JP2004507210A - 血管形成の調整における、内皮細胞表面レセプター活性の調節 - Google Patents

血管形成の調整における、内皮細胞表面レセプター活性の調節 Download PDF

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Abstract

脊椎動物被処置体における血管形成を調節する方法であり、該方法は脊椎動物対象に、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を調節する量の組成物を投与し、それにより脊椎動物対象内のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と組成物とを接触させる；そしてＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と組成物との接触によって血管形成を調節することを含む。所望により、該組成物はＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と優勢に結合するモノクローナル抗体を含む。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１のモジュレーターのスクリーニング法も記載される。

Description

【０００１】
関連特許
本出願は、その全体を出展明示により本明細書に包含させる、１９９８年９月１０日出願の、同時係属米国特許出願０９／１５２，１６０の一部係属出願である。
【０００２】
助成申請
この仕事は、ＮＩＨ認可ＤＫ３８５１７およびＣＡ６８４８５により援助された。米国特許は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、内皮細胞増殖および移動の調整および血管形成の調整における、内皮細胞表面レセプターの活性の調節に関する。より具体的に、本発明は、内皮細胞増殖および移動の調整および血管形成の調整における、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性の調節に関する。
【０００４】
発明の背景
本明細書で使用する限り、“血管形成”は、組織または臓器内への心血管の発生を意味する。正常な生理学的条件下で、ヒトまたは動物は、非常に特異的に限定された状況でのみ血管形成をする。例えば、血管形成は、創傷治癒、胎児および胚発育および黄体、子宮内膜および胎盤の形成において通常観察される。用語“内皮”なる用語は、漿膜洞（ｓｅｒｏｕｓ ｃａｖｉｔｉｅｓ）、リンパ節および血管を裏打ちする平らな上皮細胞の薄層を意味する。“内皮調節活性”は、分子が血管形成全般および、例えば、培養における内皮細胞の成長を調節する能力を意味する。
【０００５】
制御および非制御の両方の血管形成は、同じ工程で起こると考えられる。基底膜により囲まれる内皮細胞および周皮細胞は毛細血管を形成する。血管形成は、内皮細胞および白血球により放出される酵素による基底膜の侵食により開始する。血管の管腔に並ぶ内皮細胞は、次いで基底膜を通して押し出される。血管形成性刺激剤は、内皮細胞が侵食基底膜を通って移動することを誘導する。移動細胞は親血管から離れて“新芽”を形成し、そこで内皮細胞は有糸分裂を受け、増殖する。内皮新芽は互いに融合し、毛細血管ループを形成し、新規血管を創生する。
【０００６】
持続性の、非制御血管形成が多くの疾患状態で起こり、内皮細胞による異常成長および病理学的損傷のサポートがこれらの状態で見られる。非制御血管形成が存在する多様な疾患状態が、血管形成依存性または血管形成関連として一緒にグループ化されている。
【０００７】
血管形成が癌の転移に主要な役割を担うことも認識されている。血管形成活性を抑圧または排除できた場合、腫瘍は、存在しても、増殖しない。疾患状態において、血管形成の予防は、新規微小血管系の進入によりもたらされる損傷を避けるであろう。血管形成工程のコントロールを指向した治療は、これらの疾患の排除または軽減を導き得るであろう。
【０００８】
腎糸球体毛細血管の増殖は、解剖学的に分離され、一次的に行なわれる。この工程は、内皮先祖の隣接間葉からの集積、樹状分枝ネットワークの構築、および間葉および内臓上皮細胞に隣接する内皮細胞への成熟および分化が関与する。細胞外マトリックス成分、細胞表面分子および成長因子に対するレセプターが、この集合工程における段階を介在する役割を与えられている。例えば、Ｗａｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｓｃ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈ ３９：２６１−２８４ （１９９７）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ５３：８２６−８３５ （１９９８）参照。
【０００９】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、それがＳステージ発育糸球上皮細胞に誘導され、および隣接後腎間葉から集積される内皮先祖が、ＶＥＧＦレセプター、ｆｌｋ−１を発現するため、重要である。Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７１：Ｆ７４４−Ｆ７５３ （１９９６）。
【００１０】
中和ＶＥＧＦ抗体は、産後マウス腎糸球体毛細血管の発育を中断する。Ｋｉｔａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９９：２３５１−２３５７ （１９９７）。マウスでのＰＤＧＦβレセプターまたはＰＤＧＦβ遺伝子のいずれかの欠失は、間葉細胞前駆体の不完全な集積をもたらし、腎糸球体発育の失敗が伴う。Ｓｏｒｉａｎｏ、Ｐ．、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ８：１８８８−１８９６ （１９９４）；Ｌｅｖｅｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ８：１８７５−１８８７ （１９９４）。ＴＧＦβ１発現およびタイプＩＩ　ＴＧＦβレセプターは、（腎臓発育前の）胚卵黄嚢における血管発育に重要であり、タイプＩＩレセプターは、ウシ腎糸球体由来の内皮細胞のインビトロ毛細血管形態形成を介在する。Ｃｈｏｉｍｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：２１１４４−２１１５０ （１９９５）。
【００１１】
初期の証拠は、Ｅｐｈファミリーレセプターおよびそのエフリンリガンドが、腎糸球体血管発育に関与することを示唆する。ＥｐｈＢ１レセプターは、単離間葉性細胞を、ｆｌｋ−１と類似のパターンで発現し、高レベルのエフリン−Ｂ１の発現が、発達腎糸球体の血管裂け目、ならびに成熟腎糸球体の毛細血管内皮細胞に見られる。Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ５０：Ｓ−７３−Ｓ−８１ （１９９６）。エフリン−Ｂ１のオリゴマー形は、ヒト腎臓微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）の、毛細血管様構造へのインビトロ凝集を刺激する。Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １２：６６７−６７８ （１９９８）。
【００１２】
ＤＰＴＰ１０Ｄを含むレセプターチロシンホスファターゼの選択されたサブクラスは、軸索移動および神経ネットワーク凝集における重要な役割を担う。Ｄｅｓａｉ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ８４：５９９−６０９ （１９９６）。近年のデータは、哺乳類腎臓における動脈部位における、関連レセプターホスファターゼ、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１のｍＲＮＡ発現を同定している。Ｂｏｒｇｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７９：５７０−５８０ （１９９６）。今日まで、しかし、微小血管、腎糸球体毛細血管凝集または成熟にレセプターチロシンホスファターゼが関与するという証拠はない。
【００１３】
血管内皮細胞は、種々の範囲の血管床特異的特性を示すが（Ｇｕｍｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ Ｖｅｓｓｅｌｓ ２４：１１−１３ （１９８７））、まだ、連続的、抗血栓症単層裏打ちを維持するための必要性が、その増殖、移動および分化が、内皮間接触により制御される正確な必要性を血管スペースに課す。分化した細胞間接触は、相互作用している内皮細胞の中の連絡を可能にするが（Ｌａｍｐｕｇｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２９：２０３−２１７ （１９９５））、内皮間接触に応答して増殖および移動の阻止を制御する機構は、解明されていない。内皮細胞間接触により課せられる増殖における密接な調節性制御が、既存血管における内皮細胞の中の下部基底有糸分裂指数に見られる。Ｅｎｇｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １７：７３８−７４４ （１９６７）。これは、大血管の機械的分裂により喚起される増殖性内皮応答とコントロール的である。Ｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｐａｔｈｏ １７２：２８７−２９２ （１９９４）。類似の増殖および移動応答は、コンフルエントな内皮細胞単層の辺縁で、“創傷”、または固まった単層からの物理的除去細胞により刺激される。Ｃｏｏｍｂｅｒ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５２：２８９−２９６ （１９９３）。
【００１４】
移動および増殖応答における、内皮間接触の効果の分子的基礎は定義されていないが、培養細胞の研究は、内皮、線維芽細胞、および上皮細胞生育が、予定された密度でコンフルエントまで増殖し、ついで増殖を停止することを示している（密度停止）。Ａｕｇｅｎｌｉｃｈｔ ａｎｄ Ｂａｓｅｒｇａ、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ８９：２５５−２６２ （１９７４）；Ｂｅｅｋｈｕｉｚｅｎ ａｎｄ ｖａｎ Ｆｕｒｔｈ、Ｊ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓ ３１：２３０−２３９ （１９９４）；Ｒｉｊｋｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １５４：３９３−４０１ （１９９３）。この現象は、血管のその場所における内皮細胞の行動と非常に関連する。実際、内皮“創傷”のモデル培養系は、課せられた“創傷部位”の端の内皮細胞が、急速に薄層を広げ、広がり、移動し、増殖して単層の機械的分裂により作られた欠失を置きかえることを示す。Ｃｏｏｍｂｅｒ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５２：２８９−２９６ （１９９３）。
【００１５】
ＰａｌｌｅｎおよびＴｏｎｇは、培養Ｓｗｉｓｓ　３Ｔ３細胞から回収した膜関連チロシンホスファターゼ活性が、細胞密度が５×１０４／ｃｍ２に近づくに連れて８倍（活性／ｍｇタンパク質で示して）上昇するが、可溶性フラクションチロシンホスファターゼは、細胞密度に影響されないことを観察した。Ｐａｌｌｅｎ ａｎｄ Ｔｏｎｇ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：６９９６−７０００ （１９９１）。Ｏｓｔｍａらは、ＨｅＬａ細胞からクローン化され、ＤＥＰ−１と名付けられたレセプターチロシンホスファターゼの発生量が、細胞が高密度に近づくに連れ増加することを測定した。Ｏｓｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：９６８０−９６８４ （１９９４）。しかし、増殖停止およびレセプターチロシンホスファターゼを喚起する分子間の関連は作られていない。
【００１６】
今日まで、入手可能な情報は、どの種のレセプター−リガンド相互作用が、細胞表面が密度または接触停止のためのシグナルを作るようにするか示していない。このようなレセプター−リガンド相互作用の同定は、密度または接触停止、または密度または接触停止の防止が治療的価値を有する疾患における介入のためのベースとして働き得るという点で必要である。このような疾患は、腫瘍増殖に関連する血管形成のような、望ましくない血管形成により特徴付けられる。したがって、また必要なのは、血管の望ましくない、特に腫瘍中への臓側を阻害できる組成物および方法である。組成物および方法は、腫瘍中の毛細血管の形成を弱め、それにより腫瘍の増殖を阻害するべきである。
【００１７】
発明の要約
本発明により、脊椎を有する対象における血管形成を調節する方法を提供する。方法は、脊椎を有する対象に、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性調節量の組成物を投与し、それにより脊椎を有する対象内のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１が組成物により接触される；そして血管形成を、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と組成物の接触を介して調節することを含む。
【００１８】
本発明により、脊椎を有する対象における内皮細胞移動および増殖を調節する方法も提供される。方法は、脊椎を有する対象にＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性−調節量の組成物を投与し、それにより脊椎を有する対象内のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１が組成物により接触される；そして内皮細胞移動および増殖を、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と組成物の接触を介して調節することを含む。
【００１９】
本発明により、優勢的にＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を結合する抗体が提供される。所望により、抗体は優勢的にＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を結合する、モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントまたは誘導体を含む。
【００２０】
本発明により、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の内因性リガンドを単離する方法も提供される。方法は、リガンドを有する細胞または細胞溶解物をＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と接触させる；そして、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を結合するリガンドを単離することを含む。
【００２１】
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１生物学的活性を調節する能力を有する候補物質をスクリーニングする方法も記載される。方法は、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドまたはそれらのフラグメント含む試験サンプルを確立させる；候補物質を試験サンプルに投与する；および候補物質の試験サンプルにおける相互作用、効果またはそれらの組合せを測定し、それにより候補物質がＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１生物学的活性を調節する能力を測定することを含む。
【００２２】
本発明により、細胞ベースおよび無細胞アッセイの両方での、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の活性を調節する化合物のスクリーニングを行なう方法も提供される。細胞ベースアッセイにおいて、方法は、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を発現する細胞の複製試験およびコントロール培養を確立する；候補化合物を試験培養中の細胞に投与するが、コントロール培養にはしない；試験およびコントロール培養における細胞のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を測定する；そして、候補化合物が細胞におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を調節するか、試験培養で測定したＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性が、コントロール培養で測定したＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性より大きいか小さいかどうか、測定することを含む。
【００２３】
無細胞系において、方法は、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１およびリガンドを含むコントロール系を確立する（ここでＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１は、リガンドに結合できる）；ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１、リガンド、および候補化合物を含む試験系を確立する；コントロール系および試験系におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１およびリガンドの結合親和性を測定する；そして、候補化合物がＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を無細胞系で調節するか、試験系で測定した結合親和性が、コントロール系で測定した結合親和性より大きいか小さいかどうか、測定することを含む。
【００２４】
他の態様において、本発明のスクリーニングアッセイ法は、候補化合物が、外因性ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を発現する細胞の増殖を、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を発現しないものと比較して阻害するかの比較に関し、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を変える効果が、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を発現しない細胞における候補化合物の活性の欠失を証明することにより信頼できることを測定する。したがって、本発明のスクリーニングアッセイは、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性における変化に応答する増殖の変化を示す。
【００２５】
本発明により、組織が、望ましくない内皮細胞増殖をしているとして特徴付けられる、患者における組織に治療的組成物を送達するための方法を提供する。方法は、患者に、選択した治療剤に操作可能に連結した生物学的有効量の抗体を導入し、抗体は優勢的に内皮細胞の表面のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１に結合し、それにより、脊椎を有する対象内のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１は抗体により接触される；そして、治療的組成物を、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と組成物の接触を介して組織に送達することを含む。
【００２６】
したがって、本発明の目的は、増殖および生存のための細胞表面に産生されるシグナルを介在するレセプター−リガンド相互作用の局在化および特徴付けである。
【００２７】
本発明の他の目的は、増殖および生存のための細胞表面に産生されるシグナルを介在するための、内皮細胞における細胞表面レセプター活性の調節を提供することである。
【００２８】
本発明の更なる目的は、血管形成の阻害または刺激に使用するための、細胞表面レセプター活性の調節を手強することである。
【００２９】
本発明の更に別の目的は、密度または接触停止のために細胞表面に産生されるシグナルを介在するレセプター−リガンド相互作用を調節する化合物を同定することである。
【００３０】
本発明のいくつかの態様および目的は上に記載しているが、他の態様および目的は、下記の付随する最良の図面および実施例と関連して取った場合、続く記載により明らかとなるであろう。
【００３１】
図面の簡単な説明
図１Ａは、抗体ＥＣＲＴＰＡｂ−１およびＥＣＲＴＰＡｂ−２による、組換えおよび過発現ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の認識を描記し、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の細胞外（Ｅｃ）または細胞質（Ｃｙ）ドメインを表す組換えタンパク質が細菌内で発現され精製されたことを描記するオートラジオグラフである。示すように、タンパク質（１００ｎｇ）を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、モノクローナル抗体ＥＣＲＴＰＡｂ−１またはＥＣＲＴＰＡｂ−２とプローブした。
【００３２】
図１Ｂは、抗体ＥＣＲＴＰＡｂ−１　＆　ＥＣＲＴＰＡｂ−２による、組換えおよび過発現ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の認識を描記し、１００ｍｍ皿で培養されたＭＤＣＫ細胞を１４μｇの空ｐＳＲａベクター（ＳＲａ）またはｐＳＲａ−ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１／ＨＡ（ＳＲａ−ＥＣＲＴＰ／ＨＡ）発現構築物でトランスフェクトし、トランスフェクション４８時間後に回収するオートラジオグラフを描記する。示すように、膜レセプタータンパク質をＷＧＡレクチン−接合アガロースにより、１５０μｇの溶解タンパク質から回収した。レクチン−吸着、溶出タンパク質を７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ＰＶＤＦ膜に移し、ＥＣＲＴＰＡｂ−１、ＥＣＲＴＰＡｂ−２、または抗−ＨＡ（ＨＡＡｂ）モノクローナル抗体とプローブした。
【００３３】
図１Ｃは、ｐＳＲａ−ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１／ＨＡプラスミドに安定にトランスフェクトされたＭＤＣＫ細胞を冷メタノールで固定し、ＥＣＲＴＰＡｂ−２（パネルａ、ｃ＆ｄ）またはクラス適合コントロール抗体（パネルｂ）で染色したことを記載する一連の写真である。ＥＣＲＴＰＡｂ−２は、接触に際し細胞の側面縁を標識する。ＥＣＲＴＰＡｂ−２の５０μｇの組換え免疫原（Ｅｃ）とのプレインキュベーションはこの染色を遮断するが（パネルｃ）、無関係組換えタンパク質（Ｃｙ）はしなかった（パネルｄ）。
【００３４】
図２Ａ−２Ｅは、成人腎臓の内皮細胞におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の発生量を記載する写真である。方法に記載のように、ヒト腎臓のアセトン固定凍結セクション（５μｍ厚）を、ＥＣＲＴＰＡｂ−１（パネルＡ−Ｄ）またはクラス適合コントロールモノクローナル抗体（パネルＥ）とインキュベートし、結合抗体を、エピフルオレッセンス（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡により検出した。ＥＣＲＴＰＡｂ−１は顕著に腎糸球体、管周（ｐｅｒｉｔｕｂｕｌａｒ）および内皮細胞で標識された。倍率はＡ）×１００；Ｂ）×６００；Ｃ）×６００；Ｄ×４００；およびＥ）×１００であった。
【００３５】
図３は、ヒト腎臓脈管構造におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１およびＶＥカドヘリンの共焦点局在性を示す。アセトンで固定した腎臓切片を、ＥＣＲＴＰＡｂ−１およびＶＥカドヘリンに対するポリクローナルヤギ抗体で同時標識した。結合した抗体を、フルオレセイン結合抗マウスＩｇ抗体（パネルＡ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）、またはローダミン結合抗ヤギＩｇ抗体（パネルＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）で検出した。ＥＣＲＴＰＡｂ−１（緑色）染色は大動脈および糸球体毛細血管の内皮膜全体に分布し（Ａ、Ｂ）、一方、ＶＥカドヘリン標識（赤色）は内皮接合部に限定されていた（Ｃ、Ｄ）。重複する共焦点画像が、内皮接合部の内側でＥＣＲＴＰがＶＥカドヘリンと共存することが証明された（倍率６００倍）。
【００３６】
図４は、発達中のマウス糸球体におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の発現を示す一連の写真である。胎児期１４日（Ａ）、１６日（Ｂ）、出生後６日（Ｃ）、および成体マウス（Ｄ）のクリオスタット腎臓切片を、実施例１の方法に記載したようにＥＣＲＴＰＡｂ−１で免疫標識した。パネルＡとＢは、ＥＣＲＴＰＡｂ−１が間葉性領域で分散した細胞と結合し（矢印）、コンマ型の糸球体の血管の裂け目ヘ移動する内皮前駆細胞（矢印）と結合し、さらに毛細血管段階の糸球体内皮（Ｇ）と結合する。パネルＣとＤは、成熟した腎臓内でＥＣＲＴＰＡｂ−１が糸球体（Ｇ）、動脈（Ａ）、および管周毛細血管（矢印）の内皮を選択的に標識している。（元の倍率；Ａ）４００倍；Ｂ）２００倍；Ｃ）２００倍；およびＤ）３５０倍）。
【００３７】
図５Ａは、ヒト内皮培養細胞におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の内皮内部の接触の分布を示すが、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１はＶＥカドヘリンと共に接合部から分離せず、メタノールで固定したＨＲＭＥＣ細胞が実施例１の方法で記載したようにＥＣＲＴＰＡｂ−２で標識されることを示す一連の写真である。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１は内皮膜内部の接点と、連続する共焦点画像内の頂端膜の小さな斑点のある領域との間に分布している。
【００３８】
図５Ｂは、ヒト内皮細胞における内皮間接触のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の分布を示すが、ＥＣＲＴＰＣＥ／ＤＥＰ−１はカドヘリンとの接合点から解離せず、ＨＭＥＣ−１細胞をコンフルエントまで増殖させ、その後固定化する前に５ｍＭ　ＥＧＴＡを含有する中膜で０分間（パネルａおよびｃ）または２０分間（パネルｂおよびｄ）インキュベートしたものを示す一連の写真である。ＥＣＲＴＰＡｂ−２およびＶＥカドヘリン標識の分布は時間ごとに実施例１の方法に記載されたようにして調べた。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１免疫活性の分布はＣａ２＋の低い培地内で変わらなかったが、接合部のＶＥカドヘリンの染色は散逸し、ＶＥカドヘリン接合部の解離と細胞膜を横切る再分布が一致した。
【００３９】
図６Ａは、細胞内皮密度が増殖停止を強要し、レクチンの回復可能なチロシンホスファターゼ活性を増加させることを示し、同一数のヒト腎臓微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を、直径１００ｍｍ（１倍）、６０ｍｍ（２．９倍）または３５ｍｍ（８．１倍）のプラスチック皿の増殖培地で培養し、培養時点の細胞密度に指示した襞の違いを与えたことを示す線グラフである。培地は矢印で示した時点で増殖培地と交換した。細胞はＣｏｕｌｔｅｒカウンターで計数し、サンプルは４反復で示している。細胞の増殖は単一細胞の倍加後８．１倍の密度、および培養細胞の約３回の倍加後２．９倍の密度で停止した。
【００４０】
図６Ｂは、内皮細胞密度が成長停止をさせ、レクチン復元可能チロシンホスファターゼ活性を示し、同数のヒト腎臓微小血管内皮細胞（ＨＲＭＣ）を増殖培地に１００（１×）、６０（２．９×）または３５（８．１×）ｍｍ直径プラスチック皿に真樹。プレーティングの時に細胞密度における示す倍数の影響を示す線グラフである。培地を矢印で示す時点で増殖培地と変えた。細胞はＣｏｕｌｔｅｒカウンターで計数し、サンプルは４反復で示している。細胞の増殖は単一細胞の倍加後８．１倍の密度、および培養細胞の約３回の倍加後２．９倍の密度で停止した。
【００４１】
図７は、増加した細胞密度が免疫沈降するＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の活性（量ではない）を増加させることを示す放射能写真および棒グラフである。同一数のＨＲＭＥＣを図６のように示された細胞密度で培養した。実施例２の方法に記載したように３６時間培養した後、単一特異性アフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体を用いて、１ｍＭペルオキシバナジン（＋ＶＯ４）または溶媒（−ＶＯ４）で１０分間処理した細胞から直ちにＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を免疫沈降させた。回収したＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１抗原を単一特異的抗体を用いた免疫ブロットにより定量化し、その内因性ホスホチロシン含量を４Ｇ１０モノクローナル抗体を用いたホスホチロシン免疫ブロットにより評価した。免疫沈降した試料中のホスファターゼ活性を、ｐＮＰＰを基質として用いて記載したようにオルトバナジンナトリウムが存在する場合（＋ＶＯ４）と存在しない場合（−ＶＯ４）で評価した。データは生成物の光学濃度を３反復のサンプル＋／−標準誤差で示している。
【００４２】
図８Ａは、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の過剰発現、またはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１、ＥＣＲＴＰＡｂ−１に対する二価の抗体がＨＲＭＥＣを増殖停止させることを示し、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１　ｃＤＮＡを持つＨＭＲＥＣの一時的感染が低い細胞密度で増殖を阻害させることを示すグラフである。示されたように１．７μｇ　ｐＳＲα（ベクターコントロール）またはＨＡエピトープタグをつけた（血球凝集素）ｐＳＲα−ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１（ｐＳＲα−ＥＣＴＲＰ）、および、実施例２の方法に記載したように感染した細胞のＢｒｄＵ標識を数えるために、０．４μｇ　ｐＥＧＥＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でおよそ３×１０５のＨＲＭＥＣを同時感染させた。２４時間で感染した細胞は再び示された数でｐ３５培養皿に戻された。３６時間後、Ｓ期の細胞を実施例２の方法に記載したようにＢｒｄＵで３０分間標識し、＋ＧＦＰ陽性細胞をＢｒｄＵの組み込みについて数えた。示しされたデータは４反復の測定値についての平均値＋／−標準誤差を表す。
【００４３】
図８Ｂは、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１過発現、またはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１に対する２価抗体、ＥＣＲＴＰＡｂ−１がＨＲＭＥＣの増殖を停止させることを四名ｓ、ＥＣＲＴＰＡｂ−１が内皮の増殖および移動を阻害することを示す線グラフである。ＨＲＭＥＣ（３×１０４）を０時点としてｐ３５培養皿に入れた。２４時間で増殖培地を交換し、細胞を計数し、ＩｇＧコントロール物（１０μｇ／ｍｌ）かまたはＥＣＲＴＰＡｂ１（１０μｇ／ｍｌ）のいずれかの抗体を加えた。細胞の複製試料（５）を４日目に計数し、平均値＋／−標準誤差で表した。
【００４４】
図８Ｃは、０時点で同数のＨＲＭＥＣを培養し、示された濃度で抗体またはＦａｂフラグメントを加えた場合のデータポイントプロットである。反復プレートを１日目に回収して各条件でプレーティング効率が一様かどうかを確認し、６日目に細胞の増殖をそれぞれ評価した。データポイントは５反復の平均値＋／−標準誤差値を表す。
【００４５】
図９Ａは、ＥＣＲＴＰＡｂ−１による内皮移動の阻害を示し、ＨＲＭＥＣ単層が、示されたように、一時的にプラスミドｐＳＲαＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１／ＨＡまたはｐＳＲαＥｐｈＢ１／ＨＡに感染したことを示す一連の写真である。４８時間後、密集単層に“創傷”を作り、確実である３０時間かけて塞がらせた。その後単層をモノクローナル血球凝集素抗体１２ＣＡ５で染色し、高レベルのＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１／ＨＡまたはＥｐｈＢ１／ＨＡを一時的に発現する細胞の位置をそれぞれ検出した。唯一ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１過剰発現細胞だけが稀に移動して“創傷”を塞いだ。
【００４６】
図９Ｂは、ＥＣＲＴＰＡｂ−１による内皮移動の阻害を示し、クラス適合ＩｇＧコントロール（ＩｇＧ、１０μｇ／ｍｌ）、ＥＣＲＴＰＡｂ１（１０μｇ／ｍｌ）、またはＥＣＲＴＰＡｂ１（３μｇ／ｍｌ、モル濃度は同じ）のＦａｂフラグメントが含む示された抗体またはフラグメントの存在下、無添加（ＮＡ）またはホルボールミリステートアセテート（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した血清フリーの培地に交換する０時にＨＲＭＥＣ密集単層に作られた直径３００〜４２０μｍの“創傷”の分析を示す線グラフである。３反復の創傷を用いて示された時間に顕微鏡画像をなし、Ｂｉｏｑｕａｎｔ画像解析ソフトを用いて自動的取り込み手順により、残りの“創傷”部位を算定してはじめの創傷の分数として表している。各データポイントは３回の測定値の平均値＋／−標準誤差を表す。
【００４７】
図９Ｃは、図９Ｂと同様のアッセイ手順で得られたデータを解析した線グラフである。同じアッセイ手順を用いて、３の独立した時点でＩｇＧコントロール、ＥＣＲＴＰＡｂ１、またはＥＣＲＴＰＡｂ１／Ｆａｂに曝した細胞において測定した平均値の直線回帰により移動率を計算した。ｒ２値はプロットした各データポイントについて０．９０以上であった。白四角（□）は刺激を受けない細胞の閉塞に対する移動率を示す。
【００４８】
図１０は、ＥＣＲＴＰＡｂ１　Ｆａｂフラグメントが内皮密度により媒介される増殖停止を減衰することを示す線グラフである。示された数のＨＭＥＣ−１細胞を、１２ウェルディッシュ中のカバーガラス上の、無添加（ＮＡ）またはＥＣＲＴＰＡｂ１（６７ｎＭ）添加増殖培地中に０時点としてプレーティングした。２４時間後、ＢｒｄＵ染色を実施例２の方法に記載したようにアッセイし、各条件について５つの独立した視野を計数することでＢｒｄＵ陽性細胞の割合％を得た（４００細胞／ポイント以上）。データは平均値＋／−標準誤差を表す。
【００４９】
図１１は、ＥＣＲＴＰＡｂ１がｂＦＧＦに応答する角膜ポケット血管形成を阻害することを示す一連の写真である。ヒドロンペレットに、血管形成刺激剤、塩基性ＦＧＦ（９０ｎｇ）を単独で、またはクラスの適合するコントロールモノクローナル抗体（ＩｇＧ、２００ｍｇ）あるいはＥＣＲＴＰＡｂ１（２００ｎｇ）を含浸させ、麻酔をかけたマウスの角膜内皮に作ったポケットに置いた。注入から５日後、血管形成応答を評価し、撮影した。代表的な例はＥＣＲＴＰＡｂ１の封入が埋殖されたペレット周辺の増殖ゾーンを阻害することを示している。
【００５０】
図１２は、ＥＣＲＴＰＡｂ−１が、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の外部領域ペプチド配列ＱＳＲＤＴＥＶＬに結合することを示すオートラジオグラフである。“紙上のペプチド”（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， Ａｌａｂａｍａ）アレイを、ＥＣＲＴＰＡｂ−１が結合するＥＣＲＴＰの３５１アミノ酸配列を使用して産生した。アレイは、重複配列の全領域に伸びる８−１０アミノ酸の９６ペプチドを含む。このシリーズにおける単一ペプチド配列（＃４１）は、ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃにアミノ酸残基を示す。
【００５１】
図１３Ａは、ＥＣＲＴＰＡＢ−１が、野生型ＥＣＲＴＰを発現するＣＨＯ細胞では、ＥＣＲＴＰの脱リン酸化を促進し生育を停止させるが、変異ＥＣＲＴＰタンパク質、Ｃ／Ｓ（触媒的不活性点変異体）またはｃｙ（細胞質ドメイン欠失）ではしないことを示すグラフである。ＣＨＯ細胞を、２４時間、ＥＣＲＴＰＡｂ−１、ＥＣＲＴＰＡｂ−１−ＦａｂまたはコントロールＩｇＧ１の存在下に置き、トランスフェクション４８時間後に細胞数をアッセイした。右パネルにおいて細胞を，トランスフェクトし、血清含有培地（５％）で４８時間培養し、７０ｎＭのＥＣＲＴＰＡｂ−１またはＥＣＲＴＰＡｂ−１−Ｆａｂに示す時間曝した。ＥＣＲＴＰは免疫沈降し、示すように、ホスホチロシン含量（抗−ＰＹ）および抗体回収（抗−ＨＡ）の免疫ブロットによりアッセイした。ＥＣＲＴＰＡｂ−１−ＦａｂではなくＥＣＲＴＰＡｂ−１が、ｗｔの急性脱リン酸化を促進したが、触媒的不活性ＥＣＲＴＰではしなかった。
【００５２】
図１３Ｂは、野生型ＥＣＲＴＰのＣ／Ｓまたはｃｙ形のいずれかとの共トランスフェクションが、ＥＣＲＴＰＡｂ−１への暴露により課せられるＥＣＲＴＰの脱リン酸化を停止することを証明するオートラジオグラフとグラフの組合せである。これらの変異体形は、優勢ネガティブタンパク質として機能し、細胞増殖を停止させ、ＥＣＲＴＰ脱リン酸化を促進する触媒的活性ＥＣＲＴＰダイマーのＥＣＲＴＰＡｂ−１−誘導形成を遮断する。
【００５３】
発明の詳細な説明
種やｃＤＮＡ起源かにもよるが、ＤＥＰ−１（密度増強ホスファターゼに関する）、ＥＣＲＴＰ、ＰＴＰＲＪ、ＨＰＴＰη、ＣＤ１４８、ＢＹＰと呼ばれる哺乳類貫膜タンパク質遺伝子産物は最初に繊維芽細胞からクローン化され、その後赤血球始原細胞、巨核球および血小板、リンパ球、多形核白血球および血小板をはじめとするあらゆる造血系統（ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅ−Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９１：２８００−２８０９ （１９９８））で、また極めて著しくは内皮細胞で発現されることが分かっている（以降本明細書では、“ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１”と呼ぶ）（Ｂｏｒｇｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７９：５７０−５８０ （１９９６）， Ｓｃｈｏｅｃｋｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ５：７３０ （１９９４）（ａｂｓｔｒａｃｔ））。この遺伝子産物は赤血球始原細胞の分化を促進すること（Ｋｕｍｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：３０９１６−３０９２１ （１９９６））、他のシグナル伝達タンパク質と架橋された場合にリンパ球機能を調節すること（ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅ−Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９１：２８００−２８０９ （１９９８））、さらにタンパク質を過剰発現する乳癌細胞系のクローン発現を阻害すること（Ｋｅａｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６：４２３６−４２４３ （１９９６））が分かっている。
【００５４】
本発明によれば、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の外部領域エピトープに特異的な抗体がミリスチル酸酢酸ホルボールおよびウシ胎児血清の各々に応答して内皮細胞の移動および増殖を阻害することが証明された。内皮細胞の増殖および移動を阻害する生物学的活性は血管形成阻害活性の強力な指標となるとの認識がなされている。従って、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１はまた、血管形成を阻害する阻害シグナルのメディエーターでもある。
【００５５】
本発明によれば、本明細書に記載のモノクローナル抗体ＥＣＲＴＰＡｂ−１をはじめ、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を統合する抗体は血管形成を阻害する。実際に、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の外部領域に対するモノクローナル抗体は内皮細胞の増殖（ＢｒｄＵ取り込み実験によって証明）および移動を阻害する。同モノクローナルのＦａｂフラグメントはこのような活性を持たない。従って、本明細書に記載のこのようなモノクローナルＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１抗体およびその誘導体は血管形成阻害剤としての生物学的活性を有する。
【００５６】
レセプター外部領域の内因性リガンドは内皮増殖停止のシグナルを出す。従って、本発明によれば、内因性リガンドをスクリーニングする方法が提供される。例えば、内因性リガンドは、アフィニティー試薬としてＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域の融合タンパク質を調製して同定し、それに関するアッセイ法を確立し、さらに内皮細胞で発現される推定される天然リガンドをクローン化することによって単離される。このように、精製および単離された内因性リガンドもまた、血管形成阻害剤として治療用途を有する。
【００５７】
本発明によれば、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と接触させてＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を活性化させるために合成ペプチドおよびペプチド模倣物を用いてもよい。
【００５８】
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１は、腎臓および限定されるものではないが心臓、脾臓、筋肉および皮膚を含むその他の臓器の微小血管および大動脈血管の管腔および内皮膜間で発現する。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１は培養内皮細胞の内皮間接点、および重なり合う領域に局在するが、この局在はＶＥカドヘリンが豊富な接合部複合体に限定されるものではない。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性（チロシンホスファターゼ活性）は密度に媒介される増殖停止を待つ密集細胞ではおよそ２倍に増加する。さらに、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１が過剰発現すると密集前の内皮細胞でも増殖が停止する。このように本発明によれば、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１とＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１調節組成物とを接触させることによってＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を調節する方法が考えられる。最後に、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と選択的に結合し、かつ、治療組成物と結合している抗体を調製することにより、治療組成物を内皮間接点へとターゲッティングする方法が、本発明により提供される。
【００５９】
Ａ．概観
本発明は概して、血管形成がＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１により調節されること、さらにはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１機能の活性化が血管形成を阻害するという発見に関する。この発見は種々の疾病プロセスに血管形成が果たしている役割という点で重要である。血管形成を調節することにより、疾病への介入や症状の軽減、およびある場合には疾病の治癒が可能となる。
【００６０】
新しい血管の増殖が疾病に関与する病理学の原因、または一因となる場合、血管形成の阻害が疾病の有害な作用を軽減することになる。このような例としては、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症などが挙げられる。有害な組織の増殖を助けるのに新しい血管の増殖が必要とされる場合、血管形成の阻害はその組織への血液供給を少なくし、それにより血液供給要求に基づく組織塊が小さくなる。このような例としては腫瘍の増殖が挙げられ、腫瘍が数ミリの厚さを超えて増殖するため、また固形腫瘍の転移の確立のために新血管新生が継続的必要条件となる。
【００６１】
この治療法は他の生物学的プロセスではなく血管形成に極めて選択的であるので、本発明の方法はある程度有効である。実施例に示されたように、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１は内皮細胞に局在しているので、主として新しい血管増殖は実質的にＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を含み、従って、この治療法は成熟した血管には悪影響を及ぼさない。さらに、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１は正常組織に広く分布しているわけではなく、内皮細胞の表面に選択的に見られるので、この治療法を選択的に標的化できることを確信させるものである。
【００６２】
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の結合が血管形成を効果的に阻害するという発見により潜在的に高い特異性を有し、従って、毒性も比較的低い治療組成物の開発が見込める。このように本発明は抗ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モノクローナル抗体の好ましい使用を開示するが、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と選択的に結合し、従って、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１によって媒介されるもの以外の生物学的プロセスを調節してしまう副作用のない試薬をデザインすることができる。
【００６３】
本教示によって示されるように、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１との相互作用に高い選択性を有し、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１機能の調節に同様の選択性を有するモノクローナル抗体を製造することが可能である。さらに、本明細書でさらに記載されるように、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１との結合に関して選択的であるようなペプチドを設計することもできる。本発明の発見の前にはインビボにおいてＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１またはその他のチロシンホスファターゼの生物学的機能を調節する試薬の使用によって血管形成が調節され得るとは知られていなかった。
【００６４】
他の関連の方法は米国特許第５，７５３，２３０号、同第５，７３３，８７６号、同第５，７６２，９１８号、同第５，７７６，５９１号、および同第５，６６０，８２７号に記載されており、これら各々の内容は出典明示により本明細書の一部とする。
【００６５】
長期特許法条約に従い、特許請求の範囲を含む本願では”ａ” および”ａｎ”は”ｏｎｅ ｏｒｅ ｍｏｒｅ”を意味するものとした。
【００６６】
Ｂ．血管形成の調節法
本発明は組織の血管形成を阻害し、それにより血管形成に基づく組織における事象を調節する方法を提供する。一般に本方法は、血管形成を調節する量のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターを含む組成物を組織に投与することを含む。本明細書で使用する限り、“調節”なる用語は、血管形成の阻害または刺激の両方を包含する。したがって、本発明の治療法は、処置する疾患に依存して、血管形成の阻害または刺激の両方に属する。
【００６７】
血管形成とは“出芽”、血管形成または血管拡大をはじめ新血管新生に関わる種々のプロセスを含み、これらはすべての血管形成プロセスはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の発現により媒介され、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の発現に基づくものである。外傷治癒、黄体形成および胚形成を除いて、血管形成プロセスの大部分は疾病プロセスと関与していると考えられている。
【００６８】
血管形成が重要であると考えられている種々の疾病があり、限定されるものではないが免疫および非免疫性炎症、慢性関節リウマチ、および乾癬などの炎症性疾患、糖尿病性網膜症、新血管新生緑内障、アテローム性動脈硬化症斑の毛細血管増殖および骨粗鬆症などの血管の不適当または不都合な侵入に関する疾患、ならびに固形腫瘍、固形腫瘍転移症、血管繊維芽腫、水晶体後繊維増殖症、血管腫、カポジ肉腫、その他腫瘍の増殖を助けるのに新血管新生を必要とする癌などの癌関連疾患をはじめとする血管形成疾患が挙げられる。
【００６９】
このように、罹患組織の血管形成を阻害する方法は疾病の症状を緩和し、疾病にもよるが、疾病の治癒の一助となり得る。１つの実施態様では、本発明は組織における血管形成それ自体の阻害を意図する。組織における血管形成の程度、およびそれゆえ本方法によって達成される阻害の程度は、実施例に記載されているような免疫組織化学によってＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１免疫陽性未熟および発達中の血管構造を検出するための種々の方法によって評価できる。
【００７０】
本明細書に記載されるように、皮膚、筋肉、消化管、結合組織、関節、骨、その他血管形成刺激時に血管が侵入する組織をはじめ、種々の組織または組織された組織からなる器官のいずれもが疾病状態において血管形成を助長し得る。
【００７１】
このように、１つの関連する実施形態では、治療される組織は炎症組織であり、阻害される血管形成は炎症組織の新血管新生が存在する炎症組織の血管形成である。このクラスにおいて、慢性関節リウマチ患者、免疫または非免疫性炎症組織、乾癬組織などのような関節炎組織における血管形成の阻害を意図する。
【００７２】
本発明においてその多くの実施態様で治療される患者は望ましくはヒト患者であるが、本発明の原理は本発明が哺乳類をはじめとするすべての脊椎動物種に関して有効であることを示していると理解され、これらも“患者”の中に含めるものとする。これに関して哺乳類とは、血管形成が関与する疾病の治療が望ましい哺乳類種のいずれも、特に農耕および飼育哺乳類種が含まれると理解される。
【００７３】
本発明の方法は、温血脊椎動物の処置に特に有用である。したがって、本発明は哺乳類および鳥類を意図する。
【００７４】
より具体的に、意図されるのはヒトのような哺乳類、ならびに絶滅の危機に瀕しているために重要な（シベリアンタイガーのような）、ヒトのために経済的に重要な（ヒトが消費するために農家で飼育されている動物）および／または社会的に重要な（ペットとしてまたは動物園で飼育）哺乳類、例えば、ヒト以外の食肉動物（ネコおよびイヌのうような）、スワイン（ブタ、ホッグおよびイノシシ）、反芻動物（畜牛、牡牛、ヒツジ、キリン、シカ、バイソンおよびラクダ）、および馬の処置である。また、意図されるのは、絶滅の危機に瀕している、動物園にいる、ならびに家禽である種類の鳥の処置を含む鳥の処置、およびより特には、ヒトにとってまた重要であるため、家畜化された家禽、すなわち、七面鳥、鶏、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウ等のような飼鳥類である。したがって、意図されるのは、家畜化スワイン（ブタおよびホッグ）、反芻動物、馬、飼鳥類等を含むが、これらに限定されない家畜の処置である。
【００７５】
もう１つの関連の実施態様では、治療される組織は糖尿病性網膜症患者、黄斑変性患者、または新血管新生緑内障の網膜組織であり、阻害される血管形成は網膜組織の新血管新生が存在する網膜組織の血管形成である。
【００７６】
さらなる関連の実施態様では、治療される組織は固形腫瘍、転移症、皮膚癌血管腫、または血管繊維腫その他の癌患者の腫瘍組織であり、阻害される血管形成は腫瘍組織の新血管新生が存在する腫瘍組織の血管形成である。
【００７７】
腫瘍組織の血管形成の阻害は、腫瘍増殖に重要な役割の新血管新生を果たすので、特に好ましい実施態様である。腫瘍組織の新血管新生がなければ、腫瘍組織は必要な栄養が得られず、増殖が遅くなり、さらなる増殖を止め、退縮し、最後には壊死して腫瘍が死滅してしまう。あるいは、本発明は本方法に従い腫瘍の血管形成を調節することにより腫瘍の新血管新生を調節する方法を提供する。同様に、本発明は血管形成調節法を実施することにより腫瘍の増殖を調節する方法を提供する。
【００７８】
本方法はまた特に転移の形成に対して特に有効である。なぜならば（１）転移性癌細胞が一次腫瘍を出ていくためには、転移の形成に一次腫瘍の血管形成が必要とされるからであり、また（２）二次的な部位におけるその確立には転移の増殖を助長する新血管新生が必要であるからである。
【００７９】
関連の実施態様では、本発明は転移の確立を制御するため、固形腫瘍に対して向けられる通常の化学療法または手術のようなその他の療法と組み合わせた本方法の実施を意図する。血管形成阻害剤の投与は、化学療法または手術の前、途中またはに行なうことができる。例えば、本発明の血管形成阻害法は、慢性持続のために実施できる。更なる冷として、本発明の血管形成阻害法は、化学療法計画後、腫瘍組織へ血液および栄養を供給して血管形成を回復させることによる有毒攻撃に応答する時点で行なうことができる。さらなる例として、本発明の血管形成阻害法は、固形腫瘍を摘出する手術後の転移の予防として行なうことができる。
【００８０】
組織において血管形成を調節する本方法は、血管形成が起こっている、または起こる危険性がある組織と、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と結合し得る、治療上有効な量のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターを含む組成物とを接触させることを意図する。このように本方法は、本発明のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターを含有する生理学上許容される組成物の治療上有効な量を患者に投与することを含む。
【００８１】
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１レセプターモジュレーターの投与のための用量範囲はさらに本明細書に記載されるようにモジュレーターの形態およびその効力に依存し、これは血管形成および血管形成によって媒介される症状が緩和される望ましい作用をもたらすに十分な量である。この用量は過粘稠度症候群、肺水腫、鬱血性心不全などのような副作用を引き起こすほど多量であってはならない。一般に用量は患者の年齢、状態、性別および疾病の程度によって異なり、当業者ならば決定可能である。この用量はまた、いずれかの合併症があった場合には個々の医師によって調節可能である。
【００８２】
治療上有効な量とは、治療される組織において血管形成の測定可能な阻害をもたらすに十分なＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１レセプターモジュレーターの量、すなわち血管形成を調節する量である。血管形成の阻害その場で、本明細書で記載されるような免疫組織化学法により、または当業者に公知の他の方法により測定できる。
【００８３】
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターがＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１リガンド模倣物、および抗ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モノクローナル抗体またはそのフラグメントの形をとり得る限り、効力、従って、“治療上有効な”量の発現は異なり得るものと考えられる。しかしながら本アッセイ法によって示されているように、当業者ならば容易に本発明の候補ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターの効力を評価できる。
【００８４】
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターは本明細書に記載の血管形成のためのマウス角膜アッセイにおける血管形成の阻害、本明細書に記載の天然のリガンドまたはモノクローナル抗体とＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１との結合、その他のアッセイを含む種々の手段によって測定できる。
【００８５】
好ましいＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターは、１μＭ未満、好ましくは０．１μＭ未満、さらに好ましくは０．０１μＭ未満のモジュレーター濃度の溶液でＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と実質的に結合する能力を有するものである。“実質的に”とは、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターの存在下での調節により内皮細胞の増殖および移動に少なくとも５０％の低下が見られることを意味し、本明細書では５０％の低下をＩＣ５０値で示す。
【００８６】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントの形の本発明のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターの治療上有効な量とは、典型的には、生理学上許容される組成物として投与された場合に約０．０１μｇ／ｍｌないし約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１μｇ／ｍｌないし約５μｇ／ｍｌ、通常は約５μｇ／ｍｌの血漿濃度に達するに十分であるような量である。例えば、Ｍａｂ　ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１（分子量＝約１５０ｋＤａ）に関しては１０μｇ／ｍｌ＝６７×１０−９Ｍである。あるいは、用量は１日１回以上の投与で１または数日間、約０．１ｍｇ／ｋｇないし約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇないし約２００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇないし約２０ｍｇ／ｋｇまで様々であってよい。
【００８７】
ポリペプチドの形の本発明のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターの治療上有効な量とは、典型的には、生理学上許容される組成物として投与された場合に約０．００１μｇ／ｍｌないし約１０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０５μｇ／ｍｌないし約１．０μｇ／ｍｌの血漿濃度に達するに十分であるような量である。約１５，０００ｇ／モル（すなわち１５，０００Ｄａ）の質量を有するポリペプチドに基づけば、好ましい血漿モル濃度は約０．０００１μＭないし約１ｍＭである。あるいは、体重当たりの用量は１日１回以上の投与で１または数日間、約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約３０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇないし約２０ｍｇ／ｋｇまで様々であってよい。
【００８８】
本発明のモノクローナル抗体またはポリペプチドは注射または一定時間にわたる点滴により非経口投与できる。治療される組織は典型的には全身投与により体内で接触され得るので、治療組成物の静脈投与によって治療されることが最も多いが、ターゲッティングされる組織が標的分子を含んでいる場合にはその他の組織および送達手段も意図される。このように、本発明のモノクローナル抗体またはポリペプチドは静脈投与、腹膜内投与、筋肉内投与、皮下投与、腔内投与、経皮投与が可能であり、またぜん動手段による送達も可能である。
【００８９】
本発明のモノクローナル抗体またはポリペプチドを含有する治療組成物は、例えば、単位用量の注射によるなど通常静脈投与される。“単位用量”とは本発明の治療組成物についていう場合、被処置体に対する単位的用量として好適な物理的に個別の単位をいい、各単位は必要とされる希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと組み合わせて所望の治療作用をもたらすように計算された所定量の有効物質を含有する。
【００９０】
これらの組成物は投与剤形に適合した方法で、かつ、治療上有効な量で投与される。投与される量は治療される被処置体、その有効成分を利用する被処置体系の能力、および所望の治療効果の程度に依存する。投与される必要のある有効成分の厳密な量は医師の判断により、個々に独自のものである。しかしながら全身適用についての好適な用量範囲は本明細書で開示され、これは投与経路により異なる。好適な投与計画もまた様々であるが、典型的には最初の投与の後１時間以上の間をあけて次の注射またはその他の投与法で反復投与する。あるいは、血中濃度をインビボ療法について明示された範囲に維持するに十分な持続的静脈注入が考えられる。
【００９１】
Ｃ．治療組成物
本発明は本明細書に記載の治療方法を行うのに有用な治療組成物を意図する。本発明の治療組成物は生理学上許容される担体と、そこに有効成分として溶解または分散した本明細書に記載のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターとを含む。好ましい実施態様では、この治療用ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーター組成物は治療目的で哺乳類またはヒト患者に投与された場合に免疫原性を持たない。
【００９２】
本明細書において“医薬上許容される”、“生理学上許容される”およびその文法上の派生語は、組成物、担体、希釈剤および試薬についていう場合、互換的に用いられ、その物質が悪心、めまい、胃の不調などのような望ましくない生理学的作用をもたらすことなく哺乳類に投与できることを表す。
【００９３】
そこに溶解または分散した有効成分を含む薬理組成物の製造は当業者ならば十分理解しており、処方を基に限定する必要はない。典型的にはこのような組成物は溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能なように調製されるが、使用前に液体で溶液または懸濁液とするのに好適な固体状のものを調製することもできる。またこの製剤は乳化させてもよい。
【００９４】
この有効成分は、医薬上許容されるものであり、かつ有効成分と適合する賦形剤と本明細書に記載の治療法で用いるのに好適な量で混合してもよい。好適な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの混合物が挙げられる。さらに所望により、該組成物は湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など有効成分の有効性を高める補助物質を少量含んでもよい。
【００９５】
本発明の治療組成物はその中に該組成物の医薬上許容される塩を含んでもよい。医薬上許容される塩としては、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸で形成された酸付加塩（ポリペプチドの遊離のアミノ基によって形成）が挙げられる。また、遊離カルボキシル基により形成された塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄（ＩＩＩ）などの無機酸、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機酸から誘導され得る。
【００９６】
生理学上許容される担体は当技術分野で十分に公知である。液体担体の例としては、有効物質と水の他には物質を含まない、または生理的ｐＨ値でリン酸ナトリウムなどの緩衝液、生理食塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水などのその双方を含む滅菌水溶液がある。またさらに、水性担体は１を超える緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコールその他の溶質を含んでもよい。
【００９７】
液体組成物はまた、水に加えて、また水を除外して液相を含んでもよい。このような付加的な液相の例としてはグリセリン、綿実油などの植物油、および水−油エマルションが挙げられる。
【００９８】
治療組成物は血管形成を調節する量の本発明のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターを含み、典型的にはモジュレーターが治療組成物総重量の少なくとも０．１重量％の量を含むように処方される。重量％とは組成物全体に対するモジュレーターの重量比である。従って、例えば、０．１重量％は全組成物１００ｇにつき阻害剤０．１ｇとなる。
【００９９】
Ｄ．ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーター
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターは、組織における血管形成の調節をはじめ、組織におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を調節するために本方法で使用される。このように本明細書において“調節する”および“モジュレーター”は組織においてＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を阻害する、処断する、促進する、刺激する、作動させる、拮抗させる、またはそうでなければ影響を及ぼすことを包含すると解釈することを意味する。
【０１００】
このようなモジュレーターは、天然のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１リガンドとの機能的相互作用を模倣、刺激および／または、例えば、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の２量体化のような、阻害するような様式でＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と相互作用する化合物を含む種々の形態をとり得る。モジュレーターの例としては、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１天然リガンド結合部位アナログ、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１−レセプターリガンド結合相互作用に関与する構造領域を模倣するＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１天然リガンド模倣物、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１天然リガンドドメインに相当する配列を有するポリペプチド、およびＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１または天然リガンドのいずれかと免疫反応する抗体が挙げられ、これらはすべて本明細書で定義されたモジュレーター活性を示す。
【０１０１】
１．ポリペプチド
１つの実施態様では、本発明は、ポリペプチド形態のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターを意図する。ポリペプチド（ペプチド）ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターは、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の細胞外ドメインと相互さお兪し、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の２量体化を促進する。好ましいＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターペプチドは、天然リガンドに対する配列に対応し、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１　ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の２量体化を促進または拮抗する。
【０１０２】
１つの実施態様では、本発明のポリペプチドは約１００個以下のアミノ酸残基、好ましくは約６０個以下の残基、さらに好ましくは約３０個の残基を含む。ペプチドは直鎖であっても環状であってもよい。したがって、対象ポリペプチドは、必要とされる結合配列を含み、本明細書に記載されたようなアッセイにおいてＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターとして機能し得る限り、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１天然リガンドのアミノ酸残基配列と同一である必要はないと理解すべきである。
【０１０３】
対象ポリペプチドには、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターであるポリペプチドのアナログ、フラグメントまたは化学誘導体のいずれもが含まれる。このようなポリペプチドは、使用においてその変化がある利点をもたらすような種々の変更、置換、挿入および欠失を受け得る。これに関しては、本発明のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１レセプターモジュレーターポリペプチドは１以上の変化が起こる天然リガンド配列と同一であるというよりはむしろそれに対応し、本明細書で定義されるような１以上のアッセイにおいてＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターとして機能する能力を有する。従って、ポリペプチドは、アミド、タンパク質コンジュゲート、環化ペプチド、重合ペプチド、アナログ、フラグメント、化学的に修飾されたペプチド、その他誘導体を含む種々の形態のペプチド誘導体のいずれれであってもよい。
【０１０４】
“アナログ”には、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１天然リガンドの配列と実質的に同一のアミノ酸残基配列を有するポリペプチドのいずれもが含まれ、そこでは１以上の残基が機能的に同等な残基で保存的に置換されており、本明細書に記載のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーター活性を示す。保存的置換の例としてはイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの非極性（疎水性）残基あるものから別のものへの置換；アルギニンとイソロイシン間、グルタミンとアスパラギン間、グリシンとセリン間などの極性（親水性）残基のあるものから別のものへの置換；リジン、アルギニンまたはヒスチジンなどの塩基性残基のあるものから別のものへの置換；またはアスパラギン酸またはグルタミン酸などの酸性残基のあるものから別のものへの置換が挙げられる。
【０１０５】
“保存的置換”にはまた、このようなポリペプチドが必要な阻害活性を示す限り誘導体化されていない残基の代わりに化学的に誘導体化された残基の使用が含まれる。
【０１０６】
“化学的誘導体”とは、官能側基の反応によって化学的に誘導体化された１以上の残基を有する対象ポリペプチドをいう。このような誘導体化分子としては例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて塩酸アミン、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するものが挙げられる。遊離カルボキシル基は誘導体化して塩、メチル、およびエチルエステルまたはその他の種のエステルもしくはヒドラジドを形成させてもよい。遊離ヒドロキシル基は誘導体化してＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成させてもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素は誘導体化してＮ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成させてもよい。また化学誘導体としては、２０種の標準アミノ酸の天然に存在する１以上のアミノ酸誘導体を含むペプチドが含まれる。例えば、プロリンは４−ヒドロキシプロリンで置換してもよく；リジンは５−ヒドロキシリジンで置換してもよく；ヒスチジンは３−メチルヒスチジンで置換してもよく；セリンはホモセリンで置換してもよく；また、リジンはオルニチンで置換してもよい。本発明のポリペプチドはまた、必要な活性が維持される限り、その配列が本明細書で示されるポリペプチドの配列に対して１以上の残基の付加および／または欠失を有するポリペプチドのいずれもが含まれる。“フラグメント”とは、そのアミノ酸残基配列が本明細書で示されているポリペプチドのものよりも短いアミノ酸残基配列を有する対象ポリペプチドをいう。
【０１０７】
本発明のポリペプチドがＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１天然リガンドの配列とは同一ではない配列を有する場合、それは典型的には１以上の保存的または非保存的置換がなされたことによるもであり、通常はアミノ酸残基数の約３０％以下、好ましくは１０％以下が置換されている。“リンカー”を提供する目的ではポリペプチドのいずれかの末端にさらなる残基を付加してもよく、このリンカーにより本発明のポリペプチドは標識または固相マトリックス、または担体に便宜に固定することができる。本発明のポリペプチドを用いて使用できる標識、固相マトリックスおよび担体は以下に記載される。
【０１０８】
アミノ酸残基リンカーは通常は少なくとも１個の残基であるが、４０残基以上、しばしば１ないし１０残基であり得、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１リガンドエピトープを形成しないものである。架橋に用いられる典型的なアミノ酸残基はチロシン、システイン、リジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸などである。さらに、対象ポリペプチドは特に断りのない限り、末端ＮＨ２のアシル化（例えば、アセチル化またはチオグリコール酸のアミド化）、末端カルボキシルのアミド化（例えば、アンモニア、メチルアミンによる）、その他の末端修飾によって修飾された配列により、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１リガンドの天然配列とは異なっている。末端修飾は十分公知であるように、プロテイナーゼ消化による感受性を小さくし、従って、溶液、特にプロテアーゼが存在し得る生物体液中でポリペプチドの半減期を延長する働きをさせるのに有用である。この点で、ポリペプチドの環化もまた有用な末端修飾であり、環化によって形成される安定構造のため、また本明細書で記載のような環状ペプチドに対して見られる生物学的に有効な活性の観点から特に好ましい。
【０１０９】
本発明のペプチドはいずれも医薬上許容される塩の形態で使用してもよい。本発明のペプチドとペプチドをなし得る好適な酸としては、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸（ＨＣｌ）、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酢酸酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、桂皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸などの無機酸が挙げられる。ＨＣｌおよびＴＦＡ塩が特に好ましい。
【０１１０】
本発明のペプチドと塩を形成し得る好適な塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、ならびにモノ、ジおよびトリアルキルおよびアリールアミン（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミンなど）、および所望により置換されていてもよいエタノールアミン（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミンなど）などの有機塩基が挙げられる。
【０１１１】
本発明のペプチドは本明細書では対象ポリペプチドとも呼ぶが、組換えＤＮＡ技術をはじめとする、ポリペプチド分野の技術の熟練者に公知である技術のいずれによって合成することもできる。純度、抗原特性、望ましくない副生成物を含まないこと、生産の容易さなどの点から固相Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄメリフィールド型の合成のような合成科学技術は好ましい。利用可能な多くの技術の優れた概要は、固相ペプチド合成法に関しては、Ｓｔｅｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ”Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， １９６９； Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， ｅｔ ａｌ．， ”Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９７６； Ｊ． Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， ”Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”， Ｖｏｌ． ２， ｐ． ４６， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）， １９８３； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｏｌ， ３２：２２１−９６， １９６９； Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ，， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．， ３５：１６１−２１４， １９９０；および米国特許第４，２４４，９４６号、また従来の溶液合成法に関しては、Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ”Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”， Ｖｏｌ． １， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）， １９６５に見出すことができ、これらはそれぞれ出典明示して本明細書の一部とされる。このような合成で使用できる適当な保護基は上記のテキストおよびＪ．Ｆ．Ｗ． ＭｃＯｍｉｅ， ”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７３に記載されており、これは出典明示して本明細書の一部とされる。
【０１１２】
一般に、意図される固相合成法は１以上のアミノ酸残基の一連の付加、またはアミノ酸残基を適宜保護してペプチド鎖を伸長させることを含む。通常、第１のアミノ酸残基のアミノまたはカルボキシル基のいずれかを、選択的に除去できる好適な保護基で保護する。リジンなど反応性側基を含むアミノ酸に対しては選択的に除去できる異なる保護基を利用する。
【０１１３】
固相合成を例にとると、保護されたまたは誘導体化されたアミノ酸はその保護されていないカルボキシル基またはアミノ基を介して不活性な固相支持体と結合している。次いでこのアミノ基またはカルボキシル基の保護基を選択的に除去し、適宜保護された相補基（アミノ基またはカルボキシル基）を有する配列において、固相支持体にすでに結合されている残基とアミノ結合を形成するのに好適な条件下で次のアミノ酸が混合され、反応する。次いでこの新たに付加されたアミノ酸残基からアミノ基またはカルボキシル基の保護基を除去した後、次のアミノ酸（適宜保護）を付加するというように繰り返す。所望のアミノ酸をすべて連結して適切な配列とした後、残りの末端および側基保護基（ならびに固相）をいずれも順次または同時に除去して最終的に直鎖ポリペプチドを得る。
【０１１４】
例えば、上記のようにして製造されて結果的に得られる直鎖ポリペプチドを搬送させて対応する環状ペプチドを得てもよい。ペプチドを環化する方法例は、Ｚｉｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １９９２， ｐｐ． ３９３−３９４， ＥＳＣＯＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｂ．Ｖ．， １９９３に記載されている。典型的にはｔ−ブトキシカルボニルで保護したペプチドエチルエステルをメタノールに溶解し、水酸化ナトリウム溶液を加え、その混合物を２０℃で反応させて加水分解的にメチルエステル保護基を除去する。溶媒を蒸発させた後、ｔ−ブトキシカルボニルで保護したペプチドを、酸性化した水性溶媒から酢酸エチルで抽出する。次ぎにジオキソラン補助溶媒中の弱酸性条件下でこのｔ−ブトキシカルボニル保護基を除去する。こうして得られた遊離のアミノ末端とカルボキシ末端を有する保護されていない直鎖ペプチドは、ジクロロメタンおよびジメチルホルムアミドの混合物中の直鎖ペプチドの希溶液を、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびＮ−メチルモルホリンの存在下でジシクロヘキシルカルボジイミドと反応させることにより、対応する環状ペプチドへと変換する。
【０１１５】
２．抗体
本発明は、１つの実施態様において、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ーと免疫反応し、かつ、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１レセプターと結合して本明細書に記載のレセプター活性を調節する、モノクローナル抗体を含む、抗体の形態のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターについて記載する。本発明はまた、抗体を生産する細胞系、その細胞系を作出する方法、およびそのモノクローナル抗体を含む抗体を生産する方法について記載する。
【０１１６】
本発明の抗体は、１）単離されたＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と免疫反応し、かつ２）ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と結合してその生物学的機能を調節する抗体分子からなる。好ましくは、本発明の抗体は、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１のアミノ酸１−３５１を含む、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域と結合する。より好ましくは、本発明の抗体は、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域の配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃを有する８アミノ酸エピトープ、または配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃのアナログ配列を有する８アミノ酸エピトープと優勢に結合する（“アナログ”なる用語は、明細書で定義の通り）。
【０１１７】
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と選択的に結合する好ましいモノクローナル抗体としては、本明細書で以下に記載されるように、Ｍａｂ　ＥＣＲＴＰＡｂ−１の免疫反応特性を有し、分子量がそれぞれ約１５０ｋＤａで、かつ、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の外部領域と結合するモノクローナル抗体がある。Ｍａｂ　ＥＣＲＴＰＡｂ−１はハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ　ＨＢ１２５７０によって分泌されるものが好ましい。ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ　ＨＢ１２５７０は、ブダペスト条約要件に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ， ２０１１０−２２０９， Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９９８年、９月１８日の下で寄託されたものである。
【０１１８】
“抗体または抗体分子”とは、本明細書では種々の文法形態で、免疫グロブリン分子および／または免疫グロブリン分子の免疫学的に有効は部分、すなわち抗体結合部位またはパラトープを含む分子の集団をさす集合名詞として用いられる。“抗体結合部位”とは、抗原と特異的に結合する重鎖および軽鎖可変領域および超可変領域からなる抗体分子の構造部分である。
【０１１９】
本発明において用いられる抗体例としては、完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子、一本鎖免疫グロブリンまたは抗体、当技術分野でＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）として知られ、また抗体フラグメントとも呼ばれる部分をはじめ、パラトープを含む免疫グロブリン分子の一部が挙げられる。
【０１２０】
実際に、以下に示される実施例で記載されているように、Ｆａｂフラグメント、すなわちＭａｂ　ＥＣＲＴＰＡｂ−１の一価フラグメントは密度停止を放出する。このように、このような一価モジュレーターを用いて血管形成を促進する、または内皮細胞の移動および増殖を促進する、または内皮細胞に阻害的影響を与えて他の血管形成刺激の補助として機能させることも本発明の範囲内であると考えられる。従って、“調節”、“調節する”および“モジュレーター”とは、このような促進を包含するものと解釈される。
【０１２１】
“モノクローナル抗体”とはその種々の文法形態において、特定のエピトープと免疫反応し得る単一種の抗体結合部位を含む抗体分子の集団をさす。従って、モノクローナル抗体は典型的にはそれが免疫反応するいずれのエピトープに対しても単一の結合親和性を示す。従って、モノクローナル抗体は、各々異なるエピトープに免疫特異性を示す複数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば、二重特異性モノクローナル抗体を含み得る。
【０１２２】
モノクローナル抗体は典型的には単一種の抗体分子を分泌（産生）するハイブリドーマと呼ばれる単一細胞のクローンによって産生される抗体からなる。ハイブリドーマ細胞は抗体産生細胞とミエローマまたはその他の自己永続細胞系とを融合させることにより形成される。このような抗体の調製は最初にＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７ （１９７５）によって記載されており、この記載は出典明示により本明細書の一部とする。さらなる方法がＺｏｌａ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． （１９８７）により記載されている。そのようにして調製したハイブリドーマ上清は、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と免疫反応する抗体分子の存在に関して、またその生物学的機能を活性化するためのＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の阻害に関してスクリーニングすることができる。
【０１２３】
便宜には、モノクローナル抗体組成物を産生させるハイブリドーマを形成するには、ミエローマまたはその他の自己永続細胞系を、Ｃｈｅｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２６２：１７７０３−１７７１１ （１９８７）によって記載されているように、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の供給源で過免疫した哺乳類の脾臓から得たリンパ球と融合させる。
【０１２４】
ハイブリドーマを調製するために使用されるミエローマ細胞系はリンパ球と同じ種に由来するものであることが好ましい。典型的には１２９ＧＩＸ＋系統のマウスが好ましい哺乳類である。本発明はで用いられる好適なマウスミエローマ
としては、ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶｉｒｇｉｎｉａからそれぞれＣＲＬ１５８０およびＣＲＬ１５８１として入手できる、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（ＨＡＴ）細胞系Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、およびＳｐ２／０−Ａｇ１４が挙げられる。
【０１２５】
典型的にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００）を用いて脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させる。融合したハイブリッドは、ＨＡＴ感受性によって選択する。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、実施例に記載の酵素結合イムノソルベント検定法を用いて同定する。
【０１２６】
本発明のモノクローナル抗体はまた、適当な特異性を抗体分子を分泌するハイブリドーマを含有する栄養培地からなるモノクローナルハイブリドーマ培養を開始することで生産することもできる。該培養系は、ハイブリドーマにとって抗体分子が培地中へ分泌するに十分な条件および期間で維持する。その後、抗体を含有する培地を回収する。次ぎに抗体分子をさらに十分公知な方法で単離することができる。これらの組成物の調製に有用な培地は当技術分野で十分公知であり、商業的に入手可能でもあり、合成培地、同系マウスなどがある。合成培地の例としては、４．５ｇ／ｌのグルコース、２０ｍＭのグルタミンおよび２０％のウシ胎児血清を添加したダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ， Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ ８：３９６ （１９５９））がある。同系マウス系統の例としてはＢａｌｂ／Ｃがある。
【０１２７】
モノクローナル抗体、ハイブリドーマ細胞、またはハイブリドーマ細胞培養系を作出するその他の方法もまた十分公知である。例えば、Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：５７２８−５７３２ （１９８９）；およびＨｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１ （１９８９）によって記載されているような免疫レパートリーからモノクローナル抗体を単離する方法を参照。
【０１２８】
また、ハイブリドーマ細胞および本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を含む培養系も本発明により意図される。以下に示される実施例に記載され、ＡＴＣＣ　ＨＢ１２５７０とも呼ばれるモノクローナル抗体Ｍａｂ　ＥＣＲＴＰＡｂ−１を分泌するハイブリドーマ細胞系が特に好ましい。Ｍａｂ　ＥＣＲＴＰＡｂ−１は実施例に記載のようにして調製した。このように本発明は１つの実施態様において、Ｍａｂ　ＥＣＲＴＰＡｂ−１の免疫反応特性を有するモノクローナル抗体を意図する。
【０１２９】
また、あるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と同一（すなわち同等）の特異性（免疫反応特性）を有しているかどうかは、前者が後者を予め選択した標的分子と結合させないようにするかどうかを確認することにより、過度な実験を行うことなく決定することができる。固相中に存在する標的分子への結合に関する標準的な競合アッセイにおいて、本発明のモノクローナル抗体によって結合の低下が示されるように、試験されるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と競合するならば、この２つのモノクローナル抗体は同じエピトープ、または密接に関連するエピトープに結合すると考えられる。好ましい標的分子は、配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃを有する８アミノ酸エピトープ、または配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃのアナログ配列を有する８アミノ酸エピトープを含むＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域のポリペプチドフラグメントを含む（“アナログ”なる用語は、明細書で定義の通り）。
【０１３０】
あるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを決定するさらにもう１つの方法として、本発明のモノクローナル抗体を通常それが反応する標的分子と共にプレインキュベートし、その後、試験されるモノクローナル抗体を加えて、試験されるモノクローナル抗体が標的分子と結合する能力において阻害されるかどうか決定するというものがある。試験されるモノクローナル抗体が阻害されれば、おそらくそれは本発明のモノクローナル抗体と同じ、または機能的に同等なエピトープ特異性を有している。好ましい標的分子は、配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃを有する８アミノ酸エピトープ、または配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃのアナログ配列を有する８アミノ酸エピトープを含むＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域のポリペプチドフラグメントを含む（“アナログ”なる用語は、明細書で定義の通り）。
【０１３１】
あるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを決定するさらなる方法として、問題の抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸残基配列を決定するというものがある。ＣＤＲ領域において同一または機能的に同等なアミノ酸残基配列を有する抗体分子は同じ結合特異性を有する。ポリペプチドの配列決定法は当技術分野で十分公知である。
【０１３２】
抗体の免疫特異性は、その標的分子結合力、および抗体がエピトープに対して示す付随の親和性は、抗体がそれと免疫反応するエピトープによって規定される。このエピトープ特異性は、少なくともある部分は抗体を含んでなる免疫グロブリンの重鎖の可変領域のアミノ酸残基配列によって、またある部分は軽鎖可変領域アミノ酸残基配列によって規定される。“〜の結合特異性を有する”または“〜の結合選択性を有する”を用いる場合、同等のモノクローナル抗体が同一または類似の免疫反応（結合）特性を示し、予め選択された標的分子との結合に関して競合することを示す。好ましくは、本発明の抗体は、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域の配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃを有する８アミノ酸エピトープ、または配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃのアナログ配列を有する８アミノ酸エピトープに優勢的に結合する（“アナログ”なる用語は、明細書で定義の通り）。
【０１３３】
ヒト化されたモノクローナル抗体は、特に治療上ヒトに使用できる限りは、マウスモノクローナル抗体を超える特定の利点をもたらす。具体的には、ヒト抗体は循環から“外来”抗原ほどすぐには除去されず、外来抗原および外来抗体と同じ様式では免疫系を活性化しない。“ヒト”化抗体を調製する方法は一般に当技術分野で公知であり、本発明の抗体に容易に適用できる。従って、本発明は１つの実施態様において、抗原と結合する抗体の能力を実質的に妨げることなくヒト免疫系の成分導入するためにつぎ足すことによってヒト化される本発明のモノクローナル抗体を意図する。ヒト化抗体はまたＭｅｄａｒｅｘ ｏｆ Ａｎｎａｎｄａｌｅ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ （マウス）およびＡｂｇｅｎｉｘ， Ｉｎｃ．， ｏｆ　Ｆｒｅｍｏｎｔ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ （マウス）から由来のような、ヒト化抗体を生産するために操作された動物を使用して製造できる。
【０１３４】
抗体、特にモノクローナル抗体、さらに特には一本鎖モノクローナル抗体を作製するための分子クローニングアプローチの使用もまた意図される。一本鎖抗体の製造は当技術分野で記載がある。例えば、米国特許第５，２６０，２０３号を参照（この内容は出典明示により本明細書の一部とする）。これについては、免疫化した動物の脾臓から単離したＲＮＡから免疫グロブリンファージミドまたはファージ−提示ライブラリーの組合せを作り、適当な抗体を発現するファージミドを内皮組織をパンニングすることにより選択する。このアプローチはまたヒト化抗体の生産にも使用できる。従来のハイブリドーマ技術に優るこのアプローチの利点は、１回で約１０４倍という多くの抗体が生産およびスクリーニングできること、ならびに一本鎖におけるＨおよびＬ鎖の組合せによって新たな特異性が生じ、これにより適当な抗体を見つけ出せる機会がさらに増えるということである。このように、本発明の抗体または本発明の抗体の“誘導体”は、結合特異性および実質的に結合特異性と同様の親和性、およびＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１などの本明細書に記載の抗体の軽鎖および重鎖凝集可変領域を有する単一のポリペプチド鎖結合分子に適するものである。好ましくは、本発明の抗体は、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域の配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃを有する８アミノ酸エピトープ、または配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃのアナログ配列を有する８アミノ酸エピトープに優勢的に結合する（“アナログ”なる用語は、明細書で定義の通り）。
【０１３５】
“Ｆｖ”は、完全抗原認識および結合部位を含む、最小抗体フラグメントである。二本鎖Ｆｖ種において、この認識は、密接な、非共有結合的関係における一つの重鎖および一つの軽鎖可変性ドメインの２量体を含む。一本鎖Ｆｖ種（ｓｃＦｖ）において、一つの重鎖および軽鎖可変性ドメインが、軽鎖および重鎖が、二本鎖Ｆｖ種におけるものと類似の“２量体”構造に結合できるように、柔軟性ペプチドリンカーにより共有結合的に結合される。各可変性ドメインの３個のＣＤＲがＶＨ−ＶＬダイマーの表面上に抗原結合部位を定義するために相互作用するのはこの配置である。集合的に、６個のＣＤＲが抗体への抗原結合特性を付与する。しかし、一つの可変性ドメイン（または、抗原に特異的な３個のＣＤＲのみを含むＦｖの半分）が、全結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識し、結合する能力を有することさえある。ｓｃＦｖのレビューのために、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９−３１５ （１９９４）参照。
【０１３６】
抗体の生産のためにファージ提示アプローチを使用して、ＥＣＲＴＰ／ＤＲＰ１外部領域に結合するｓｃＦｖ抗体クローンが同定されている。これは、本明細書に記載のＥＣＲＴＰＡｂ−１を使用した、これらのファージ提示抗体の競合除外により達成された。Ｆｖ旅行きを、配列決定し、２価環納性試薬を設計し、下記の本発明のスクリーニングアッセイにおいて試験する。したがって、抗体、またはそれらの誘導体またはフラグメントの好ましい供給源は、組換えファージ提示抗体ライブラリーである。組換えファージは、マウスおよびラットのような哺乳類種を含む、適当な脊椎動物種から単離された核酸をコードする抗体を含むことができる；しかし、好ましくは、ヒトから単離された核酸をコードする抗体を含む。このような抗体は、したがって、既に“ヒト化”されている。
【０１３７】
３．その他のモジュレーター
これまでに記載した、そして近畿に発見した血管形成阻害または内皮細胞増殖抑制化学化合物は組織におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性のモジュレーターであるとも考えられる。このような化合物の例としては、限定されるものではないが、アンギオスタチン、エンドスタチンおよびトロンボスポンジンが上げられる。従って、このような化合物は、本発明の方法に従い、組織におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性の調節に使用してもよい。
【０１３８】
本明細書で組織におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性の開示が与えられれば、本発明の方法に従い、まだ明らかになっていない化学化合物を用いて組織におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を調節し得るということも考えられる。一つの実施態様において、本発明のモジュレーターは、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域の配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃを有する８アミノ酸エピトープと相互作用する。他の態様において、本発明のモジュレーターは、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の細胞内触媒ｔ計ドメインと相互作用する。このようなモジュレーターの同定は本明細書に示される組織におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性に向けされたスクリーニングアッセイの記載を通して、提供される。
【０１３９】
Ｄ．スクリーニングアッセイ
当業者ならば、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の局在化および機能についての本明細書の開示、ならびにこのような局在化および機能に関するインビトロアッセイが、部分的であれ完全であれ、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の機能的活性を調節する化合物に関するスクリーニングできる機会を与えることが理解できるであろう。これに関して、“調節する”とは、対象化合物が、細胞増殖、細胞生存および血管形成におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性のような、しかしこれらに限定されない、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の１以上の機能的活性を増強または低下させることを意味するものとする。
【０１４０】
さらに、以下の実施例で例示されるスクリーニングアッセイには、生化学アッセイ（例えば、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性に対する抗ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１レセプターモノクローナル抗体の作用を測定する）、およびインビトロ細胞アッセイ（例えば、内皮細胞の増殖および移動に対するＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１過剰発現の作用を測定するおよび／またはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１リン酸化を評価する）が含まれる。例示の生化学アッセイは、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を調節する化合物のスクリーニングに特に有用であり、一方、細胞アッセイはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を完全に変更する化合物のスクリーニングに特に有用である。このように、細胞増殖、細胞生存、内皮細胞の増殖および移動の調節、ならびに血管形成の調節におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の役割についての本明細書で開示されるまで、当技術分野でＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を調節する化合物のスクリーニングに対する動機付けは欠如していた。
【０１４１】
当業者ならば、分子結合部位におけるリガンドの結合が直接的に（例えば、その部位を遮断することによる）調節することもできるし、また間接的に（例えば、離れた部位における第２の、すなわち異なるリガンドの結合の後に誘導される配座変化による）調節することもできることが分かるであろう。これに関しては、その内因性リガンドに対するＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の結合部位特異性は、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の離れた部位で結合する薬剤によって完全に調節または変更できる（すなわち、異なるリガンドに結合する）と考えられる。後者のいくつかのアッセイでスクリーニングされ得る化合物の例としては、少なくとも核酸（例えば、タンパク質と結合してそれらの機能を変更するＤＮＡオリゴヌクレオチドアプタマー）、タンパク質、抗体および抗体フラグメント、炭水化物、レクチン、有機化合物などが含まれる。このようなスクリーニングアッセイは動物およびヒトに有用な薬剤となり得る候補治療薬を同定するのに有用であり得る。
【０１４２】
またさらに、細胞増殖、細胞生存、内皮細胞の移動および増殖、密度がもたらす増殖停止、ならびに血管形成の調節におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の重要性により、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と、またはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を含む複合体と結合することによってそれらの活性を調節するために細胞には内在する調節機構が存在すると理解される。このような調節因子には少なくとも、（ａ）複合体と結合し、さらに複合体を脱安定化または安定化することによって調節作用を機能させる補因子；（ｂ）複合体に結合した場合にＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１に配座変化を引き起こすことによって複合体の活性を調節または変更する作用因子；（ｃ）複合体の一方または両方の構成要素を不活性化する酵素；および（ｄ）ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１またはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１複合体と結合して機能的活性を調節または変更する細胞制御因子（例えば、シグナル変換二次伝達物質、転写調節因子、ＤＮＡ複製因子など）が含まれる。当業者ならば、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の機能的領域が、三次元分子モデリングや模倣化合物、例えば、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１とその内因性結合パートナーまたはその他の結合パートナー間の三次元相互作用を模倣するために構築される有機化合物の構築のための特に魅力ある標的を示すと認識しているであろう。
【０１４３】
本発明の方法および組成物を使用して、候補物質を試験するためのスクリーニングアッセイが導き出され得る。候補物質は、内皮細胞増殖、細胞生存、細胞移動および増殖、密度により誘導される増殖停止および／または血管形成、および／またはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１リン酸化を、内皮細胞増殖、細胞生存、細胞移動および増殖、密度により誘導される増殖停止および血管増殖を調節する、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１との結合または他の分子間相互作用により、調節または変更する能力を有する可能性のある物質である。
【０１４４】
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１生物学的活性を調節する能力に関して、候補物質をスクリーニングする方法も記載する。本該方法はＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドまたはそれらのフラグメントを含む試験サンプルを確立する：試験サンプルに候補物質を投与する：および候補物質の試験サンプルにおける相互作用、効果またはそれらの組合せを測定し、それにより候補物質がＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１生物学的活性を調節する能力を測定することを含む。
【０１４５】
本発明はまた細胞増殖、細胞生存、内皮細胞移動および増殖、密度により誘導される増殖停止および／または血管形成および／またはＥＣＲＴＰ／ＤＲＰ−１リン酸化を調節または変更する能力に関して物質をスクリーニングする方法を提供し、該方法は機能的ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を含む細胞を準備し、さらに細胞増殖、細胞生存、その細胞の移動または増殖、その細胞の密度により誘導される増殖停止、またはその細胞における血管形成の阻害を調節または変更する選択された物質の能力を試験するおよび／または細胞中のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−リン酸化を評価するステップを含む。
【０１４６】
本発明のスクリーニングアッセイは一般に、標的細胞における細胞増殖、細胞生存、内皮細胞の移動および増殖、密度により誘導される増殖停止および／または血管形成、および／またはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１リン酸化に影響を与える候補物質の能力を測定することを含み、例えば、細胞増殖、細胞生存、内皮細胞の移動および増殖、密度により誘導される増殖停止および／または血管形成、および／またはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１リン酸化を調節または変更するものを同定するための候補物質のスクリーニングがある。標的細胞としては、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を含むことが既知の天然に存在する細胞であっても、本明細書でも示され当技術分野で公知でもある形質転換法に従って作出された形質転換細胞であってもよい。
【０１４７】
したがって、一つの実施態様において、本発明によりレセプターチロシンホスファターゼを調節する能力に関して候補物質をスクリーニングする方法は、レセプターチロシンホスファターゼポリペプチドを含む試験サンプルを確立する；および候補物質を試験サンプルに投与する；候補物質の試験サンプルにおける相互作用、効果またはそれらの組合せを測定し、それにより候補物質がレセプターチロシンホスファターゼ生物学的活性を調節する能力を測定することを含む。
【０１４８】
他の実施態様において、本発明により、候補物質がレセプターチロシンホスファターゼを調節する能力をスクリーニングする方法は、レセプターチロシンホスファターゼを含む試験サンプルを確立する；候補物質を試験サンプルに投与する；そして試験サンプルにおけるレセプターチロシンホスファターゼ生物学的活性を測定する；レセプターチロシンホスファターゼ上のホスホチロシン残基を検出する；そして候補物質がレセプターチロシンホスファターゼ生物学的活性を調節する能力、試験サンプルに関して測定したレセプターチロシンホスファターゼ生物学的活性が、コントロールサンプルに関して測定したレセプターチロシンホスファターゼ生物学的活性より大きいか、低いか、およびレセプターチロシンホスファターゼ上のホスホチロシン残基の量が、コントロールサンプル由来のレセプターホスホチロシン残基の量より多いか少ないかを測定することを含む。好ましいレセプターチロシンホスファターゼは、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を含む。
【０１４９】
更に別の実施態様において、本発明のレセプターチロシンホスファターゼを調節する能力に関して候補物質をスクリーニングする方法は、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を発現する細胞の複製試験およびコントロール培養を確立する；候補化合物を試験培養中の細胞に投与するが、コントロール培養にはしない；試験およびコントロール培養における細胞のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を測定する；そして、候補化合物が細胞におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を調節するか、試験培養で測定したＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性が、コントロール培養で測定したＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性より大きいか小さいかどうか、測定することを含む。
【０１５０】
本発明のスクリーニングアッセイはまた、候補化合物が、外因性ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を発現する細胞の増殖を、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を発現しないものと比較して阻害するかの比較に関し、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を変える効果が、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を発現しない細胞における候補化合物の活性の欠失を証明することにより信頼できることを測定する。本発明のスクリーニングアッセイは、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性における変化に応答する増殖の変化を示す。例えば、本発明のスクリーニング法は、ＣＨＯ／ＥＣＲＴＰ／ＤＲＰ−１とＣＨＯ親細胞系における増殖阻害を比較することによる、生物学的フラクション（血漿、細胞溶解物、細胞膜抽出タンパク質）における増殖阻害活性をスクリーニングすることによる、生物学的活性カウンター−レセプター（リガンド）のスクリーニングに使用できる。
【０１５１】
無細胞系において、本発明により、レセプターチロシンホスファターゼを調節する能力に関して、候補物質をスクリーイングする方法は、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１およびリガンドを含むコントロール系を確立する（ここでＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１は、リガンドに結合できる）；ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１、リガンド、および候補化合物を含む試験系を確立する；コントロール系および試験系におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１およびリガンドの結合親和性を測定する；そして、候補化合物がＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を無細胞系で調節するか、試験系で測定した結合親和性が、コントロール系で測定した結合親和性より大きいか小さいかどうか、測定することを含む。所望により、リガンドはＥＣＲＴＰ／ＤＲＰ−１を優勢に結合する抗体を含む。この場合、リガンドがモノクローナル抗体を含むのが好ましい。
【０１５２】
本発明により、（ａ）候補モジュレーター物質とＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドまたはそれらのフラグメントを、候補モジュレーター物質とＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドまたはそれらのフラグメントが結合し、それらの間で複合体を形成するのに好ましい条件下で接触させる；および（ｂ）複合体を検出することを含む。
【０１５３】
複合体は、任意の適当な方法で検出できる。例えば、複合体は、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドまたはそれらのフラグメントに接合した標識を介して；その複合体に、形成に続いて特異的に結合する標識試薬を介して；または競合アッセイを介して検出できる。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドフラグメントは、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域フラグメントであり得る。好ましくは、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域フラグメントは、配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃを有する８アミノ酸エピトープ、または配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃのアナログ配列を有する８アミノ酸エピトープを含む（“アナログ”なる用語は、明細書で定義の通り）。所望により、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、検出可能な標識と接合してもよい。この場合、検出段階は：（ｉ）非結合標識結合物質から複合体を離す；そして（ｉｉ）複合体に存在するか、非結合である検出可能標識のを検出する：段階を含む。
【０１５４】
抗体、またはそれらの誘導体は、候補モジュレーター物質としてスクリーニングできる。上記のように、抗体、またはそれらの誘導体またはフラグメントの好ましい供給源は、組換えファージ提示抗体ライブラリである。組換えファージは、マウスおよびラットのような哺乳類種を含む適当な脊椎動物種から単離した抗体をコードする核酸を含み得る；しかし、好ましくは、ヒトから単離した抗体をコードする核酸を含む。このような抗体は、したがって、既に“ヒト化”されている。
【０１５５】
他の態様において、本発明は、上記親和性スクリーニング法に使用するためのキットに関する。キットは、第１コンテナに包含された、配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃを有する８アミノ酸エピトープまたは配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃのアナログ配列を有する８アミノ酸エピトープを含むＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域ポリペプチド、またはそれらのフラグメントを含む、結合剤を含む（“アナログ”なる用語は、明細書で定義の通り）。所望により、結合剤は固相支持体に固定化され、またはキットは第２容器に包含された固相支持体も含み得る。
【０１５６】
キットは、更に、検出可能標識を含む試薬またはインディケーターを含み得、インディケーターは他の容器に包含される。あるいは、結合剤は、検出可能標識またはインディケーターを含み得る。好ましくは、インディケーターは放射活性標識または酵素、または他の適当なインディケーターである。
【０１５７】
使用できる医薬スクリーニングのための他の技術は、出展明示により本明細書に包含させる公開ＰＣＴ出願ＷＯ８０／０３５６４に記載のような目的のタンパク質に対する適当な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングのために提供される。この記載において、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドに適応するとして、複数の異なる小試験化合物を、プラスチックピンまたは他の表面のような、固体支持体上に合成する。試験化合物を、ＥＣＲＴＰ／ＤＲＰ−１ポリペプチド、またはそれらのフラグメントと反応させ、洗浄する。結合ＥＣＲＴＰ／ＤＲＰ−１を次いで当分野で既知の方法により検出する。精製ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドはまた、上記医薬スクリーニング技術に使用するために、直接プレートにコートできる。あるいは、非中和抗体を使用して、ペプチドを捕獲し、それを固体支持体上に固定化できる。
【０１５８】
本発明のスクリーニングアッセイはまた候補物質が、ＥＣＲＴＰ／ＤＥｐ−１生物学的活性を調節、すなわち、阻害または促進する、および、好ましくは、それにより、標的細胞内でＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１生物学的活性を調節する能力の測定も関与する。標的細胞は、本発明のポリペプチドを含むことが既知の天然に存在する細胞か、上記に明示のトランスフェクションの工程に従い産生したトランスフェクト細胞のいずれかであり得る。試験サンプルは、更にＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を発現する細胞または細胞系を含み得る；本発明はまた例示の方法における使用に適した組換え細胞系を意図する。このようなさ細胞系は、哺乳類、またはヒトであり得、またはそれらは酵母を含むがそれに限定されない他の生物由来であり得る。例示的アッセイは、内皮細胞移動および増殖、密度により誘導される増殖停止、血管形成、または他のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１介在細胞性プロセスのために重要なＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１相互作用遺伝子を効率的に同定する、酵母２ハイブリッドスクリーニングのような、遺伝子スクリーニングアッセイおよび分子生物学的スクリーニングを含む。酵母２ハイブリッドシステムの一つの変法が記載され（（Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：９５７８−９５８２、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から商品として入手可能である。
【０１５９】
合理的な医薬設計によりＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１のモジュレーターを同定する方法は、また本発明により提供される。方法は、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の構造に基づいて、触媒ドメイン（細胞内部位）にける基質結合部位においてアミノ酸と、またはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域と非共有結合的結合を形成する、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の可能性のあるモジュレーターを設計する；モジュレーターを合成する；そして可能性のあるモジュレーターがＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の活性を調節するかどうかを測定する段階を含む。
【０１６０】
したがって、本発明は、外部領域相互作用ならびに触媒的モジュレーターの両方に関する、スクリーニングおよび合理的医薬設の方法に関する。例えば、外部領域と無関係に、触媒機能の調節を介して増殖停止から細胞を解く触媒的触媒的アンタゴニストが、スクリーニングおよび設計できる。例えば更に、本発明のモジュレーターは、配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃを有する８アミノ酸エピトープ、または配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃのアナログ配列を有する８アミノ酸エピトープとの相互作用に関してスクリーニングできる（“アナログ”なる用語は、明細書で定義の通り）。
【０１６１】
モジュレーターは、本明細書に記載され、当分野で既知の技術を使用して合成できる。モジュレーターがＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の生物学的活性を調節するか否かは、本明細書に記載のスクリーニング方法により、または当分野で既知の他のスクリーニング方法により成す。
【０１６２】
当技術分野で十分公知であるように、スクリーニングアッセイは、細胞増殖、内皮細胞の移動および増殖、密度により誘導される増殖停止、血管形成および／またはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１リン酸化の調節または変更を試験するのに好適な条件下にある細胞を提供する。これらの条件としては、限定されるものではないが、ｐＨ、温度、張性、細胞周期に関与する適切な因子（例えば、増殖因子）の存在、およびグリコシル化またはプレニル化といったポリペプチドの適切な修飾が含まれる。原核細胞または真核細胞ではＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１が発現され利用され得ると考えられる。また宿主細胞はレセプターが見られる細胞下画分に分画することもできる。例えば、ポリペプチドを発現する細胞を核、小胞体、小胞、または細胞の膜表面へと分画できる。
【０１６３】
ｐＨは好ましくは約６．０ないし約８．０、より好ましくは約６．８ないし約７．８、最も好ましくは約７．４である。好ましい実施態様では、温度は約２０℃ないし約５０℃、より好ましくは約３０℃ないし約４０℃、いっそう好ましくは約３７℃である。浸透圧は好ましくは約５ｍｏｓｍ／Ｌないし約４００ｍｏｓｍ／Ｌ、より好ましくは約２００ｍｏｓｍ／Ｌないし約４００ｍｏｓｍ／Ｌ、いっそう好ましくは約２９０ｍｏｓｍ／Ｌないし約３１０ｍｏｓｍ／Ｌである。特殊な細胞における内皮細胞の移動および増殖、密度により誘導される増殖停止および／または血管形成の適切な試験には因子の存在が必要とされる場合もあろう。このような因子としては、例えば、増殖因子、インターロイキンまたはコロニー刺激因子の存在および不在（回収）がある。
【０１６４】
Ｅ．ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１のモジュレーターの同定方法
このように本発明はまた、候補となるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１モジュレーターを同定するアッセイ法に適する。これらのアッセイ法では、候補分子を、天然リガンドに結合するＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を促進する能力に関して評価し、さらに組織において血管形成を調節する能力に関して評価する。
【０１６５】
例としてのアッセイは、ひな奬尿膜（ＣＡＭ）における血管形成を測定するものであり、ＣＡＭアッセイとも呼ばれている。ＣＡＭアッセイは他でも詳細に記載されており、さらに腫瘍組織の血管形成および新血管新生の双方を測定するのにも用いられている。Ａｕｓｐｒｕｎｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ７９：５９７−６１８ （１９７５）およびＯｓｓｏｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４０：２３００−２３０９ （１９８０）参照。
【０１６６】
ＣＡＭアッセイは、組織全体で新血管新生が起こっており、実際のひな胚の血管がＣＡＭへ、またはＣＡＭ上で形成される組織へと生育するので、インビボ血管形成のアッセイモデルとして十分に認識されている。ＣＡＭアッセイは新しい血管の成長の量および程度の双方に基づく新血管新生の阻害を示す。さらに、腫瘍組織など、ＣＡＭ上に移植されたいずれの組織の成長も容易にモニターできる。最後に、このアッセイは、アッセイ系に毒性に関する内部標準が存在するので特に有用である。ひな胚は試験試薬に曝されるので、その胚の健康状態は毒性の指標となる。
【０１６７】
Ｆ．イムノトキシンをはじめとするターゲッティング・エージェント／毒素化合物の調製
本発明のターゲッティング・エージェント／毒素化合物の調製方法も本明細書に記載される。本発明の抗体などのターゲッティング・エージェントは、架橋または組換えＤＮＡ技術のいずれかによって本発明の毒素と連結または機能し得る形で結合させて、例えば、ターゲッテッド・イムノトキシンを作製すればよい。
【０１６８】
イムノトキシンの調製は一般に当技術分野で十分公知であるが（例えば、それぞれ出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第４，３４０，５３５号および同第５，７７６，４２７号、ならびに欧州特許ＥＰ４４１６７参照）、一定の利点はイムノトキシンの調製およびその次の臨床投与のための精製の双方において一定の好ましい技術を適用することにより達成できる。例えば、毒素部分をターゲッテッド・エージェントと結合させるのに首尾よく使用できる多種のジスルフィド結合含有リンカーが知られているが、一般に薬理学的特性および能力の違いに基づき、あるリンカーが他のリンカーよりも好ましい。例えば、インビボにおける安定性がより高いためにジスルフィド結合を含む、すなわち立体的に“障害にある”リンカーが好ましく、このようにして作用部位における結合に先立ち毒素部分の遊離が妨げられる。
【０１６９】
抗内皮細胞抗体と結合し得る広範な細胞傷害剤が知られている。例としては多種の有用な植物、真菌由来の毒素または細菌由来の毒素でさえも含まれ、例示すれば種々のＡ鎖毒素、特にリシンＡ鎖、サポリンまたはゲロニンなどのリボゾーム不活性化タンパク質、サルシン、アスペルギリン、レスオリクトシン、胎盤リボヌクレアーゼなどのリボヌクレアーゼ、ジフテリア毒、および数種だけを命名したシュードモナス外毒素が挙げられる。
【０１７０】
しかしながら、薬理学的見地からは適当な生物学的応答をもたらすできる限り小さな分子を使用することが好ましい。従って、やはり適当な抗細胞応答をもたらすと考えられるより短い鎖のペプチドを使用することが好ましい。
【０１７１】
あるいは、毒素部分に対する組換えＤＮＡ技術の適用は本発明によればさらに重要な利点をもたらすことがわかる。例えば、生物学的に有効な毒素候補のクローニングおよび発現はこれまでに他の刊行物に記載されており（Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２１０：７３１ （１９８７）； Ｌａｍｂ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊｒｎｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １４８：２６５−２７０ （１９８５）； Ｈａｉｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １３：８０１９−８０３３ （１９８５））、今ややはり適当な毒素活性を示すより短い、またはその他の点での変異ペプチドを同定および調製することができる。さらに、クローン化した毒素候補の使用により位置指定突然変異誘発の適用が可能となり、これにより変異型ペプチドの調節およびスクリーニングが容易にできるようになり、さらに本発明に関する使用に有用な部分が得られる。
【０１７２】
遊離可能な毒素が意図される場合には、意図される作用部位以外の身体の他所で見られる条件下では完全な形のままである複合体を得ることが望ましく、その部位ではコンジュゲートが良好な“遊離”特性を有することが望ましい。従って、用いる特定の架橋試薬および架橋される構造をはじめ、特定の架橋スキームには重要な点がある。
【０１７３】
架橋試薬は２つの異なるタンパク質（例えば、毒素と結合剤）の官能基をともに結合する分子橋を形成するために用いられる。段階的方法で２つの異なるタンパク質を結合させるには、望ましくないホモ重合体の形成を排除するヘテロ二官能性架橋剤を使用することができる。ヘテロ二官能性架橋剤の例としては、２種の反応性基、すなわち第一級アミン基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）と反応するものと、チオール基（例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど）と反応する他のものが含まれる。第一級アミン反応性基により、架橋剤は一方のタンパク質（例えば、選択された抗体またはフラグメント）のリジン残基と反応し、チオール反応性基により、すでに第１のタンパク質と結合した架橋剤はもう一方のタンパク質のシステイン残基（遊離スルフィドリル基）と反応し得る。
【０１７４】
これらいずれかの架橋剤の２つの反応性基間のスペーサー・アームは様々な長さと化学組成を有する。長いスペーサーは複合化合物をより柔軟にし、架橋におけるいくつかの特定の成分（例えば、ベンゼン基）は反応性基に外部安定性を与えるか、または種々の状況の作用に対する化学結合の耐性を高める（例えば、還元剤に対するジスルフィド結合の耐性）。
【０１７５】
架橋剤の例としてはＳＭＰＴがあり、これは隣接するベンゼン環とメチル基による“立体障害”があるジスルフィド結合を含む二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害は組織や血液に存在し得るグルタチオンなどのチオエート陰イオンによる攻撃から結合を保護する機能を果たし、これにより結合剤により作用部位に送達する前にコンジュゲートが解離するのを防ぐ助けをする。ＳＭＰＴ架橋剤は、他の多くの公知の架橋剤ついては、システインまたは第一級アミンのＳＨのような官能基（例えば、リジンのエプシロンアミノ基）を架橋する能力を与える。もう１つの可能性ある種類の架橋剤としては、スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３−ジチオプロピオネートなどの、切断可能なジスルフィド結合を含むヘテロ二環官能性光反応性フェニルアジドが挙げられる。Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル基は第一級アミノ基およびフェニルアジド（光分解性に対して）はいずれのアミノ酸残基とも非選択的に反応する。
【０１７６】
“障害のある”架橋剤は一般に本発明の実施に好ましいが、障害のないリンカーも使用でき、これと共にやはり分かっている利点がある。保護されたジスルフィドを含むまたは形成するとは考えられないが他の有用な架橋剤としては、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰおよび２−イミノチオランが挙げられる（Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４７：５９２４−５９３１ （１９８７））。このような架橋剤の使用は当技術分野で十分理解されている。
【０１７７】
共役させたところで、共役していない毒素またはターゲッティング・エージェントなどの混入を除去するためにこのコンジュゲートを精製することが重要であろう。共役していないターゲッティング・エージェントを除去して望ましくない毒性を軽減し、共役および非共役種間で抗原に対して競合する可能性を避けることが重要である。一般に、最も好ましい精製技術はゲル濾過またはゲル浸透工程によるブルー・セファロースの使用が組み入れられる。ブルー・セファロースはＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３ＧＡおよびアガロースからなるカラムマトリックスであり、免疫コンジュゲートの精製に有用であることが分かっている（Ｋｎｏｗｌｅｓ ＆ Ｔｈｏｒｐｅ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ １２０：４４０−４４３ （１９８７））。ブルー・セファロースの使用は非共役毒素からの共役毒素の良好な分離が得られる毒素結合にイオン交換の特性を組み合わせたものである。ブルー・セファロースカラムにより共役製剤から遊離の（非共役）ターゲッティング・エージェント（例えば、抗体またはフラグメント）の除去が可能となる。遊離の（非共役）毒素を除去するには、通常のゲル濾過法または高性能液体クロマトグラフィーを用いる分子排除クロマトグラフィー工程が好ましい。
【０１７８】
当業者に十分公知の標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて本発明のターゲッティング・エージェント／毒素化合物をコードする核酸を発現させてもよい。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ組換え／遺伝子組換えがある。さらにＤＮＡおよびＲＮＡ合成は自動シンセサイザーを用いて行ってもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）に記載の技術を参照）。
【０１７９】
本明細書に記載のような組換えＤＮＡ技術によって作製した場合、本発明のターゲッティング・エージェント／毒素化合物は本明細書において“融合タンパク質”と呼ばれる。このような融合タンパク質は、その融合タンパク質が本発明の方法に従って使用され得るように、機能し得る形で連結された少なくともターゲッティング・エージェントと毒素部分を含むと理解される。この融合タンパク質はまた、その融合タンパク質のターゲッティングまたは毒素活性にあまり影響を及ぼさない限り、ターゲッティング・エージェントと毒素化合物に機能し得る形で連結するペプチドスペーサーのようなさらなるペプチド配列を含んでもよい。
【０１８０】
融合タンパク質の一部として用いられる特異な毒素化合物にもよるが、ジスルフィド結合したループ構造中に保持できる、ターゲッティング・エージェントと毒素化合物に機能し得る形で連結するペプチドスペーサーとする必要があろう。次ぎに、ループ内のタンパク質分解性切断によってヘテロ二量体のポリペプチドが得られ、ここではターゲッティング・エージェントと毒素化合物はただ１つのジスルフィド結合により連結されている。例えば、Ｌｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔｏｘｉｎｓ （Ｅｄ． Ａ． Ｆｒａｎｋ， Ｍ． Ｄｅｋｋｅｒ Ｐｕｂｌ．， ｐ． １８３） （１９９２）参照。このような毒素の例としてはリシンＡ鎖毒素がある。
【０１８１】
その他のある毒素化合物を用いる場合には、融合タンパク質のターゲッティング・エージェントと毒素化合物を機能し得る形で連結するには非切断性ペプチドスペーサーを与えてもよい。非切断性ペプチドスペーサーとの結合に使用され得る毒素としては、それ自体、タンパク質分解性切断によって細胞傷害性ジスルフィド結合型へと変換され得るものがある（例えば、Ｏｇａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５６：２０６７８−２０６８５ （１９９０）参照）。このような毒素化合物の例としてはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素化合物がある。
【０１８２】
本明細書で使用され得る核酸は、注目されるターゲッティング・エージェントをコードする核酸配列と注目される毒素化合物をコードする核酸配列とを含む。このようなターゲッティング・エージェントをコードする、また毒素エージェントをコードする核酸配列は、核酸の翻訳が本発明のターゲッティング・エージェント／毒素化合物をもたらすように連結されている。
【０１８３】
上記のものなど、標準的な技術を用いて、上記の核酸および適当な転写／翻訳制御配列を含む発現ベクターを構築してもよい。種々の宿主−発現ベクター系が使用できる。これらには、限定されるものではないが、ターゲッティング・エージェント／毒素コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮ発現ベクターで形質転換した細菌（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物；ターゲッティング・エージェント／毒素コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ））；ターゲッティング・エージェント／毒素コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュウロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ターゲッティング・エージェント／毒素コード配列を含む、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または哺乳類細胞ゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、もしくは哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、レンチウイルスベクター）を含む組換え発現構築体を有する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が含まれる。
【０１８４】
細菌系では、発現されるターゲッティング・エージェント／毒素化合物のために意図される使用に応じていくつかの発現ベクターが有利に選択できる。例えば、抗体の作製またはペプチドライブラリーのスクリーニングのために大量のターゲッティング・エージェント／毒素化合物を作製する場合には、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましいであろう。このようなベクターとしては、限定されるものではないが、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（ターゲッティング・エージェント／毒素コード配列が個々にｌａｃＺコード領域と共にベクターのフレーム内に連結されているので、さらにｌａｃＺ産物部分を含む融合タンパク質が得られる）（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ ２：１７９１ （１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １３：３１０１−３１０９ （１９８５））； Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：５５０３−５５０９ （１９８９）などが挙げられる。またｐＧＥＸベクターを用いてターゲッティング・エージェント／毒素化合物などの外来ポリペプチドをさらにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む融合タンパク質として発現させてもよい。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させた後、遊離のグルタチオンの存在下で溶出させることによって細胞溶解物から容易に精製できる。ｐＧＥＸベクターはトロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むようにデザインして融合タンパク質のターゲッティング・エージェント／毒素タンパク質をＧＳＴ部分から遊離できるようにする。
【０１８５】
昆虫系では、オートグラフ・カリフォルニア核多汗症ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いてが外来遺伝子を発現させる。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞で増殖する。ターゲッティング・エージェント／毒素コード配列はこのウイルス非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置く。ターゲッティング・エージェント／毒素コード配列の挿入が上手くいけば、ポリヘドリン遺伝子が不活性化されて、非閉塞性組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされているタンパク質性の外被を欠いたウイルス）が生産される。次ぎにこれらの組換えウイルスを用いてスポドプテラ・フルギペルダ細胞を感染させ、挿入した遺伝子を発現させる（例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ４６：５８４ （１９８３）；米国特許第４，２１５，０５１号参照）。
【０１８６】
哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルスに基づく発現系を使用できる。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合には、ターゲッティング・エージェント／毒素コード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび３部リーダー配列に連結すればよい。次ぎにこのキメラ遺伝子はインビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入すればよい。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１からＥ３）に挿入すると、生存能力があり、かつ、感染した宿主内でターゲッティング・エージェント／毒素タンパク質を発現できる組換えウイルスが得られる（例えば、Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９ （１９８４）参照）。また、挿入したターゲッティング・エージェント／毒素コード配列の有効な転写のためには特異的開始シグナルも必要とされる。これらのシグナルとして、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列がある。ＡＴＧ開始コドンをはじめ外因性の翻訳制御シグナルをさらに提供する必要がある。当業者ならばこれを容易に決定し、必要なシグナルを提供することができる。さらに、全挿入配列が確実に翻訳されるには、この開始コドンを所望のコード配列のリーディングフレームと同調させなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは多様な起源のものであってよく、天然のものでも合成のものであってもよい。発現効率は適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの包含させることによって高められる（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３：５１６−５４４ （１９８７）参照）。
【０１８７】
さらに、挿入配列の発現を調節する、または所望の特異的様式で遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする宿主細胞系を選択すればよい。このようなタンパク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）はタンパク質の機能にとって重要である。種々の宿主細胞がタンパク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾の特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。発現した外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングを確実なものとするには、適当な細胞系または宿主系を選択すればよい。この目的のためには、適切な一次転写物のプロセッシング、グリコシル化、および遺伝子酸物のリン酸化のための細胞内機構を有する真核宿主細胞を使用すればよい。このような哺乳類宿主細胞としては、限定されるものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８などが挙げられる。長期間にわたって高収量の組換えタンパク質を生産するには安定した発現が好ましい。例えば、ターゲッティング・エージェント／毒素化合物をコードする構築物を安定して発現する細胞系が操作され得る。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるよりもむしろ、宿主細胞は適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるターゲッティング・エージェント／毒素ＤＮＡと選択マーカーで形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後、操作細胞を豊富培地で１または２日間増殖させ、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミド内の選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞はそれらの染色体にプラスミドを安定して組み込むことができ、増殖して細胞叢をなし、次ぎにこれをクローン化して細胞系へと拡大することができる。
【０１８８】
限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １１：２２３ （１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボキシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｓｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ４８：２０２６ （１９６２） ）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ２２：８１７ （１９８０））をはじめいくつかの選択系が使用でき、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞で用いることができる。また、メトトレキセート耐性を付与するｄｈｆｒ （Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：３５６７ （１９８０））； Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８：１５２７ （１９８１））；
ミコフェノール酸耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８：２０７２ （１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与するｎｅｏの選択（Ｃｏｌｂｅｒｒａ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １５０：１ （１９８１））；およびハイグロマイシン耐性を付与するｈｙｇｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ３０：１４７ （１９８４））の選択の基礎として代謝拮抗物質を使用することもできる。
【０１８９】
十分に精製された化合物を調製した後、非経口投与し得る医薬組成物へと調製するのが好ましい。これは最終精製工程に好適な医薬組成物を含む媒質を用いることによってなされる。
【０１９０】
本発明の好適な医薬組成物は一般に所望のコンジュゲート約１０ないし約１００ｍｇを、滅菌水溶液などの許容される医薬希釈剤または賦形剤と混合して、最終濃度約０．２５ないし約２．５ｍｇ／ｍｌとしたものである。このような製剤は典型的にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液、または医薬賦形剤などの付加添加剤、ＢＳＡもしくはＨＳＡなどの安定剤、または塩化ナトリウムなどの塩を含む。非経口投与のためには、一般にそれらの安定性、非免疫原性および非発熱性を保証することによりさらに医薬上許容される組成物とするのが望ましい。このような技術は、出典明示により本明細書の一部とされるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ （１９８０）で例示されるように、一般に当技術分野で十分公知である。外毒素の混入は最低限安全なレベルに、例えば、０．５μｇ／タンパク質ｍｇのレベルに維持されるべきであると考えられる。さらにヒトへの投与のためには、製剤は無菌性、 発熱性、全般的な安全性および生物学的基準のＦＤＡ局により要求される純度基準を満たさなければならない。
【０１９１】
本発明に従うターゲッティング・エージェント／毒素化合物（イムノトキシンを含む）の好ましい非経口製剤は０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液ｐＨ７．５ないし９．０中、０．２５ないし２．５ｍｇコンジュゲート／ｍｌである。この製剤は−１０℃ないし−７０℃で少なくとも１年間冷凍保存できる。
【０１９２】
Ｇ．ターゲッティング・エージェントへのその他の薬剤の結合
本発明の大部分の治療適用は内皮、特に腫瘍内皮への毒素のターゲッティングを含むものと考えられる。これは他の可能性のある薬剤に比べ細胞死滅作用を送達するほとんどの毒素の能力がずっと高いことによるものである。しかしながら、ターゲット・エージェントが、ターゲッティング・エージェント／イムノトキシンなどの毒素化合物による有効な中毒と一致する経路によっては取り込まれないが、抗腫瘍薬、その他のサイトカイン、代謝拮抗物質、アルキル化剤、ホルモンなどのような化学療法薬をターゲッティングすることが望まれるといった状況があり得る。これらの薬剤の、それらの非ターゲッティング・エージェント共役対応物に優る利点は抗体などのターゲッティング・エージェントによって付加選択的に与えられる。薬剤の例としては、限定されるものではないが、ステロイド、シトシン、アラビノシド、メトトレキセート、アミノプテリン、アントラシクリン、マイトマイシンＣ、ビンカアルカロイド、デメコルシン、エトポシド、ミトラマイシンなどが挙げられる。このリストはもちろん、単に、組織への特異的送達のための抗体などのターゲッティング・エージェントに医薬剤を結合する技術が十分に確立されているという例である。
【０１９３】
特定の利点は腫瘍の画像形成への本発明の適用によって達成され得ると考えられる。腫瘍脈管構造の画像形成は、現行の画像形成技術と比べた場合、細胞が容易に利用できるという点で主な利点をもたらすと考えられる。さらに、抗体などのターゲッティング・エージェントに常磁性で、放射性で、かつ蛍光性でさえあるイオンを結合させる技術は十分確立されている。これらの方法の多くは、例えば、抗体と結合したＤＴＰＡなどの有機キレート剤を用いる金属キレート錯体に使用を含む。例えば、米国特許第４，４７２，５０９号参照。本発明に関して、選択されたイオンはこのように、抗体などのターゲッティング・エージェントによる腫瘍内皮へターゲッティングされ、結合したイオンにより画像処理が可能となる。
【０１９４】
種々の化学療法薬およびその他の薬理剤はこれまでに首尾よく抗体と共役できており、薬理学的機能することが示されている（例えば、Ｖａｉｃｋｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ ９：１９５−２０９ （１９９１）参照）。検討されている抗腫瘍薬の例としては、ドキソルビシン、ダウノマイシン、メトトレキセート、ビンブラスチン、および例えばの種々のものが挙げられる（Ｄｉｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ １：６５−７７ （１９８８）； Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ １：７９−１０３ （１９８８））。さらに、ネオカルジノスタチン（Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １１：３７３−３８１ （１９８０））、マクロマイシン、トレニモン（Ｇｈｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｘｙｍｏｎｏｇｙ ９３：２８０−３３３ （１９８３））およびα−アマニチンなどのその他の薬剤の結合も記載されている。
【０１９５】
化学療法薬の他、本発明はその他の多様な薬剤の、腫瘍脈管構造への特異的送達へ適用できると考えれる。例えば、ある状況下では、ラッセルクサリヘビ蛇毒、活性型因子ＩＸ、活性型因子Ｘまたはトロンビンなどの凝血薬の送達が望まれるかも知れない。これにより腫瘍の血液供給が凝血する。また、ホスホリパーゼＣ（Ｆｌｉｃｋｉｎｇｅｒ ＆ Ｔｒｏｓｔ， Ｅｕ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １２（２）：１５９−６０ （１９７６））またはコブラ蛇毒因子（ＣＶＦ）（Ｖｏｇｅｌ ＆ Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ １１８（２）：２６２−２６８ （１９８１））など、腫瘍内皮細胞を直接溶解するはずの細胞表面溶解剤をターゲッティングすることも考えられる。このような構造の、抗体などのターゲッティング・エージェントへの機能的に作用する結合は、例えば、ＳＭＰＴなどのタンパク質間結合剤によって容易に達成され得る。さらに、例えば、サイトカイン放出の調節を達成するためには、増殖因子、その他のサイトカイン、または細菌の外毒素もしくは細菌外毒素の脂質Ａ部分を選択された細胞種へターゲッティングするこのが望まれるかも知れない。Ｇｈｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， ＣＲＣ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ３：２６２−３５６ （１９８７）によって例示されるように、このような物質の結合も十分当技術分野の範囲内である。
【０１９６】
このように一般に、抗体のアミノ酸または炭水化物基への結合または架橋のために利用できる第一級または第二級アミン基、ヒドラジンまたはヒドラジド基、カルボキシルアルコール、リン酸基またはアルキル化基を有するいずれの薬理剤も抗体と共役させることができると考えられる。タンパク質構造の場合、このことは上記のような架橋剤により最も容易に達成される。ドキソルビシンおよびダウノマイシンの場合、結合は薬剤と抗体間の酸に不安定なアシルヒドラゾンまたはシスアコニチル結合により達成し得る。最後に、メトトレキセートまたはアミノプテリンの場合、結合は薬剤のγ−カルボキシル基と抗体のアミノ酸間の、Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａなどのペプチドスペーサーにより達成される。
【０１９７】
あるいは、核酸によってコードされる構造であるこのような構造は、例えば、上記のものなど標準的な組換えＤＮＡ技術により本発明のターゲッティング・エージェントと機能し得る形で結合させてもよい。
【０１９８】
実施例
以下の実施例は本発明の好ましい様式を例示するために含められるものである。以下の実施例のある態様は、本発明者らによって本発明の実施に十分機能することを発見または意図した技術および手法に関して記載するものである。これらの実施例は発明者らの標準的な実験室実践の使用により例示される。本開示および当技術分野の一般的なレベルに照らし、当業者には、以下の実施例は単に例次を意図するものであり、本発明の精神および範囲から外れることなく多くの置換、改良および変更が使用できることが明らかであろう。
【０１９９】
実施例１
発達中および成熟腎臓脈管構造におけるレセプターチロシンホスファターゼ、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の内皮局在性
腎臓微小血管系の発達構成は、隣接した上皮および糸球体間質細胞に関連した内皮細胞の空間的かつ時間的に調整された移動、構成、分化および成熟を必要とする規則的なプロセスである。構成の分子決定因子はたいてい確定されていないが、それでも関連する適当な内皮応答を指示する細胞表面レセプターの必要条件は予想される。レセプターチロシンホスファターゼ、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の内皮発現および分布を腎臓微小血管系発達構成中に評価した。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域エピトープに対して作製したモノクローナル抗体のその発現は、ヒトおよびマウス成熟腎臓の糸球体、管周毛細血管および腎動脈循環系における内皮細胞の膜表面に局在する。腎臓発達中、後腎間葉細胞の副次群においておよび発達中の糸球体への集積時初期の糸球体毛細血管内皮細胞の推定前駆細胞においてＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１免疫染色が明瞭である。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１は管腔膜表面に顕著に表れ、内皮間接触において斑点状に集積し、ＶＥカドヘリンとは部分的に重複するが同時には存在しない。インビトロ研究ではＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１はその分布が部分的に重複するが、またＶＥカドヘリンとは同時には存在しない密集培養ヒト腎臓および皮膚微小血管内皮細胞における内皮間接触の位置に集積されることが示されている。内皮接合部複合体からのＶＥカドヘリンの試験的解離により内皮間接触からＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１は再分配されない。これらの発見によりＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域が内皮細胞の表面で発現されるタンパク質、および細胞間接触により誘導されるタンパク質と相互に作用し合い、細胞認識、または移動もしくは増殖の停止に関するシグナルを伝達することが示される。
【０２００】
ヒト腎臓微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）において発現されるレセプターチロシンホスファターゼを同定するため、保存されたホスファターゼドメインから誘導された縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＳｃｈｏｅｃｋｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ５： ７３０ （１９９４）（要約）に記載される方法に従い、発現メッセージを提示するｃＤＮＡを増幅して、配列決定した。推定レセプターのうち、同定されたｃＤＮＡはＥＣＲＴＰ（内皮細胞レセプターチロシンホスファターゼ）と称したもの、すなわちＯｓｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．がＨｅＬａ細胞からクローニングし、ＷＩ−３８細胞における細胞密度により存在量を調整したＤＥＰ−１（密度増強型ホスファターゼ）ｃＤＮＡと実質的に同一の産物であった（Ｏｓｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１： ９６８０−９６８４ （１９９４））。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１（ｂｙｐ−１、ＨＰＴＰｈ、およびＣＤ１４８とも呼ばれる）発現は新生児平滑筋細胞、乳癌および甲状腺癌細胞系、ならびにすべての造血系統において同定されている（Ｋｅａｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６： ４２３６−４２４３ （１９９６）； ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅ−Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９１： ２８００−２８０９ （１９９８））。 ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１発現は腎臓の動脈内皮細胞において同定されたが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション試験ではＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１　ｍＲＮＡの糸球体毛細血管局在性の検出はできなかった（Ｂｏｒｇｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７９： ５７０−５８０ （１９９６））。その発現の発達タイミングおよび分布についてはまだ報告されていない。
【０２０１】
ＧＬＥＰＰ−１、ＳＡＰ−１、およびＤＰＴＰ　１０ＤをはじめとするＩＩＩ種レセプターチロシンホスファターゼ系の他のメンバーと同様に、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１は８種以上のフィブロネクチンＩＩＩ型反復配列および単一の細胞質ドメインホスファターゼ触媒ドメインを含む大きな細胞外ドメインを特徴とするＩ型膜タンパク質である（Ｏｓｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１： ９６８０−９６８４ （１９９４））。ＧＬＥＰＰ−１レセプターチロシンホスファターゼは構造的にＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と類似しているが、それでも腎臓発現が有足細胞の完全性に関わっている糸球体内臓上皮細胞に限定されることがわかっている（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４： １９９５３−１９９６２ （１９９４））。レセプターＰＴＰμ、κおよびλを含むＭＡＭドメインとは異なり、入手可能なデータは同種親和結合におけるＩＩＩ種レセプターの関与を支持しておらず、リガンドがまだ同定されていない。
【０２０２】
モノクローナル抗体はＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域エピトープに対して作製され、成熟および発達中の腎臓の腎臓循環に分配されるという特徴がある。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１は糸球体、管周および腎動脈内皮細胞で高レベルで発現され、それが毛細血管構成および維持に必要とされる細胞間認識の一助となることを示唆するインビボおよびインビトロにおける分布パターンを示す。
【０２０３】
方法
細胞系および細胞培養物−ヒト一次腎臓微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を単離、培養し、記載のように解凍した後に三次および四次継代に使用した（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， インビトロ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ３３： ２６１−２６９ （１９９７））。ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ−１細胞、ＣＤＣ）は、１５％胎児ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｌｏｇａｎ ＵＴ， ＵＳＡ）、１０ｎｇ／ｍｌ上皮細胞増殖因子（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ； Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）および１ｍｇ／ｍｌヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． ｏｆ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を含有するＭＣＤＢ１３１培地（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． ｏｆ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で増殖させた（Ａｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ９９： ６８３−６９０ （１９９２））。Ｍａｄｉｎ　Ｄａｒｂｙ　Ｃａｎｉｎｅ　Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞（Ｌ． Ｌｉｍｂｉｒｄ， Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙの厚意による提供）は、４．５％Ｄ−グルコースを含有し、１０％胎児ウシ血清を添加したダルベッコの最少必須培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）で増殖させた。すべての増殖培地に１ｍＭ　Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を添加した。
【０２０４】
組換えＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１タンパク質に対する抗体の作製−ヒトＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１レセプターの外部領域（アミノ酸１７５−５３６）および触媒ドメイン（アミノ酸１０４８−１３３８）配列（Ｏｓｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１： ９６８０−９６８４ （１９９４））をｐＲＳＥＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｌａｎｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にサブクローニングした。組換え融合タンパク質を細菌で発現させ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｏｆ Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの登録商標ＮＩ−アガロースアフィニティーの下に販売されているキットで精製し、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより４０および３６ｋＤａそれぞれの９５％を越える相同性をもったタンパク質として特定した。マウスハイブリドーマ抗体（ＥＣＲＴＰＡｂ−１、ＥＣＲＴＰＡｂ−２）は、腹膜内で免疫化し、ＳＰ２−０細胞と融合させ、ＥＬＩＳＡスクリーニングにかけ、選択、伸長し、さらにＰＲＯＴＥＩＮ　Ａ−ＡＧＡＲＯＳＥ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． ｏｆ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製することによりＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域（ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ｅｃ）タンパク質に対して作製される。
【０２０５】
外因性発現したＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の免疫検出−１００ｍｍプラスチック皿（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｆｒａｎｋｉｎ Ｌａｋｅｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙにより登録商標Ｆａｌｃｏｎとして販売）で増殖させたＭＤＣＫ細胞を、製造業者のプロトコールに従い、陽イオン脂質（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｗｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いて血球凝集素ペプチド（ＨＡ）の３反復配列をカルボキシ末端に加えて改変したヒトＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１レセプターの高レベルの発現を行う発現プラスミドｐＳＲａ　ＤＥＰ−１／３ｘＨＡでトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、細胞を氷上に置き、氷冷ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、直ちに０．５ｍｌ溶解緩衝液（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．５、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、２μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭ　ＰＭＳＦ）で溶解した。溶解物を遠心分離により清澄化し、膜レセプターを４℃で４時間のＷＧＡ−アガロース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． ｏｆ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）へのバッチ吸着により回収した。得られた沈降物を還元条件下で７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、イモビロン−Ｐトランスファーメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に移し、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１３７ｍＭ　ＮａＣｌ）中の５％脱脂粉乳で４℃で一晩ブロッキングした。ブロットをマウスモノクローナルＥＣＲＴＰＡｂｓ１または２（１０μｇ／ｍｌ）もしくは抗ＨＡ（２．５μｇ／ｍｌ）抗体と共にインキュベートし、次いでセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄｉａｎａ）とインキュベートした。メンブランをＴＢＳＴで洗浄した後、製造業者の指示に従い、化学ルミネセンス基質（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて顕出させた。
【０２０６】
安定的にトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞の作出および細胞染色−ＭＤＣＫ細胞を、製造業者のプロトコールに従い、陽イオン脂質（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いて発現プラスミドｐＣＤＮＡ３　ＤＥＰ−１／３ｘＨＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトした。安定的にトランスフェクトした細胞を、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）を培地に最終濃度８００μｇ／ｍｌで加えて選択し、制限希釈クローニングにより単一コロニーを得た。この細胞をカバーグラス（Ｆｉｓｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａｒ）で増殖させ、１００％メタノールにより−２０℃で１０分間固定した。カバーグラスをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、５％ヤギ血清により室温で３０分間ブロッキングし、ＥＣＲＴＰＡｂ−２（１０μｇ／ｍｌ）と共に６０分間インキュベートし、洗浄した後、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）と共に６０分間インキュベートした。カバーグラスを固定して共焦顕微鏡（登録商標Ｚｅｉｓｓ， ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ， Ｇｅｒｎａｍｙにより、ＺＥＩＺＺ ＬＳＭ４１０の名で販売されている装置）により解析した。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１−Ａｂの免疫反応性を予め吸着させるため、５０μｇのＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１タンパク質（ＥｃまたはＣｙ）をＥＣＲＴＰＡｂ−２と共に４℃で４時間予備インキュベートし、１５，０００ｒｐｍで２０分間マイクロ遠心分離にかけ、得られた上清を用いて細胞を染色した。
【０２０７】
組織免疫局在性−ヒト腎臓組織をドライアイス−アセトン浴で急速凍結した。クリオスタット切片（４ｍｍ）をアセトン中−２０℃で１０分間固定し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、製造業者の指示に従い、アビジン−ビオチンブロッキング試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． ｏｆ Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で予め吸着した。切片をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、５％ヤギ血清によりブロッキングし、モノクローナルＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１レセプター抗体（ＥＣＲＴＰ−Ａｂ１、１０μｇ／ｍｌ、１０分）と共にインキュベートし、洗浄し、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、７．５μｇ／ｍｌ、６０分）と共にインキュベートし、洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ｏｆ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、 ４μｇ／ｍｌ、３０分）と共にインキュベートし、最後にリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。カバーグラス（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． ｏｆ Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａにより、商標Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄの名で販売）を固定して共焦顕微鏡（（登録商標Ｚｅｉｓｓ， ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ， Ｇｅｒｎａｍｙにより、ＺＥＩＺＺ ＬＳＭ４１０の名で販売されている装置）により解析した。同時位置決定試験（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）ではアセトンで固定した凍結切片を５％ロバ血清によりブロッキングし、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１レセプター抗体（１０μｇ／ｍｌ）およびヤギＶＥカドヘリン抗体（５μｇ／ｍｌ、 Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の混合物と共に室温で６０分間インキュベートした。特異的な抗体をＦＩＴＣ結合ロバ抗マウスおよびローダミン結合ロバ抗ヤギ抗体の混合物（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を用いて室温で６０分間検出した。同一切片についての波長４８８ｎｍおよび５６８ｎｍそれぞれにおけるＺｅｉｓｓ　ＬＳＭ４１０共焦顕微鏡による解析で得られた重複画像において各抗原の特異的免疫染色を同定した。
【０２０８】
免疫標識したマウス腎臓切片は高いバックグラウンドを示し、別の手法を必要とした。抗ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１レセプター　ｍＡｂ、ＥＣＲＴＰ−Ａｂ１とＦＩＴＣとを直接結合した。便宜には、ＥＣＲＴＰ−Ａｂ１（０．１Ｍ　炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０中０．９４ｍｇ　ＩｇＧ／ｍｌ、０．５５ｍｌ）と０．０３ｍｌＦＩＴＣ溶液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＤＭＳＯ中１．０ｍｇ／ｍｌ）とを４℃で一晩結合した。塩化アンモニウムを最終濃度５０ｍＭまで加えて反応を停止させた。４℃で２時間のインキュベーションの後、混合物をリン酸緩衝生理食塩水で徹底的に透析し、結合していないＦＩＴＣを除去した。同じプロトコールを用いてＦＩＴＣと結合したラット糸球体基底膜に対するマウスモノクローナルＩｇＧをコントロールとして用いた（Ｈｙｉｎｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７０： Ｆ８８６−Ｆ８９９ （１９９６））。アセトンで固定した切片を０．５Ｍ塩化アンモニウムによりブロッキングし、ＭｏＡｂ−ＦＩＴＣコンジュゲートと共に３０分間インキュベートし、洗浄し、エピ蛍光顕微鏡観察により調べた。さらなるいくつかのコントロール実験では切片とのインキュベーションの前に、抗ＤＥＰ−ＦＩＴＣコンジュゲートと１モル過剰の免疫化ペプチドとを混合した。
【０２０９】
ヒト内皮細胞系の免疫ブロットおよび免疫組織化学
６０ｍｍ皿で増殖させたヒト内皮細胞を密集したとき、０．５ｍｌ溶解緩衝液（２０ｍＭ　ＴｒｉｓＣｌ　ｐＨ７．５、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５％ＳＤＳ、０．５％デオキシコレート、２μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭ　フェニルメチルスルホニルフルオリド）で氷上で３０分間溶解した。清澄化した溶解タンパク質１５０μｇをアフィニティー精製したウサギＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１レセプター抗体またはウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． ｏｆ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）１０μｇ／ｍｌと共に４℃で４時間インキュベートし、免疫沈降物をタンパク質Ａセファロース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． ｏｆ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を用いて回収した。ＳＤＳ−ＰＡＤＥおよび免疫ブロット手順は前記のように行った。内皮細胞をコーティングの施していないカバーグラス（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｈｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）で増殖させた後、５０％メタノールにより４℃で１０分間固定した。カバーグラスをＰＢＳで洗浄し、５％ヤギ血清により室温で３０分間ブロッキングし、ＥＣＲＴＰＡｂ−２モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）またはＶＥカドヘリンモノクローナル抗体（２μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）と共に６０分間インキュベートし、洗浄した後、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｏｆ Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に６０分間インキュベートし、洗浄し、最後にフルオレセイン結合（ＦＩＴＣ）ストレプトアビジン（４μｇ／ｍｌ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ｏｆ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）と共に３０分間インキュベートした。カバーグラスを固定して共焦顕微鏡（登録商標Ｚｅｉｓｓ， ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ， Ｇｅｒｎａｍｙにより、ＺＥＩＺＺ ＬＳＭ４１０の名で販売されている装置）により解析した。
【０２１０】
内皮カドヘリン複合体を解離させるカルシウムのキレート化−１５％胎児ウシ血清を添加したＤＭＥＭ培地のカバーグラスで増殖させた密集ＨＭＥＣ−１細胞をＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（ｂ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． ｏｆ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）に、最終濃度５ｍＭに達するまで加えて曝した。細胞をさらに２０分間インキュベートした後、５０％メタノールにより４℃で１０分間固定し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、前記のようにモノクローナルＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１抗体（１０μｇ／ｍｌ）またはＶＥカドヘリンモノクローナル抗体（２μｇ／ｍｌ、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）で染色した。
【０２１１】
結果−モノクローナル抗体は組換えおよび発現されたＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を認識する。外部領域（Ｅｃ）または細胞質ドメイン（Ｃｙ）いずれかのＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１配列を提示する組換え融合タンパク質を細菌で発現させ、ウサギおよび／またはマウスの免疫化に使用した。図１Ａに示されるように、モノクローナル抗体、ＥＣＲＴＰＡｂ−１およびＥＣＲＴＰＡｂ−２は外部領域組換えタンパク質を特異的に同定するが、細胞質ドメインのものは同定しない。これらの抗体が哺乳類細胞で発現される全長タンパク質を認識するかどうかを確かめるため、ＭＤＣＫ細胞をエンプティ発現プラスミド（ＳＲａ）またはカルボキシ末端に血球凝集素エピトープ（ＳＲａ　ＤＥＰ−１／ＨＡ）タグを付けた全長ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の発現を駆動するもののいずれかで一時的にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞の細胞溶解物をエピトープ特異的モノクローナル抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降させた後、ＥＣＲＴＰＡｂ−１およびＥＣＲＴＰＡｂ−２（図１Ｂ）をはじめとする示された抗体でプローブした。両者とも２２０ｋＤａ　ＨＡタグ付きＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を認識した。
【０２１２】
最後に、モノクローナル抗体が無傷な細胞で発現されるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を特異的に認識する能力を、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１で安定的にトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞を用いて調べた。ＥＣＲＴＰＡｂ−２による間接エピ蛍光染色でＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を細胞膜外側（図１Ｃ、パネルａ）に局在化したが、この知見は透過膜支持体上で密集まで増殖させたＭＤＣＫ細胞の共焦Ｚ面切片において確かめられた。免疫化ペプチド（Ｅｃ）との競合により免疫染色はブロッキングされた（図１Ｃ、パネルｃ）が、関連のない細胞質ドメイン融合タンパク質（Ｃｙ）はブロッキングされなかった（図１Ｃ、パネルｄ）。
【０２１３】
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１免疫反応性は糸球体毛細血管、管周毛細血管および腎動脈の内皮細胞に局在する。哺乳類成熟腎臓におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の分布を決定するため、間接または直接免疫蛍光染色試験をヒトおよびマウス起源の凍結切片で行った。図２に示されるように、ＥＣＲＴＰ−Ａｂ２ではＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１発現は動脈、糸球体および管周毛細血管に、特にこれらの部位の内皮細胞に免疫局在化される。高倍率のフレームでは少なくとも内皮膜の定義づけが最も確実な動脈部位の内皮細胞管腔膜に沿って標識する優勢なＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１が示される（図３）。
【０２１４】
糸球体微小循環系の斑点状染色特性によりＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１が内皮接合部複合体に加わるかどうかの評価がなされた。ＥＣＲＴＰ−Ａｂ１およびＶＥカドヘリン抗体を用いる二重標識研究ではいくつかの重複がはっきりとわかった（図３）。管腔内皮膜染色に加え、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の局所集積はＶＥカドヘリンを含む内皮接合部複合体に限定されるものではないが、内皮間接触、重複の地点でも明らかであった（Ｌａｍｐｕｇｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２９： ２０３−２１７ （１９９５）。このパターンは動脈および管周毛細血管の双方でもはっきりとわかった。腎外部位では脳、肺、肝臓および脾臓の毛細血管および大脈管内皮細胞が確認され、心臓内染色もはっきりとわかった。
【０２１５】
成熟腎臓の血管内皮における顕著なＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１発現に基づき、このレセプターのマウス胎児の腎臓血管発達中の時間的かつ空間的発現を調べた。図４に示されるように、ＥＣＲＴＰ−Ａｂ１は、その類似した染色パターンがマウスおよびヒト成熟腎臓であることから、さらにマウス組織の染色をブロッキングする組換えヒト免疫原（Ｅｃ）の作用から抗原、そのマウスＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１として結合する。Ｅ１４、Ｅ１６および生後６日における発達中のマウス腎臓のＥＣＲＴＰ−Ａｂ１−ＦＩＴＣの結合体（図４Ａ〜Ｃ）は、ＶＥＧＦレセプター、ｆｌｋ−１およびＥｐｈＢ１／ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１レセプター−リガンドに対する抗体を用いて前記で見られたパターンと極めて類似した免疫反応性パターンを示した（Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ，． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ５０： Ｓ−７３−Ｓ−８１ （１９９６））。特に、ＥＣＲＴＰ−Ａｂ１−ＦＩＴＣは胎児腎臓皮質の発達中の糸球体および微細血管内皮細胞と結合した。小さいが強い結合した抗体のフォーカスは血管芽細胞と考えられる単離皮質間葉細胞で見られた（図４Ａおよび４Ｂ）。発達中のコンマおよびＳ形糸球体の血管裂内で糸球体内皮前駆細胞と一致する細胞の副次群が標識された（図４Ａおよび４Ｂ）。
【０２１６】
新生児腎臓切片におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の免疫標識では、はっきりと識別できる血管標識パターンが得られた（図４Ｃ）。細動脈、糸球体および管周毛細血管内皮はすべて強く標識された（図３Ｃ）。成人マウス腎臓では、ヒト腎臓切片と同様に糸球体内皮細胞もまた明らかに標識された。未発達および成熟腎臓内の他の細胞はＥＣＲＴＰ−Ａｂ１−ＦＩＴＣと結合せず、切片をコントロールモノクローナルＩｇＧ−ＦＩＴＣ結合体、またはＥＣＲＴＰ−Ａｂ１−ＦＩＴＣの混合物で標識したが、免疫化ペプチド（Ｅｃ）は染色されないことがわかった。
【０２１７】
ＥＣＲＴＰ−Ａｂ１を用いる独立した免疫ブロットおよび免疫蛍光染色試験では、異なる血管部位の範囲から培養した、そのクローニング起源であるＨＲＭＥＣ、皮膚微小血管内皮細胞系、ＨＭＥＣ−１（Ａｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ９９：６８３−６９０ （１９９２））；ヒト臍帯静脈内皮細胞；およびＨＵＶＥＣ誘導細胞系、Ｅａｈｙ９２６（Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １５３： ４３７−４４９ （１９９２））を含む内皮細胞において高レベルの発現が示された。この抗体により認識されたエピトープはＨＥＫ２９３細胞、糸球体糸球体間質細胞、血管平滑筋細胞、およびＰ１９胚性癌腫細胞をはじめとする非内皮細胞系では検出されなかった。
【０２１８】
図５ではヒト腎臓微小血管内皮細胞、ＨＲＭＥＣ（パネルＡ）、およびヒト皮膚微小血管内皮細胞、ＨＭＥＣ（パネルＢ）におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１局在性パターンが示されている。ＨＲＭＥＣ密集培養物では内皮間接触地点でＥＣＲＴＰ−Ａｂ２による顕著な染色が示された。さらに、基底膜表面ではなく、頂部表面（パネルＡ）を捕らえる共焦面において頂部膜染色の斑点状の集積があった。互いの接触を絶つのに十分な低い濃度で培養された内皮細胞は接触細胞に見られる細胞境界の顕著な染色パターンを示さなかった。ＥＣＲＴＰ−Ａｂ１ではＥＣＲＴＰ−Ａｂ２で見られる内皮間の局在性は示されなかったが、頂部表面においてレセプターの副次群だけがはっきりと染色されたことは注意すべきである。
【０２１９】
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の内皮細胞間接触部位におけるこの明白な集積は無傷な成熟脈管に見られる染色の斑点状集積と一致しており、レセプターの副次群が内皮間接触の地点に分布していることが示唆される。よって、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の分布をＶＥカドヘリンと比較した。ＨＭＥＣ密集培養物の二重標識試験におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１およびＶＥカドヘリン免疫反応性の共焦位置決定ではまた、内皮間接合部に存するＶＥカドヘリンによるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１染色ではわずかな重複が示された。ヒト腎臓組織の二重標識切片において同時局在化の類似パターンが見られた（図３）。最後に、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１免疫反応性の細胞間集積にＶＥカドヘリン相互作用の完全性が必要であるかを確かめるため、試験を行った。図５Ｂに示されるように、ＨＭＥＣ−１細胞のＥＧＴＡ処理により内皮間接合部複合体からＶＥカドヘリンが解離するが、２０〜３０分間にわたる試験ではＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の局在性への明白な影響はない。この結果はＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を保有するいずれの内皮間接合部ではカドヘリンの完全性が必要でないことを示している。さらに、これらのデータはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１およびＶＥカドヘリンは部分的に重複するが、正確には無傷な脈管内皮細胞において同時には存在しないという観察に一致している（図３）。
【０２２０】
考察−本明細書に示されたいくつかの観察は、血管の発達および内皮細胞間相互作用におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１チロシンホスファターゼについての新たな見解を提供する。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の、培養したヒト腎臓微小血管内皮細胞で発現された転写物としての最初の同定の重要性はいくつかのレベルで確認されてきた（Ｓｃｈｏｅｃｋｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ５： ７３０ （１９９４）（要約））。まさに糸球体および管周毛細血管が無傷な腎臓組織で行うように培養したＨＲＭＥＣのものは細胞膜上でタンパク質を発現する。実際には、毛細血管および動脈内皮はヒトおよびマウス成熟腎臓におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１発現の有力な細胞源と考えられる。Ｂｏｒｇｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７９： ５７０−５８０ （１９９６）に記載された前記のラット腎臓におけるｉｎ ｓｉｔｕ試験に対し、高レベルの発現がマウスおよびヒト双方の糸球体において見られた。
【０２２１】
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１が分布する膜の部位についての慎重な評価では、糸球体毛細血管におけるいく分かの粒状染色パターンの原因と思われる内皮間膜染色に加え、動脈内皮における顕著な頂部膜染色を示した。人工ＭＤＣＫ上皮細胞系および接触培養ＨＲＭＥＣにおけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の細胞膜外側の分布（図５）により、ＶＥカドヘリン複合体完全性とＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１膜外集積との関係の評価が外見的になされた。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１およびＶＥカドヘリン免疫染色とのｉｎ ｓｉｔｕ重複はわずかであり（図３）、すべてではないがいくつかの接合部複合体において内皮間接触の極めて焦点に近い領域に限定される。カルシウムのキレート化によりＶＥカドヘリン複合体を解離した培養内皮細胞ではＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の膜外分布が維持されるため、内皮間複合体を維持したＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１分布の解剖学的同時位置決定も機能的相互関係もないことが推断される。しかしながら、これらの発見ではＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１膜外分布の作用によりＶＥカドヘリンを含む内皮間複合体の構成を許容する条件が確立されるという可能性を排除できない。
【０２２２】
また膜外分布はＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１細胞外ドメインと、ジャクスタクリン結合により得られたリガンド−レセプター複合体においてレセプターを再分布させ、安定化させ得る膜との接触において発現した推定リガンドとの相互作用に反映される。確かに、膜関連レセプターチロシンホスファターゼ活性が内皮細胞を含む密に接触した培養細胞で増大するという有効な証拠がある（Ｐａｌｌｅｎ ａｎｄ Ｔｏｎｇ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ　ＵＳＡ ８８： ６９９６−７０００ （１９９１）； Ｂａｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３： ３４０８−３４１４ （１９９８））。本実施例に示した培養系では細胞密度および細胞密度媒介の増殖停止と相関するＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性の増大が証明された。
【０２２３】
動脈における、および明らかに毛細血管内皮におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の頂部膜分布、特に血小板およびすべての造血系統がＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１レセプターを発現することを示すデータについては興味がそそられる（Ｐａｌｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ５７： １０１−１０３ （１９９７））。レセプターと無傷の脈管の管腔膜において出合う内皮細胞および循環細胞のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１間の同種親和性相互作用により、それぞれの連動している細胞の調節因子または補助レセプターがいずれの下流応答の調節にも重要でありそうなことが示唆されている。
【０２２４】
最後に、糸球体毛細血管網の構成の一助となる細胞におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１発現の発達パターンを評価するデータにより、この調整されたプロセスにおけるこのレセプターの役割についての見解が与えられる。ＤＰＴＰ１０ＤをはじめとするＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１サブクラスのレセプターチロシンホスファターゼには発達中にニューロンを正確な目的へと導く重要な役割が与えられいる（Ｄｅｓａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８４： ５９９−６０９ （１９９６））。これまでの報告では赤血球、リンパ球、および骨髄系統を含む造血源において発現が確認されている（Ｐａｌｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ５７： １０１−１０３ （１９９７））。血管芽細胞が造血および血管内皮系統両方の共通の前駆細胞であるという証拠の累積により、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１発現がこれらの前駆細胞の個体発生初期に開始されることがわかる。さらに、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１が作用してそれを発現する赤血球系統細胞の分化を促進し得ることもわかる（Ｋｕｍｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７１： ３０９１６−３０９２１ （１９９６））。
【０２２５】
実施例２
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１が内皮の増殖停止および移動阻害のシグナルを媒介する
トロンボスポンジン、アンギオスタチンおよびエンドスタチンなどの血管形成の強力な内因性阻害剤は、インビトロにおける培養内皮細胞の増殖および移動を阻害する。このような血管形成阻害調節は、内皮表面レセプターを保証することによる内皮の増殖および移動のシグナルによる停止であると考えられる。培養内皮細胞の最も強力な増殖阻害シグナルの１つは細胞間接触により得られ、これは“密度媒介性増殖停止”または“接触媒介性増殖停止”として当技術分野において記載されている。ヒト腎臓およびその他の器官の微小血管および大脈管内皮での内皮間接触におけるレセプターチロシンホスファターゼ、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の高レベルの発現については実施例１に記載されている。
【０２２６】
本実施例ではＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１が内皮増殖および移動停止シグナルを媒介することが確かめられた。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１は細胞間接触に関与して触媒作用によって活性化される。全長ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の一時的過剰発現によって内皮増殖および移動が停止する。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域と結合する二価形態のモノクローナル抗体、ＥＣＲＴＰＡｂ−１は内皮増殖および移動を阻害するが、Ｆａｂフラグメントは不活性である。この抗体はマウス系の角膜血管形成応答を阻害する。これらの発見は、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１が、接触している内皮細胞の表面にあるそのリガンドとの結合部分に内皮増殖および移動停止シグナルを送ること、さらに内皮増殖停止シグナルの代用アクチベーター、またはモジュレーターが血管形成阻害剤の実現性ある候補であることが示される。
【０２２７】
方法
細胞培養物−ヒト腎臓微小血管内皮一次細胞ＨＲＭＥＣを、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ３３： ２６１−２６９ （１９９７）に記載されるように、単離し、培養し、解凍した後に第３および第４継代に使用した。ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ−１細胞、ＣＤＣ）を１５％胎児ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｌｏｇａｎ ＵＴ， ＵＳＡ）、１０ｎｇ／ｍｌ上皮細胞増殖因子（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ； Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）および１μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．ｏｆ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を含有するＭＣＤＢ１３１培地（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．ｏｆ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で増殖させた（Ａｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ９９： ６８３−６９０ （１９９２））。すべての増殖培地に１ｍＭ　Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）を添加した。
【０２２８】
抗体−ヒトＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の外部領域（ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ｅｃ、アミノ酸１７５−５３６）および触媒ドメイン（ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ｃｙ、アミノ酸１０４８−１３３８）配列（Ｏｓｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１： ９６８０−９６８４ （１９９４）をｐＲＳＥＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｌａｎｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にサブクローニングした。組換え融合タンパク質を細菌で発現させ、Ｎｉ−アガロースアフィニティー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｌａｎｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で精製し、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより４０および３６ｋＤａそれぞれの９５％を越える相同性をもったタンパク質として特定した。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ｃｙタンパク質に対するウサギ抗血清は、Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３： ２０４−２１１ （１９９３）に記載されるように、免疫化を繰り返して産生し、アフィニティー精製した。マウスハイブリドーマ抗体ＥＣＲＴＰＡｂ−１は、腹膜内免疫化、ＳＰ２−０細胞との融合、ＥＬＩＳＡスクリーニング、選択、伸長、およびタンパク質Ａ−アガロース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）でのアフィニティークロマトグラフィー精製によるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ｅｃタンパク質での免疫化の後に得られた。
【０２２９】
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１存在量およびチロシンホスファターゼ活性のアッセイ−高密度で培養し、図面の説明で示された時間に回収した細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水で反復洗浄した後、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、１ｍＭ　β−メルカプトエタノール、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含有する緩衝液２ｍｌを加えた。洗浄剤で溶解した細胞を４℃で１５分間インキュベートし、１３，０００×ｇ、４℃で１０分間のマイクロ遠心分離を繰り返して（２回）不溶性物質を除去した。溶解画分のタンパク質を改良ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ｏｆ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を用いて定量した。いくつかの試験では、アガロース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）に結合した小麦胚（ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ）レクチン（ＷＧＡ）からのバッチ吸着および溶出については、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１； ２３５８８−２３５９３ （１９９６）に記載されるように行った。ホスファターゼアッセイに付した画分の最終溶出物を２５ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．２）、０．１ｍｇ／ｍｌウシアルブミン、１０ｍＭジチオトレイトール（ホスファターゼアッセイ緩衝液）、および３ｍＭ　Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’トリアセチルキトトリオース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を含有する緩衝液中に入れた。
【０２３０】
３２Ｐ−標識したリン酸化基質（Ｒａｙｔｉｄｅ）は、記載される製造業者（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｕｎｉｏｎｄａｌｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）の推奨により調製し、（ｄｐｍ／ｆｍｏｌ）の比活性を達成した。レクチン精製画分のホスファターゼ活性を、記載されるようにＮａ３ＶＯ４の存在または不在下において３００ｎｇ／ｍｌ基質を用いて２００μｌ容量のホスファターゼ緩衝液中、３０℃で図面の説明で示された時間に３反復でアッセイした。解離したホスファターゼをシンチレーション計数により定量し、データを平均ｃｐｍ＋／−標準誤差として示した。アッセイは１〜１０分間にわたり線形であった。
【０２３１】
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性および存在量（図８）を求めるため、ＨＲＭＥＣ細胞を図面の説明で示された細胞密度で培養した。培養３６時間後、指示されるように、細胞の部分集団を過バナジウム酸塩（１ｍＭ　Ｈ２Ｏ２−１ｍＭ　Ｎａ３ＶＯ４）で１０分処理した後、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ／ｐＨ７．５、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、５μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含有する緩衝液に溶解し、遠心分離により清澄化し、同量の溶解タンパク質（１５０μｇ）を、アフィニティー精製した単一特異的ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ウサギ抗体（１２．５μｇ／ｍｌ）との４℃で一晩のインキュベーションにより免疫沈降させ、タンパク質Ａセファロース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で回収した。
【０２３２】
洗浄した免疫複合体を、Ｗａｎｇ． Ｙ． ａｎｄ Ｐａｌｌｅｎ， Ｃ． Ｊ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７： １６６９６−１６７０２ （１９９２）にてこれまでに記載されているように、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ｐＮＰＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を用いてＰＴＰ活性についてアッセイした。便宜には、免疫複合体を反応混合物（５０ｍＭ　酢酸ナトリウム／ｐＨ５．５、０．５ｍｇ／ｍｌウシアルブミン、０．５ｍＭ　ＤＴＴ、５ｍＭ　ｐＮＰＰ）と共に、１ｍＭ　Ｎａ３ＶＯ４の不在または存在下において３０℃で３０分間インキュベートした。２Ｎ　ＮａＯＨを加えて反応を停止させ、４１０ｎｍで吸光度を測定した。
【０２３３】
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１存在量を定量化するため、免疫沈降画分を還元条件下で７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、ＰＶＤＦメンブラン（登録商標イモビロン−Ｐとして、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｏｉｎ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから販売）に移し、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１３７ｍＭ　ＮａＣｌ）中の５％脱脂粉乳で４℃で一晩ブロッキングした。ブロットをＥＣＲＴＰＡｂ１（１０μｇ／ｍｌ）またはホスホチロシンモノクローナル抗体、４Ｇ１０（１．０μｇ／ｍｌ、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共にインキュベートし、結合した抗体をセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）および化学ルミネセンス試薬（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて検出した。
【０２３４】
増殖アッセイ−ＨＲＭＥＣ増殖（図６）の開始アッセイでは、細胞を指示された密度で培養し、指示された時間に回収して、５反復で計数した。データは平均±標準誤差で示している。他の試験（図８および９）では、ＨＭＥＣ−１細胞を３５ｍｍ径皿（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙから、登録商標Ｆａｌｃｏｎの名で販売）で増殖させ、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１レセプター発現プラスミド（カルボキシ末端血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグ付きヒトＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の高レベルの発現を行う、親ベクターｐＳＲαまたはｐＳＲα−ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１／３ｘＨＡのいずれか、１．８μｇ）および緑色蛍光タンパク質発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、０．４μｇ）で同時トランスフェクトした。これらの条件下でＨＭＥＣ−１細胞の４０〜５０％をトランスフェクトするアデノウイルスによるリポフェクタミン法を用い、これは実施例１にも記載されている。トランスフェクション４８時間後にトランスフェクト細胞を回収し、１２ウェルプレートの個々のウェルにおけるカバーグラスで、図面の説明で示された密度（範囲２〜１０×１０４）において再び培養し、付着した細胞は２０〜９０＋％密集に達した。トランスフェクション７０時間後に１０μＭ　５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）を培地に加え、増殖中の細胞を３０分間標識した。ＢｒｄＵ取り込みを、製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄｉａｎａ）のプロトコールに従い、モノクローナルＢｒｄＵ抗体およびローダミン結合抗マウスＩｇＧを用いて免疫組織化学的に検出した。少なくとも５つの独立した場所の細胞をエピ蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ Ｅ６００（登録商標））下で観察し、ＧＦＰ陽性細胞におけるＢｒｄＵ標識頻度を評価した。
【０２３５】
平面内皮移動アッセイ−平面内皮移動アッセイを開発し、３００〜５００μ径の円形“創傷”の内皮閉鎖速度を調べた。ドリルプレスに備わる回転シリコンビットを用いてマルチウェルプレートの各ウェル内の密集内皮単層に３〜５の“創傷”を創った。“創傷”の際、各ウェルの培地に図面の説明で指示された濃度の薬剤を添加した。指示された時間（４および８時間）に取り込んだ顕微鏡写真画像の各傷の残存面積をＮｉｋｏｎ　Ｄｉａｐｈｏｔ顕微鏡に対応させたＢｉｏｑｕａｎｔ（Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ， Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ）ソフトウェアパッケージを用いて定量した。この方法で表すと、傷の閉鎖速度は著しく線形であり、直線線形回帰ｒ２値＞０．９８５である。本明細書に示された各データポイントは、同一ウェルの各３回以上の測定の平均±標準誤差を表している。記載した各試験は３回以上の独立した観察による典型的な研究結果である。
【０２３６】
移動についてのｉｎ ｓｉｔｕトランスフェクションアッセイ−６ウェル培養プレートで増殖させた密集ＨＭＥＣ−１細胞を２．２μｇの発現プラスミド、ｐＳＲαＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１／３ｘＨＡまたはｐＳＲα−ＥｐｈＢ１／３ｘＨＡ（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １２； ６６７−６７８ （１９９８））でトランスフェクトし、記載されるようにトランスフェクション４８時間後に円形の傷を創った。傷がほぼ閉鎖した（創傷１２時間後）ときに単層を２％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、０．０２％サポニンで透過性を付与し、５％ヤギ血清によりブロッキングし、５μｇ／ｍｌのモノクローナルＨＡ抗体、１２ＣＡ５（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｍｐａｎｙ（ＢＡｂＣｏ）， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に６０分間インキュベートした。次いでカバーグラスをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． ｏｆ Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、７．５μｇ／ｍｌ）と共に６０分間インキュベートし、洗浄し、ＨＲＰ結合アビジン−ビオチン複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． ｏｆ Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に３０分間インキュベートし、最後に６ｍｇ／ｍｌの３，３’−ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を用いて顕出させた。
【０２３７】
角膜ポケット血管形成アッセイ−血管形成または抗血管形成活性を調べる薬剤を、Ｋｅｎｙｏｎ， Ｖｏｅｓｔ， ｅｔ ａｌ．， （１９９６）に記載されるように約０．２μｌ容量の不活性ヒドロン（ｈｙｄｒｏｎ）ペレット内に入れて緩効性形態にした。ペレットを麻酔をかけたＣ５７ＢＬマウスの顕微鏡解剖により作出したポケットの角膜上皮に埋植する。５〜７日にわたり、血管形成因子は脈管化した隣接角膜周辺の脈管の内増殖を刺激する。細隙灯写真撮影により写真による記録を行う。これらの脈管の見かけの密度および大きさを評価し、評点を付ける。いくつかのケースでは、犠牲にする前の進行の時間経過は麻酔をかけた動物に合わせる。脈管を、長さ、密度、およびそれらが発達する周辺のラジカル表面（時計の文字盤時間として表す）について評価する。
【０２３８】
結果−ヒト腎臓微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）が血清添加増殖培地において増殖停止を示す細胞密度（細胞数／表面積）を確認するため、開始試験を行った。ｉｎ ｓｉｔｕ試験ではヒト腎臓の糸球体および糸球体外微小血管内皮細胞、ならびに動脈および広範なその他の組織においてＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の高レベルの発現が示されている。図６Ａでは、同数のＨＲＭＥＣを、指示されるように３５ｍｍ径皿の１、２．９、または８．１倍の表面積の９．６、２８．３、または７８．５ｃｍ２の細胞培養プレートで培養した。増殖培地は３日ごとに取り替えた。継体数により、ＨＲＭＥＣは約１．３〜６×１０４細胞／ｃｍ２の密度で増殖停止、最大増殖刺激に対する応答に取って代わる応答に達した。密度が制限されない条件下での倍加時間は約４４時間である。確認したヒト皮膚微小血管内皮細胞系、ＨＭＥＣ−１も同様に、密度媒介性増殖停止特性を示した。
【０２３９】
繊維芽細胞密度の増大と膜結合画分から回収されたチロシンホスファターゼ活性の増大との関係は以前からあった。例えば、Ｐａｌｌｅｎ， Ｃ． Ｊ． ａｎｄ Ｔｏｎｇ， Ｐ． Ｈ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ　ＵＳＡ ８８： ６９９６−７０００ （１９９１）参照。膜結合タンパク質のうち、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を含む表面レセプターを外部領域のＮ−結合グリコシル化によって改変し、レクチンアフィニティークロマトグラフィーを用いて回収してもよい。Ｈｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８４： ４１８６−４１９４ （１９９４）． 図６Ｂに示されるように、同数の培養ＨＲＭＥＣから回収した小麦胚（小麦麦芽凝集素、ＷＧＡ）レクチン画分のチロシンホスファターゼ活性を、培養皿の表面積によって決定した密度で、所定の時間に解析した。培養後１５時間で早くもバナジウム酸塩感受性チロシンホスファターゼ活性の顕著な差が見られた。レクチンで回収したレセプター結合チロシンホスファターゼ活性は、増殖停止をさせるに十分な密度（８．１×）で培養した細胞では低密度（１×）で培養したものに比べ、２倍高かった。低密度（２．９および１×）で培養した細胞が増殖したため、活性の増強が見られ、著しい差はなくなった。レクチン回収活性の増強は、増殖停止推定時間において明らかであり、特異的チロシンホスファターゼの有力性が増強されたか、先在するホスファターゼの活性が増強されたか、またはチロシンホスファターゼが集積され、レクチン回収タンパク質と結合したかのいずれかが考えられた。細胞密度を増大させることにより、ＤＥＰ−１レセプターの有力性が増強されるというこれまでの報告により、発明者らはＤＥＰ−１活性および分布の評価ができる（Ｏｓｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１： ９６８０−９６８４ （１９９４））。
【０２４０】
図７に示されるように、異なる密度で３３時間培養した細胞との比較では免疫沈降したＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１抗原量の差は検出できなかった。さらなる試験では、これらの密度におけるＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００溶性対不溶性画分の割合の変化を示すことができなかった（示さず）。しかしながら、最低（１×）細胞密度に対し、最高（８．１×）細胞密度で培養した細胞の免疫沈降では、バナジウム酸塩感受性ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１結合チロシンホスファターゼ活性の１．８倍の増強が得られた。下のパネル免疫ブロットに示されるように（図７）、免疫沈降したＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１はそれ自身がバナジウム酸塩と予備処理した細胞のチロシンリンタンパク質である。さらに、高密度で培養した細胞から回収した免疫沈降ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の内在ホスホチロシンレベルは下がり、その画分のチロシンホスファターゼ活性の増強と相関している。これらの知見により、高密度で培養した内皮細胞ではＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１存在量の急激な変化はないが、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１結合ホスファターゼ活性が増強することが示される。ゲルザイモグラフィーホスファターゼアッセイによる、増強した活性がＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１に内在することの証明は、上手くいかなかった。
【０２４１】
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１が内皮増殖および移動を停止させ得るシグナルを媒介する可能性をさらに追求していくため、ＨＭＥＣ−１細胞を、エピトープタグ付きＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の高レベルの発現を推進する発現プラスミドおよびトランスフェクト細胞を標識する緑色蛍光タンパク質の発現を駆動するプラスミドで同時トランスフェクトした。アデノウイルスによるトランスフェクション法を用い、非トランスフェクト細胞と同様の生存、移動および増殖特性を示すＨＭＥＣ−１細胞の４０〜５０％のトランスフェクションを常法どおり行った。図８Ａに示されるように、エンプティ発現ベクターに比べ、全長ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の高レベルの発現により、トランスフェクト細胞の培養密度の範囲にわたってＢｒｄＵ取り込みの著しい抑制がなされる。
【０２４２】
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１過剰発現は、増殖に見られるもののように、内皮移動に同様の影響を与えた。図９Ａに示されるように、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１／ＨＡまたはレセプターチロシンキナーゼ、ＥｐｈＢ１／ＨＡのいずれかの血球凝集素エピトープ（ＨＡ）タグ付き形の発現を推進するプラスミドでトランスフェクトしたＨＭＥＣ−１細胞を、密集単層を迅速に得られる密度でプレーティングした。約５００μ径の円形“創傷”を創り、３３時間後に発現タンパク質ＨＡエピトープの染色により“創傷”を閉鎖するトランスフェクト細胞および非トランスフェクト細胞の移動を調べた。ＥｐｈＢ１／ＨＡコントロールでトランスフェクトした細胞とは異なり、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１／ＨＡ発現細胞は移動せず、傷の閉鎖に携わっていなかった。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の強制過剰発現は増殖および移動に作用するというこのレセプターの潜在能力には有益であるが、このアプローチは内因性発現したＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と相互作用する高親和性試薬の使用とあまり差がない。このため、発明者らは発明者らがＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域配列に対して作製したモノクローナル抗体のパネルを活性に関してスクリーニングした。
【０２４３】
図８Ｂに示されるように、二価形モノクローナルＥＣＲＴＰＡｂ１は増殖培地の反復交換にかかわらず、低密度で増殖させたＨＲＭＥＣの増殖に著しい増殖効果を与えた。同濃度のクラス適合モノクローナルコントロール抗体は不活性であった。オリゴマー化は多数のレセプターチロシンキナーゼおよびホスファターゼの活性化の重大な決定因子である（Ｗｅｉｓｓ， Ａ． ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ， Ｊ．， Ｃｅｌｌ ９４： ２７７−２８０ （１９９８））ため、ＥＣＲＴＰＡｂ１　Ｆａｂフラグメントを調製し、相互作用するモノクローナルの二価性が活性に必要であるかどうかを調べた。また、図８Ｂおよび８Ｃに示されるように、等モル濃度のＥＣＲＴＰＡｂ１　Ｆａｂフラグメントは、血清含有増殖培地で密集に至らない密度で増殖させた内皮細胞の増殖阻害剤としては不活性であった。
【０２４４】
さらなる内皮“創傷”閉鎖アッセイを行い、図９Ａに示された目的と同じく、二価および一価ＥＣＲＴＰＡｂ１の内皮移動への影響を調べた。示された時間に残っている最初の傷面積の残部分を図９Ｂに示す。ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）は血清フリー培地の非刺激細胞に比べ、移動および傷閉鎖速度を著しく加速させた。二価ＥＣＲＴＰＡｂ１は目立った活性を示し、ＰＭＡ刺激移動を阻害したが、等モル濃度の一価Ｆａｂフラグメントおよびコントロールモノクローナルは不活性であった。このアッセイにおける時間依存的“創傷”閉鎖の線形性によって発明者らは集団の相対移動速度を図９Ｃで示されたように分数閉鎖／時間で求めることができた。有効濃度の二価ＥＣＲＴＰＡｂ１（６７および２００ｎＭ）は増殖阻害剤として同等に有効であった（図８Ｃ）。
【０２４５】
全体として、これらの知見では、二価抗体による内因性ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の結合が“代替リガンド”のように機能して、通常細胞間接触時に内因性膜結合リガンドによって引き起こされる応答に匹敵する働きをすることが考えられる。ＥＣＲＴＰＡｂ１　Ｆａｂフラグメントは密集に至らない細胞の移動および増殖を阻害する“代替リガンド”としては不活性であったため、発明者らはそれらが高密度で増殖させた細胞におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の内因性リガンド結合のアンタゴニストとしての活性を有するかどうかを求めた。発明者らはＦａｂフラグメントが高密度で増殖させた細胞における内因性リガンド−レセプター結合および後の増殖停止シグナルを阻害するのであろうと推論した。図１０に示される、ＥＣＲＴＰＡｂ１　ＦａｂはＳ期に入ったことを示す密度によるＢｒｄＵ取り込み阻害から細胞を解放するという著しい効果があった。
【０２４６】
ＥＣＲＴＰＡｂ１血管形成性シグナルを誘導する働きをするかどうかを調べる最終試験として、発明者らはマウス角膜ポケットアッセイにおいてこの抗体が基底ＦＧＦに対する血管形成応答を改変するかどうかを試験した。図１１に示される、血管形成を阻害する埋殖緩効性ヒドロン（ｈｙｄｒｏｎ）ペレットにＥＣＲＴＰＡｂ１を封入（コントロールＩｇＧはしない）し、それらが血管形成刺激源に接近するにつれての毛細血管芽の長さの減少により評点を付けた。毛細血管の長さのこの減少により、新たな脈管の放射性分布に影響することなく、前駆血管形成基底ＦＧＦがＥＣＲＴＰＡｂ１よりも迅速に緩効性ペレットから拡散し、血管形成の活発な開始がなされ、やがて減衰がおこり得ることが示される。
【０２４７】
実施例３
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の内因性リガンドのスクリーニング方法
標識したＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を用い、スキャッチャード解析によるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１リガンドをもつ細胞を同定する結合研究を行い；ポリアクリルアミドゲルでＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１リガンドを明らかにする架橋研究を行う。これらの最初の特性化方法を用いて、多数および少数のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１リガンドをもつ細胞の精製および単離について確認する。一度高レベルのＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１リガンドをもつ細胞系が同定されれば、次のアプローチによりタンパク質を精製する。
【０２４８】
アプローチＡ：生化学的精製
高レベルのＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１リガンドを発現する細胞系を溶解し、溶解物および膜調製物のタンパク質をゲル濾過精製した後、セファロースなどの固相に結合したＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を含有するカラムを用いてリガンドを精製する。次いで精製リガンドタンパク質を微量配列決定し、タンパク質配列から誘導された縮重オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子をクローニングすることができる。
【０２４９】
アプローチＢ：ｃＤＮＡライブラリーの精製
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を１２５Ｉにより放射性標識し、スクラッチャード解析によりリガンドの特異的結合に関して細胞系または組織をスクリーニングする。このようなリガンド結合が確認されれば、ｃＤＮＡライブラリーをその組織または細胞系から構築し、特異的結合を示さない細胞系にトランスフェクトする。次いでこれらのトランスフェクト細胞を、それらがＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１リガンドの遺伝子を含有する構築物でトランスフェクトしたことが示される新たに獲得した特異的結合に関してスクリーニングする。その後陽性クローンのプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して同定する。さらに単一構築物をヌル細胞に再度トランスフェクトし、リガンドとレセプター間の結合をトランスフェクト遺伝子が媒介することを確認する（Ｋｌｕｚｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９： ４６１８−４６２２ （１９９２））。
【０２５０】
あるいは、キメラＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１および免疫グロブリンＦｃ分子を構築する（ＬａＲｏｃｈｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２９： ３５７−３６６ （１９９５））。次いでキメラ分子を用い、フローサイトメトリーにより全細胞におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１のリガンドとの結合に関してスクリーニングできる。また分子に免疫グロブリン成分が存在するため、代謝標識細胞の免疫ブロッティングまたは免疫沈降法により細胞溶解物をスクリーニングする。この手法は種々の異なる方法によってＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１結合タンパク質が同定できる。さらにペプチドを配列決定し、全分子が縮重オリゴヌクレオチドアプローチによりクローニングできるように、同定されたタンパク質のペプチド消化物を作出する。
【０２５１】
したがって、本実施例は、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１に対するリガンドの単離のための方法、およびＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１に対するリガンドの精製および単離に関する。本方法は、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１に対するリガンドを有するまたは有することが疑われる細胞または細胞溶解物をＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と接触させる；そして、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を結合するリガンドを単離することを含む。リガンドを有する細胞が、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を標識する；細胞培養物を標識ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１とスクリーニングする；そして上昇した量の標識ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と結合する細胞を単離することにより同定される。
【０２５２】
リガンドは、細胞を溶解し、細胞溶解物を、カラム内の固相マトリックスに結合したＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１と接触させながらカラムを通すことにより単離する。あるいは、リガンドを、リガンドを結合する細胞からｃＤＮＡライブラリーを構築する；ｃＤＮＡライブラリーを、リガンドの結合を示さない細胞系内にトランスフェクトする；新規に獲得した特異的結合に関して、細胞系をスクリーニングする；特異的結合を示す細胞からＤＮＡを単離する；そして単離ＤＮＡを配列決定し、リガンドに対するＤＮＡ配列を決定することにより、単離する。
【０２５３】
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１は、所望により、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を免疫グロブリンに結合させることにより標識してもよい。この場合、リガンドは、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１−リガンド−免疫グロブリン複合体の免疫沈降により単離する。あるいは、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１のリガンドを、フローサイトメトリーを使用して単離する。
【０２５４】
実施例４
ＥＣＲＴＰＡｂ−１に対する結合エピトープの同定
９６個の８個から９個のアミノ酸ペプチドのシリーズを作った。それに対してＡＣＲＴＰＡｂ−１が由来した、３５１アミノ酸の重複エピトープに伸びる８個から９個のアミノ酸ペプチドを作った。これらのペプチドを、膜の表面上に、決められたアレイで生産し、固定化し、ＥＣＲＴＰＡｂ−１でプローブした。ＥＣＲＴＰＡｂ−１のアレイにおけるペプチド＃４１への結合は、ペルオキシダーゼ接合抗マウスＩｇＧ二次抗体を使用して、化学ルミネセンスオートラジオグラフィーにより、同定した（図１２）。アレイ由来のこのペプチドの配列は、ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃである。８アミノ酸エピトープは、ＥＣＲＴＰ外部領域内の標的配列を示し、それに対して、ＥＣＲＴＰアゴニストおよびアンタゴニストが、ＡＣＲＴＰＡｂ−１の生物学的活性を基にして、相互作用する。ヒト化抗体を含む抗体、およびこの定義したアミノ酸配列に高い親和性を有する他のペプチドは、ＥＣＲＴＰＡｂ−１を使用して、本明細書で証明したものと同等な生物学的活性を有する。
【０２５５】
実施例５
ＥＣＲＴＰを結合する抗体、タンパク質およびペプチドのの生物学的活性のスコアリングのためのアッセイ
ＥＣＲＴＰを介した生物学的活性のスコアリングを可能にする、単純再構成アッセイシステムを開発する努力において、内因性ＥＣＲＴＰを発現しないチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ＥＣＲＴＰの高レベル発現を駆動するプラスミドで（ｐＳＲα−ＥＣＲＴＰ／ＨＡ）、またはこれらの細胞の触媒的に不活性な変異形（ｐＳＲα−ＥＣＲＴＰ／ＨＡ／Ｃ−Ｓ、ｐＳＲα−ＥＣＲＴＰ／ＨＡΔｃｙ）でトランスフェクトした。一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、ついで２４ウェルプレートに分散し、蒔き、コントロールＩｇＧ１またはＥＣＲＴＰＡｂ−１、またはＥＣＲＴＰの１価形（ＥＣＲＴＰＡｂ−１−Ｆａｂ）のいずれかに曝した。変異形ではなく、野生型ＥＣＲＴＰでトランスフェクトした細胞の増殖は、ＥＣＲＴＰＡｂ−１とのインキュベーションにより阻害された（約４０％）が、コントロールＩｇＧ１またはＥＣＲＴＰＡｂ−１−Ｆａｂのいずれかでは阻害されなかった。
【０２５６】
平行して、ＥＣＲＴＰを、これらのプラスミドでトランスフェクトし、同等量のＥＣＲＴＰを発現するＣＨＯ細胞、または変異形（図１３Ａおよび１３Ｂの挿入部に示す）から、ＥＣＲＴＰＡｂ−１またはＥＣＲＴＰＡｂ−１−Ｆａｂのいずれかへの暴露の時間経過（０−３０分）に続いて免疫沈降した。図１３Ａおよび１３Ｂの右の免疫ブロットパネルに示されるように、Ａｂ１は、野生型（ＷＴ）ＥＣＲＴのチロシン残基の急速な脱リン酸化を惹き起こすが、触媒的に不活性なＣ／Ｓ変異形では効果はなかった。これらの発見は、触媒的ホスファターゼ機能が、増殖を阻害し、ＥＣＲＴＰの脱リン酸化を惹き起こすためのＥＣＲＴＰＡｂ−１の作用に重要であることを最初に証明する。
【０２５７】
最後に、ＥＣＲＴＰの触媒的に不活性なＣ／ＳまたはＣｙ欠失形と、機能的ＥＣＲＴＰ形の共発現は、ＣＨＯ増殖におけるＥＣＲＴＰＡｂ−１の阻害効果を無くす（図１３Ｂ）。この増殖アッセイは、したがって、推定カウンター−レセプター（リガンド）が、細胞増殖阻害のためにＥＣＲＴＰを介して機能するのに適しているかどうかを評価する。いずれの場合も、ＥＣＲＴＰＡｂ−１の１価または２価形は、機能的カウンター−レセプターを定義するためのアッセイに使用できる。
【０２５８】
実施例６
触媒的不活性ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を有するトランスジェニック動物
ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の触媒的不活性化形を発現するトランスジェニックマウスを作った。マウスは、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１遺伝子に関して、“ノックアウト”アプローチを使用して製造した。胚死が、ホモ接合体“ノックアウト”動物で観察された。ヘテロ接合体動物は、明白な血管新生奇形を示した。したがって、トランスジェニックマウスをは、細胞増殖、細胞生存および血管形成におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の役割を更に確立した。
【０２５９】
参照文献
以下に挙げた参照文献ならびに本明細書に記載のすべての参照文献は、とれらが本明細書で用いられる方法論、技術および／または組成物に関する背景を補足、説明、提示する、または教示する範囲で出典明示により本明細書の一部とされる。
Ａｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，　Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ９９：６８３−６９０ （１９９２）．
Ａｕｇｅｎｌｉｃｈｔ ａｎｄ Ｂａｓｅｒｇａ，　Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ８９：２５５−２６２ （１９７４）．
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Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４，２４４，９４６
Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４，２１５，０５１
Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４，３４０，５３５
Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４，４７２，５０９
Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，６６０，８２７
Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，７３３，８７６
Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，７５３，２３０
Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，７６２，９１８
Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，７６６，５９１
Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，７７６，４２７
Ｖａｉｃｋｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ ９：１９５２０９ （１９９１）．
Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：５５０３５５０９ （１９８９）．
Ｖｏｇｅｌ ＆ Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ １１８（２）：２６２２６８ （１９８１）．
Ｗａｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，　Ｍｉｃｒｏｓｃ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈ ３９：２６１−２８４ （１９９７）．
Ｗａｎｇ， Ｙ． ａｎｄ Ｐａｌｌｅｎ， Ｃ．Ｊ．，　Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：１６６９６−１６７０２ （１９９２）．
Ｗｅｉｓｓ， Ａ． ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ， Ｊ．， Ｃｅｌｌ ９４：２７７−２８０ （１９９８）．
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【０２６０】
本発明の種々の詳細が、本発明の範囲から逸脱することなく変化できることは理解されよう。更に、前記の記載は説明の目的であり、限定する目的ではない−本発明は特許請求の範囲により定義されている。
【０２６１】
【表１】
Figure 2004507210
【０２６２】
【表２】
Figure 2004507210

【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】抗体ＥＣＲＴＰＡｂ−１およびＥＣＲＴＰＡｂ−２による、組換えおよび過発現ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の認識を描記し、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の細胞外（Ｅｃ）または細胞質（Ｃｙ）ドメインを表す組換えタンパク質が細菌内で発現され精製されたことを描記するオートラジオグラフである。示すように、タンパク質（１００ｎｇ）を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、モノクローナル抗体ＥＣＲＴＰＡｂ−１またはＥＣＲＴＰＡｂ−２とプローブした。
【図１Ｂ】抗体ＥＣＲＴＰＡｂ−１　＆　ＥＣＲＴＰＡｂ−２による、組換えおよび過発現ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の認識を描記し、１００ｍｍ皿で培養されたＭＤＣＫ細胞を１４μｇの空ｐＳＲａベクター（ＳＲａ）またはｐＳＲａ−ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１／ＨＡ（ＳＲａ−ＥＣＲＴＰ／ＨＡ）発現構築物でトランスフェクトし、トランスフェクション４８時間後に回収するオートラジオグラフを描記する。示すように、膜レセプタータンパク質をＷＧＡレクチン−接合アガロースにより、１５０μｇの溶解タンパク質から回収した。レクチン−吸着、溶出タンパク質を７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ＰＶＤＦ膜に移し、ＥＣＲＴＰＡｂ−１、ＥＣＲＴＰＡｂ−２、または抗−ＨＡ（ＨＡＡｂ）モノクローナル抗体とプローブした。
【図１Ｃ】ｐＳＲａ−ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１／ＨＡプラスミドに安定にトランスフェクトされたＭＤＣＫ細胞を冷メタノールで固定し、ＥＣＲＴＰＡｂ−２（パネルａ、ｃ＆ｄ）またはクラス適合コントロール抗体（パネルｂ）で染色したことを記載する一連の写真である。ＥＣＲＴＰＡｂ−２は、接触に際し細胞の側面縁を標識する。ＥＣＲＴＰＡｂ−２の５０μｇの組換え免疫原（Ｅｃ）とのプレインキュベーションはこの染色を遮断するが（パネルｃ）、無関係組換えタンパク質（Ｃｙ）はしなかった（パネルｄ）。
【図２】成人腎臓の内皮細胞におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の発生量を記載する写真である。方法に記載のように、ヒト腎臓のアセトン固定凍結セクション（５μｍ厚）を、ＥＣＲＴＰＡｂ−１（パネルＡ−Ｄ）またはクラス適合コントロールモノクローナル抗体（パネルＥ）とインキュベートし、結合抗体を、エピフルオレッセンス（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡により検出した。ＥＣＲＴＰＡｂ−１は顕著に腎糸球体、管周（ｐｅｒｉｔｕｂｕｌａｒ）および内皮細胞で標識された。倍率はＡ）×１００；Ｂ）×６００；Ｃ）×６００；Ｄ×４００；およびＥ）×１００であった。
【図３】ヒト腎臓脈管構造におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１およびＶＥカドヘリンの共焦点局在性を示す。アセトンで固定した腎臓切片を、ＥＣＲＴＰＡｂ−１およびＶＥカドヘリンに対するポリクローナルヤギ抗体で同時標識した。結合した抗体を、フルオレセイン結合抗マウスＩｇ抗体（パネルＡ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）、またはローダミン結合抗ヤギＩｇ抗体（パネルＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）で検出した。ＥＣＲＴＰＡｂ−１（緑色）染色は大動脈および糸球体毛細血管の内皮膜全体に分布し（Ａ、Ｂ）、一方、ＶＥカドヘリン標識（赤色）は内皮接合部に限定されていた（Ｃ、Ｄ）。重複する共焦点画像が、内皮接合部の内側でＥＣＲＴＰがＶＥカドヘリンと共存することが証明された（倍率６００倍）。
【図４】発達中のマウス糸球体におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の発現を示す一連の写真である。胎児期１４日（Ａ）、１６日（Ｂ）、出生後６日（Ｃ）、および成体マウス（Ｄ）のクリオスタット腎臓切片を、実施例１の方法に記載したようにＥＣＲＴＰＡｂ−１で免疫標識した。パネルＡとＢは、ＥＣＲＴＰＡｂ−１が間葉性領域で分散した細胞と結合し（矢印）、コンマ型の糸球体の血管の裂け目ヘ移動する内皮前駆細胞（矢印）と結合し、さらに毛細血管段階の糸球体内皮（Ｇ）と結合する。パネルＣとＤは、成熟した腎臓内でＥＣＲＴＰＡｂ−１が糸球体（Ｇ）、動脈（Ａ）、および管周毛細血管（矢印）の内皮を選択的に標識している。（元の倍率；Ａ）４００倍；Ｂ）２００倍；Ｃ）２００倍；およびＤ）３５０倍）。
【図５Ａ】ヒト内皮培養細胞におけるＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の内皮内部の接触の分布を示すが、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１はＶＥカドヘリンと共に接合部から分離せず、メタノールで固定したＨＲＭＥＣ細胞が実施例１の方法で記載したようにＥＣＲＴＰＡｂ−２で標識されることを示す一連の写真である。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１は内皮膜内部の接点と、連続する共焦点画像内の頂端膜の小さな斑点のある領域との間に分布している。
【図５Ｂ】ヒト内皮細胞における内皮間接触のＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の分布を示すが、ＥＣＲＴＰＣＥ／ＤＥＰ−１はカドヘリンとの接合点から解離せず、ＨＭＥＣ−１細胞をコンフルエントまで増殖させ、その後固定化する前に５ｍＭ　ＥＧＴＡを含有する中膜で０分間（パネルａおよびｃ）または２０分間（パネルｂおよびｄ）インキュベートしたものを示す一連の写真である。ＥＣＲＴＰＡｂ−２およびＶＥカドヘリン標識の分布は時間ごとに実施例１の方法に記載されたようにして調べた。ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１免疫活性の分布はＣａ２＋の低い培地内で変わらなかったが、接合部のＶＥカドヘリンの染色は散逸し、ＶＥカドヘリン接合部の解離と細胞膜を横切る再分布が一致した。
【図６Ａ】細胞内皮密度が増殖停止を強要し、レクチンの回復可能なチロシンホスファターゼ活性を増加させることを示し、同一数のヒト腎臓微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を、直径１００ｍｍ（１倍）、６０ｍｍ（２．９倍）または３５ｍｍ（８．１倍）のプラスチック皿の増殖培地で培養し、培養時点の細胞密度に指示した襞の違いを与えたことを示す線グラフである。培地は矢印で示した時点で増殖培地と交換した。細胞はＣｏｕｌｔｅｒカウンターで計数し、サンプルは４反復で示している。細胞の増殖は単一細胞の倍加後８．１倍の密度、および培養細胞の約３回の倍加後２．９倍の密度で停止した。
【図６Ｂ】内皮細胞密度が成長停止をさせ、レクチン復元可能チロシンホスファターゼ活性を示し、同数のヒト腎臓微小血管内皮細胞（ＨＲＭＣ）を増殖培地に１００（１×）、６０（２．９×）または３５（８．１×）ｍｍ直径プラスチック皿に真樹。プレーティングの時に細胞密度における示す倍数の影響を示す線グラフである。培地を矢印で示す時点で増殖培地と変えた。細胞はＣｏｕｌｔｅｒカウンターで計数し、サンプルは４反復で示している。細胞の増殖は単一細胞の倍加後８．１倍の密度、および培養細胞の約３回の倍加後２．９倍の密度で停止した。
【図７】増加した細胞密度が免疫沈降するＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の活性（量ではない）を増加させることを示す放射能写真および棒グラフである。同一数のＨＲＭＥＣを図６のように示された細胞密度で培養した。実施例２の方法に記載したように３６時間培養した後、単一特異性アフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体を用いて、１ｍＭペルオキシバナジン（＋ＶＯ４）または溶媒（−ＶＯ４）で１０分間処理した細胞から直ちにＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を免疫沈降させた。回収したＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１抗原を単一特異的抗体を用いた免疫ブロットにより定量化し、その内因性ホスホチロシン含量を４Ｇ１０モノクローナル抗体を用いたホスホチロシン免疫ブロットにより評価した。免疫沈降した試料中のホスファターゼ活性を、ｐＮＰＰを基質として用いて記載したようにオルトバナジンナトリウムが存在する場合（＋ＶＯ４）と存在しない場合（−ＶＯ４）で評価した。データは生成物の光学濃度を３反復のサンプル＋／−標準誤差で示している。
【図８Ａ】ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の過剰発現、またはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１、ＥＣＲＴＰＡｂ−１に対する二価の抗体がＨＲＭＥＣを増殖停止させることを示し、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１　ｃＤＮＡを持つＨＭＲＥＣの一時的感染が低い細胞密度で増殖を阻害させることを示すグラフである。示されたように１．７μｇ　ｐＳＲα（ベクターコントロール）またはＨＡエピトープタグをつけた（血球凝集素）ｐＳＲα−ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１（ｐＳＲα−ＥＣＴＲＰ）、および、実施例２の方法に記載したように感染した細胞のＢｒｄＵ標識を数えるために、０．４μｇ　ｐＥＧＥＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でおよそ３×１０５のＨＲＭＥＣを同時感染させた。２４時間で感染した細胞は再び示された数でｐ３５培養皿に戻された。３６時間後、Ｓ期の細胞を実施例２の方法に記載したようにＢｒｄＵで３０分間標識し、＋ＧＦＰ陽性細胞をＢｒｄＵの組み込みについて数えた。示しされたデータは４反復の測定値についての平均値＋／−標準誤差を表す。
【図８Ｂ】ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１過発現、またはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１に対する２価抗体、ＥＣＲＴＰＡｂ−１がＨＲＭＥＣの増殖を停止させることを四名ｓ、ＥＣＲＴＰＡｂ−１が内皮の増殖および移動を阻害することを示す線グラフである。ＨＲＭＥＣ（３×１０４）を０時点としてｐ３５培養皿に入れた。２４時間で増殖培地を交換し、細胞を計数し、ＩｇＧコントロール物（１０μｇ／ｍｌ）かまたはＥＣＲＴＰＡｂ１（１０μｇ／ｍｌ）のいずれかの抗体を加えた。細胞の複製試料（５）を４日目に計数し、平均値＋／−標準誤差で表した。
【図８Ｃ】０時点で同数のＨＲＭＥＣを培養し、示された濃度で抗体またはＦａｂフラグメントを加えた場合のデータポイントプロットである。反復プレートを１日目に回収して各条件でプレーティング効率が一様かどうかを確認し、６日目に細胞の増殖をそれぞれ評価した。データポイントは５反復の平均値＋／−標準誤差値を表す。
【図９Ａ】ＥＣＲＴＰＡｂ−１による内皮移動の阻害を示し、ＨＲＭＥＣ単層が、示されたように、一時的にプラスミドｐＳＲαＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１／ＨＡまたはｐＳＲαＥｐｈＢ１／ＨＡに感染したことを示す一連の写真である。４８時間後、密集単層に“創傷”を作り、確実である３０時間かけて塞がらせた。その後単層をモノクローナル血球凝集素抗体１２ＣＡ５で染色し、高レベルのＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１／ＨＡまたはＥｐｈＢ１／ＨＡを一時的に発現する細胞の位置をそれぞれ検出した。唯一ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１過剰発現細胞だけが稀に移動して“創傷”を塞いだ。
【図９Ｂ】ＥＣＲＴＰＡｂ−１による内皮移動の阻害を示し、クラス適合ＩｇＧコントロール（ＩｇＧ、１０μｇ／ｍｌ）、ＥＣＲＴＰＡｂ１（１０μｇ／ｍｌ）、またはＥＣＲＴＰＡｂ１（３μｇ／ｍｌ、モル濃度は同じ）のＦａｂフラグメントが含む示された抗体またはフラグメントの存在下、無添加（ＮＡ）またはホルボールミリステートアセテート（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した血清フリーの培地に交換する０時にＨＲＭＥＣ密集単層に作られた直径３００〜４２０μｍの“創傷”の分析を示す線グラフである。３反復の創傷を用いて示された時間に顕微鏡画像をなし、Ｂｉｏｑｕａｎｔ画像解析ソフトを用いて自動的取り込み手順により、残りの“創傷”部位を算定してはじめの創傷の分数として表している。各データポイントは３回の測定値の平均値＋／−標準誤差を表す。
【図９Ｃ】図９Ｂと同様のアッセイ手順で得られたデータを解析した線グラフである。同じアッセイ手順を用いて、３の独立した時点でＩｇＧコントロール、ＥＣＲＴＰＡｂ１、またはＥＣＲＴＰＡｂ１／Ｆａｂに曝した細胞において測定した平均値の直線回帰により移動率を計算した。ｒ２値はプロットした各データポイントについて０．９０以上であった。白四角（□）は刺激を受けない細胞の閉塞に対する移動率を示す。
【図１０】ＥＣＲＴＰＡｂ１　Ｆａｂフラグメントが内皮密度により媒介される増殖停止を減衰することを示す線グラフである。示された数のＨＭＥＣ−１細胞を、１２ウェルディッシュ中のカバーガラス上の、無添加（ＮＡ）またはＥＣＲＴＰＡｂ１（６７ｎＭ）添加増殖培地中に０時点としてプレーティングした。２４時間後、ＢｒｄＵ染色を実施例２の方法に記載したようにアッセイし、各条件について５つの独立した視野を計数することでＢｒｄＵ陽性細胞の割合％を得た（４００細胞／ポイント以上）。データは平均値＋／−標準誤差を表す。
【図１１】ＥＣＲＴＰＡｂ１がｂＦＧＦに応答する角膜ポケット血管形成を阻害することを示す一連の写真である。ヒドロンペレットに、血管形成刺激剤、塩基性ＦＧＦ（９０ｎｇ）を単独で、またはクラスの適合するコントロールモノクローナル抗体（ＩｇＧ、２００ｍｇ）あるいはＥＣＲＴＰＡｂ１（２００ｎｇ）を含浸させ、麻酔をかけたマウスの角膜内皮に作ったポケットに置いた。注入から５日後、血管形成応答を評価し、撮影した。代表的な例はＥＣＲＴＰＡｂ１の封入が埋殖されたペレット周辺の増殖ゾーンを阻害することを示している。
【図１２】ＥＣＲＴＰＡｂ−１が、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の外部領域ペプチド配列ＱＳＲＤＴＥＶＬに結合することを示すオートラジオグラフである。“紙上のペプチド”（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， Ａｌａｂａｍａ）アレイを、ＥＣＲＴＰＡｂ−１が結合するＥＣＲＴＰの３５１アミノ酸配列を使用して産生した。アレイは、重複配列の全領域に伸びる８−１０アミノ酸の９６ペプチドを含む。このシリーズにおける単一ペプチド配列（＃４１）は、ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃにアミノ酸残基を示す。
【図１３Ａ】ＥＣＲＴＰＡＢ−１が、野生型ＥＣＲＴＰを発現するＣＨＯ細胞では、ＥＣＲＴＰの脱リン酸化を促進し生育を停止させるが、変異ＥＣＲＴＰタンパク質、Ｃ／Ｓ（触媒的不活性点変異体）またはｃｙ（細胞質ドメイン欠失）ではしないことを示すグラフである。ＣＨＯ細胞を、２４時間、ＥＣＲＴＰＡｂ−１、ＥＣＲＴＰＡｂ−１−ＦａｂまたはコントロールＩｇＧ１の存在下に置き、トランスフェクション４８時間後に細胞数をアッセイした。右パネルにおいて細胞を，トランスフェクトし、血清含有培地（５％）で４８時間培養し、７０ｎＭのＥＣＲＴＰＡｂ−１またはＥＣＲＴＰＡｂ−１−Ｆａｂに示す時間曝した。ＥＣＲＴＰは免疫沈降し、示すように、ホスホチロシン含量（抗−ＰＹ）および抗体回収（抗−ＨＡ）の免疫ブロットによりアッセイした。ＥＣＲＴＰＡｂ−１−ＦａｂではなくＥＣＲＴＰＡｂ−１が、ｗｔの急性脱リン酸化を促進したが、触媒的不活性ＥＣＲＴＰではしなかった。
【図１３Ｂ】野生型ＥＣＲＴＰのＣ／Ｓまたはｃｙ形のいずれかとの共トランスフェクションが、ＥＣＲＴＰＡｂ−１への暴露により課せられるＥＣＲＴＰの脱リン酸化を停止することを証明するオートラジオグラフとグラフの組合せである。これらの変異体形は、優勢ネガティブタンパク質として機能し、細胞増殖を停止させ、ＥＣＲＴＰ脱リン酸化を促進する触媒的活性ＥＣＲＴＰダイマーのＥＣＲＴＰＡｂ−１−誘導形成を遮断する。

Claims (44)

  1. ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１に優先的に結合する精製抗体、または該抗体のフラグメントまたは誘導体。
  2. ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の外部領域に優先的に結合する、請求項１に記載の抗体。
  3. ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域の、配列ＱＳＲＤＴＥＶＬを有する８アミノ酸エピトープ、または配列ＱＳＲＤＴＥＶＬのアナログ配列を有する８アミノ酸エピトープに優先的に結合する、請求項２に記載の抗体。
  4. モノクローナル抗体、またはそれらのフラグメントまたは誘導体である、請求項１に記載の抗体。
  5. ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の外部領域に優先的に結合する、約１５０ｋＤａの分子量を有する、モノクローナル抗体ＥＣＲＴＰＡｂ−１である、請求項４に記載の抗体。
  6. ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２５７０を有するハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体の免疫反応特性を有することにより更に特徴付けられる、請求項４に記載の抗体。
  7. モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２５７０を有するハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体である、請求項６に記載の抗体。
  8. ヒト化されている、請求項１に記載の抗体。
  9. ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の外部領域に優先的に結合する、請求項８に記載の抗体。
  10. ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域の、配列ＱＳＲＤＴＥＶＬを有する８アミノ酸エピトープ、または配列ＱＳＲＤＴＥＶＬのアナログ配列を有する８アミノ酸エピトープと優先的に結合する、請求項９に記載の抗体。
  11. ヒト化抗体が、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の外部領域に優先的に結合する約１５０ｋＤａの分子量を有するモノクローナル抗体ＥＣＲＴＰＡｂ−１を含む、請求項８に記載の抗体。
  12. ヒト化抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２５７０を有するハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体の免疫反応性特性を有することにより更に特徴付けられる、請求項８に記載の抗体。
  13. モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２５７０を有するハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体である、請求項１２に記載の抗体。
  14. 薬学的に許容される希釈剤または賦形剤中の、請求項１に記載の抗体。
  15. 単離および精製された生物学的に活性なＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチド、またはそれらのアミド、接合、環化、フラグメント、化学的修飾エンボディメント、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  16. ポリペプチドがＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１の外部領域を更に含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. ポリペプチドが、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域の配列ＱＳＲＤＴＥＶＬを有する８アミノ酸エピトープ、またはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域の配列ＱＳＲＤＴＥＶＬのアナログ配列を有する８アミノ酸エピトープを更に含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドを発現する細胞を更に含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
  19. （ａ）レセプターチロシンホスファターゼを含む試験サンプルの確立；
    （ｂ）試験サンプルへの候補物質の投与；および
    （ｃ）試験サンプルにおけるレセプターチロシンホスファターゼ生物学的活性　の測定；
    （ｄ）レセプターチロシンホスファターゼ上のホスホチロシン残基の検出；および
    （ｅ）試験サンプルに関して測定したレセプターチロシンホスファターゼ生物学的活性がコントロールサンプルに関して測定したレセプターチロシンホスファターゼ生物学的活性よりも大きいか小さいか、およびレセプターチロシンホスファターゼ上のホスホチロシン残基の量が、コントロールサンプル由来のチロシンホスフェート誘導体上のホスホチロシン残基の量より多いか少ないか、候補物質がレセプターチロシンホスファターゼを調節するかの決定
    を含む、レセプターチロシンホスファターゼを調節する能力に関して、候補物質をスクリーニングする方法。
  20. 試験およびコントロールサンプルが更に細胞を含み、レセプターチロシンホスファターゼが細胞に発現される、請求項１９に記載の方法。
  21. 試験およびコントロールサンプルが、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を発現する細胞を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性が、内皮細胞移動および増殖の調節、密度誘発増殖停止の調節、血管形成の調節およびこれらの組合せから選択される、請求項２１に記載の方法。
  23. 候補物質が、レセプターチロシンホスファターゼに対する天然リガンドを含む細胞または細胞溶解物を更に含み、該方法がレセプターチロシンホスファターゼに対する天然リガンドの単離を更に含む、請求項１９に記載の方法。
  24. レセプターチロシンホスファターゼがＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を含む、請求項２３に記載の方法。
  25. リガンドが、細胞を溶解し、細胞溶解物を、カラム内の固相に結合したＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を含むカラムを通すことにより単離した、請求項２４に記載の方法。
  26. リガンドを、リガンドを結合する細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを構築する；ｃＤＮＡライブラリーを、リガンドの結合を示さない細胞系にトランスフェクトする；新たに特異的結合を獲得した細胞系をスクリーニングする；そしてリガンドのためのＤＮＡ配列を決定するために、単離ＤＮＡを配列決定することにより単離する、請求項２４に記載の方法。
  27. 請求項１９に記載のアッセイに使用するのに適した、組換え細胞系。
  28. （ａ）ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドまたはそれらのフラグメントを含む試験サンプルの確立；
    （ｂ）候補物質の試験サンプルへの投与；および
    （ｃ）候補物質の試験サンプルにおける相互作用、効果またはそれらの組合せを測定し、それにより候補物質がＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１生物学的活性を調節する能力を測定する：
    ことを含む、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１生物学的活性を調節する能力に関する候補物質のスクリーニング法。
  29. 試験サンプルが更にＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を発現する細胞を含み、そして候補物質の試験サンプルにおける相互作用、効果またはそれらの組合せの測定が：
    （ｉ）候補物質の試験サンプルにおける相互作用、効果またはそれらの組合せを、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を発現しない細胞における候補物質の試験サンプルにおける相互作用、効果またはそれらの組合せと比較する；および
    （ｉｉ）候補化合物がＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１活性を調節するかを、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１を発現しない細胞における候補化合物の相互作用、効果またはそれらの組合せの欠如を証明することにより測定する
    ことを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 候補物質の試験サンプル上での相互作用、効果またはそれらの組合せの測定が、更に
    （ｉ）候補物質とＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドまたはそれらのフラグメントを、候補物質とＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドまたはそれらのフラグメントが結合し、それらの間で複合体を形成するのに好ましい条件下で接触させる；および
    （ｉｉ）複合体を検出する：
    ことによる、候補物質と試験サンプルの間の結合の測定を含む、請求項２８に記載の方法。
  31. 複合体を、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドまたはそれらのフラグメントに接合した標識を介して；その複合体に、形成に続いて特異的に結合する標識試薬を介して；またはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドまたはそれらのフラグメントに結合することが既知の物質との競合アッセイを介して検出する、請求項３０に記載の方法。
  32. ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドまたはそれらのフラグメントが、検出可能な標識と接合している、請求項３０に記載の方法。
  33. 複合体の検出の段階が更に：
    （ｉ）非結合標識ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドまたはそれらのフラグメントから複合体を離す；および
    （ｉｉ）複合体に存在するまたは非結合である検出可能標識を検出する：
    ことを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１ポリペプチドフラグメントがＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域フラグメントである、請求項３０に記載の方法。
  35. ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域フラグメントが配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃを有する８アミノ酸エピトープを含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 候補物質が抗体、またはそれらの誘導体またはフラグメントである、請求項３０に記載の方法。
  37. 候補抗体、またはそれらの誘導体またはフラグメントが、組換えファージ−ディスプレイ抗体ライブラリー由来である、請求項３６に記載の方法。
  38. 第１コンテナに包含された、ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域ポリペプチド、またはそれらのフラグメントを含む、候補物質がＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１生物学的活性を調節する能力をスクリーニングするためのキット。
  39. ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域ポリペプチド、またはそれらのフラグメントが配列ｎ−ＱＳＲＤＴＥＶＬ−ｃを有する８アミノ酸エピトープを含む、請求項３８に記載のキット。
  40. 更に固相支持体を含む、請求項３８に記載のキット。
  41. ＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域ポリペプチド、またはそれらのフラグメントが固相支持体に固定化されている、請求項４０に記載のキット。
  42. 更に検出可能標識を含む、請求項３８に記載のキット。
  43. 検出可能標識が他のコンテナに包含されるか、またはＥＣＲＴＰ／ＤＥＰ−１外部領域ポリペプチド、またはそれらのフラグメントが検出可能標識を含む、請求項４１に記載のキット。
  44. 検出可能標識が放射活性標識または酵素である、請求項４３に記載のキット。
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