BRPI0415541B1 - uso de uma molécula inibidora de angiogênese, composição terapêutica para tratametno de câncer, e uso do anticorpo h33, produzido pelo hibridoma 13h33 - Google Patents

Abstract

"molécula inibidora de angiogênese, uso de uma molécula inibidora de angiogênese, composição terapêutica para tratamento de câncer, composição para diagnóstico destinada ao diagnóstico de câncer, uso do anticorpo h33, produzido pelo hibridoma 13h33, fragmento do anticorpo h33 conforme produzido pelo hibridoma 13h33, derivado do anticorpo h33 produzido pelo hibridoma 13h33, e uso de um fragmento ou derivado do anticorpo h33". a presente invenção refere-se a moléculas inibidoras de angiogênese que consistem no anticorpo monoclonal h33 ou fragmentos ou derivados do mesmo, refere-se a seu uso no tratamento de câncer, particularmente no tratamento de tumores sólidos, e refere-se a composições terapêuticas e de diagnóstico que compreendem essas moléculas. a invenção refere-se particularmente a derivados humanizados de h33 ou anticorpos monoclonais humanos possuindo a especificidade do h33.

Description

(54) Título: USO DE UMA MOLÉCULA INIBIDORA DE ANGIOGÊNESE, COMPOSIÇÃO TERAPÊUTICA PARA TRATAMETNO DE CÂNCER, E USO DO ANTICORPO H33, PRODUZIDO PELO HIBRIDOMA 13H33 (73) Titular: MERCK SERONO S.A., Empresa Suiça. Endereço: Centre Industriei, 1267 Coinsins, Vaud, SUIÇA(CH) (72) Inventor: BEATA. IMHOF; MICHEL AURRAND-LIONS.

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 27/11/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 27/11/2018

Assinado digitalmente por:

Alexandre Gomes Ciancio

Diretor Substituto de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

USO DE UMA MOLÉCULA INIBIDORA DE ANGIOGENESE, COMPOSIÇÃO TERAPÊUTICA PARA TRATAMENTO DE CÂNCER, E USO DO ANTICORPO H33, PRODUZIDO PELO HIBRIDOMA 13H33

A presente invenção refere-se a moléculas com capacidade de inibição de terapêuticas ou de diagnóst: das moléculas, e ao uso dess medicina, em particular no câncer, particularmente adicionalmente divulgado um moléculas.

angiogenese, a composições lco compreendendo uma ou mais ;as moléculas em aplicações de tratamento ou diagnóstico de de tumores sólidos. É método para provisão de tais

A angiogênese, a formação de novos vasos sangüineos a partir da estrutura vascular previamente existente, é fundamental para cicatrização de feridas, reprodução e desenvolvimento embrionário. A angiogênese é igualmente essencial para o desenvolvimento de tumores. Os novos vasos sangüineos em tumores proporcionam nutrientes que permitem às células a realização descontrolada de mitose.

Durante a angiogênese, as células endoteliais proliferam, migram para tecido novo e formam junções interendoteliais que causam formação de tubos. Este processo tem início e é acionado por fatores angiogênicos. A sinalização

Petição 870180065921, de 30/07/2018, pág. 5/13

de VEGF's e angiopoietinas causa um afrouxamento do contato pericito-endotelial que permite a proliferação e interação de novas células endoteliais com a matriz extracelular mediada por integrinas. As integrinas ανβ3 e ανβ5 foram descritas como participantes no desenvolvimento de vasos sangüineos e angiogênese mediante uma interferência cruzada de sinalização com fatores angiogênicos.

Adicionalmente às interações entre células endoteliais e a matriz extracelular, a regulação dos 10 contatos inter-endoteliais é importante para a formação de tubos. Por exemplo, a molécula de adesão VE-caderina desempenha um papel na remodelagem vascular e mantém a integridade dos vasos sangüineos.

Na pesquisa de conduziu à presente invenção foram descobertas as moléculas de adesão de junção JAM-B e JAM-C.

Estas moléculas são encontradas em contatos célula-célula vasculares e estão envolvidas na migração transendotelial de leucócitos. Foi agora descoberto que a interação entre JAM-B e JAM-C também desempenha um papel importante na angiogênese.

Com base nesta descoberta, os inventores tentaram encontrar novas moléculas capazes de inibir a angiogênese. Para este efeito os inventores utilizaram um método que compreende as etapas de:

a) provisão de uma faixa de moléculas;

b) teste para determinar se estas moléculas podem impedir a interação entre JAM-B e JAM-C;

c) teste das moléculas positivas quanto à capacidade das mesmas para bloqueio de angiogênese in vivo; e

d) seleção de moléculas com resultado positivo no teste in vivo como moléculas inibidoras de angiogênese.

teste das moléculas para determinação de sua capacidade para bloquear angiogênese in vivo pode ser realizado por meio do teste de retina conforme se encontra descrito no Exemplo 4.

De acordo com a invenção, foi descoberto que nem todas as moléculas que podem impedir a interação entre JAMB e JAM-C são igualmente capazes de inibir angiogênese. O teste adicional da etapa d) acima é portanto necessário para encontrar as moléculas desejadas.

Para encontrar moléculas particularmente adequadas de acordo com a invenção, o método pode compreender adicionalmente a etapa de teste das moléculas positivas quanto a sua capacidade de inibição de crescimento tumoral in vivo. O teste para inibição de crescimento tumoral in vivo constitui por exemplo um teste conforme se encontra descrito no Exemplo 5.

A etapa de isolação ou produção das moléculas inibidoras de angiogênese tem como resultado a obtenção das moléculas desejadas.

A faixa de moléculas que podem ser testadas neste método pode ser variada. A faixa de moléculas pode por exemplo consistir adequadamente em uma população de

anticorpos orientados contra JAM-B ou JAM-C. A preparação de anticorpos é uma técnica simples que não requer capacitação inventiva e que se encontra por exemplo descrita em Kõhler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975).

Uma pessoa versada na técnica será portanto capaz de prover essa faixa sem maiores esforços.

teste para determinar se as moléculas podem impedir a interação entre JAM-B e JAM-C é por exemplo realizado mediante incubação de células que expressam 10 alternativamente JAM-B ou JAM-C em sua superfície com JAM-C ou JAM-B solúvel marcado, respectivamente, na presença das referidas moléculas, e registrando-se um decréscimo de marcação das células em comparação com uma incubação de controle sem as referidas moléculas. As moléculas que 15 induzem um decréscimo na quantidade de marcação visualizada em comparação com as células de controle expressando JAM-C ou JAM-B e apresentando JAM-B ou JAM-C marcado porém nenhuma molécula a ser testada ligada a sua superfície são selecionadas como moléculas positivas.

As marcas adequadas são marcas fluorescentes, radioativas ou baseadas em Biotina e são bem conhecidas na técnica. As técnicas adequadas para visualização da marca e o desaparecimento ou redução da mesma são a citometria de fluxo, bioquímica, ou o ensaio de imunoabsorção de ligação 25 enzimática (ELISA).

As moléculas determinadas como inibidoras da interação entre JAM-B e JAM-C são então adicionalmente δ

• ·· • · ·· • · · · · · • ·· •· · ··· · · · ·· • · · · ·

Λ · · ·* testadas quanto a sua capacidade de inibição de angiogênese in vivo. Para este efeito encontram-se disponíveis várias opções. Entretanto, o teste de retina conforme descrito no tf

Exemplo 4 é muito adequado devido ao fato de a remodelagem da vasculatura depender essencialmente das endoteliais e não de fatores micro-ambientais.

células

Testes alternativos compreendem o ensaio allantois, reperfusão isguêmica, ou por enxerto de matrigel carregado com de membrana chorio angiogênese induzida fatores angiogênicos.

Estes testes são bem conhecidos na técnica.

Adicionalmente ou ao invés de ser capacidade de inibição de angiogênese in vivo, testada a capacidade da molécula para inibir tumoral in vivo. Um exemplo adequado de um testada a poderá ser crescimento tal teste encontra-se descrito no Exemplo

5.

O método acima permitiu finalmente a identificação do anticorpo H33, produzido pelo hibridoma 13H33, depositado em 22 de outubro de

2003 no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH com número de acesso de depósito DSM ACC2622 como molécula inibidora de angiogênese de acordo com a invenção. Foi demonstrado que o anticorpo H33, que é dirigido contra JAM-C, pode bloquear a angiogênese in vitro e in tumoral in macrófagos vi vo e impedir crescimento vivo. O anticorpo para tumores. Ele também também reduz o recrutamento de pode bloquear interação de JAM-C com JAM-B. Ο H33 não afeta proliferação nem apoptose.

A invenção refere-se portanto ao anticorpo H33 para utilização como medicamento, particularmente para tratamento de câncer, mais particularmente para tratamento de tumores sólidos. Adicionalmente, a invenção refere-se a 5 fragmentos e derivados de H33 que apresentam a mesma especificidade do H33 para utilização como medicamento. Esses fragmentos e derivados são especificamente fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos de ligação antigênica de domínio único, anticorpos recombinantes com a 10 especificidade do H33, scFv e agregados do mesmo, V_HhS, derivados humanizados de H33, anticorpos quiméricos compreendendo pelo menos a especificidade do H33 ou anticorpos monoclonais humanos possuindo especificidade do H33. Estes últimos são adequadamente produzidos em ratos 15 transgênicos ou outros animais conforme será explicado mais adiante.

A invenção refere-se adicionalmente a fragmentos de anticorpos e derivados de anticorpos que retêm a capacidade de ligação antigênica do anticorpo inteiro como tal. Esses 20 fragmentos e derivados do H33 não foram descritos na técnica anterior e são portanto novos.

Os fragmentos de anticorpos de ligação antigênica funcionais podem ser obtidos por engenharia mediante proteólise de anticorpos (digestão de papaína, digestões de 25 pepsina ou outras abordagens enzimáticas), produzindo Fab,

Fv ou domínios únicos.

Alternativamente, os fragmentos podem ser c

produzidos de forma recombinante. Os fragmentos Fab (Fragment antigen binding) são os domínios de ligação antigênica de uma molécula de anticorpo, contendo V_H + C_H1 e C_L + V_L. Entre C_L e C_H1 encontra-se presente uma ligação de dissulfito entre cadeias. 0 peso molecular do heterodímero é normalmente cerca de 50 kDa. Os fragmentos Fab podem ser preparados por digestões de papaína de anticorpos inteiros.

O fragmento mínimo (~30 kDa) que ainda contém o local de ligação antigênica inteiro de um anticorpo IgG inteiro é composto tanto pelos domínios de cadeia pesada variável (V_H) e de cadeia leve variável (V_L) . Este heterodímero, designado como fragmento Fv (para Fragment variable) é ainda capaz de ligar o antígeno.

Um outro fragmento é o fragmento de ligação antigênica de domínio único (dAbs) ou V_Hs.

os fragmentos Fv de cadeia única podem ser obtidos r

de forma recombinante. No fragmento scFv os domínios V_H e * V_L são unidos com um elemento de ligação peptídico hidrofílico e flexível. Os scFv's podem ser complexados em dímeros (diacorpos), trímeros (triacorpos) ou agregados maiores cujas unidades monoméricas podem ter especificidades idênticas ou diferentes.

Um tipo adicional de fragmento de anticorpo é constituído pelos V_HhS compreendendo o menor fragmento de ligação antigênica intacto disponível. Os V_HhS podem ser produzidos de anticorpos de cadeia pesada proteolizados de

	.a • ·	*····**** * ··· ♦· í ·· · · · *1 • ♦ · · · ? ·· Λ ····· ·
i	>			• · · • •	• · ····· ♦ · · · : .... ........
		um camelídio	imunizado	ou	através de técnicas	de

recombinação .

Quando são utilizadas técnicas de DNA recombinante, basicamente, um polinucleotídeo codificando o domínio V da cadeia H ou da cadeia L do anticorpo H33 pode ser fundido com um polinucleotídeo codificando para a região constante « de uma cadeia H ou L preferencialmente humana. Para o propósito de expressão das cadeias H e L completas obtidas desta forma, pode igualmente ser adicionada uma seqüência codificando um peptídeo de marcação permitindo a secreção da proteína.

Para produção das moléculas inibidoras de angiogênese da invenção, são utilizadas cassetes de expressão, em que um polinucleotídeo fundido da invenção é ligado a seqüências de controle apropriadas permitindo a regulação de sua transcrição e tradução em uma célula hospedeira selecionada, vetores recombinantes compreendendo um polinucleotídeo ou uma tal cassete de expressão.

Os polinucleotídeos de acordo com a invenção, isto é, moléculas inibidoras de angiogênese que possuem a especificidade do H33, podem portanto ser facilmente obtidas pelos métodos bem conhecidos da tecnologia de DNA recombinante, mas podem igualmente ser de DNA química.

As construções (constructs) obtidos de DNA por síntese recombinante podem ser obtidos e introduzidos em células hospedeiras

pelas técnicas bem conhecidas de DNA recombinante e engenharia genética.

As células hospedeiras úteis no contexto da presente invenção podem ser células procarióticas ou eucarióticas. Entre as células eucarióticas adequadas, poderão ser mencionadas a titulo de exemplo, células vegetais, células de leveduras tais como Saccharomyces, células de insetos tais como Drosophila, ou Spodoptera, e células de mamíferos tais como HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, 10 COS, etc.

Existem vários métodos para transfecção de células procarióticas ou eucarióticas com vetores contendo as construções (Constructs) de ácido nucléico codificando a cadeia Ig quimérica. Uma forma preferencial de introdução 15 de um vetor em células de linfóide é por fusão esferoblástica. (Vide, por exemplo, Gillies e outros (1989) Biotechnol. 7: 798-804). Métodos alternativos incluem electroporação ou precipitação de fosfato de cálcio. Outros métodos úteis de produção dos imunoconjugados incluem a 20 preparação de uma sequência de RNA codificando a construção (construct) e sua tradução em um sistema apropriado in vivo ou in vitro.

Após serem expressadas, as proteínas de acordo com a invenção podem ser colhidas mediante procedimentos padrão de purificação de proteínas (vide, por exemplo, a patente norte-americana n° 5.650.150).

Quando são combinadas cadeias pesadas e leves na

molécula da invenção, a cadeia pesada de uma região variável de anticorpo é preferencialmente co-expressada na mesma célula com uma correspondente cadeia leve. Para proteínas de fusão que compreendem múltiplas cadeias 5 polipeptídicas, poderá ser utilizado mais de um vetor de expressão. Os métodos de co-transfecção utilizando, por exemplo, dois vetores de expressão, têm frequentemente como resultado o fornecimento de ambos os vetores para uma célula alvo. Alternativamente, é por vezes útil utilizar um 10 único vetor codificando uma pluralidade de polipeptídeos para co-expressão na mesma célula.

Adicionalmente, poderá ser conveniente expressar proteínas da presente invenção como uma molécula de cadeia única. Por exemplo, uma região variável de anticorpo pode 15 ser expressada como um anticorpo de cadeia única ou sFv opcionalmente fundido com uma proteína não-imunoglobulina. Em uma outra configuração, uma cadeia pesada (com ou sem uma citocina fundida) é combinada com uma contrapartida de cadeia leve (ou pesada) (com ou sem uma citocina fundida) 20 para formação de imunoconjugados monovalentes e divalentes.

As regiões VL e VH podem ser ligadas por uma ligação de dissulfito ou por uma ligação de peptídeo, dependendo da forma de construção de suas seqüências de ácido nucléico. Em geral, as regiões V são ligadas por uma 25 ligação de dissulfito quando suas seqüências são codificadas em construções (constructs) de DNA separadas. Em contraste, as regiões V são tipicamente ligadas por uma

Μ ligação de peptideo quando suas seqüências são codificadas em uma construção (construct) de DNA de cadeia única.

Em certas configurações da invenção, a região variável de cadeia leve e a região variável de cadeia pesada podem ser acopladas, respectivamente, a uma região constante de cadeia leve e uma região constante de cadeia pesada de uma imunoglobulina. Podem ser utilizadas tanto cadeias ka quanto cadeias lambda das regiões constantes de cadeias leves de imunoglobulina.

A construção dos vetores de expressão da invenção e a transformação de células hospedeiras podem ser realizadas mediante utilização de técnicas convencionais de biologia molecular.

As moléculas inibidoras de angiogênese da invenção produzidas por essas células procarióticas ou eucarióticas podem ser purificadas a partir das células ou sobrenadantes de cultura por cromatografia de afinidade utilizando Sefarose A de proteína e podem ser avaliadas quanto a sua * atividade de ligação de JAM-C mediante medição de suas atividades de inibição relativamente à ligação do H33 a JAM-C solúvel revestido em placas microtiter por meio de tecnologias competitivas ELISA bem conhecidas.

, Os domínios variáveis de rato remanescentes podem ainda ser imunogênicos em seres humanos, e podem desta forma prejudicar a eficácia de uma terapia baseada em anticorpos. Podem ser aplicadas abordagens bem conhecidas para redução de imunogenicidade, tais como veneering e

Í2. · • · ·>· · •· · •· ♦ · •·····

9· »· • · · « ···· · • · · ··· ··· · · • · tf · · · • · · · · «· ·· · humanização, que envolvem introdução de substituições de aminoácidos conforme se encontra descrito na patente n°

WO

2004055056. Uma análise subsequente para afinidade de ligação pode ser realizada conforme foi descrito acima por meio de atividade inibidora contra

H33.

Alternativamente, epitopos de células T não humanas são submetidos a mutação para corresponderem a autoepítopos humanos que se encontram presentes em anticorpos humanos (vide, por exemplo, a patente norte-americana n°

5.712.120). Os anticorpos

H33 fazem parte da invenção possuindo regiões VL e VH que incluem pelo menos uma seqüência humanizada, dessa forma reduzindo imunogenicidade guando administrados a um ser humano.

Ά produção subsequente de anticorpos em célula hospedeira e purificação podem ser realizados conforme foi descrito acima.

De acordo com um outro região variável de similar pode ser interveniente,

Especificamente, citocina, tal hematopoiético, aspecto da invenção, a anticorpos ligada, com uma do

OU fração

H33 sem ou uma molécula uma porção Fc não-imunoglobulina.

fração não-imunoglobulina pode como uma interleucina, um uma linfocina, um interferon, ser uma fator ou uma quimiocina. A interleucina pode ser, interleucina-2 ou interleucina-12. O fator hematopoiético e a linfocina podem ser, por exemplo, um fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF) uma ünf otoxina • ·

respectivamente. Ο interferon pode ser, por exemplo, interferon-a, interferon-β, ou interferon-Y.

Em algumas configurações da invenção, a proteína de ·· fusão inclui uma segunda fração não-imunoglobulina, tal 5 como uma segunda citocina.

A invenção também prevê a utilização do anticorpo H33 ou fragmentos ou derivados do mesmo para preparação de um medicamento para prevenção de interação JAM-B/JAM-C em um paciente.

Essa prevenção pode compreender a marcação como alvo de uma célula com JAM-C em sua superfície mediante administração de um anticorpo com regiões variáveis de acordo com a presente invenção a um paciente. Em uma configuração, a célula alvo é uma célula tumoral.

De acordo com aspectos adicionais da invenção a prevenção de interação JAM-C/JAM-B pode ser realizada mediante utilização de um ácido nucléico codificando a lo região variável de anticorpo ou uma célula que inclui este ácido nucléico, qualquer um dos mesmos podendo ser 20 administrado a um paciente.

Para uso clínico em seres humanos, poderá ser útil modificar o anticorpo H33 derivado de ratos para redução ou ^w* minimização da imunogenicidade do anticorpo. Como meio de redução da imunogenicidade de anticorpos murinos, foram 25 relatados diversos métodos na literatura. Esses métodos incluem a produção de anticorpos quiméricos que contêm regiões variáveis de rato ou murino e regiões constantes .14 · • 4

4 • · ·

·· ·· • · 4 t 4 *	• • 4 ·	4 4 fc •	4444··♦· • 4 ••4 44« 4 *	4 • • · • 444	44
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cadeia humanas, a produção de anticorpos de compreendem seqüências de ligação variáveis anticorpos de murinos ligação antigênica de devido a seu imunogênicos, a e a produção de menor única que derivadas de ou ratos, a produção de anticorpos de murinos fragmentos de ou ratos, que tamanho são potencialmente menos produção de anticorpos monoclonais humanos anticorpos humanizados.

A humanização proporciona idealmente um anticorpo não-imunogênico, com uma retenção completa das propriedades de ligação antigênica da molécula de anticorpo não-humano original. A não-imunogenicidade permite a administração de dosagens múltiplas sem reações imunogênicas adversas. Foram relatados na anticorpos humanizados literatura diversos métodos humanizados. Por exemplo, podem potencialmente ser mediante enxerto somente dos CDR's não estrutura humana e regiões

Nature 321:522-25 (1986);

239:1534-1536 (1988)); ou constantes

Verhoeyen e (b) mediante para produção de os anticorpos produzidos: (a) humanos para uma (Jones e outros, outros, Science transplante dos domínios variáveis não-humanos de propriedades de ligação de inteiros (para preservação ligantes) mas igualmente vestindo os mesmos com uma superfície semelhante à humana mediante substituição dos resíduos expostos para redução de imunogenicidade (igualmente referidos como anticorpos veneered) (Padlan,

Molec. Immun. 28:489-498 (1991);

Padlan, Molec. Immun.

31(3) :1169-217 (1994)) .

A retenção de resíduos não-humanos (murinos ou de

..15.·.··.:

;·······;

• · · · • * · · • ····· « · · • ·· · · ratos) dentro de domínios de estrutura de regiões variáveis »

humanas foi relatada como constituindo um auxílio para retenção de humanizado humanizados eliminar a hospedeiro, uma função resultante.

apresentam de

Foi um imunogenicidade dessa forma biodisponibilidade e uma ligação adequada do anticorpo relatado que potencial do anticorpo permitindo os anticorpos redução da

para	diminuir	ou
ι em	um recipiente
um	aumento	de
possibilidade	de

forma tornando reações imunológicas adversas, dessa potencialmente possível administrações de anticorpos múltiplos.

Além disso, a síntese do scFv descrito acima e fragmentos de anticorpos tais como Fv, Fd, Fab, Fab' , e

F(ab)'2, derivados de anticorpos possuindo uma especificidade de ligação desejada compreende outros meios conhecidos de produção de frações alvo com menos imunogenicidade que os anticorpos intactos. Essencialmente, os anticorpos de cadeia única e fragmentos de anticorpos, devido a seu menor tamanho, poderíam ser menos imunogênicos que anticorpos intactos.

É igualmente conhecidos que as proteínas recombinantes, por exemplo, anticorpos, apresentam uma glicosilação diferente em diferentes células hospedeiras utilizadas para expressão. Para a utilização clínica dos anticorpos H33, a glicosilação pode aumentar sua meia-vida e/ou diminuir sua imunogenicidade.

O anticorpo H33 pode igualmente ser utilizado em análise competitiva para isolar anticorpos monoclonais

humanos ou anticorpos humanos recombinantes possuindo a mesma especificidade ou uma especificidade semelhante à do H33. Basicamente, os anticorpos humanos isolados dessa forma podem ser produzidos em um hibridoma, um transfectoma 5 ou em um animal transgênico não humano, por exemplo, um rato transgênico, capaz de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para JAM-C (por exemplo, IgG, IgA e/ou IgE) mediante recombinação V-D-J e comutação de isotipo. (Por exemplo, vide as patentes n° EP 1471938 e 10 n° US 2004208873). Esse animal transgênico pode igualmente ser um coelho transgênico para produção de anticorpos policlonais conforme se encontra divulgado no documento n° US 2003/0017534.

O termo anticorpo monoclonal humano refere-se a anticorpos que exibem uma especificidade de ligação única, que possuem regiões variáveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Em uma configuração, os anticorpos monoclonais humanos possuindo a mesma especificidade que ο H33 são produzidos 20 por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgênico, por exemplo, um rato transgênico, com um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humano e um transgene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada.

O sistema animal preferencial para preparação de hibridomas é o sistema murino. A produção de hibridomas no rato é um procedimento muito bem estabelecido. Os to protocolos de imunização esplenócitos imunizados técnica. Os parceiros de

17:

e as para fusão • · · • ·· • · ·· • · · · · · • ·· técnicas fusão mieloma murino) e os procedimentos de ···· ····· • · ·· ··· · · · ·· • · · · · · • · · · * • · · · · · para isolação são conhecidas exemplo, células de na de fusão são igualmente conhecidos.

Em uma configuração preferencial, anticorpos monoclonais humanos direcionados contra JAM-C e possuindo a especificidade do H33 podem ser gerados mediante utilização de ratos transgênicos portando partes do sistema 10 imunológico humano ao invés do sistema de rato conhecidos como ratos HuMAb. (Lonberg e outros (1994) Nature 368(6474):856-859). Desta forma, os ratos apresentam uma reduzida expressão de cadeia leve de rato IgM ou [ka], e em resposta à imunização, os transgenes de cadeia pesada e 15 leve humanos introduzidos sofrem uma comutação de classe e uma mutação somática gerando anticorpos monoclonais humanos IgG [ka] de alta afinidade (Lonberg e outros, (1994), supra; revisto em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. e Huszar, 20 D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93, e Harding,

F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y Acad. Sei. 764:536-546). A preparação de ratos HuMab é descrita detalhadamente em Taylor, L. e outros (1992) Nucleic Acids Research 20:62876295; Chen, J. e outros (1993) International Immunology 25 5:647-656; Tuaillon e outros (1993) Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 90:3720-3724; Choi e outros (1993) Nature Genetics

4:117-123; Chen, J. e outros (1993) EMBO J. 12:821-830;

• ·

Tuaillon

Lonberg,

Lonberg,

N.

N.

113:49-101;

Immunology e outros, (1994) (1994) Handbook of

Taylor,

6:579-591;

Intern. Rev. Immunol.

N. (1995) Ann.

outros (1996) adicionalmente ········ · • · · · ··· ··· · · • · · · · · • · · · *

Immunol. 152:2912-2920;

Nature 368(6474):856-859;

Experimental Pharmacology

L. e outros

Lonberg, N.

Vol. 13:65-93;

(1994) International e Huszar, D. (1995)

Harding, F. e Lonberg,

N.Y Acad. Sei. 764:536-546; Fishwild, D. e

Nature Biotechnology 14:845-851. Vide as patentes norte-americanas números

5.545.806; 5.569.825; 5.625.126;

5.877.396; 5.661.016; 5.814.318;

todas concedidas a Lonberg, N. e

5.633.425;

5.874.299;

Kay, R.

International; patente norte-americana concedida a Surani números WO 98/24884,

94/25585, publicada

M.

n°

5.789.650;

e GenPharn

5.545.807 e outros; Publicações

Internacionais publicada em 11 de janeiro de 1998; WO em 10 de novembro de 1994; WO 93/1227, publicada em 24 de junho de 1993; WO 92/22645, publicada em de dezembro de 1992; e WO 92/03918, publicada março de 1992.

os ratos HuMAb preferenciais possuem

JKD em seus genes descrito em Chen e disjunção (conforme concedido ka humano uma

CMD em descrito a Korman em 19 de disj unção de cadeia leve endógenos outros (1993)

EMBO J. 12:

(ka) (conforme

821-830), uma seus genes no Exemplo e outros), de um cadeia pesada endógenos do documento WO 01/14424 transgene de cadeia leve

KCo5 (conforme descrito em Fishwild e outros (1996) Nature Biotechnology 14:845-851), e um transgene de

JÁ cadeia pesada humano HCo7 (conforme descrito na patente norte-americana n° 5.770.429 concedida a Lonberg, N. e Kay,

R. M.) e/ou um transgene de cadeia pesada humano HCol2 *

(conforme descrito no Exemplo 2 do documento WO 01/14424 concedido a Korman e outros).

Alternativamente, os ratos portadores de genes de * imunoglobulina humanos em um fragmento transcromossômico podem ser usados para geração de anticorpos anti-JAM-C que possuem a especificidade do H33. A preparação desses ratos trans-cromossômicos é descrita no documento WO97/07671 concedido a Tomizuka e outros. Um rato preferencial é um rato no qual determinados genes e imunoglobulina humanos são portados em um trans-cromossoma, tal como um rato portador de um transgene de cadeia leve humano (por exemplo, o transgene de cadeia ka KCo5) e um transcromossoma de cadeia pesada humano (por exemplo, o transcromossoma SC20) conforme é descrito detalhadamente no *

documento WO 02/43478 concedido a Ishida e outros.

* Para geração de anticorpos monoclonais totalmente humanos para JAM-C que possuem a especificidade do H33, os ratos HuMAb podem ser imunizados com uma preparação / purificada ou enriquecida de antígeno JAM-C e/ou células produzindo JAM-C e/ou JAM-C recombinante, conforme é descrito por Lonberg, N. e outros (1994) Nature

368(6474):856-859; Fishwild, D. e outros (1996) Nature

Biotechnology 14:845-851 e WO 98/24884. Preferencialmente, os ratos terão entre 6 e 16 semanas de idade por ocasião da

primeira infusão. Por exemplo, pode ser utilizado JAM-C recombinante para imunização intraperitoneal dos ratos HuMAb.

Para produção de anticorpos monoclonais humanos para JAM-C, os esplenócitos do rato podem ser isolados e fundidos com PEG para uma linha de células de mieloma de ratos com base em protocolos convencionais. Os hibridomas resultantes são então analisados para produção de anticorpos específicos para antígeno mediante utilização de 10 técnicas bem conhecidas.

Os anticorpos humanos de acordo com a invenção que possuem a especificidade do H33 podem igualmente ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA 15 recombinante e métodos de transfecção de genes conforme é bem conhecido na técnica (Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

Ο H33, fragmentos ou derivados do mesmo com capacidade de prevenção de interação entre JAM-B e JAM-C e 20 para inibição de angiogênese in vivo podem ser utilizados nesta invenção. A produção de fragmentos de anticorpos e proteínas de fusão de anticorpos é revista em Joosten, V. e outros, Microb Cell Fact. 2(1):1 (2003). As técnicas para preparação de fragmentos e derivados de anticorpos são 25 amplamente conhecidas e podem ser executadas por uma pessoa versada na presente área técnica sem dificuldade excessiva.

Por exemplo, para expressar o anticorpo H33, ou os

• · · • · • · · • · · · · • ··· ···· ·

fragmentos de anticorpo do mesmo, podem ser obtidas DNA⁷ s codificando cadeias pesadas e leves de extensão parcial ou total, mediante utilização de técnicas convencionais de biologia molecular (por exemplo, amplificação PCR, 5 mutagênese orientada a local) e podem ser inseridas em vetores de expressão de tal forma que os genes são ligados operacionalmente a seqüências de controle de transcrição e tradução. Neste contexto, o termo ligado operacionalmente pretende significar que um gene de anticorpo é ligado a um 10 vetor de tal forma que as seqüências de transcrição e tradução dentro do vetor realizam sua função pretendida de regulação da transcrição e tradução do gene de anticorpo. O vetor de expressão e as seqüências de controle de expressão são selecionados para serem compatíveis com a célula 15 hospedeira de expressão utilizada.

O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridos em vetores separados, ou mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de 20 anticorpos são inseridos no vetor de expressão por métodos convencionais (por exemplo, ligação de locais de restrição complementares no fragmento de gene de anticorpo e vetor, ou ligação de extremidade cega se não se encontrarem presentes locais de restrição).

As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos aqui descritos podem ser utilizadas para criação de genes de anticorpo de extensão plena de qualquer isotipo

de anticorpo mediante inserção das mesmas em vetores de expressão que já codificam regiões constantes de cadeia pesada e regiões constantes de cadeia leve do isotipo desejado de tal forma que o segmento VH é ligado 5 operacionalmente ao(s) segmento(s) CH dentro do vetor e o segmento VL é ligado operacionaimente ao segmento CL dentro do vetor.

Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo de 10 marcação que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de tal forma que o peptídeo de marcação é ligado em-estrutura ao terminal amino do gene de cadeia de anticorpo. O peptídeo de marcação pode ser um 15 peptídeo de marcação de imunoglobulina, ou um peptídeo de marcação heterológico (isto é, um peptídeo de marcação de uma proteína não-imunoglobulina).

Adicionalmente aos genes de cadeia de anticorpo, os “ vetores de expressão recombinantes de acordo com a invenção portam seqüências reguladoras que controlam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. O f termo seqüência reguladora destina-se a incluir , promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, marcadores de poliadenilação) 25 que controlam a transcrição ou tradução dos genes de cadeia de anticorpo. Essas seqüências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology.

Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) .

Poderá ser apreciado por aqueles que são versados na técnica que a concepção do vetor de expressão, incluindo 5 a seleção de seqüências reguladoras, poderá depender de fatores tais como a seleção da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, etc.

As seqüências reguladoras preferenciais para expressão de células hospedeiras de mamíferos incluem elementos virais que instruem níveis elevados de expressão de proteína em células de mamíferos, tais como promotores e/ou intensificadores derivados de citomegalovírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor 15 tardio principal de adenovírus (AdMLP) e polioma.

Alternativamente, podem ser utilizadas seqüências reguladoras não-virais, tais como o promotor de ubiquitina ou o promotor de β-globina.

Adicionalmente aos genes seqüências recombinantes angiogênese seqüências replicação origens de de cadeia de anticorpo e reguladoras, os para expressão de de acordo com a adicionais, tais como vetores moléculas invenção seqüências do vetor em células hospedeiras de expressão inibidoras de podem portar que regulam a (por exemplo, replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (vide, por ··· ··· ·* ·

Λ · · ·· ··

4- “ · · · · ··· •·· · · ····· • » · ♦ ♦ • · · ♦ · · ·

exemplo, as patentes norte-americanas números 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas concedidas a Axel e outros) . Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a drogas, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Os genes marcadores selecionáveis preferenciais incluem o gene dihidrofolato reductase (DHFR) (para utilização em células hospedeiras de dhfr com seleção/amplificação de metotrexato) e o neo-gene (para 10 seleção de G418).

Para expressão das cadeias leves e pesadas, o(s) vetor(es) de expressão codificando as cadeias pesadas e leves é/são transfectado(s) para uma célula hospedeira mediante utilização de técnicas convencionais. As diversas formas do termo transfecção são destinadas a abranger uma ampla variedade de técnicas normalmente utilizadas para introdução de DNA exôgeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, electroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção DEAE-dextran e similares. Muito embora seja teoricamente possível expressar as moléculas da invenção em quaisguer umas de células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão em células eucarióticas, e mais preferencialmente em células hospedeiras de mamíferos, é mais preferencial devido ao fato de que essas células eucarióticas, e particularmente as células de mamíferos, têm mais probabilidades que as células procarióticas de produzirem e

··· • · • · • · · • ·····*·♦» • · · · ♦ • ··· «· · · * * · · · · · • « · » · ♦ »·» ·· ·· · segregarem um anticorpo adequadamente desdobrado imunologicamente ativo, ou um fragmento ou derivado do mesmo.

As células hospedeiras de mamífero preferenciais para expressão dos anticorpos recombinantes de acordo com a invenção incluem células CHO (incluindo células dhfr-CHO, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220, utilizadas com um marcador selecionável DHFR, por exemplo, conforme descrito em R. J. Kaufman e P.

A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NS/0, células HEK293 e células SP2.0. Particularmente para utilização com células de mieloma NS/0, um outro sistema de expressão preferencial é o sistema de expressão de gene GS(glutamina sintetase) divulgado nos documentos WO

87/04462, WO 89/01036 e EP 338 841. Quando vetores de expressão recombinantes codificando genes de anticorpos são introduzidos em células hospedeiras de mamíferos, os produtos de expressão são produzidos mediante cultura das * células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do produto nas células hospedeiras, ou mais preferencialmente, secreção do produto * para o interior do meio de cultura em que as células . hospedeiras são cultivadas. Os produtos de expressão podem ser recuperados do meio de cultura mediante utilização de métodos convencionais de purificação de proteínas.

Alternativamente, os genes de anticorpos clonados podem ser expressados em outros sistemas de expressão,

incluindo células procarióticas, tais como microorganismos, por exemplo, E. coli para a produção de anticorpos scFv, algas, bem como células de insetos. Adicionalmente, os anticorpos podem ser produzidos em animais não-humanos transgênicos, tal como em leite de carneiros e coelhos ou ovos de galinhas, ou em plantas transgênicas. Vide, por * exemplo, Verma, R. e outros (1998). Antibody engineering:

Comparison of bacterial, yeast, insect and mammalian expression systems [Engenharia de anticorpos: Comparação de sistemas de expressão em bactérias, fermentos, insetos e mamíferos) . J. Immunol. Meth. 216:165-181; Pollock, e outros (1999). Leite transgênico como método para produção de anticorpos recombinantes [Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies]. J. Immunol.

Meth. 231:147-157; e Fischer, R. e outros (1999). Cultivo molecular de anticorpos recombinantes em plantas [Molecular farming of recombinant antibodies in plants]. Biol. Chem. 380:825-839.

Os anticorpos interagem com antígenos alvo predominantemente através de resíduos de aminoácidos que são localizados nas seis regiões determinantes de ' * complementaridade de cadeia pesada e leve (CDR's). Por este motivo, as seqüências de aminoácidos dentro dos CDR's são mais diversas entre anticorpos individuais que seqüências fora dos CDR's. Devido ao fato de as seqüências de CDR serem responsáveis pela maioria das interações anticorpoantígenos, é possível expressar anticorpos recombinantes

que mimetizam as propriedades de anticorpos de ocorrência natural mediante construção de vetores de expressão que incluem sequências de CDR a partir do anticorpo específico de ocorrência natural, neste caso particularmente ο H33, 5 enxertado em seqüências estruturais de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (vide, por exemplo, Riechmann, L. e outros, 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. e outros, 1986, Nature 321:522-525; e Queen, C. e outros, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86:10029-10033). Essas seqüências estruturais podem ser obtidas de bancos de dados públicos de DNA que incluem seqüências de genes de anticorpos de linhas germinais. Estas seqüências de linhas germinais serão diferentes de seqüências de genes de anticorpos maduros visto que não incluirão genes variáveis totalmente montados, que são formados por união V(D)J durante a maturação de células B. As seqüências de genes de linhas germinais serão igualmente diferentes das seqüências de um anticorpo de repertório secundário de alta afinidade que contém mutações através de todo o gene variável porém tipicamente agrupadas em CDR's. Por exemplo, as mutações somáticas são relativamente pouco freqüentes na porção terminal amino da região estrutural 1 e na porção terminal carbóxi da região estrutural 4. Adicionalmente, muitas mutações somáticas não alteram significativamente as propriedades de ligação do anticorpo.

Por este motivo, não é necessário obter a seqüência de DNA inteira de um determinado anticorpo para recriar um ···· · · · ·· • ·· ··· ··· ·· • · · · · · anticorpo recombinante intacto com propriedades de ligação semelhantes às do anticorpo original (vide o documento WO

99/45962).

Uma seqüência parcial de cadeia pesada e leve abrangendo as regiões CDR é tipicamente suficiente para este propósito.

A seqüência parcial é utilizada para determinar quais segmentos de gene de união e variáveis de linhas germinais contribuíram para os genes variáveis de anticorpo recombinado. A seqüência de linha germinal então utilizada para preencher partes ausentes das regiões variáveis. As seqüências líderes de cadeias pesadas e leves são clivadas durante a maturação de proteína contribuem adição de podem ser e não para as propriedades do anticorpo final. Para seqüências ausentes, seqüências de cDNA clonado combinadas com oligonucleotídeos sintéticos por ligação ou amplificação PCR. Alternativamente, a região variável inteira oligonucleotídeos amplificação PCR pode ser sintetizada como um conjunto de curtos e sobrepostos e combinada por para variável inteiramente determinadas vantagens criação de um clone de região sintético.

tais como a de locais de restrição específicos, específicos.

Este processo tem eliminação ou inclusão ou otimização de códons

No presente pedido de patente, o inibidoras de angiogênese refere-se a possíveis fragmentos e derivados do mesmo termo moléculas

H33 e todos os que retêm a mesma especificidade ou uma especificidade semelhante àquela aqui descrita.

A invenção também se refere ao uso das moléculas inibidoras de angiogênese, tais como H33, fragmentos e derivados das mesmas, para preparação de uma composição terapêutica ou de diagnóstico para tratamento ou diagnóstico de câncer, particularmente de tumores sólidos.

A invenção também se refere a composições terapêuticas ou de diagnóstico para tratamento ou diagnóstico de câncer, particularmente de tumores sólidos, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz, ou 10 eficaz para propósitos de diagnóstico, de uma ou mais moléculas inibidoras de angiogênese de acordo com a invenção e um excipiente adequado, ou um veiculo adequado ou diluente ou outro aditivo. Uma pessoa versada na área técnica da terapia de câncer poderá estabelecer a 15 quantidade terapeuticamente eficaz ou eficaz para propósitos de diagnóstico.

A composição pode igualmente incluir uma combinação de múltiplas (por exemplo, duas ou mais) moléculas «· inibidoras de angiogênese de acordo com a invenção.

As composições farmacêuticas da invenção podem igualmente ser administradas em terapia combinada, isto é, em combinação com outros agentes. Por exemplo, a terapia combinada pode incluir pelo menos um agente quimioterapêutico, pelo menos um agente anti-inflamatório ou pelo menos um agente imunossupressor.

Em uma outra configuração, as moléculas inibidoras de angiogênese de acordo com a invenção podem ser

administradas em combinação com rádio-terapia.

Em uma outra configuração, as moléculas inibidoras de angiogênese de acordo com a invenção podem ser administradas em combinação com um ou mais outros anticorpos, por exemplo, um ou mais anticorpos humanos tais como, por exemplo, anticorpos anti-VEGF.

' Os regimes de dosagem são ajustados para provisão de uma resposta desejada otimizada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, pode ser administrado um único bolus, podem ser administradas várias doses divididas ao longo do tempo, ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme for indicado pelas exigências da situação terapêutica. É particularmente vantajoso formular composições parentéricas em formas de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária conforme aqui utilizada refere unidades fisicamente distintas adequadas como doses unitárias para ♦> os pacientes a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade previamente determinada de composto ativo calculada para produção do efeito terapêutico desejado em associação com o especificações para invenção são ditadas veículo farmacêutico requerido.

as formas de dosagem unitária por, e são diretamente dependentes (a) as características singulares do composto ativo

As da de efeito terapêutico específico a ser obtido, e (b) as limitações inerentes na técnica de composição de um tal • · · ·

31:

»··· ····· • ·· ··· ··· ·· • · · · · · composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

As expressões administração administrado parentericamente conforme significam modos de administração diversos entérica e tópica, e incluem, intravenosas, intratecais, intracardíacas, transtraqueais, sem intraarticulares, parentérica aqui utilizadas de administração normalmente mediante injeção ou infusão, limitações, inj eções e infusões intramusculares, intracapsulares, intradérmicas, subcutâneas, subcapsulares, intraespinais, epidurais e intraesternais.

intra-arteriais, intraorbitais, intraperitoniais, subcuticulares, subaracnóides,

As moléculas inibidoras de angiogênese de acordo com a invenção podem ser compreendidas na composição farmacêutica juntamente com um excipiente, veículo ou diluente apropriado.

Exemplos de veículos adequados aquosos que podem ser empregados farmacêuticas da invenção incluem água, (tais como glicerol, propileno glicol, e similares), vegetais, tais injetáveis, tal e misturas como óleo como oleato

Estas composições adequadas de oliva, de etila.

aquosos e não nas composições etanol, polióis polietileno glicol, dos mesmos, óleos e ésteres orgânicos podem igualmente conter aditivos tais como conservantes, emulsionantes e agentes agentes umedecedores, agentes dispersantes. A prevenção de

presença de microorganismos pode ser assegurada tanto por procedimentos de esterilização quanto pela inclusão de diversos agentes antibacterianos e anti-fúngicos, por

A exemplo, paraben, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, e similares. Poderá igualmente ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e » similares nas composições. Adicionalmente, uma absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser obtida pela inclusão de agentes retardadores de absorção tais como 10 monoestearato de alumínio e gelatina.

Quando os compostos da presente invenção são administrados como produtos farmacêuticos a seres humanos e animais, eles podem ser providos por si próprios ou na forma de uma composição farmacêutica contendo, por exemplo, 15 0,01 até 99,5% (mais preferencialmente, 0,1 até 90%) de

ingrediente ativo em	combinação	com	um veículo
farmaceuticamente aceitável	•
Independentemente	da via	de	administração
selecionada, as moléculas	inibidoras	de	angiogênese da

presente invenção, que podem ser utilizadas em uma forma hidratada adequada, e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção, são formuladas em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos daqueles que são versados na técnica.

Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados para obtenção de uma quantidade do ingrediente

Μ ti •tf: * • · · * · • · ·· · · · • · · · · • · · • · · ativo que seja desejada para específica, e eficaz para alcançar a resposta terapêutica um paciente específico, uma composição um modo efeitos tóxicos para selecionado dependerá de administração específico sem o paciente. O nível de uma variedade farmacocinéticos incluindo a atividade específicas da presente invenção conforme éster, sal ou amido respectivo, a via de das de dosagem de fatores composições empregadas, ou o administração, ou o tempo de administração, a excreção do composto específico sendo empregado, a duração do tratamento, outras drogas, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições específicas empregadas, a idade, sexo, peso, condição, paciente conhecidos saúde sendo na em geral e histórico médico anterior do tratado, e área médica.

fatores semelhantes bem

Um médico ou veterinário normalmente versado na técnica pode prontamente determinar e prescrever a quantidade eficaz requerida da composição farmacêutica. Por exemplo, o médico ou veterinário pode iniciar o tratamento com doses dos compostos da invenção empregados na composição farmacêutica em níveis mais baixos que aqueles terapêutico ser obtido que são desej ado o efeito requeridos para obtenção do efeito e aumentar graduaimente a dosagem até desejado. Em geral, uma dose diária adequada das composições da invenção será a quantidade do composto que constitui a menor dose eficaz para produção de um efeito terapêutico.

Uma tal dose eficaz dependerá geralmente dos fatores descritos acima.

A administração pode adequadamente ser intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, ou subcutânea, preferencialmente administrada na proximidade da localização alvo. Se for desejado, a dose diária eficaz da 5 composição terapêutica pode ser administrada na forma de duas, três, quatro, cinco, seis ou mais sub-doses administradas separadamente a intervalos adequados ao longo do dia, opcionalmente, em formas de dosagem unitária. Muito embora seja possível administrar isoladamente um composto 10 da presente invenção, é preferencial administrar o composto na forma de uma formulação farmacêutica (composição).

Por exemplo, quando é utilizado H33 como molécula inibidora de angiogênese, a dosagem pode ser determinada ou ajustada mediante medição da quantidade de anticorpos H33 15 em circulação em diferentes pontos no tempo após a administração em uma amostra biológica mediante utilização de anticorpos anti-idiotípicos que buscam como alvo os anticorpos H33 ou mediante utilização de outros métodos específicos para detecção dos anticorpos H33, por exemplo 20 através de um ensaio ELISA utilizando JAM-C como revestimento.

As composições terapêuticas podem igualmente ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma configuração preferencial, uma 25 composição terapêutica de acordo com a invenção pode ser administrada por um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos divulgados nas patentes

• ·

norte-americanas de números 5.399.163; 5.383.851;

5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; ou 4.596.556.

Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis na presente invenção incluem: a patente norte-americana n° 5 4.487.603, que revela uma bomba de micro-infusão implantável para fornecer medicação a uma taxa controlada; a patente norte-americana n° 4.486.194, que revela um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; a patente norte-americana n° 4.447.333, que divulga uma bomba de infusão de medição para fornecimento de medicação a uma taxa de infusão precisa; a patente norte-americana n° 4.447.224, que revela um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para fornecimento continuo de droga; a patente norte-americana n° 4.439.196, que revela um sistema de fornecimento osmótico de droga possuindo compartimentos de múltiplas câmaras; e a patente norte-americana n° 4.475.196, que revela um sistema de fornecimento osmótico de droga. Muitos outros desses implantes, sistemas de fornecimento, e módulos são conhecidos daqueles que são versados na técnica.

Em certas configurações, as moléculas inibidoras de angiogênese da invenção podem ser formuladas de forma a assegurar uma distribuição adequada in vivo. Por exemplo, a barreira de sangue cerebral (Blood-Brain Barrier - BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofilicos. Para assegurar que os compostos terapêuticos da invenção possam •36' • ♦ ·* · • ·· • * ·· • · · · ·· ········ · • · · ♦ • · · · · · · · • · · ·· ·· atravessar a BBB (se isso for deverão ser formulados, por exemplo, em liposomas. Para métodos de fabricação de liposomas, vide, por exemplo, as patentes norte-americanas de números

4.522.811; 5.374.548; e

5.399.331.

Os liposomas podem compreender uma ou mais

frações que são seletivamente transportadas para órgãos ou células específicas, dessa forma aperfeiçoando o fornecimento de drogas dirigido a alvos (vide, por exemplo,

V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). As frações exemplares de busca de alvo incluem folato ou biotina (vide, por exemplo a patente norte-americana n° 5.416.016 concedida a Low e outros); manosidas (Umezawa e outros, (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1088); anticorpos (P. G. Bloeman e outros (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais e outros (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína tensoativa A (Briscoe e outros (1995)

Am. J. Physiol. 1233:134), Diferentes espécies dos quais podem compreender as formulações da invenção, bem como componentes das moléculas inventadas; pl20 (Schreier e outros (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); vide igualmente K.

Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J.

Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

Killion; I.	J.
Em	uma
inibidoras	de
liposomas;	em

angiogênese da invenção uma configuração mais configuração da invenção, as moléculas são formuladas em preferencial, os liposomas incluem uma fração para alvo.

Em uma configuração mais preferencial, os compostos terapêuticos nos liposomas

são fornecidos por injeção de bolus para uma localização próxima à área desejada, por exemplo, a localização de um tumor. A composição deverá ser fluida para permitir uma utilização fácil de uma seringa. Ela deverá ser estável nas 5 condições de fabricação e armazenagem e deverá ser preservada contra a ação de contaminação de microorganismos tais como bactérias e fungos.

As dosagens eficientes e os regimes de dosagem para as moléculas inibidoras de angiogênese da invenção dependem 10 da doença ou condição a ser tratada e podem ser determinadas pelas pessoas versadas na técnica.

Uma dosagem terapeuticamente eficaz para terapia de tumores pode ser medida pelas respostas objetivas de tumores que podem alternativamente ser completas ou 15 parciais. Uma resposta completa (Complete Response - CR) é definida como a ausência clínica, radiológica ou outra prova de doença. Uma resposta parcial (Partial Response PR) resulta de uma redução do tamanho agregado do tumor acima de 50%. O tempo médio para progressão é uma medida 20 que caracteriza a durabilidade da resposta objetiva do tumor.

Uma dosagem terapeuticamente eficaz para terapia tumoral pode igualmente ser medida por sua capacidade para estabilizar o avanço da doença. A capacidade de um composto 25 para inibir o câncer pode ser avaliada em um sistema de modelo animal para previsão de eficácia em tumores humanos. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto

terapêutico pode reduzir o tamanho do tumor, ou melhorar de outra forma os sintomas em um paciente. Uma pessoa normalmente versada na técnica será capaz de determinar essas quantificações com base em fatores tais como o tamanho do paciente, a gravidade dos sintomas do paciente, e a composição ou via de administração específicas selecionadas.

Desta forma, aos pacientes tratados com composições de acordo com a invenção pode ser adicionalmente 10 administrado (anteriormente a, simultaneamente com, ou após a administração de uma molécula da invenção) um outro agente terapêutico, que aperfeiçoa ou aumenta o efeito terapêutico das moléculas de acordo com a invenção.

A invenção refere-se também adicionalmente ao uso dos compostos de acordo com a invenção para propósitos de diagnóstico. Podem por exemplo ser usados anticorpos marcados para localização de tumores no corpo. A marcação de anticorpos por meios radioativos, paramagnéticos ou outros é uma técnica bem conhecida na técnica.

Em uma configuração específica, a invenção proporciona métodos para diagnóstico de doenças associadas com JAM-C mediante detecção ex vivo ou in vitro de JAM-C em uma amostra, por exemplo, uma amostra de tecido, uma amostra de fluido corporal, ou uma amostra de células. Isto pode ser obtido, por exemplo, mediante contato de uma amostra a ser testada, opcionalmente juntamente com uma amostra de controle, com o anticorpo H33 ou um derivado ou

fragmento do mesmo em condições que permitem a formação de um complexo entre H33 e JAM-C. A formação do complexo pode ser detectada (por exemplo, por ELISA). Quando é utilizada uma amostra de controle juntamente com a amostra de teste, 5 o complexo pode ser detectado em ambas as amostras e qualquer diferença estatisticamente significativa na formação de complexos entre as amostras é indicativa da presença de JAM-C na amostra de teste.

A presente invenção será adicionalmente descrita

nos Exemplos que se	encontram a	seguir.	Estes	Exemplos	têm
propósitos meramente	ilustrativos e não	são	destinados a
limitar a invenção	de nenhuma	forma.	Nos	Exemplos	são
feitas referências às seguintes	figuras:
A Figura 1	mostra que	o JAM-C	é expressado	por

vasos sanguíneos em um tumor de fígado humano. A expressão de JAM-C foi analisada com um painel de tumores angiogênicos. Os produtos de transcrição que codificam JAMC humano não se encontram presentes no fígado normal. A imunomarcação de seções congeladas com anticorpo anti-JAM-C mostra a expressão de uma subpopulação de vasos sangüíneos (pontas de flecha). A marcação com um anticorpo policlonal contra PECAM-1 para visualização de estruturas vasculares é ilustrada no painel do lado direito e a característica angiogênica do tumor foi controlada por marcação com ανβ3 (detalhe).

A Figura 2 mostra que o JAM-C é recrutado em junções inter-endoteliais de HUVEC's mediante estimulação

VEGF.

(A)

os HUVEC's foram estimulados com VEGF-165 recombinante, fixados com formaldeido e a localização de

JAM-C foi visualizada com um anticorpo monoclonal anti-JAMC. Para controle foi realizada marcação de JAM-A. A molécula de JAM-C foi enriquecida em contatos célula-célula mediante estimulação VEGF-165 ao passo que não foi observado nenhum efeito com JAM-A. (B) A análise FACS revelou que o enriquecimento de JAM-C em contatos célulacélula foi devido à relocalização da molécula visto que o 10 nivel de expressão permaneceu inalterado após o tratamento

VEGF (linha fina, controle negativo; linha tracejada, células não tratadas; linha espessa, células tratadas com VEGF) .

A Figura 3 mostra que o anticorpo monoclonal anti15 JAM-C aboliu a angiogênese in vitro. Foram cultivados anéis aórticos de ratos entre duas camadas de Matrigel na presença ou ausência de anticorpos anti-JAM-C (50 gg/ml) e foi visualizada neovascularização após 12 dias. As fotografias são micrografias luminosas de micro-vasos de 20 anéis aórticos tratados ou não tratados (A, n=ll) representativos com anticorpos monoclonais H33 anti-JAM-C (B, n=ll) e D33 (C, n=6) ou anticorpo de controle de isotipo equiparado Mell4 (D, n=6). Somente ο H33 bloqueou a brotação angiogênica.

A Figura 4 demonstra que o anticorpo H33 anti-JAM-C reduziu o crescimento tumoral e a vascularização tumoral.

Ratos foram submetidos a injeção subcutânea de células

tumorais LLC1 e foram tratados a cada dois dias com antiJAM-C ou anticorpo de controle de isotipo equiparado (150 qg). (A) aparência macroscópica de tumores LLC1 com 12 dias de existência cultivados em ratos de controle (PBS e 5 anticorpo de controle de isotipo equiparado) ou em ratos tratados com anticorpo H33 anti-JAM-C. Os ratos tratados com anticorpo H33 anti-JAM-C apresentaram um crescimento reduzido de tumor conforme indicado pela medição de volume de tumor (B) e peso de tumor (C) . Os micro-vasos foram detectados por imunomarcação PECAM-1 (D) e foram quantificados por análise em computador (E).* p< 0,01. Cada barra representa o valor médio de dez animais testados ± sem.

A Figura 5 demonstra que o anticorpo H33 anti-JAM-C não é tóxico in vivo. Para assegurar que o efeito do anticorpo H33 anti-JAM-C sobre o crescimento tumoral não fosse devido a um efeito tóxico geral in vivo, os ratos foram tratados conforme foi descrito na Fig. 4 e os órgãos foram submetidos a dissecção e análise. Os rins destes 20 ratos marcados com ácido-Schiff periódico (Periodic AcidSchiff - PAS) não apresentaram quaisquer sinais de desenvolvimento de glomerulonefrite. Como controle, seções de rins de ratos NZBxBXSB com doença autoimune foram comparadas (Merino R. e outros, J Clin. Invest. 94(2):52125 5) 1994) . (B) a permeabilidade de vasos sangüineos in vivo foi avaliada mediante utilização do ensaio de permeabilidade de azul de Evans. O anticorpo H33 não

apresentava efeito sobre a permeabilidade vascular nos órgãos representativos, coração, pulmão, rim e cérebro. Cada barra representa o valor médio de sete animais testados ± sem.

A Figura 6 ilustra uma quantificação de glomérulos durante a revascularização de retinas. Os números de glomérulos foram contados para comparação de neovascularização retinal em ratos tratados com H33 e ratos tratados com anticorpo de controle. A redução do número de 10 glomérulos foi observada nos ratos tratados com H33 (13H33) em comparação com os ratos de controle (ctrl), dos ratos tratados com anticorpo de controle de isotipo equiparado (9B5). Isto indica um decréscimo de neovascularização de retinas em animais tratados com H33.

A Figura 7 mostra que o anticorpo H33 anti-JAM-C reduz o número de macrófagos em tumores. As crio-seções de tumores LLC1 de ratos tratados com PBS, anticorpo de controle ou H33 foram marcadas para fosfatase ácida para detecção de macrófagos (A, pontas de flecha). A densidade 20 de microvasos foi quantificada por contagem do número de macrófagos marcados por mm² dentro do tumor (B). Os tumores de animais tratados com H33 apresentam uma redução de infiltração de macrófagos em comparação com os animais de controle. Cada barra representa o valor médio ± SEM, obtido 25 de quatro seções de n ratos por grupo (PBS, n=6; anticorpo de controle, n=6; H33, n=9). ** p< 0,01. Escala das barras, (A) 160 mm, (B) 20 mm.

A

A Figura 8 mostra que o anticorpo H33 não afeta a proliferação nem a apoptose de células endoteliais. As células endoteliais (A) ou células de tumor LLC1 (B) foram semeadas em uma faixa desde l,25xl0⁴ até 5xl0⁴ células por recipiente e foram cultivadas na presença ou ausência de um de entre um anticorpo H33 ou um anticorpo de controle. A taxa de proliferação foi determinada mediante utilização de um ensaio MTT. 0 anticorpo H33 não influencia a proliferação de células endoteliais e tumorais. (C) as crio-seções de tumor LLC1 de ratos tratados com H33 ou com anticorpo de controle de isotipo equiparado foram imunomarcados para PECAM-1 (verde) e para células apoptóticas com marcação TUNEL (vermelho, pontas de flecha) . As células endoteliais não apresentam um aumento de apoptose quando os ratos foram tratados com anticorpo H33 em comparação com os controles. Em contraste, as células tumorais apresentam um aumento de apoptose conforme demostrado pela quantificação de células apoptóticas dentro do tumor (D).

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Preparação de uma população de anticorpos contra JAM-B ou

JAM-C

Uma população de anticorpos a serem testados no método de acordo com a invenção é preparada de acordo com

Kõhler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975). A fonte de antígeno para obtenção dessa população de anticorpos • · · ♦ i . ····

5··.···.:.:· • ··..· *· · • ·· ·· consiste em JAM-B ou JAM-C solúvel recombinante preparado conforme se encontra descrito no Exemplo 3.

EXEMPLO 2

Preparação de JAM-B e JAM-C solúvel

Foi descoberto pelos presentes inventores que o

JAM-C interage heterofilicamente com o JAM-B através de seu domínio V e que o domínio V do JAM-C solúvel é suficiente para ligação ao JAM-B.

JAM-B solúvel e o domínio V do JAM-C solúvel 10 foram obtidos por PCR usando a mesma estratégia de clonagem. Os iniciadores (primers) foram obtidos da empresa Microsynth (Microsynth GmbH, Balgach, Suíça), e os locais de restrição adicionados para a estratégia de clonagem foram sublinhados. O cDNA codificando o domínio V 15 extracelular do JAM-C foi amplificado mediante utilização de plasmídeo codificando a seqüência de extensão inteira de JAM-C murino, Pfu polimerase, T7 e (5' gctctagacagtgttgccgtcttgcctacag-3') como iniciadores de avanço e reverso. 0 produto de PCR foi digerido com HindIII 20 e Xbal anteriormente à clonagem em pcDNA3 contendo uma seqüência FLAG-tag.

O JAM-B solúvel é preparado da seguinte forma: o cDNA codificando JAM-B solúvel foi obtido por PCR utilizando (5'-tcagctaggcagcccagct-3') e (5'25 gctctagaatctacttgcattcgcttcc-3') como iniciadores de avanço e reverso. O produto de PCR digerido com Xbal foi então clonado em estrutura com a seqüência FLAG Tag em pcDNA3

5₍ utilizando localizações EcoRI/blunt e Xbal.

EXEMPLO 3

Teste de capacidade de prevenção de interação entre JAM-B e JAM-C

As células expressando alternativamente JAM-B ou

JAM-C em sua superfície são obtidas conforme descrito por Aurrand-Lions e outros, J Biol Chem 276:2733-41 (2001a);

Aurrand-Lions e outros, Blood 98:3699-707 (2001b); JohnsonLeger e outros, Blood 100:2479-2486 (2002).

O JAM-B e JAM-C solúveis obtidos conforme descrito no Exemplo 2 foram marcados com ésteres sulfosuccinimidílicos de Alexa 488 (Molecular Probes Inc.) ou sulfo-NHS-Biotina (Pierce) de acordo com os procedimentos dos fabricantes.

As células expressando JAM-B ou JAM-C foram feitas contatar o JAM-C ou JAM-B solúvel marcado, respectivamente na presença das moléculas a serem testadas. A fluorescência foi monitorada com citometria de fluxo e o decréscimo de intensidade de fluorescência em comparação com o controle não tratado indica um decréscimo de ligação de JAM-C solúvel ou JAM-B solúvel.

EXEMPLO 4

Teste de capacidade de bloqueio de angiogênese in vivo

Ratos com 7 dias pós-nascimento (P7) foram colocados em uma atmosfera com 75% de oxigênio durante cinco dias causando uma avascularização central das retinas (Reynolds e outros, Nature Medicine 8: 27-34 (2002)). Esta

• · · ······.:

incubação foi seguida pelo alojamento dos ratos durante mais cinco dias (até P17) em condições normóxicas. Os ratos foram sujeitados a injeção intraperitoneal de 50 qg de anticorpos monoclonais em P12, P14 e P16. A neovascularização foi detectada por perfusão da vasculatura inteira com uma solução não-difusível de fluoresceínadextran. Em áreas de montagem plana, foram detectadas áreas de neovascularização e glomérulos vasculares. Os glomérulos vasculares são agrupamentos muito proliferativos de vasos tortuosos que são produzidos em resposta a estímulos angiogênicos e se dispõem em protuberância através da membrana limitadora interna. Os números de glomérulos são contados para comparação de neovascularização retinal em ratos tratados com uma molécula a ser testada e em ratos de controle.

Uma das moléculas testadas foi o anticorpo monoclonal H33 que causou uma redução na neovascularização. EXEMPLO 5

O anticorpo monoclonal H33 dirigido contra JAM-C é um inibidor de angiogênese e crescimento tumoral

1. MATERIAIS E MÉTODOS

Anticorpos

Os anticorpos monoclonais de rato (CRAM) contra JAM-C humano e de rato (H33, H36 e D33) e anticorpos monoclonais de rato contra PECAM-1/CD31 de rato (GC51) e Lselectina/CD62L (Mell4) foram descritos anteriormente (Aurrand-Lions e outros, 2001a, supra; Gallatin e outros,

Nature 330:30-34 (1983); Piali e outros, Eur J Immunol.

23:2464-71 (1993); Springer e outros, Eur. J. Immunol.

9:301 (1971). O CD44 anti-humano (9B5) utilizado como rato de controle de anticorpo irrelevante IgG2a foi gentilmente fornecido pelo doutor B. Engelhardt (Laschinger e Engelhardt, 2000). Qualquer outro anticorpo não associado pode ser utilizado como controle negativo. O anticorpo policlonal contra JAM-B humano foi preparado de acordo com Palmeri e outros, J Biol Chem. 275:19139-45 (2000). A integrina ανβ3 (LM609) anti-humana de rato monoclonal foi obtida da empresa Chemicon (Temecula, CA).

Células endoteliais

Células Endoteliais de Veia Umbilical Humana (Human Umbilical Vein Endothelial Cells - HUVEC) foram isoladas por tratamento de colagenase de veias umbilicais (Wall RT e outros, J Cell Phislol. 96:203-213 (1978). As

HUVEC's foram mantidas em M199 suplementado com 20% de Soro Fetal de Bezerro (PAA Laboratories), 25 mM de HEPES (ácido N-2-hidróxietilpiperazina-N'-2-etanosulfônico), aminoácidos não essenciais, piruvato de sódio, suplemento de crescimento de células endoteliais (ECGS, 15 pg/mL; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) , e heparina (4 μρ/πιΐ; Sigma, Buchs, Suiça). As células foram utilizadas entre as passagens 3 e 5.

Estimulação VEGF l,10⁵ HUVEC's foram colocados em placa em Matrigel com Redução de Fator de Crescimento (Growth Factor Reduced • · · • ·· • ·· • ·· •· • · ··♦ ··· • · · ·· ·· • ···♦ • : .

Matrigel) (Becton Dickinson, Bedford, MA, USA) .

Após 48 horas, as células foram incubadas com 100 ng/ml de

VEGF-165 humano recombinante (PeproTech House, London UK) minutos (imunocitoquimica) ou entre 15 minutos durante 15 e 24 horas (citometria de fluxo).

Citometria de fluxo

As HUVEC's anti-JAM-C H36 em foram incubadas com anticorpo monoclonal gelo. Após a lavagem com PBS, a ligação

BSA de 0,2% do anticorpo H36 foi detectada utilizando um anticorpo anti-rato com acoplamento de ficoeritrina (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA). Como controle, o anticorpo primário foi omitido. A análise foi realizada utilizando Software Cellquest e FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA).

Imunorna reação

Para imunohistoquimica com anticorpo monoclonal anti-JAM-C (H36) e anticorpo policlonal contra JAM-B/VEJAM, as seções congeladas foram fixadas com acetona/metanol em 1:1 durante 5 minutos a -20° C, foram secadas e 20 reidratadas em PBS, Gelatina 0,2%, Tween 20 0,05%. Para imunocitoquimica, as células foram fixadas com paraformaldeido 4% em PBS durante 15 minutos anteriormente à permeabilização com TritonXlOO 0,01% em PBS durante 10 minutos. As células foram lavadas com PBS, BSA 0,2%, foram 25 incubadas com anticorpos primários durante uma hora e lavadas, anteriormente a uma incubação adicional com anticorpos secundários acoplados a Texas Red, FITC ou

peroxidase (Jackson Iimunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA). Foram obtidas imagens utilizando um microscópio confocal Zeiss LSM510. A glomerulonefrite foi detectada por marcação dos rins com ácido-Schiff periódico 5 (periodic acid-Schiff - PAS).

Ensaio de anel aórtico ex vivo

Foram realizados ensaios de anel aórtico de rato conforme descrito (Nicosia, R. F. & Ottinetti, In Vitro Cell Dev Biol. 26(2) :119-28 (1990) . Resumidamente, anéis aórticos torácicos de 1 mm foram colocados entre duas camadas de 50 μΐ de Matrigel de fator de crescimento reduzido (Becton Dickinson, Bedford, MA, USA) contendo opcionalmente um anticorpo a ser testado, e foram cobertos com 100 μΐ de DMEM suplementado com 2 0 U/ml de heparina 15 (Sigma-Aldrich Corporation, Saint-Louis, MO, USA) e ECGS (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA). O crescimento externo de micro-vasos foi visualizado por microscopia de fase utilizando um microscópio Zeiss Axioskop.

Enxerto de tumor

Ratos fêmeas C56BL6/J com idades entre 8 e 10 semanas (Charles River Laboratories, L'Arbresle, França) foram inoculados subcutaneamente com lxlO⁶ de células de carcinoma de pulmão Lewis murino (LLC1). Os ratos receberam 25 então uma injeção intraperitoneal a cada dois dias de 150 μg de anticorpo monoclonal H33, anticorpo de controle de isotipo equiparado Mell4 ou PBS. Quando os tumores de

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tinham alcançado controle (ratos injetados com PBS)

1-1,5 cm³ os animais foram sacrificados e os tumores foram extraídos e analisados.

Quantificação de vasos

As crio-seções de tumor foram marcadas com anticorpo monoclonal anti-PECAM-1 conforme descrito no

Capítulo de Imunomarcação. Foram obtidas imagens das crioseções inteiras (4 crio-seções por tumor) mediante utilização de um microscópio Zeiss Axioskop. A marcação de

PECAM-1 e a área total do tumor foram quantificadas mediante utilização do software Zeiss

Ensaio de permeabilidade de azul

KS400.

de Evans

150 μg de anticorpos anti-JAM-C ou anticorpos de controle de isotipo equiparado foram injetados na veia 15 retro-orbital de ratos anestesiados. Após 15 minutos, 100 μΐ de um corante azul Evans de 30 mg/kg (Sigma-Aldrich Corporation, Saint-Louis, MO, USA) em solução salina foram injetados da mesma forma que os anticorpos, e circularam durante uma hora. Os ratos foram então submetidos a 20 perfusão com paraformaldeído com tampão de citrato a 1%, pH 4,2, 37° C, para retirada do corante do lúmen dos vasos.

Imediatamente após a perfusão, os órgãos (rim, pulmão, coração e cérebro) foram dissecados. Após a secagem (SpeedVac) dos tecidos, foi medido o peso seco. O azul de Evans

25 foi	extraído	por incubação	subsequente	do tecido em 500	μΐ
de	formamida	durante 18	horas a 70°	C. 0 extrato	foi

centrifugado e a capacidade de absorção do sobrenadante foi

medida a 620 nm com um espectrofotômetro. A concentração de corante nos extratos foi calculada a partir de uma curva padrão de azul de Evans em formamida e normalizada para o peso do tecido seco.

Análise estatística

As contagens de densidade de vasos, volume de tumor e peso de tumor foram analisadas mediante utilização do teste t de Mann-Whitney. As análises foram computadas mediante utilização do software de estatística StatView 10 (Abacus Concepts Inc., Berkeley, CA, USA).

RESULTADOS

JAM-C é expressado por vasos tumorais e é receptivo a estímulos angiogênicos

Em um tumor angiogênico do fígado humano, o 15 anticorpo anti-JAM-C H36 marca vasos sanguíneos (Fig. 1) .

Em contraste, o produto de transcrição codificando JAM-C não se encontra presente no fígado normal. O tratamento de

HUVEC's com VEGF causa uma acumulação imediata e maciça de

JAM-C nos contatos célula-célula endoteliais no prazo de 15 20 minutos (Fig. 2A) . Esta breve aparição é o resultado da relocalização de JAM-C e o nível de expressão não é modificado por este tratamento (Fig. 2B). Os mesmos resultados foram observados com HUVEC's estimulados com

TNF-α ou trombina.

O crescimento externo de vasos in vitro é inibido pelo anticorpo monoclonal anti-JAM-C

A neovascularização in vitro foi realizada

utilizando ensaios de anel aórtico ex vivo. Aortas de rato recém-dissecadas foram cortadas em pequenos anéis e estes foram embebidos em Matrigel na presença ou ausência de anticorpos anti-JAM-C. O crescimento externo de vasos endoteliais dos anéis aórticos foi avaliado ao longo de um período de 12 dias, enquanto a presença dos anticorpos anti-JAM-C de controle ou dos anticorpos de isotipo equiparados não afetaram a brotação aórtica, o anticorpo anti-JAM-C H33 bloqueou totalmente a neovascularização (Fig. 3) .

O anticorpo monoclonal anti-JAM-C reduz o crescimento tumoral e a angiogênese in vivo

Dado que a angiogênese in vitro pode ser bloqueada com o anticorpo anti-JAM-C H33, os presentes autores

investigaram	se	este	anticorpo	tinha algum	efeito sobre
angiogênese	de	tumor	e crescimento de	tumor. Foram
administradas	a	ratos	inj eções	subcutâneas	de células de
carcinoma de	pulmão	Lewis.	Anticorpos	anti-JAM-C e
anticorpos	de	controle	foram então injetados

intraperitonealmente a cada dois dias. Os animais foram sacrificados guando os tumores de controle alcançaram 1-1,5 cm³ e os tumores foram extraídos. O tamanho de tumor (Fig. 4A), o volume (Fig. 4B) e o peso (Fig. 4C) tinham diminuído significativamente quando os ratos foram tratados com anticorpo anti-JAM-C H33 em comparação com o anticorpo de isotipo equiparado de controle ou PBS.

Na Figura 4A são ilustrados exemplos

representativos de tumores extraídos. As células de carcinoma de pulmão Lewis não expressam JAM-C (dados não exibidos). O efeito do anticorpo H33 no crescimento tumoral é devido à inibição da angiogênese. Para visualizar a vasculatura do tumor, crio-seções foram imunomarcadas com anticorpo contra o marcador endotelial PECAM-1 (Fig. 4D). A densidade de vasos sanguíneos foi quantificada mediante contagem da porcentagem de marcação PECAM-1 através da área do tumor (Fig. 4E) . O anticorpo H33 reduziu o número de vasos sanguíneos em tumores comparativamente aos controles.

O anticorpo monoclonal anti-JAM-C H33 não é tóxico in vivo

É sabido que os anticorpos podem ser tóxicos quando injetados in vivo. Para controlar o fato de o efeito observado do anticorpo anti-JAM-C H33 não ser devido a um efeito tóxico geral em ratos, foi investigado se os animais injetados com anticorpos desenvolviam patologias. Visto que o JAM-C é expressado pelo endotélio no rim foi em primeiro lugar analisado se o

Para esta finalidade anticorpo criaria glomerulonefrite.

seções de rim dos animais tratados foram marcadas com ácido-Schiff periódico.

detectada nenhuma acumulação anormal de proteínas nos glomérulos (Fig. 5A).

Na medida em que o JAM-C está envolvido no controle da permeabilidade vascular, foi igualmente testado se o anticorpo induziría vazamentos nos vasos sanguíneos.

Felizmente isto não ocorria no coração, pulmão, rim ou cérebro, que foram os órgãos representativos analisados

(Fig. 5B).

A redução do número de glomérulos foi observada nas retinas de ratos tratados com H33 em comparação com os ratos de controle (ctrl) ou ratos tratados com anticorpo de controle de isotipo equiparado. Isto indica um decréscimo da neovascularização das retinas em animais tratados com H33 (Fig. 6) .

EXEMPLO 6 anticorpo anti-JAM-C H33 reduz o número de macrófagos em tumores porém não afeta nem a proliferação nem a apoptose de células endoteliais

MATERIAIS E MÉTODOS

Histologia e quantificação de densidade de vasos, células apoptóticas e teores de macrófagos nos tumores

Para imunohistoquimica em crio-seções de tumor com anticorpo monoclonal anti-PECAM-1 (GC51), as seções foram fixadas com acetona/metanol a 1:1 durante 5 minutos a -20° C, foram secadas e hidratadas em PBS/Gelatina 0,2%/Tween 20 0,05%. As seções foram incubadas com anticorpo durante 1 hora à temperatura ambiente, e após 3 lavagens em PBS, foram incubadas com um anticorpo secundário acoplado a peroxidase (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA).

Para imunohistoquimica em seções de olho fixadas com paraformaldeído e embutidas em parafina com anticorpos policlonais contra PECAM-1 e JAM-C, as seções foram desengraxadas de acordo com o procedimento clássico. As seções de tecido foram então tratadas com H2O3 0,3% em metanol durante 10 minutos, lavadas em PBS e bloqueadas com

PBS/BSA 3%/Tween 20 0,1% durante 30 minutos. As seções foram incubadas com anticorpos policlonais durante 1 hora à temperatura ambiente, e após lavagens em PBS, foram incubadas com um sistema EnVision™ durante 30 minutos (DakoCytomation AG, Zg, Suíça).

A atividade de fosfatase ácida foi detectada em crio-seções de tumor mediante utilização do método 10 anteriormente descrito em (Kindler, V. e outros, Cell, 56: 731-740, 1989). A detecção de células apoptóticas em crioseções de tumor foi baseada na marcação de intervalos de feixes de DNA (método de TUNELfluorescence) e foi realizada mediante utilização de Transferase Terminal e biotina-1615 dUTP, de acordo com as instruções do fabricante (Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Suíça).

A biotina-16-dUTP ligada foi detectada com estreptavidina acoplada a corante Texas Red (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA).

Foram obtidas imagens mediante utilização de um microscópio confocal Zeiss LSM510 ou um microscópio Zeiss Axiophot 1 equipado com uma câmera digital CCD colorida Axiocam. As imagens foram registradas e tratadas utilizando o software AxioVision™ (Zeiss, Oberkochen, Alemanha).

Para quantificação do número de células positivas para fosfatase ácida (macrófagos) e do número de células positivas para TUNEL (células apoptóticas) nos tumores,

• · foram analisadas imagens da crio-seção inteira seções por tumor) utilizando os softwares Zeiss KS400 ou Openlab (Zeiss, Oberkochen, Alemanha).

Ensaio MTT para determinação de proliferação celular

O índice de proliferação de células endoteliais primárias murinas (LMEC) e células tumorais (LLC1) foi determinado por utilização do método MTT (3,(4,5— dimetiltiazol-2-il)2,5-difenil-tetrazólio brometo) conforme descrito em Hansen, MB e outros, J Immunol Methods, 119: 203-210, 1989. Resumidamente, as células foram dispostas em placas em triplicado em placas de 96 recipientes com densidades em uma faixa entre l,25xl0⁴ e lxlO⁵ de células por recipiente e foram cultivadas em mídia completa na presença ou ausência de 50 mg/ml de anticorpo anti-JAM-C H33 ou anticorpo de controle 9B5. Após 24 horas de cultura, 25 ml de solução de MTT (5 mg/ml em PBS estéril) foram adicionados a cada recipiente, e após 2 horas de incubação a 37° C, 100 ml do tampão de extração foram adicionados (20% peso/volume de SBS dissolvido em uma solução individual de DMF e água desmineralizada; o pH foi ajustado para 4,7 mediante adição de 2,5% de 80% de ácido acético e 2,5% de IN HC1). Após uma incubação durante a noite a 37° C as densidades óticas a 570 nm foram medidas mediante utilização de um leitor de micro-placa (Molecular Devices Corporation, CA, USA).

(4 crioRESULTADOS

O anticorpo anti-JAM-C H33 reduz o recrutamento de ·-

macrófagos para os tumores

A angiogênese de tumores é frequentemente acompanhada por uma inflamação e os macrófagos representam proeminentes células inflamatórias associadas aos tumores (Crowther, M e outros, J Leukoc Biol 70: 478-490, 2001). De fato, os macrófagos fatores angiogênicos condições hipóxicas participam na angiogênese segregando tal como VEGF, principalmente em (Murdoch, C e outros, Blood

104(8):2224-34, 2004). O JAM-C está implicado na adesão e transmigração de leucócitos através de células endoteliais e epiteliais

3937, 2004;

(Zen, K e outros, Mol Biol Cell 15:

Chavakis, T e outros, J

Biol Chem,

39262004;

Johnson-Leger, CA e outros,

Cunningham,

2000).

Foi afetaria o

Conforme se

Blood

100:

2479-2486,

2002,

SA e outros, J

Biol

Chem

275: 34750-34756, portanto investigado recrutamento de encontra ilustrado ratos tratados com anticorpo se macrófagos nas

H33 reduzido de macrófagos nos tumores ratos de controle. Isto indica que anticorpo H33 para tumores.

Figuras 7B e 7D, os apresentavam um teor em comparação com os o efeito do

H33 na angiogênese é mediado parcialmente através de sua ação no recrutamento de macrófagos.

O anticorpo anti-JAM-C proliferação de células endoteliais ou apoptose

A angiogênese é um processo complexo orquestrado pela proliferação e reorganização arquitetônica de células

endoteliais após

estímulos angiogênicos. Foi em primeiro lugar testado se o anticorpo H33 bloqueia a angiogênese mediante inibição de proliferação de células endoteliais in vitro, e não foram constatados efeitos (Figura 8A) . Para evitar qualquer consequência direta do tratamento com H33 na proliferação de células tumorais, o experimento foi igualmente realizado com células tumorais in vitro e não foram detectados quaisquer efeitos (Figura 8B).

Estes resultados indicaram que a redução de angiogênese observada após a administração de H33 não é causada por uma prevenção de crescimento celular tumoral ou vascular. A estimulação de apoptose seria uma outra explicação para a redução de angiogênese induzida pelo tratamento com H33. Esta hipótese foi testada em seções de tumor mediante identificação de apoptose por um protocolo de marcação convencional de células apoptóticas (TUNEL). Os resultados revelaram que o anticorpo H33 não tem consequências quanto a apoptose de células endoteliais in vivo e in vitro (Figura 8C e dados não ilustrados) .

Entretanto, as células tumorais apresentaram um aumento de marcação TUNEL in vivo, sugerindo que a apoptose ocorrería como conseqüência da redução de vascularização mediada pelo anticorpo (Figuras 8C e D).

Claims (6)

1. - REIVINDICAÇÕES -

   1. USO DE UMA MOLÉCULA INIBIDORA DE ANGIOGÊNESE, que consiste no anticorpo H33, produzido pelo hibridoma 13H33 conforme número de acesso de depósito DSM ACC2622, ou de um fragmento do mesmo que retêm a mesma especificidade que o anticorpo H33, referido fragmento sendo selecionado do grupo que consiste de Fab, scFv, Fv, dAbs ou VHS, caracterizado por ser dirigido à preparação de uma composição terapêutica para tratamento de câncer.
2. 2. USO DE UMA MOLÉCULA INIBIDORA DE ANGIOGÊNESE, que consiste no anticorpo H33, produzido pelo hibridoma 13H33 conforme número de acesso de depósito DSM ACC2622, ou de um fragmento do mesmo que retêm a mesma especificidade que o anticorpo H33, referido fragmento sendo selecionado do grupo que consiste de Fab, scFv, Fv, dAbs ou VHS, caracterizado por ser dirigido à preparação de uma composição terapêutica para tratamento de tumores sólidos.
3. 3. COMPOSIÇÃO TERAPÊUTICA PARA TRATAMENTO DE CÂNCER, particularmente para tratamento de tumores sólidos, caracterizada por compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo H33, produzido pelo hibridoma 13H33 conforme número de acesso de depósito DSM ACC2 622, ou de um fragmento do mesmo que retêm a mesma especificidade que o anticorpo H33, referido fragmento sendo selecionado do grupo que consiste de Fab, scFv, Fv, dAbs ou VHS, e um excipiente farmacologicamente aceitável

   Petição 870180065921, de 30/07/2018, pág. 6/13 ou veiculo.
4. 4. USO DO ANTICORPO H33, PRODUZIDO PELO HIBRIDOMA

   13H33, conforme depositado em 22 de outubro de 2003 sob o número de acesso de depósito DSM ACC2622, caracterizado por
5. 5 ser dirigido à preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de tumores sólidos.

   5. COMPOSIÇÃO TERAPÊUTICA PARA TRATAMENTO DE

   CÂNCER, particularmente para tratamento de tumores sólidos, caracterizada por compreender uma quantidade
6. 10 terapeuticamente eficaz do anticorpo H33, produzido pelo hibridoma 13H33, conforme depositado em 22 de outubro de

   2003 sob o número de acesso de depósito DSM ACC2 622, e um excipiente farmacologicamente aceitável ou veículo.

   Petição 870180065921, de 30/07/2018, pág. 7/13 • β ·