석하였다. 분석 결과는 통계 소프트웨어 StatView(Abacus Concepts Inc. Berkeley, CA, USA)를 이용하여 계산하였다.

결과

JAM-C는 종양 혈관에 의해 발현되고 혈관신생 자극에 반응한다

인간 간의 혈관신생 종양에서, 항-JAM-C 항체 H36 균주는 혈관을 착색시킨 다(도 1). 대조적으로, JAM-C를 인코딩하는 전사체는 정상 간에서 존재하지 않는다. VEGF로 HUVEC의 처리는 15분 내에 내피 세포-세포 접점에서 JAM-C의 즉각적인 대규모 축적을 유도한다(도 2A). 이런 짧은 출현은 JAM-C 재국지화(relocalization)의 결과이며, 발현 수준은 이런 처리에 의해 변화되지 않는다(도 2B). HUVEC를 TNF-α 또는 트롬빈(thrombin)으로 자극하는 경우에도 동일한 결과가 관찰되었다.

시험관내에서 혈관 성장(outgrowth)은 항-JAM-C 단클론 항체에 의해 저해된다

시험관내에서 신혈관형성은 탈체 대동맥 환 검사를 이용하여 수행하였다. 새로 절제된 생쥐 대동맥은 작은 환으로 절단하고 항-JAM-C 항체의 존부하에 Matrigel에 집어넣었다. 대동맥 환으로부터 내피 혈관의 성장은 12일동안 사정하였다. 대조 항-JAM-C 또는 아이소타입 정합된 항체는 대동맥 발아(sprouting)에 영향을 주지 않는 반면, H33 항-JAM-C 항체는 혈관형성을 완전히 차단한다(도 3).

항-JAM-C 단클론 항체는 생체내에서 종양 성장과 혈관신생을 감소시킨다

시험관내 혈관신생이 H33 항-JAM-C 항체에 의해 차단될 수 있음을 고려하여, 상기 항체가 종양 혈관신생과 종양 성장에 영향을 주는 지를 조사하였다. 생쥐는 Lewis 폐 암종 세포를 피내 주입하였다. 이후, 항-JAM-C와 대조 항체를 격일로 복강내 주입하였다. 대조 종양이 1-1.5 cm³에 도달하면, 동물은 희생시키고 종양을 절제하였다. 대조 아이소타입 정합된 항체 또는 PBS에 비하여 H33 항-JAM-C 항체로 생쥐를 처리하는 경우에, 종양 크기(도 4A), 체적(도 4B), 중량(도 4C)이 현저하게 감소하였다.

절제된 종양의 대표적인 실례는 도 4A에 도시한다. Lewis 폐 암종 세포는 JAM-C를 발현하지 않는다(데이터 제시하지 않음). 종양 성장에 대한 H33 항체 효과는 혈관신생의 저해에 기인한다.

종양 맥관구조(vasculature)를 가시화시키기 위하여, 냉동절편은 내피 마커 PECAM-1에 대한 항체로 면역염색하였다(도 4D). 혈관 밀도(Blood vessel density)는 종양의 전체 면적에서 PECAM-1 염색의 %를 계산하여 정량하였다(도 4E). H33 항체는 대조에 비하여 종양에서 혈관 수를 감소시켰다.

H33 항-JAM-C 단클론 항체는 생체내에서 비-독성이다

항체는 생체내 주입되는 경우에 독성을 나타낼 수 있다. H33 항-JAM-C 항체의 관찰된 효과가 생쥐에서 전체적인 독성 효과에 기인하지 않음을 확인하기 위하여, 항체 주입된 동물에서 병리가 발생하는 지를 조사하였다. JAM-C가 신장에서 내피 세포층에 의해 발현되기 때문에, 상기 항체가 사구체신염을 유발하는 지를 먼저 분석하였다. 이를 위하여, 처리된 동물의 신장 절편을 과요오드산-Schiff로 염색하였다. 사구체에서 단백질의 비정상적인 축적은 검출되지 않았다(도 5A).

JAM-C가 혈관 투과성을 조절하는데 관여하기 때문에, 상기 항체가 혈관의 누출을 유도하는 지를 또한 조사하였다. 다행스럽게도, 분석된 대표적인 기관인 심장, 폐, 신장 또는 뇌에서 이런 현상은 관찰되지 않았다(도 5B).

사구체 수치의 감소는 대조 생쥐(ctrl) 또는 아이소타입 정합된 대조 항체로 처리된 생쥐에 비하여 H33 처리된 생쥐의 망막에서 관찰되었다. 이는 H33 처리된 동물에서 망막의 감소된 혈관형성을 암시한다(도 6).

실시예 6

항-JAM-C 항체 H33은 종양에서 대식세포의 수치를 감소시키지만 내피 세포의 증식 및 아폽토시스에는 영향을 주지 않는다

재료와 방법

혈관 밀도, 아폽토시스 세포, 종양으로 대식세포 용적의 조직 구조와 정량

종양 냉동절편에서 단클론 항체 항-PECAM-1(GC51)을 이용한 면역조직화학을 위하여, 절편은 -20℃에서 5분간 아세톤/메탄올 1:1로 고정시키고 건조시키고 PBS/젤라틴 0.2%/Tween 20 0.05%에서 수화시켰다. 절편은 실온에서 1시간동안 항체와 함께 배양하고, PBS에서 3시간 세척이후 과산화효소에 결합된 2차 항체(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA)와 함께 배양하였다.

파라포름알데히드-고정되고 파라핀 포매된 눈 절편에서 PECAM-1과 JAM-C에 대한 다클론 항체를 이용한 면역조직화학검사를 위하여, 절편은 전통적인 절차에 따라 탈납(dewaxing)하였다. 이후, 조직 절편은 메탄올에 녹인 H₂0₂ 0.3%로 10분간 처리하고 PBS에서 세척하고 PBS/BSA 3%/Tween20 0.1%로 30분간 차단하였다. 절편은 실온에서 1시간동안 다클론 항체와 함께 배양하고, PBS에서 세척이후 EnVision^TM 시스템(DakoCytomation AG, Zg, Switzerland)과 함께 30분간 배양하였다.

산 포스파타아제 활성은 종양 냉동절편에서 기존 문헌(Kindler, V. et al., Cell, 56: 731-740, 1989)에 기술된 방법을 이용하여 검출하였다. 종양 냉동절편에서 아폽토시스 세포의 검출은 DNA 가닥 절단(strand break)의 라벨링(labelling)(TUNEL 형광 방법)에 기초하고, 제조업자(Roche diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland)의 사용설명서에 따라 말단 전이효소(Terminal Transferase)와 비오틴-16-dUTP를 이용하여 수행하였다.

결합된 비오틴-16-dUTP는 Texas Red 염료에 결합된 스트렙타비딘(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA)으로 검출하였다.

사진은 Axiocam 칼라 CCD 카메라가 구비된 Zeiss LSM510 공초점 현미경 또는 Zeiss Axiophot 1 현미경을 이용하여 촬영하였다. 영상은 기록하고 AxioVisionT 소프트웨어(Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하여 처리하였다.

종양으로의 산 포스파타아제-양성 세포(대식세포) 개수 및 TUNEL양성 세포(아폽토시스 세포) 개수를 정량하기 위하여, Zeiss KS400 또는 Openlab 소프트웨어(Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하여 전체 냉동절편(종양당 4개의 냉동절편)을 분석하였다.

세포 증식의 결정을 위한 MTT 검사

뮤린 일차 내피 세포(LMEC)와 종양 세포(LLC1)의 증식 지수는 Hansen, MB et al., J Immunol Methods, 119: 203-210, 1989에 기술된 바와 같이 MTT(3,(4,5-디메틸티아졸-2-일)2,5-디페닐-테트라졸륨 브롬화물) 방법을 이용하여 결정하였다. 간단히 말하면, 세포는 웰당 1.25x10⁴ 내지 1x10⁵개 세포의 밀도로 96 웰 평판에 삼중 으로 도말하고 50 ㎎/㎖의 항-JAM-C 항체 H33 또는 대조 항체 9B5의 존부하에 완전 배지에서 배양하였다. 24시간 배양이후, 25 ㎖의 MTT 용액(무균 PBS에서 5 ㎎/㎖)을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 배양이후, 100 ㎖의 추출 완충액(각 DMF와 탈염된 물의 용액에 용해된 20% w/v의 SDS; pH는 2.5%의 80% 아세트산과 2.5% IN HCl을 첨가하여 4.7로 조정하였다)을 첨가하였다. 37℃에서 하룻밤 배양이후, 마이크로플레이트 판독기(Molecular devices corporation, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

결과

H33 항-JAM-C 항체는 대식세포의 종양으로의 동원을 감소시킨다

종양 혈관신생은 염증을 빈번하게 동반하는데, 대식세포는 현저한 종양-연관된 염증 세포를 대표한다(Crowther, M et al., J Leukoc Biol 70: 478-490, 2001). 실제로, 대식세포는 주로 산소결핍 조건하에 VEGF와 같은 혈관신생 인자를 분비함으로써 혈관신생에 참여한다(Murdoch, C et al., Blood 104(8):2224-34, 2004). JAM-C는 내피 세포와 상피 세포를 통한 백혈구 유착(adhesion)과 이주(transmigration)에 관여한다(Zen, K et al., Mol Biol Cell 15: 3926-3937, 2004; Chavakis, T et al., J Biol Chem, 2004; Johnson-Leger, CA et al., Blood 100: 2479-2486, 2002, Cunningham, SA et al., J Biol Chem 275: 34750-34756, 2000).

이런 이유로, H33 항체가 대식세포의 종양으로의 동원에 영향을 줄 수 있는 지를 조사하였다. 도 7B와 7D에 도시된 바와 같이, H33 항체로 처리된 생쥐는 대조 생쥐에 비하여 종양에서 대식세포 용적을 감소시켰다. 이는 혈관신생에 대한 H33 효과가 부분적으로, 대식세포의 동원에 대한 효과를 통하여 매개된다는 것을 암시한다.

H33 항-JAM-C 항체는 내피 세포 증식 또는 아폽토시스에 영향을 주지 않는다

혈관신생은 혈관신생 자극이후 내피 세포의 증식과 구성적 개편(architectural reorganization)에 의해 조정되는 복합적인 과정이다. 먼저, H33 항체가 시험관내에서 내피 세포의 증식을 저해함으로써 혈관신생을 차단하는 지를 조사했지만 어떤 효과도 관찰되지 않았다(도 8A). 종양 세포 증식에 대한 H33 처리의 직접적인 결과를 피하기 위하여, 상기 실험은 시험관내에서 종양 세포로도 수행하였지만 어떤 효과도 관찰되지 않았다(도 8B).

이들 결과는 H33 투여이후 관찰된 혈관신생의 감소가 혈관이나 종양 세포 성장의 예방에 의해 유도되는 것이 아님을 암시한다. 아폽토시스의 자극은 H33 처리에 의해 유도된 혈관신생 감소에 대한 다른 해석이다. 이런 가설은 아폽토시스 세포의 표준 라벨링 프로토콜(TUNEL)로 아폽토시스를 확인함으로써 종양 절편에서 검증하였다. 결과로써, H33 항체는 생체내와 시험관내에서 내피 세포 아폽토시스에 어떤 영향도 주지 않는 것으로 밝혀졌다(도 8C, 데이터 제시하지 않음). 하지만, 종양 세포는 생체내에서 증가된 TUNEL 라벨링을 보였는데, 이는 아폽토시스가 항체-매개된 감소된 혈관형성의 결과로서 발생한다는 것을 암시한다(도 8C와 D).

Claims

JAM-C에 대항하는 혈관신생(angiogenesis) 저해 분자에 있어서, 수탁 번호 DSM ACC2622하에 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁된 하이브리도마 13H33에 의해 생산되는 항체 H33인 것을 특징으로 하는 혈관신생(angiogenesis) 저해 분자.
제 1항에 있어서, 분자는

a) 항체 H33에 기초하여 항체 H33과 동일한 결합 특이성을 보유하고, 항체 H33의 모든 CDR을 포함하는 인간화 항체;

b) 항체 H33에 기초하여 항체 H33과 동일한 결합 특이성을 보유하고, 항체 H33의 모든 CDR을 포함하는 키메라 항체;

c) 항체 H33과 동일한 결합 특이성을 보유하고, 항체 H33의 모든 CDR을 포함하는 항체 H33의 Fab;

d) 항체 H33과 동일한 결합 특이성을 보유하고, 항체 H33의 모든 CDR을 포함하는 항체 H33의 Fv;

e) 항체 H33과 동일한 결합 특이성을 보유하고, 항체 H33의 모든 CDR을 포함하는 항체 H33의 scFv, scFv의 이량체, scFv의 삼량체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈관신생 저해 분자.
제 1항에 있어서, 분자는

a) 시험관내와 생체내에서 혈관신생을 차단하고;

b) 생체내에서 종양 성장을 예방하고;

c) 대식세포의 종양으로의 동원을 감소시키는 것을 특징으로 하는 혈관신생 저해 분자.
(a) 제 1항 내지 3항중 어느 한 항에 따른 혈관신생 저해 분자 및 (b) 하나 또는 두 개의 비-면역글로불린 부분(moiety)을 포함하는 융합 단백질.
제 1항 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, 약물로서 사용되는 것을 특징으로 하는 혈관신생 저해 분자.
수탁 번호 DSM ACC2622하에 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁된 하이브리도마 13H33.
제 1항 내지 3항중 어느 한 항에 따른 혈관신생 저해 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
선택된 숙주 세포에서 전사와 번역의 조절이 가능한 조절 서열에 연결된 제 7항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
제 8항에 따른 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터.
제 9항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제 1항 내지 3항중 어느 한 항에 따른 혈관신생 저해 분자를 생산하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법:

a) 상기 혈관신생 저해 분자를 인코딩하는 재조합 발현 벡터를 진핵이나 원핵 숙주 세포에 도입하는 단계;

b) 숙주 세포에서 산물의 발현이 가능할 만큼 충분한 시간동안 상기 숙주 세포를 배양하는 단계.
제 11항에 있어서, 숙주 세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
제 12항에 있어서, 숙주 세포는 CHO, NS/O 골수종, COS, HEK293 또는 SP2.0 세포인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
암의 치료를 위한 약물의 제조에 이용되는, 제 1항 내지 3항중 어느 한 항에 따른 혈관신생 저해 분자 및 부형제, 담체 또는 희석제를 함유하는 제약학적 조성물.
제 14항에 있어서, 암은 고형 종양인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
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