CN1744920A

CN1744920A - 被偕二膦酸酯衍生物覆盖的新型磁性颗粒组合物

Info

Publication number: CN1744920A
Application number: CNA2003801093249A
Authority: CN
Inventors: M·波尔; C·科罗; I·雷纳尔; O·卢梭
Original assignee: Guerbet SA
Current assignee: Guerbet SA
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2003-12-19
Publication date: 2006-03-08
Anticipated expiration: 2023-12-19
Also published as: PT1572246E; BR0316886A; DE60326383D1; US20100297025A1; CN100358584C; EP1572246B1; EP1572246A2; US20040253181A1; CA2510531C; JP2006513198A; WO2004058275A3; ATE423575T1; WO2004058275A2; FR2848850B1; US7780953B2; AU2003299388A1; AU2003299388A8; JP4638738B2; FR2848850A1; CA2510531A1

Abstract

本发明涉及含有基于铁化合物的酸性磁性颗粒(p)的组合物，该酸性磁性颗粒(p)被一种或几种通式(I)的偕二膦酸酯化合物所络合：X－L－CH(PO₃H₂)₂ (I)；其中：―L表示将基团X与偕二膦酸根－CH(PO₃H₂)₂连接起来的有机基团；―X表示能够与生物媒介反应的化学基团；所述颗粒的全部或部分基团X任选与生物媒介相偶联。本发明还涉及该组合物的制备方法及其应用，特别是作为磁共振造影(MRI)对比物的应用。

Description

被偕二膦酸酯衍生物覆盖的新型磁性颗粒组合物

技术领域

本发明涉及被一种分子覆盖的磁性颗粒组合物，此分子一方面含有与该颗粒的表面相键合的偕二膦酸根基团，另一方面含有能够以共价键与被称为生物媒介的靶实体相键合的活性基团。本发明还涉及其制备方法及其用途，特别是作为核磁共振成像(MRI)用的对比化合物的用途。

背景技术

MRI能够观察到活体生物的内部器官，因此在诊断、治疗和手术当中成为有力的指导和助手。

使用对比化合物有助于改善由此种技术得到的影像的分辨率，以及诊断的准确性。

因此，在待检验的器官环境中有各种磁性片段，比如顺磁、铁磁或超顺磁片段存在时，就可以增强此对比效果。

顺磁物质含有处于离子或有机金属状态下的特定的金属，比如铁、锰、钆。铁磁对比物质一般含有微米级或亚微米级的磁性颗粒聚集体，也就是说不小于100～200nm，比如铁氧体颗粒，特别包括磁铁矿(Fe₃O₄)、磁赤铁矿(γ-Fe₂O₃)和其行为与永久磁体相类似的其他过渡元素的磁性无机化合物。超顺磁颗粒一般是很小的铁氧体颗粒，特别包括磁铁矿(Fe₃O₄)、磁赤铁矿(γ-Fe₂O₃)和其他过渡元素的磁性无机化合物，它们的尺寸小于大约100～150nm。与铁磁颗粒不同，由于超顺磁颗粒的尺寸小于临界值，其行为不再像独立的小磁体，这就是说，只有当它们受到外界磁场的作用时才能够在优势的方向上排列整齐。与铁磁颗粒相比，超顺磁颗粒有利地具有更高的有效密度。

为了得到磁性颗粒的胶体溶液(在后面也称之为铁磁流体，在生理介质中是稳定的)，必须对磁性颗粒的表面进行调理。

一般说来，在医学成像时使用的磁性颗粒都覆盖着大分子，比如像糊精之类的碳水化合物、清蛋白之类的蛋白质，或者如甲基丙烯酸酯和有机硅烷之类的合成聚合物。能够得到此类颗粒的合成，一般是按照所谓的de Molday法进行的(参见Robert S.Molday和D.Mackenzie，J of Immunological Methods(1982)，52，pp.353-367)，需要麻烦而昂贵的提纯工艺。

在磁性颗粒的许多生物医学应用中，必须将该颗粒偶联到具有特定亲合性的分子上，使得该颗粒特异地键合到靶细胞或靶组织上。此辨认过程经常是通过在固定在该颗粒上的配体(生物媒介)和靶细胞或靶组织表面上的受体之间形成亲合性络合物来保证的。这种具有特异亲和性的分子，可以直接被吸附在颗粒的表面上，也可以通过共价键键合在上面。

一般说来，在大分子上共价接枝具有特异亲和性的分子要求比如通过氧化进行预先的化学活化，以在大分子上产生固定点。

然而，一般很难控制在大分子上产生的固定点的数目，因此以后的具有特异亲和性分子的接枝也就不能控制。

为了对最终的颗粒溶液相对于靶的亲合性进行调制，具有特异亲和性分子的接枝量控制是很重要的，但也是为了调节药物动力学、生物学分布和任选调节这些颗粒的代谢、排泄和无害化。此外，从产业的观点出发，尽可能减少具有特异亲和性分子的量可能是有利的，因为它们的成本一般是很高的。

再有，在大分子的表面上的没有与特异亲和性分子反应的活性基团有可能在体内产生毒性反应。

与此类似，从物理化学的观点出发，通过化学吸附进行特异亲和性分子的接枝，一般也是很难控制的，而且在生理学介质中更不稳定的。此外，化学吸附会引起与特异亲和性分子自由部分的平衡。而这种自由部分对MRI对比是有害的。

迄今为止，对用低分子量有机分子覆盖磁性颗粒已有叙述。

文献J.of Coll.And Interf.Science 2001，238，pp.37-42公开了用有机分子覆盖磁性颗粒的方法，该有机分子所含的二膦酸根部分使得得到的目的物很小(小于15nm)而且在很宽的pH值范围内是稳定的。

然而，在该文献中叙述的通过PCS(光子校正分光光度计)测量被二膦酸酯化合物覆盖的颗粒流体动力学尺寸的方法，要求一个在100nm的过滤器进行预过滤的步骤，以除去聚集体，只分离出小流体动力学尺寸的颗粒。因此，此测量不能反映出得到的颗粒的实际流体动力学尺寸，实际上它要更大一些。

此外，由在该文献中叙述的方法对偕二膦酸酯化合物覆盖的颗粒进行的提纯要求使用渗析或由树脂进行处理的步骤，已发现这是很复杂的、重复性很差的，很难在工业上实施的步骤。而且要记住，偕二膦酸根是-CH(PO₃H₂)₂基团。

因此，如果不借助于复杂的提纯过程，那个方法既不能控制偕二膦酸酯化合物在磁性颗粒表面上的接枝量，也不能控制所得到的颗粒的动力学尺寸。再有，该文献既没有叙述，也没有暗示对二膦酸酯化合物，特别是偕二膦酸酯覆盖的颗粒与特定靶实体进行偶联的方法，以用于特定的生物医学应用中，这使得其很不适于该靶向过程。

在本发明的上下文内，流体动力学直径指的是按照PCS技术(光子校正分光光度计：参考资料：R.Pecora-J.of NanoparticleResearch(2000)，vol.2，pp.123-131)，通过光散射测定的颗粒在溶液中被其水合层围绕的直径。

出版物WO 97/01760叙述了被二巯基琥珀酸(DMSA)覆盖的磁性颗粒，它通过DMSA的巯基与特定的靶实体膜联蛋白相偶联。

然而，在正常的pH值和离子强度的条件下，在颗粒的表面上存在的DMSA的巯基具有氧化的倾向，形成二硫化物桥，这就导致形成聚集体。结果使流体动力学尺寸加大，使多分散性提高。

膜联蛋白的接枝也要求通过二硫化物桥的还原，预先使巯基再生。

最后，膜联蛋白的接枝很难控制。因此，在偶联之后，发现必须通过与BSA(牛血清白蛋白)反应使残留的巯基灭活，以避免在活体内的毒性反应，或者避免得到的颗粒在以后聚集。

因此就须要得到一种颗粒，它在特定的诊断方面是有效的，而同时显示出低的多分散性并且是稳定的。

发明内容

现已发现，借助于结合使用偕二膦酸酯化合物和酸性磁性颗粒，就能够控制官能化偕二膦酸酯化合物在磁性颗粒上的接枝和得到的颗粒与生物媒介的偶联。此双重控制具有特别能够控制得到的颗粒，即被偕二膦酸酯化合物接枝的酸性磁性颗粒(p)的流体动力学尺寸的优点，而无论它们是否与生物媒介偶联。因此，本发明特别涉及：

—在其上面接枝了偕二膦酸酯的酸性颗粒，一旦进行了接枝，这种颗粒就能够与至少一种生物媒介结合；

—被偕二膦酸酯接枝，并且与至少一种生物媒介偶联的颗粒。

在此范围内发现，用来得到这种磁性颗粒的方法包括有限的步骤数，实施简单而且能够再现。再有，无须复杂的提纯过程，而且具有很好产率的特征。

在本发明的范围内，“酸性磁性颗粒”意味着与在所谓“酸性”铁磁流体中存在的同样类型的磁性颗粒，其在先有技术中是已知的，但既没有叙述，也没有暗示其与偕二膦酸酯的结合。

在文献中，特别是在出版物Massart等人的C.R.Acad.Sc.Paris，t.291，7/07/1980，Série C和IEE，Transactions on Magnetics，1981，vol.MAG-17，n°2，p.1247中像“碱性”铁磁流体一样广泛地叙述了“酸性”铁磁流体。

一般把酸性铁磁流体的酸性磁性颗粒描述为在酸性介质中在表面上具有质子化的羟基点。

相反，一般把碱性铁磁流体的磁性颗粒描述为具有在碱性介质中被OH^-离子络合的点。

在反应点方面这样的表示方法实际上相当于一个模型，这个模型也已经被各种显示出酸性和碱性磁性颗粒的表现很像是弱的多元酸和/或多元碱的工作所确认。

本发明人有利地显示出，与“碱性”铁磁流体不同，“酸性”铁磁流体是很稳定的，并不表现出颗粒聚集的现象，这就导致更好地控制前体(即未接枝的颗粒)的流体动力学尺寸，因此控制了被偕二膦酸酯化合物接枝的颗粒的动力学尺寸，然后，如果适当的话，控制了与生物媒介偶联的所述颗粒的动力学尺寸，而无需复杂的提纯步骤。

本发明人意外地发现，可以用偕二膦酸酯很好地覆盖磁性颗粒，对于潜在可被偕二膦酸酯络合剂分子接枝的在酸性磁性颗粒表面上每一个质子化羟基点，这都是可能的。此相互作用能够有利地使颗粒的表面被均匀地屏蔽，这特别避免以后颗粒被免疫系统所识别。

特别是，本发明人发现了使酸性磁性颗粒的流体动力学尺寸减小，从而能够得到很小尺寸的磁性颗粒的方法。用偕二膦酸酯试剂对这些颗粒进行受控制的接枝，任选再接着进行类似的与生物媒介的受控制的偶联，就能够有利地得到小流体动力学尺寸的最终磁性颗粒，而无需复杂的提纯步骤，因此最终就提供了一种可靠的、可重复的因而具有工业意义的制备方法。

本发明人还研究了用一方面含有一个能够与生物媒介形成共价键的基团X，另一方面含有代替偕二膦酸根的二膦酸根基团的化合物与酸性磁性颗粒(p)形成络合物的过程。

如此得到了稳定的颗粒，与先有技术相比，该颗粒已经得到明显的改善，而与生物媒介的偶联明显比偕二膦酸酯的效率更低。特别是，当使用二膦酸酯化合物HOOC-CH₂-N(CH₂(PO₃H₂))₂时，由于还不很清楚的原因，颗粒具有的与生物媒介偶联的速度仅是用偕二膦酸酯时的二分之一。因此结果是制造被二膦酸酯接枝并与生物媒介偶联的磁性颗粒的成本要高得多。

因此，本发明的目的是提出一种被偕二膦酸酯衍生物受控接枝的，任选经过此衍生物以受控的方式与特殊类型的靶实体(生物媒介)偶联的磁性颗粒组合物。

更具体说，本发明的目的是还提供这样一类组合物，它在悬浮液中是稳定的，特别是在生理介质中是稳定的，其有利地具有受控的流体动力学尺寸，特别是具有小的流体动力学尺寸。

本发明的目的是还提供一种制备此组合物的方法。

按照本发明的第一方面，它涉及到含有基于铁化合物的酸性磁性颗粒(p)的组合物，每一个此酸性磁性颗粒(p)都被一个或几个通式(I)的偕二膦酸酯化合物络合：

X-L-CH(PO₃H₂)₂ (I)

其中：

L表示将基团X与偕二膦酸根-CH(PO₃H₂)₂连接起来的有机基团；

X表示能够与生物媒介反应的化学基团；此颗粒(p)的全部或部分基团X任选与生物媒介相偶联。

本领域的专业人员都能够理解，“每一个被络合”意味着该组合物也可以包括没有被通式(I)的化合物络合的磁性颗粒(p)，这主要是由于随机分布的原因和/或由于在下面将要叙述的此组合物的制备方法的缘故。

此组合物呈稳定的纳米级颗粒水溶液的形式。

在这些组合物中，颗粒上的化合物(I)的络合率高于70％，优选高于80、90或95％，应该理解，在本说明中“络合率”优选指的是通式(I)的化合物与在酸性磁性颗粒(p)上存在的质子化位置的数量比。

对于酸性磁性颗粒(p)，特别优选的是，其质子化位置中有至少90％被通式(I)的化合物络合，这有利地导致对颗粒有良好的覆盖，特别能够保证颗粒的良好稳定性，避免颗粒被免疫系统识别，使以后面任选的与生物媒介的偶联更加有效。

具体实施方式

磁性颗粒(p)

在本叙述的范围内，“基于铁化合物的颗粒”意味着一种颗粒，其中的全部或部分是由铁的衍生物构成的，此衍生物一般含有铁(III)，一般是氧化铁或氢氧化铁。

作为一般的规则，部分或全部酸性磁性颗粒(p)是由氢氧化铁、水合氧化铁、铁氧体、混合氧化铁，比如氧化铁与钴、镍、锰、铍、镁、钙、钡、锶、铜、锌或铂的混合物或者前面各种化合物的混合物构成的。

在本发明的范围内，术语“铁氧体”意味着通式为[xFe₂O₃，yMO_z]的氧化铁，其中M表示在磁场的作用下能够被磁化的金属，比如Fe、Co、Ru、Mg、Mn，此可磁化的金属任选可以是放射性的。

本发明组合物的酸性磁性颗粒(p)优选含有铁氧体，特别是磁赤铁矿(γ-Fe₂O₃)和磁铁矿(Fe₃O₄)，或者是混合的钴铁氧体(Fe₂CoO₄)或锰铁氧体(Fe₂MnO₄)。

在本说明书中，给予酸性磁性颗粒(p)以很特别的优选，其中的全部或部分，优选是其中的大部分是由磁赤铁矿或磁铁矿或它们的混合物构成的。

按照本发明的组合物，其酸性磁性颗粒(p)在其表面上具有在酸性介质中被质子化的羟基点，更确切说这相当于由于在颗粒的表面上的Fe³⁺离子和酸性水分子(H₃O⁺)之间很强的相互作用而产生的Fe-OH₂ ⁺。按照J.Lyklema等人的工作，Materials Science Research，1984，17，pp.1-24，这样的质子可以看作是构成颗粒的。在酸性颗粒上质子化位置的百分比一般为1.3～2.5％(mol点/mol铁)。

按照一个特别有效的变体，此酸性颗粒(p)是超顺磁的。

此磁性颗粒(p)具有5～300nm，优选5～60nm，更优选5～30nm的流体动力学直径。

本发明的组合物优选是酸性磁性颗粒(p)的悬浮液，在适当的情况下，它有利地具有适合于形成为稳定的胶体溶液(纳米级颗粒的稳定水悬浮液)的浓度，这就是说，以金属离子的总摩尔数表示，磁性颗粒(p)的浓度一般为2μmol/L¹～4mol/L¹。

通式(I)的化合物

按照本发明的通式(I)化合物含有偕二膦酸酯基团，它保证通式(I)的化合物被固定在酸性磁性颗粒的表面上。

更确切地说，本发明人发现，每一个偕二膦酸酯基团与在酸性颗粒表面上的单个质子化羟基点相互反应。

本发明的通式(I)化合物含有一个能够使偕二膦酸酯基团和活性实体X连接和/或彼此形成间隔的链接(L)，所述活性实体X能够保证和生物媒介的共价接枝。

链接L优选表示一个二价基团。

此链接L优选选自：

—脂肪族基团、脂环族基团、脂环-脂肪族基团、芳香族基团、芳香族-脂肪族基团，对于脂肪族、脂环族和芳香族基团，任选可被甲基、羟基、甲氧基、乙酰氧基、酰胺基或氯、碘或溴原子取代；

—基团-L₁-NHCO-L₂，这里L₁和L₂相同或不同，表示脂肪族基团、脂环族基团、芳香族基团、脂环-脂肪族基团或芳香族-脂肪族基团，对于所述基团，任选可被甲基、羟基、甲氧基、乙酰氧基、酰胺基或氯、碘或溴原子取代；

在本发明范围内的脂肪族基团意味着优选含有1～16个碳原子，更优选含有1～6个碳原子的线形或分支的烃链。其具体例子是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、异丁基、戊基和己基。

术语“脂环族”意味着优选含有3～8个碳原子的环状烃链。作为例子，将特别提到环丙基和环己基。

术语“芳香族”表示优选含有5～20个碳原子，更优选含有6～18个碳原子的单环或多环的芳香族烃基。其例子特别是苯基和1-或2-萘基。按照一个特定的实施方案，在本发明范围内的“芳香族”基团可加入一个或几个杂原子，比如硫、氧或氮。在此特定的情况下，“芳香族”基团表示单环或多环杂芳基团。

“脂肪族-脂环族”和“脂肪族-芳香族”基团分别表示被如上所定义的脂环族基团或芳香族基团取代的与上述定义相当的脂肪族链。作为脂肪族-芳香族基团的例子，特别可提到苄基。

按照一个优选的实施方案，L表示一个任选被取代的亚苯基，对于X和偕二膦酸酯基团，可处于邻位、间位或对位。

按照一个特别优选的实施方案，L表示被取代的或未被取代的脂肪族基团，更优选是基团-(CH₂)_p-，这里p是1～5的整数。

按照另一个优选的实施方案，L表示基团L₁-CONH-L₂，更优选是-(CH₂)_n-NHCO-(CH₂)_m-，这里n和m表示0～5的整数。

对通式(I)的偕二膦酸酯化合物的端基X进行选择，使其能够与生物媒介上的基团反应并形成共价键。对于涉及这些偶联过程的更多信息特别可参考如下著作：Bioconjugate techniques，Greg T.Hermanson，1995，出版社：Academic，San Diego，Calif。

作为优选的X基团，特别可提到：

—-COOH，

—-NH₂、-NCS、-NH-NH₂、-CHO、烷基焦羰基(alkylpyrocarbonyl)(-CO-O-CO-烷基)、酰叠氮基(acylazidyl)(-CO-N₃)、亚胺基碳酸根(-O-C(NH)-NH₂)、乙烯基硫基(-S-CH＝CH₂)、吡啶基二硫基(-S-S-Py)、卤代乙酰基、马来酰亚胺基、二氯三嗪基、卤素，

—特别优选基团-COOH和NH₂。

在本叙述的范围内，术语“烷基”(alk)意味着C1～C6烷基，对于其一部分的术语“吡啶基”(Py)意味着吡啶基。

马来酰亚胺基表示如下通式的环状基团：

二氯三嗪基表示如下通式的基团：

在卤素基团中，特别可以提到氯、溴、氟和碘，特别优选的是氯和溴。

在本发明的范围内，“卤代乙酰基”意味着其一个氢原子被卤素原子取代的乙酰基CH₃-CO-，所述卤素原子如上所定义。

X优选表示基团-COOH或-NH₂，而L表示被取代的或未被取代的脂肪族基团，更好表示基团-(CH₂)_p-，这里p是1～5的整数。

最特别优选的是通式(Ia)的化合物：

HOOC(CH₂)₂-CH(PO₃H₂)₂ (Ia)

按照另一个优选的实施方案，L表示基团L₁-CONH-L₂，更优选表示-(CH₂)_n-NHCO-(CH₂)_m，这里n和m表示0～5的整数，X表示-COOH或-NH₂。

当然，在本发明的范围内，基团X和生物媒介的偶联可以以间接的方式进行，这就是说，经过均二官能的或杂二官能的试剂进行。作为均二官能试剂的说明，戊二醛可以是适合于实施比如基团X＝-NH₂与生物媒介的基团-NH₂的偶联的。

按照本发明的一个优选实施方案，基团X与生物媒介形成如下类型的共价键L₃：

-CONH-、-COO-、-NHCO-、-OCO-、-NH-CS-NH-、-C-S-、-N-NH-CO-、-CO-NH-N-、-CH₂NH-、-N-CH₂-、-N-CS-N-、-CO-CH₂-S-、-N-CO-CH₂-S-、-N-CO-CH₂-CH₂-S-、-CH＝NH-NH-、-NH-NH＝CH-、-CH＝N-O-或-O-N＝CH-，或者相当于如下的分子式：

按照一个特定的实施方案，可以预见到经过如下类型的键在同样的基团X上偶联两个生物媒介：

按照本发明的酸性磁性颗粒(p)的质子化位置可以被至少两个具有相同或不同结构的通式(I)的化合物络合。

按照一个优选的实施方案，磁性颗粒(p)被具有不同结构，特别是具有不同的基团X的两种通式(I)的化合物的一个或几个分子络合。这有利地使得能够随后将具有能与不同基团X反应的基团的生物媒介进行接枝。

按照一个优选的实施方案，偕二膦酸酯化合物的全部或部分基团X与生物媒介偶联。

因此，本发明还涉及一种组合物(可以用作MRI的对比化合物)，该组合物含有酸性纳米级颗粒(p)的稳定水悬浮液，其中至少90％的质子化位置被一种或几种同样的或不同的通式(I)偕二膦酸酯化合物所络合：

X-L-CH(PO₃H₂)₂ (I)

其中全部或部分基团X与至少一个生物媒介偶联。

“全部或部分”意味着并非必须所有的偕二膦酸酯化合物的基团X要与生物媒介相偶联，而是使用该生物媒介时偶联度要足以达到所需的诊断特异性。还规定，如果使用几种基团X和/或几种生物媒介，这些基团X和/或生物媒介可以是相同或不同的。

如此与生物媒介结合的颗粒被写作：

(分支)r-酸性颗粒 (III)

其中r表示每个颗粒接枝的分支数，分支的定义如下：

[((生物媒介)-XL₃)_s-L-CH(PO₃H₂)₂]，L₃是来源于通式(I)化合物的基团X和生物媒介任选经过均二官能或杂二官能试剂偶联的如上所定义的共价键；s表示每一个基团X偶联的生物媒介的数，具体可等于1、2或3。

生物媒介

在本发明的范围内，“生物媒介”优选意味着一种特异的靶实体(一般是一种配体)，这就是说，对于给定的靶组织和/或生物受体和/或转运蛋白和/或生物基质具有特异的亲合性。

存在有许多受体/配体亲合对，如所定义的本发明可以很容易被本领域的专业人员应用于各种能够与靶受体(比如抗体/抗原、凝集素/多糖、生物素/抗生物素蛋白或核酸(+和-链)对)形成亲合对的配体，应该理解，配体可以通过共价键与通式(I)化合物的端基X直接偶联，也可以通过一个二官能试剂与其间接偶联。

在本叙述的范围内，术语“生物媒介”进一步还覆盖了具有药理学和/或细胞毒活性的有机分子，或者更一般地覆盖在治疗或预防治疗的方法中使用的药效基团。

在本发明的范围内，术语“药效基团”覆盖了具有药理学和/或细胞毒活性的有机分子，及其结构类似物，后者可能具有药理学和/或细胞毒活性。

在本叙述的范围内，“生物媒介”进一步表示在本性上明显亲水的生物相容的分子，比如氨基醇。

作为优选的生物媒介，特别可以提到任选是重组的或者突变的蛋白质、糖蛋白、凝集素、生物素、维生素、蝶酸或氨基蝶酸衍生物、反叶酸和叶酸衍生物、抗体或抗体片段、肽及其衍生物、单糖或多糖、抗生物素蛋白、(膜或核)受体底物或抑制剂、磷脂、类固醇及其类似物、核苷酸、核糖核酸序列、脱氧核糖核酸序列、激素或类激素物质、氨基酸、具有药理活性的有机分子、药效基团、任选重组或变异的蛋白质、抗体或抗体片段、氨基醇、磷脂衍生物、药效基团；特别优选反叶酸和叶酸衍生物、联整蛋白寻靶剂或MMP寻靶剂等。

特别包括抗体和药效基团的生物媒介可以任选地被官能化，使其能够与基团X反应，优选形成如下类型的共价键：

-CONH-、-COO-、-NHCO-、-OCO-、-NH-CS-NH-、-C-S-、-N-NH-CO、-CO-NH-N-、-CH₂NH-、-N-CH₂-、-N-CS-N-、-CO-CH₂-S-、-N-CO-CH₂-S-、-N-CO-CH₂-CH₂-S-、-CH＝NH-NH-、-NH-NH＝CH-、-CH＝N-O-或-O-N＝CH-，或者相当于如下的分子式：

术语“叶酸衍生物和反叶酸衍生物”表示将叶酸或蝶酸的至少一个化学基团官能化，使其能够与基团X形成共价键而得到的分子，特别是如上所述的类型。作为官能化的例子，特别可以提到羟基的醚化、羧酸根的酯化或酰胺化，或者对(2-氨基吡啶)结构单元，特别是在氨基蝶酸和蝶酸衍生物中存在的(2-氨基吡啶)结构单元进行改性和/或引进取代基。作为叶酸衍生物的优选例子，更特别可以提到在M.P.Costi在Current Drug Targets(2001)，vol.2，pp.135-166中叙述的衍生物。

作为“磷脂”衍生物的例子，可以提到磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇或鞘磷脂衍生物或神经酰胺衍生物，在此术语“衍生物”意味着分子被官能化使其能够与如上所述的基团X进行共价反应，特别是在X＝-COOH或-NH₂时。

在本叙述的范围内，“肽衍生物”意味着来源于氨基酸的肽，它可以是天然的，也可以是非天然的，能够通过比如肽键的改性使其原有的结构通过某些化学基团的官能化而被化学改性，使得得到的肽能够与基团X进行共价反应。作为指导，肽衍生物可以表示多肽、假肽、逆肽、肽模拟体、环状肽、抑制酶肽、激动肽或拮抗肽。作为优选的例子，可以提到在核医学中使用的官能化肽(参考S.Liu和D.ScottEdwards的Topicsin Current Chemistry(2002)，222，p.259-278和Okarvi的Nuclear Medicine Communication，1999，20：1093-1112)和蛋白酶，特别是金属蛋白酶的抑制剂或底物。

一类特别的生物媒介是高度亲水的分子，比如氨基醇或氨基聚乙二醇。此类氨基醇特别可用于得到在水稳定性和生物相容性方面足够亲水的最终磁性颗粒，也可以用来调节药物动力学和生物学分布。

在氨基醇当中，特别优选的是相当于如下通式(II)的化合物：

其中，R₁和R₂相同或不同，表示含有2～6个碳原子，优选被6～10个羟基取代的脂肪族烃链，或者当R₁和/或R₂被氧原子隔开时，被4～8个羟基取代。

在此范围内，一般优选分子中R₁表示-(CH₂)-(CHOH)₄-CH₂OH或-(CH₂)-CHOH-CH₂OH和R₂表示-CH₂(CHOH)₄-CH₂OH的氨基醇。

在氨基聚乙二醇中，特别优选通式(II)的化合物，其中R₁和R₂相同或不同，表示H、烷基或通式为-CH₂-(CH₂-O-CH₂)_k-CH₂OR₃的聚乙二醇链，其中k在2～100之间，R₃选自H、烷基或-(CO)烷基，术语“烷基”(alkyl或alk)表示在链中具有大约1～6个碳原子的线形或分支脂肪族烃基。

氨基聚乙二醇的例子特别是化合物O-(2-氨基乙基)-O’-甲基聚乙二醇1100、O-(2-氨基乙基)-O’-甲基聚乙二醇2000和O-(2-氨基乙基)-O’-甲基聚乙二醇750。

按照本发明的一个特定实施方案，在适当的情况下，性质不同的生物媒介通过基团X被偶联到磁性颗粒(p)的表面上。在此范围内，最特别优选的是在每个磁性颗粒(p)上都偶联两种不同的生物媒介。

按照一个实施方案，在氨基醇和不同性质的生物媒介之间进行“混合的”偶联，这就是说，对给定的靶显示出特异的亲合性，或显示出药物学和/或细胞毒活性，使得最终产物的生物学分布发生改变。

优选1～100％的偕二膦酸酯化合物的基团X被至少两种相同或不同的生物媒介偶联。作为例子，可以是30％的基团X与生物媒介B1偶联，30％与生物媒介B2偶联，30％与生物媒介B3偶联，B1、B2和B3是不同的。

虽然能够设想在酸性磁性颗粒(p)的表面上存在的基团X100％与生物媒介偶联，但一般优选的偶联率是它限制最终颗粒的流体动力学尺寸增大，而同时又能够保证有效地进行特定的寻靶。

因此，按照本发明的优选实施方案，通式(I)化合物的基团X中，有1～70％，特别是有1～50％被偶联，特别是当生物媒介相同时。

按照本发明的一个也是优选的实施方案，当生物媒介是不同的时候，特别是当其涉及到氨基醇和不同性质的生物媒介时，那么通式(I)化合物的基团X中有1～100％被偶联。

更为一般地，可以使用不同但能够对同样的病理进行特异寻靶的生物媒介进行混合偶联，比如具有不同序列的肽，它们能够对在病理学癌区或心血管区被过量表达的各种金属蛋白酶(MMPs)进行寻靶。

下面分成三类更准确地叙述特别在本发明的范围内使用的各种生物媒介：

-A)心血管

-B)肿瘤学

-C)炎症和退行性疾病

A)心血管领域和处于危险中的动脉粥样硬化斑块

在心血管疾病中，特别是在与动脉粥样硬化斑块相关的心血管疾病中存在的各种生物学系统/机制，对于按照本发明的对比或治疗剂是优选的靶子，特别是涉及到金属蛋白酶(MMPs)的系统、血栓系统、膜联蛋白系统。

已知基质金属蛋白酶(MMPs)，即基质蛋白酶(matrixin)是具有使细胞外基质的蛋白质组分降解性能的酶。此围绕着细胞和组织的细胞外基质由比如胶原蛋白的蛋白质构成。这种MMPs分成3类：明胶酶(IV型胶原蛋白酶)、基质溶素和间质胶原蛋白酶。

在动脉粥样硬化斑块中MMPs被过量表达。在心血管领域，许多研究指出，在斑块的细胞外基质重新造型时涉及到MMPs。对于动脉粥样硬化斑块，按照非穷举的方式，其中至少有8种MMPs被过量表达：

酶	MMP符号
酶	MMP符号	间质胶原蛋白酶	MMP-1
明胶酶A	MMP-2	间质胶原蛋白酶	MMP-1
明胶酶A	MMP-2	明胶酶B	MMP-9
基质溶素-1	MMP-3	明胶酶B	MMP-9
基质溶素-1	MMP-3	溶基质蛋白	MMP-7
巨噬细胞弹性蛋白酶	MMP-12	溶基质蛋白	MMP-7
巨噬细胞弹性蛋白酶	MMP-12	胶原蛋白酶-3	MMP-13
膜型MMP MT-MMP-1	MMP-14	胶原蛋白酶-3	MMP-13

Johnson J等人在Activation of Matrix-degradingMetalloproteinases by Mast Cell Proteases in AtheroscleroticPlaque，Arterioscl.Thromb.Vasc.Biol.1998；18：1707-1715中特别叙述了MMP1和MMP3。

因此，本发明涉及与生物媒介偶联了的通式(III)的纳米级颗粒，其中生物媒介是能够抑制至少一种MMP的试剂，特别是应用于心血管领域中的MMP抑制剂。按照一个优选的实施方案，此抑制剂是llomastat或在后面所举例的一种肽的衍生物。优选的MMP抑制剂选自在Current Medicinal Chemistry，2001，8，425-474和Chem.Rev，1999，99，2735-2776中叙述的。MMP抑制剂的应用特别指的是TIMPs，见DDT vol 1，N°1，1996年1月，Elsevier Science，16-17；Bioconjugate Chem.，2001，12，964-971。

对于血栓，已知：

—在活化的血小板上表达Gpllb/llla受体(已经作为抗血小板剂的靶子用于治疗)；

—纤维蛋白与血栓形成有关。

更准确说，当涉及到血栓时，已经显示出涉及到在活化血小板上的Gpllb/llla糖蛋白。血小板是骨髓巨核细胞的无核断片，它在动脉粥样硬化和血栓形成的过程中起着决定性的作用。最普遍使用的传统抗血小板药物是阿司匹林、氯苄噻啶和氯达格雷。有关导致血小板凝聚的分子机理知识使得能够开发出新型的一类对抗血小板受体纤维蛋白原的分子，整联蛋白GPllb/llla。与上面提到的拮抗剂相比，主要的优点是，阻断了血小板活化的最后一步，而与血小板活化的路径无关。由于血小板-血小板的相互作用对于形成血栓来说是至关重要的，纤维蛋白原(它在血小板之间形成桥)与GPllb/llla络合物的结合在止血和血栓形成中是个关键性的事件。当血小板被活化时，位于血小板膜表面上的GPllb/llla糖蛋白受体的空间构像发生改变，则可与溶于血浆的纤维蛋白原分子和钙相结合。纤维蛋白原经过Ca²⁺-纤维蛋白原键被交联在血小板之间，形成可在其中捕获血球的网络。凝血酶通过将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，收紧了此网络的网眼。此凝聚的过程将导致在受伤的区域形成血栓。因此进行了许多研究以在GPllb/llla受体上识别出配体相互作用点。GPllb/llla络合物在血小板中是重要的与膜结合的杂二聚糖蛋白络合物(每个血小板大约50,000个拷贝)。

至少有两个系列的与在人类纤维蛋白原中天然存在的氨基酸序列相当的肽，已知能够抑制粘附大分子与GPllb/llla受体的结合：一个是Arg-Gly-Asp(RGD)序列，一个是Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Valγ链。

Arg-Gly-Asp(RGD)序列最初被识别为纤维结合素的粘结序列，一种在其被血小板释放出来以后，在血小板-血小板和血小板-血管的相互作用中起着重要的作用的整联蛋白。此序列也存在于纤维蛋白原、von Willebrand因子和玻璃体结合蛋白中(在纤维蛋白溶解和与血管结合中的作用)。

GPllb/llla络合物识别此抑制在血小板上的纤维结合素、纤维蛋白原、Willebrand因子和玻璃体结合蛋白结合的序列。所有这些配体都含有至少一种RGD序列；而纤维蛋白原的每半个分子含有其中的两个。在活体内，由于纤维蛋白原在血浆中的高浓度，所以它是主要的配体。

因此，本发明涉及与生物媒介偶联的颗粒(III)：

—其中生物媒介能够靶向GPllb/llla受体；

—其中生物媒介能够靶向纤维蛋白，特别是通过对纤维蛋白单体有选择性的肽，以使纤维蛋白从可溶的纤维蛋白原分子分化。

本发明特别涉及分子中的生物媒介含有RGD链段的化合物(lll)在心血管领域中的应用。

比如，在WO 2001/9188、US6,521,211、US 6,403,056、Seminarsin nuclear medicine，1990，52-67、Nuclear Medicine and Radiology，28，2001，515-526中叙述的肽和来源于Diatide公司的apcitideAcutect的应用。

B)肿瘤学领域

按照本发明的一个实施方案，借助于本发明得到的特异的成像，其目标是得到用已知的技术无法得到的新生血管发生的标记、在细胞外基质中的肿瘤细胞或病变的特异寻靶。与肿瘤的进展有关的各种生理学系统(或机制)，对于按照本发明的对比剂或治疗剂都是优选的靶子：涉及到能够结合叶酸酯受体的化合物的系统、涉及到MMPs的系统、涉及到与血管发生有关的生长因子的系统。

按照一个实施方案，本发明涉及化合物(lll)，其中生物媒介是能够靶向叶酸酯受体的衍生物，此生物媒介能够提供对肿瘤细胞的特异性识别。特别被用作生物媒介的通式(E)的叶酸衍生物被记做BIOVECTOR：

其中：

a)G1独立地选自卤素、R_f2、OR_f2、SR_f3、NR_f4R_f5，优选G1是NH₂或OH；

b)G2独立地选自卤素、R_f2、OR_f2、SR_f3和NR_f4R_f5；

c)G3和G4表示独立地选自-(R_f6’)C＝、-N＝、-(R_f6’)C(R_f7’)-、-N(R_f4’)-的二价基团；

当包括G3的环是芳香环时，G3优选是-N＝(叶酸)或-CH-(在下面叙述的化合物：CB3717，raltitrexed，MAI)，当包括G3的环不是芳香环时，G3优选是-NH-或-CH2-(在下面叙述的化合物：AG-2034，lometrexol)；

当包括G3的环是芳香环时，G4优选是-CH-或-C(CH₃)-，而当包括G3的环不是芳香环时，G4优选是-CH₂-或-CH(CH₃)-；

e)G5不存在(pemetrexed化合物)或选自-(R_f6’)C＝、-N＝、-(R_f6’)C(R_f7’)-、-N(R_f4’)-；

f)环J可能是5元或6元芳杂环，成环的原子可能是C、N、O、S；

vii)G6是N或C(下面叙述的化合物：3-去氮杂-ICI-198，583)；

h)K1和K2独立地选自-C(Z_f)-、-C(Z_f)O-、-OC(Z_f)-、-N(R_f4”)-、-C(Z_f)N(R_f4)、-N(R_f4”)-C(Z_f)、-O-C(Z)-N(R_f4”)-、-N(R_f4”)C(Z_f)-O-、N(R_f4”)-C(Z_f)-N(R_f5”)-、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R_f4”)S(O)2-、-C(R_f6”)(R_f7”)-、-N(C≡CH)-、-N(CH₂-C≡CH)-、C1～C12烷基和C1～C12烷氧基；其中Z_f是O或S；K1优选是-N(R_f4”)-或-C(R_f6”)(R_f7”)-，同时R_f”4、R_f6”、R_f7”是H；A2可能与氨基酸共价相连；

i)R_f1选自H、卤素、C1～C12烷基和C1～C12烷氧基；R_f2、R_f3、R_f4、R_f4’、R_f4”、R_f5、R_f5”’、R_f6”和R_f7”独立地选自H、卤素、C1～C12烷基、C1～C12烷氧基、C，-C，2烷酰基、C，-C，2烯基、C1～C12炔基、(C1～C12烷氧基)羰基和(C，-C，2烷基氨基)羰基；

j)R_f6和R_f7独立地选自H、卤素、C1～C12烷基、C1～C12烷氧基；或者R_f6和R_f7一起形成O＝；

k)R_f6’和R_f7’独立地选自H、卤素、C1～C12烷基、C1～C12烷氧基，或者R_f6’和R_f7’一起形成O＝；

1)Lf是一个二价链接，在适当的情况下，它包括经过其α-氨基通过酰胺键与K2或K1结合的天然氨基酸或天然的聚氨基酸；

m)n、p、r和s各自独立地是0或1。

通式(E)包括互变异构的形式，比如分子中G1是OH、SH或NH的化合物。

对于其分子中基团K1、K2、R_f1、R_f2、R_f3、R_f4、R_f4’、R_f4”、R_f5、R_f5”、R_f6、R_f7”、R_f6、R_f7、R_f6’和R_f7’中至少一个含有氢原子或烷基、烷氧基、烷基氨基、烷酰基、烯基、炔基、烷氧羰基或烷基氨基羰基的化合物，该基团优选含有1～6个碳原子(C1～C6)，更优选含有1～4个碳原子(C1～C4)。

至于在肿瘤学领域中的MMPs，已知MMPs具有两种不同的功能：

a)它们有助于通过破坏细胞外基质而使肿瘤扩散；

b)它们创建促进原发和转移肿瘤生长和血管发生的环境。

在主要的人类肿瘤中表达的MMPs具体如下：

—乳腺癌：MMP-1、2、3、7、9、11、13、14；

—结肠直肠癌：MMP-1、2、3、7、9、11；

—肺癌：MMP-2、3、7、9、11、14；

—前列腺癌：MMP-1、2、3、7、9。

在肿瘤进展的状态和MMPs的表达水平之间经常存在有相关关系。一般说来。恶性肿瘤比良性肿瘤表达出更大量的MMP。

因此，本发明涉及化合物(lll)在肿瘤学领域中的应用，其中的生物媒介是一种MMP抑制剂。按照优选的实施方案，使用了选自在Current Medicinal Chemistry，2001，8，425-474；Chem.Rev，1999，99，2735-2776中叙述的抑制剂。特别使用的MMP抑制剂，指的是在DDT vol 1，N°1，1996年1月，Elsevier Science，16-17；BioconjugateChem.，2001，12，964-971中被称为TIMPs的抑制剂。

涉及到血管发生，研究显示，在各种不同的肿瘤中，血管发生是一个预示性的因素，特别是对于乳腺癌、肾癌、前列腺癌、结肠癌和脑癌，还有黑色素瘤。

因此，本发明涉及化合物(lll)，其中生物媒介能够靶向血管发生标记物。

已经发现，某些内皮生长因子是肿瘤特异性的。在正常的成人体中，构成血管内壁的内皮细胞不显示出自然的增生倾向。另一方面，在病理的状态下，比如，在肿瘤进展或形成转移的过程中，增加的氧和营养供给的需求通过局部灌注的增加进行转运。由此，肿瘤有利地形成了新生的血管网络，已知作为血管发生的一个过程。

血管内皮生长因子(VEGF)是很强的和有选择性的血管生成生长因子。它是通过刺激在细胞外膜上的至少3个受体：VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)和NP-1而起作用。VEGFs受体属于大RTK(酪氨酸-激酶受体)家族。这些整联蛋白族的蛋白质具有能够结合配体的细胞外区域、穿膜结构域和带有酪氨酸激酶活性的细胞质区。在VEGFRs的情况下，激酶区被对每一种受体具有特异性的短序列所间断。

因此，本发明涉及化合物(lll)，其中的生物媒介是一种能够与在内皮细胞的表面上存在的血管发生受体相结合的试剂。

特别使用了在文献WO 01/012809、WO 01/83693、WO 02/057299(靶向VEGFR3的8个氨基酸的肽)；Nuclear MedicineCommunications(1999)，20，Pharmacological Review，179，206，2000；Journal of Biological Chemistry，2000，275，13588-13596；Journal of Biological Chemistry，2002，277，45，43137-43142；J.Mol.Bio，2001，316，769-787；Biochemistry，1998，37，17754-17772；Chem.J.Biochem.Mol.Biol，2000，16，803-806中叙述的生物媒介(特别是通过噬菌体显示得到的肽)。特别可以使用(i)VEGF相关酶活性的抑制剂，比如喹唑啉、氨基噻唑或氨茴酰胺化合物，(ii)作为VEGF拮抗剂的化合物，特别是小分子，比如二苯并噻吩和文献JP-2001-353075、JP2000-395413中的分子、抗体。也可以使用文献US 6,610,269的生物媒介，此文献叙述了许多靶向在血管发生的情况下被过量表达的受体的试剂。

还已经知道，整联蛋白αvβ3在血管系统中很少被表达，而在肿瘤细胞中会被过量表达(晚期恶性胶质瘤、卵巢黑色素瘤)。αvβ3参与了各期的血管发生：αvβ3调节内皮细胞与基质的粘连，它将信号传递给细胞核，是通过与内皮细胞生长因子受体(VEGFR-2，flk)合作而具有原血管发生作用的受体。与膜型金属蛋白酶-1(MT1-MMP)一起发生作用的αvβ3，负着活化在细胞表面基质上的金属蛋白酶-2的任务。用RGD肽，或者用抗体阻断此受体，也还涉及到阻断αvβ5会诱发细胞凋亡。在血管发生的增生期特别涉及到αvβ5，像αvβ5。许多基质蛋白具有共同的序列：Arg-Gly-Asp(叫作RGD)，已经将其鉴别为与某些整联蛋白相互作用的反应点。包括此RGD序列的大量抗发生抑制剂已经被开发。

因此，本发明涉及化合物(lll)，其中生物媒介是适合于在肿瘤学中应用的RGD肽。

对于以αvβ3为靶的RGD肽，本发明人推荐对αvβ3显示出高度亲合性(以避免与基质蛋白结合)，但对αllbβ3显示出低亲合性的用来抑制血管发生的生物媒介。实际上，已经发现，αllbβ3拮抗剂可引起不利的出血问题。本发明人特别推荐具有环状RGD肽序列的拮抗剂，它对酶的降解是更为稳定的，具有更好的亲合性和选择性，由于旋转的限制，此肽的构像得以保持在有利的位置。

更准确说，在对RGD肽进行结构-活性分析以后，本发明人最特别地推荐环状RGD肽，为了在有利于保持对αvβ3的亲合性的条件下，以避免被酶(外肽酶和内肽酶)降解，该肽具有很短的环，以使其更加具有刚性(5-氨基酸环比6-氨基酸环更优选)，还具有D构形的氨基酸。天门冬氨酸的β-碳和精氨酸的β-碳之间的距离特别要小于6.6，以对αvβ3比对αllbβ3具有更大的选择性(后者的反应点大于前者的反应点)。靠近天门冬氨酸的疏水氨基也促进更好的选择性。这样的结构对于受体点上疏水基团和亲水基团的正确曝露是最优化的。本发明人特别推荐环(Arg-Gly-Asp-Dphe-Val)肽，也叫作环(RGDfV)，小写字母表示相应的氨基酸是处于D构像的。它显示出的IC₅₀在nmol级(2～2.5nM)。此肽对于可以与FR衍生物反应的赖氨酸的侧链氨基是特别有利的。X.Dai、Z.Su、J.O.Liu在TetrahedronLetters(2000)，41，pp.6295-6298中叙述了其合成方法。

RGDfV peptide

它能够与特别在-COOH、角鲨酸根、异氰尿酸根官能化的USPIOs(官能化颗粒)偶联。本发明人克服了与选择氨基酸保护和选择偶联介质有关的技术困难。

还可以使用具有受限制柔韧性构像的化合物，这种肽对αvβ3具有良好的亲合性和选择性：

—在其中RGD链段被放置在两个半胱氨酸之间的肽，其对αvβ3的活性增加，比如(环(CRGDC))；

—在其中RGD基团不在环中，但与两个环的边界处，其中至少一个是由两个半胱氨酸之间的二硫桥形成的(WO 02/26776)。

也可以使用：

—多肽生物媒介，对其选择使得它们在活体内与至少一种酶，特别是MMP相互作用，此相互作用导致与靶蛋白结合更强；

—含有酶切位点的生物媒介，此切割导致构像改变；

—来源于抗体的生物媒介，比如LM609(Nature Medicine，vol.4、5，1998年5月，623)；

—模拟RGD肽的生物媒介，具有喹诺酮或苯并二氮杂型结构。

本发明还涉及化合物(lll)，其中生物媒介是适合于在肿瘤学领域中应用的RGD肽的肽模拟物。可以使用：

—由硫代酰胺键(CSNH)，或者由酮基亚甲基(COCH₂)取代一个或两个肽键的肽，条件是取代基不会引起任何重大的构像变化；

—表现出环状肽(RGDfV)的每一个氨基酸都被N-甲基化的肽(EMD121974，也称为Cilengtide：环(RGDf-N(Me)V))，此肽显示出很高的亲合性(IC₅₀＝0.58nM)和很好的选择性(比对αllbβ3大1500倍)；

—具有如下序列的肽：环(Xaa-Yaa-GD-Mamb)，基团Mamb是N-氨基甲基苯甲酸。已经表明，DXaa-N-MeArg肽是非常具有活性的αllbβ3拮抗剂，而Lxaa-Arg拮抗剂对αvβ3具有选择性；

—由于与天门冬氨酸相邻的氨基酸的疏水本性和由于使肽在水溶液中的柔软性变小的Mamb基团，对αvβ3显示出很高亲合性的环状肽(RGDD(tBuG)Mamb)(IC₅₀＝0.6nM，对αllbβ3是14μm)；

—具有基团：环(ARGDMamb)的肽XJ735(DUPONT)。这使其能够抑制纤维蛋白原与αvβ3受体的结合(IC₅₀-70nM)，但不会阻断其他整联蛋白(αvβ5、α5β1)；

—在参考肽RGDfV中，引进各种基团以代替Dphe-Val(或fV)得到的肽。

合成这些基团是为了模拟βll’折叠，但也是为了降低在γ-旋转区的柔软性。活性最高的试剂是环(RGD-(R)-ANC)(IC₅₀＝0.8nM)。也可以在环(RGDX)序列中引进糖X代替这两个氨基酸(fv)(LohofE.等人，Angew.Chem.Ed.Engl.(2000)，39(15)，pp.2761-2764)；

—在环中引进双键的肽(Kawaguchi等人，Biochemical andBiophysical Research Communications(2001)，288(3)，pp.711-717)；

—在Chemlibrary.bri.nrc.ca中叙述的肽。

本发明还涉及化合物(lll)，其中的生物媒介是以整联蛋白αvβ3为靶的非肽分子，适合于用于肿瘤学领域中。可以使用在下表中的化合物，业已证明其nM级亲合性。

化合物

苯并二氮杂-Benzozepine和衍生物

苯甲酰胺

和文献WO 01/97861的其他化合物

乙酰基吡啶

和文献WO 99/52896的其他化合物

杂五环核

和来自Lohof等人在Angew.Chem.Int.Ed.Eng，2000，39(15)，pp.2761-2764的其他化合物

和文献WO 00/00486的基于乙酰基噻吩的其他化合物

(和来自Du Pont制药公司的化合物SG256、SM256和XJ735)

和来自文献WO 00/03973的类似物

碳水化合物

硫藤黄素

和具有pyrrothine基团的其他化合物。

还可以使用在文献US 6,537,520(在血管发生的过程中过量表达的以αvβ3为靶的生物媒介)和WO 01/198294中提到的生物媒介(吲唑核)。在某些情况下，可以在同样的化合物中使用几种不同的生物媒介，以增加获得相同靶的机会，比如对于αvβ3的RGD肽和苯并二氮杂。除了如上所述的RGD型生物媒介或功能等同物以外，可以使用如下的MMP抑制化合物，要知道在详细叙述中给出了实验操作程序，这使得能够实现活体外或活体内的筛选：

—肽、肽模拟物、功能相当的非肽，它们在诊断或治疗方面都是有效的，特别选自Bachem，Amersham公司2002年的产品目录中的商品抑制剂；

—在文献WO 01/60416、WO 01/60820、WO 2001/92244、EP-558635和EP-663823中叙述的抑制剂；

—如在文献EP-793641、EP-766665、EP-740655、EP-689538、EP-575844、EP-634998、WO 99/29667、EP-965592、EP-922702、WO99/52889、WO 99/42443、WO 01/60416(Du Pont，特别是通式la和lb)中叙述的如下这些类的抑制剂：异羟肟酸酯、异羟肟酸吡咯烷酯、双环异羟肟酸酯、异羟肟酸环丁酯、异羟肟酸琥珀酸酯、异羟肟磺酰胺、异羟肟酸丙氨酸酯等。

—如在文献EP-725075、US 5,679,700、WO 98/03516、EP-716086、WO 2000/74681和WO 2000/04030中叙述的基于膦酸的抑制剂；

—基于环酰亚胺的抑制剂(US 5,854,275)；

—基于三环磺酰胺的抑制剂(WO 2000/06561)；

—基于氧丁酸的抑制剂；

—TIMPS衍生物(Bioconjugate Chem，2001，12，964-971)。

在肿瘤学领域中，对于骨组织癌，分子中的生物媒介是基于膦酸酯或基于二膦酸酯的化合物(lll)也是很有用的。这些化合物也可以用于由于免疫问题(自体免疫疾病，比如类风湿性关节炎)而造成的骨问题有关的疾病，用于代谢疾病(骨质疏松等)和感染性疾病。

在这些化合物中，生物媒介是比如在文献WO 02/062398中叙述的生物媒介。可以使用在美国专利6,534,488或美国专利6,509,324中叙述的二膦酸酯，商品二膦酸酯，比如羟乙二磷酸盐、氯甲双磷酸盐、pamidronate、alendronate、ibandonate、YH592或EB-1053等。

C)炎症和退行性疾病领域

是位于巨噬细胞上的受体，例如SRA受体(清除受体)或Fc受体(US 2002/58284)，的配体的生物媒介将特别被靶向。

动脉粥样硬化的进展涉及到捕获LDLs，还涉及其在斑块中的氧化。由一组被称为清除受体(SRs)的受体介导这些被氧化的LDLs被巨噬细胞吞噬。因此，此类膜结合蛋白质在巨噬细胞逐渐转化为泡沫细胞的过程中起着主要作用。SRs是能够结合衰老细胞和被化学或生物学修饰的脂蛋白的膜结合表面蛋白。主要的一组SR被分成几类：

1/A类SRs：l型、ll型和MARCO

2/B类SRs：l型、ll型和CD36

3/D类SRs：CD68

4/E类和F类SRs：“类凝集素”：LOX-1

5/当前还未分类的SRs：SR-PSOX。

正如在文献USA 2002/0127181和在De Winther等人的ATVB2000；20：290-297；Kunjathoor等人，J.Biol.Chem.2002；277：49982-49988中所提到的，在心血管疾病(动脉粥样硬化、粥样硬化斑块、冠状动脉疾病、血栓形成、局部缺血、心肌梗死等)中，SRA受体被巨噬细胞过量表达。使用按照本发明的化合物靶向与这些病理有关的SRA是本发明的一部分。

因此，本发明还覆盖用于诊断和/或治疗炎性疾病的，被与如下化合物相结合的通式(l)的化合物络合的颗粒：

1)SR-靶向生物媒介，特别是：

1a)在文献US 6,255,298、US 6,458,845、WO 00/06147、WO00/03704中叙述的生物媒介；

1b)改性的脂蛋白，特别是乙酰基化的LDLs(acLDL，Gurudutta等，Nucl.Med.Biol.，2001，28：235-24)和氧化的LDLs(oxLDL)

1c)在Esbach等人的Hepatology，199318：537、DeRijke等人的J.Biol.Chem.，1994，269：824、Van Oosten等人的Infect.Immun.，1998，66：5107、Bijsterbosch等人的Nucleic Acids Res.，199725：3290和Biessen等人的Mol.Pha rmacol.，53：262，1998中叙述的AcLDL、OxLDL和LPS配体；

1d)由噬菌体显示筛选的能够与SR-Al受体结合的肽；

2)叶酸酯受体靶向的生物媒介(这些叶酸酯受体在被活化的巨噬细胞中被过量表达)，用于涉及巨噬细胞活化的病理；

3)用于靶向淀粉样斑块的肽，特别会导致早老痴呆症(比如在WO 01/74374、US 6,329,531中所叙述)；

4)在比如美国专利6,491,893中叙述的CSF型生物媒介(GCSF、GM-CSF等)；

5)以在巨噬细胞中过量表达的受体(CD68、MRP8-14等)为靶的抗体或抗体片段。

在炎性疾病领域中，本发明特别使用了磷脂酰丝氨酸或磷脂酰丝氨酸衍生物作为用于诊断巨噬细胞相关的疾病的生物媒介。

磷脂酰丝氨酸(PS)是一种主要位于胞浆侧细胞内表面上的膜磷脂。其总的负电荷使其极性稳定化，避免其通过血浆膜扩散。PS是作用是巨噬细胞的识别信号。此信号的本质仍还是未知的(直接识别、电荷密度、多受体、可诱导单受体)。按照最近出版的研究报告，据认为是在经受了体内平衡中断的区域里存在的某些巨噬细胞的表面上，在诱导了此受体之后，在PS和PS受体(PSR)之间的直接相互作用。在某些巨噬细胞中，PS也经过其附着阴离子磷脂的反应点与清除受体发生作用。在所有具有生存能力细胞膜的内表面上表达了PS。在细胞受损的事件中，或者在凋亡过程开始时，膜结合移位酶引起PS翻转到细胞的外表面上。此细胞外表达构成了巨噬细胞的识别信号，它识别和吞噬受损细胞，如此就避免了局部的炎症。

本发明人制备了与PS或衍生物结合的对比剂，意图被巨噬细胞有活性地吸收，以形成各种病理的影像。克服了几种化学技术上的困难，以制备出如下的PS生物媒介，该螯合物将与自由NH₂基团偶联：

为了完全控制最终产物的结构，必须制备被正确官能化的PS衍生物。在PS的极性部分上存在的氨基酸残基是进一步困难的根源，其必须通过进行化学反应保护/解保护自由胺和酸基团，和/或使用与这些基团相适应的化学方法进行控制。用来保护氨基酸残基的基团就是在氨基酸化学中使用的传统基团(Boc、tBu、Z、Bn等)。用来提供在PS和超顺磁颗粒之间的键的优选的基团是NH₂、COOH和SH。

本发明人还制备了与生物媒介偶联的产物，其中在至少一个脂肪链上缺少磷脂酰丝氨酸，没有以干扰的方式改变亲合性。

除了本申请中已提到的本领域的那些以外，还可以使用：

1)在文献WO 01/97850(VEGF寻靶受体和促血管生成素)、US6,372,194(聚合物，比如聚hystidine)、WO 2001/9188(纤维蛋白寻靶多肽)、WO 01/77145(整联蛋白寻靶肽)、WO 02/26776(αvβ3整联蛋白寻靶肽)、WO 03/062198(MMP金属蛋白酶寻靶肽)、WO99/40947(寻靶肽，比如KDR/Flk-1受体，包括R-X-K-X-H和R-X-K-X-H，或Tie-1和2受体)、WO 02/062810和Müller等人在Eur.J.Org.Chem.，2002，3966-3973(唾液酸Lewis糖苷)、WO02/40060(抗氧化剂，比如抗坏血酸)、US 6,524,554(促吞噬素的寻靶)、WO 02/094873(靶向G-蛋白质受体GPCRs，特别是缩胆囊素)、US 6,489,333(整联蛋白拮抗剂和胍模拟物的结合)、US 6,511,648(喹诺酮寻靶αvβ3或αvβ5)、US A 2002/0106325、WO 01/97861(苯并二氮杂和整联蛋白寻靶类似物)、用于靶向整联蛋白的生物媒介，包括α5β1、WO 01/98294(咪唑和类似物)、WO 01/60416(MMP抑制剂，特别是异羟肟酸酯)、WO 02/081497(αvβ3寻靶肽，比如RGDWXE)、WO 01/10450(RGD肽)、US 6,261,535(抗体或抗体片段(FGF、TGFb、GV39、GV97、ELAM、VCAM，可用TNF或IL诱导))、US 5,707,605(靶向通过与其靶相互作用改性的分子)、WO 02/28441(类淀粉沉淀寻靶剂)、WO 02/056670(组织蛋白酶切割肽)、US6,410,695(米托蒽醌或醌)、US 6,391,280(上皮寻靶多肽)、US6,491,893(GCSF)、US 2002/0128553、WO 02/054088、WO 02/32292、WO 02/38546、WO 2003/6059、US 6,534,038、WO 99/54317(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)、WO 01/77102、EP 1,121,377、Pha rmacologicalReviews(52，n°2，179；生长因子PDGF、EGF、FGF等)、TopicsinCurrent Chemistry(222，W.Krause，Springer)，Bioorganic&Medicinal Chemistry(11，2003，1319-1341；αvβ3寻靶的四氢苯并氮杂酮(tetrahydrobenzazepinon)衍生物)中叙述的生物媒介。

2)血管发生抑制剂，特别是在临床试验中验证过的或已经商业化的，特别是：

—涉及到FGFR或VEGFR受体的血管发生抑制剂，比如SU101、SU5416、SU6668、ZD4190、PTK787、ZK225846、氮杂环化合物(WO00/244156、WO 02/059110)；

—涉及MMPs的血管发生抑制剂，例如BB25-16(marimastat)、AG3340(prinomastat)、solimastat、BAY12-9566、BMS 275291、metastat、neovastat；

—涉及整联蛋白的血管发生抑制剂，比如SM256、SG545、EC-ECM阻断粘连分子(比如EMD121-947，或vitaxin)；

—具有更为间接的血管发生作用机理的药物，比如羧基氨基三唑、TNP470、角鲨胺、ZD0101；

—在文献WO 99/40947中叙述的抑制剂，对于与KDR受体结合很有选择性的抗体、促生长素抑制素类似物(WO 94/00489)、选择蛋白结合肽(WO 94/05269)、生长因子(VEGF、EGF、PDGF、TNF、MCSF、白介素)；在Nuclear Medicine Communications，1999，20中叙述的VEFG寻靶生物媒介；

—文献WO 02/066512的抑制肽。

3)能够靶向如下受体的生物媒介：CD36、EPAS-1、ARNT、NHE3、Tie-1、1/KDR、Flt-1、Tek、神经纤毛蛋白-1、多效营养因子、内皮唾酸蛋白、Axl、alPi、a2ssl、a4P1、a5pl、eph B4(ephrin)、层粘连蛋白A受体、neutrophilin 65受体、OB-RP瘦蛋白受体、CXCR-4趋化因子受体(和在文献WO 99/40947中提到的其他受体)、LHRH、铃蟾肽/GRP、胃泌素受体、VIP、CCK、Tln4。

4)酪氨酸激酶抑制剂型生物媒介。

5)选自下面的GPllb/llla抑制剂的已知抑制剂：

(1)GPllb/llla受体的单克隆抗体的Fab片段，Abciximab(ReoPro^TM)，

(2)静脉注射的小肽和肽模拟分子，比如eptifibatide(Integrilin^TM)和tirofiban(Aggrastat^TM)。

6)作为纤维蛋白原受体拮抗剂的肽(EP-425212)、作为llb/llla受体配体的肽、纤维蛋白原配体、凝血酶配体、能够以粥样硬化斑块为靶子的肽、血小板、纤维蛋白、基于蛭素的肽、靶向llb/llla受体的鸟嘌呤基衍生物。

7)具有抗凝血作用、抗血小板凝聚作用、抗动脉粥样硬化作用、抗再狭窄作用和/或抗凝固作用的本领域专业人员已知作为药物的其他生物媒介或生物活性的生物媒介片段。

8)在专利US 6,537,520中与DOTA结合叙述的靶向αvβ3的其他生物媒介或生物媒介的生物活性片段，选自如下的化合物：丝裂霉素、维A酸、ribomustin、gemcitabine、长春新碱、依托泊苷、cladribine、二溴甘露醇、氨甲蝶呤、阿霉素、卡波醌、戊糖苷、二胺硝吖啶、净司他丁、cetrorelix、letrozole、raltitrexed、道诺红菌素、fadrozole、fotemustin、thymalfasin、sobuzoxane、nedaplatin、阿糖胞苷、bicalutamide、长春瑞滨、vesnarinone、氨鲁米特、安吖啶、丙谷酰胺、依利酯铵、ketanserin、doxifluridine、阿维A酯、异维生素A酸、链脲霉素、尼氮芥、长春地辛、氟硝丁酰胺、drogenil、甘氨硫嘌呤、氟基嘧啶、丙亚胺、sizofilan、卡铂、二溴卫茅醇、呋氟脲嘧啶、异环磷酰胺、松龙苯芥、溶链菌、左咪唑、鬼臼噻吩苷、胺丙磺酯、依诺他滨、麦角乙脲、羟甲烯龙、三苯氧胺、黄体酮、环戊缩环硫雄烷、环硫雄醇、formestane、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、集落刺激因子-1、集落刺激因子-2、denileukindiftitox、白介素-2、促黄体生成激素释放因子。

9)靶向特定的癌的某些生物媒介，比如靶向与直肠结肠癌有关的ST受体或速激肽受体的肽。

10)使用膦型化合物的生物媒介。

11)靶向P-选凝素、E-选凝素的生物媒介，比如被Morikawa等人1996，951中叙述的8-氨基酸肽和各种糖。

12)膜联蛋白V或靶向凋亡过程的生物媒介。

13)由筛选技术得到的任何肽，比如通过噬菌体显示，任选被非天然氨基酸改性(http//chemlibrary.bri.nrc.ca)，比如来源于噬菌体显示文库的肽：RGD、NGR、CRRETAWAC、KGD、RGD-4C、XXXY*XXX、RPLPP、APPLPPR。

14)靶向粥样硬化斑块的其他已知肽生物媒介，特别是在文献WO2003/014145中提到的。

15)维生素。

16)激素受体的配体，包括激素和类固醇。

17)靶向阿片样受体的生物媒介。

18)靶向TKI受体的生物媒介。

19)LB4和VnR拮抗剂。

20)硝咪唑和苄基胍化合物。

21)在Topics in Current Chemistry，vol.222，260-274，《基于受体的诊断金属药物基础》中提到的生物媒介，特别是：

—靶向在肿瘤中过量表达的肽受体(比如LHRH受体、韩蛙皮素/GRP、VIP受体、CCK受体、速激肽受体)的生物媒介，特别是生长抑素类似物或韩蛙皮素类似物，任选糖基化的奥曲肽衍生的肽、VIP肽、α-MSHs、CCK-B肽；

—选自环RGD肽、纤维蛋白α-链、CSVTCR、促吞噬素、fMLF、YIGSR(受体：层粘素)。

22)低聚糖、多糖和糖衍生物，Glu-寻靶衍生物。

23)用于smart型药物的生物媒介。

24)心肌生命力标记物(tetrofosmin和hexakis-2-甲氧基-2-甲基丙基异腈)。

25)糖和脂肪代谢示踪物。

26)神经递质受体(D、5HT、Ach、GABA、NA受体)配体。

27)低聚核苷酸。

28)组织因子。

29)在WO 03/20701中叙述的生物媒介，特别是PK11195、周边苯并二氮杂受体的配体。

30)纤维蛋白结合肽，特别是在WO 03/11115中叙述的肽序列。

31)在WO 02/085903中叙述的淀粉样斑块凝聚抑制剂。

32)可用于光成像的荧光色素型生物媒介。

在适当的时候，化合物(l)链接L的长度将是变化的，以使化合物(lll)的生物学分布实现最佳化和/或促进其被生物靶进行特异的识别。

最终的颗粒

在本发明的范围内，最终的被络合并任选与生物媒介偶联的颗粒，其总的流体动力学直径在5～200nm，优选在5～60nm之间。

任选与生物媒介偶联的磁性颗粒(p)组合物一般呈水悬浮液的形式，任选在水相容的有机溶剂，比如DMSO、丙酮或甲醇存在下，生物相容的悬浮液是特别优选的。

按照本发明的一个优选实施方案，被络合和任选与生物媒介偶联的酸性磁性颗粒(p)组合物含有一种或几种可药用载体和/或添加剂。在此范围内，特别优选灭菌的组合物。

颗粒的制备方法

按照本发明的另一方面，本发明的目标是酸性磁性颗粒(p)的制备方法，其中至少90％的质子化位置被一个或几个同样或不同的通式(l)的偕二膦酸酯化合物络合，基团X可能与至少一个生物媒介偶联，所述方法包括使基于铁化合物的酸性磁性颗粒(p)的酸性溶液与足够量的如上所述通式(l)化合物接触，回收得到的络合颗粒。

按照本发明的另一个方面，其目标是被化合物(l)络合的并且用生物媒介覆盖的磁性纳米级颗粒组合物的制备方法，该方法相继包括如下的步骤：

i)使基于铁化合物的酸性磁性颗粒(p)的酸性溶液与足够量如上所定义的通式(l)的化合物接触，回收得到的络合颗粒；

ii)使在磁性颗粒(p)表面上络合的通式(l)化合物的全部或部分基团X与生物媒介偶联。

步骤i)优选包括如下步骤i.1)和i.2)：

i.1)制备基于铁化合物的酸性磁性颗粒(p)的酸性溶液；

i.2)将来源于i.1)的溶液与足够量的如上所定义通式(l)化合物接触，回收得到的络合颗粒。

按照本发明的方法的一个优选实施方案，在步骤i)中使用的酸性铁磁流体含有基于铁氧体，优选是基于磁赤铁矿或磁铁矿的磁性颗粒。

一般说来，步骤i)任选在水相容性溶剂，比如DMSO、丙酮或甲醇存在下，在酸性pH值，优选在1～3的pH值，在水性介质中进行。

不希望受到任何理论的限制，在磁性颗粒(p)络合的步骤中，通过特别如N.Fauconnier等人在出版物Prog.Colloid Polym.Sci.(1996)，100，pp.212-216中叙述的脱出质子过程，磁性颗粒(p)初始被质子化的点与通式(l)化合物的偕二膦酸酯端基相互反应。因此，酸性磁性颗粒(p)的质子化位置可以被看作通式(l)化合物的偕二膦酸酯基团在磁性颗粒表面上的“附着点或结合点”。

按照一个特别优选的实施方案，在存在的相对于颗粒(p)的表面上质子化羟基点的摩尔数为1～3摩尔当量的情况下，使得络合至少70％，优选高于90％的磁性颗粒(p)的质子化位置。一般说来，这表明，根据其尺寸不同，每个颗粒大约40～200个通式(l)的化合物，表面质子化位置数正比于酸性磁性颗粒(p)的表面积。

对确定通式(l)化合物的摩尔数与酸性磁性颗粒(p)的质子化位置的摩尔数之比的接枝度进行的评价，可有利地通过传统的方法，比如C、P和Fe元素分析进行。具体说，在化合物(l)接枝之前，酸性磁性颗粒(p)不含磷原子或碳原子。而在颗粒的表面上接枝化合物(l)以后，测定磷/铁比就能够确定在酸性磁性颗粒(p)上接枝的化合物(l)的摩尔数。

再有，每个磁性颗粒上的质子化位置数，可按照本领域专业人员已知的传统技术获得，比如电导率测定或基于酸的测试。

借助于这些分析工具，可以按照希望最后达到的接枝度来调节通式(l)化合物的量。

因此，此方法能够有利地控制用通式(l)化合物对磁性颗粒(p)的接枝。

出乎意料的是，与不使用酸性颗粒的先有技术相比，本发明人还发现，与在碱性颗粒上接枝不同，用通式(l)的化合物接枝的酸性磁性颗粒(p)在3～12的pH值，特别在生理学pH值当中是最为稳定的，这就构成随后进行生物媒介，特别包括蛋白质或抗体偶联的主要优点，不会使其降解或变性。

此性能并非是显然的，一般说来，无论是什么络合剂，其在颗粒表面上的接枝都将改变颗粒的表面电荷，因此其稳定性的范围与pH值和离子强度都是有关的。

本发明人意外地观察到在偕二膦酸酯基团和活性X基团之间有很好的选择性：只有偕二膦酸酯基团才在酸性颗粒的表面上络合。

与先有技术不同，将络合的磁性颗粒进行分离有利地无需任何复杂的提纯步骤，比如使用透析或在树脂上进行处理。

在络合之后，被通式(l)化合物络合的酸性磁性颗粒(p)形成了絮凝物，按照一个优选的实施方案，此絮凝物可以通过简单的磁性分离而从反应介质中分离出来。

在步骤(ii)之前，用水洗涤回收絮凝物几次，以除去过量的未反应通式(l)化合物。

在步骤(i)的末尾，一般将回收的絮凝物悬浮在pH值6～7的水溶液中，这导致絮凝物消除凝聚(胶溶作用)并产生胶体溶液。

按照一个优选的实施方案，预先进行一个步骤，包括将在步骤(i)形成的絮凝物悬浮在pH值10～11的碱性水溶液中，然后再将pH值转变为6～7。实际上，在碱性pH值进行的处理，其目的是增强偕二膦酸酯化合物与酸性磁性颗粒(p)表面的结合。

按照一个有利的方面，在步骤(i)末尾得到的被偕二膦酸酯化合物络合的酸性磁性颗粒(p)是相对非多分散的，表现出的“流体动力学尺寸”的分布与原料酸性铁磁流体是很相似的。因此这个络合的步骤不会产生任何聚集的现象，这使其能够避免任何附加的过滤步骤。

按照另一个有利的方面，能够以很好的铁的产率，一般在70～95％之间，得到被偕二膦酸酯化合物络合的磁性颗粒。

在生理学pH值下，在任选的溶剂存在下，用通式(l)化合物接枝的酸性磁性颗粒(p)有利地是稳定的，这使得能够在铁磁流体介质中直接进行生物媒介的偶联。

先有技术没有以任何方式建议在酸性颗粒上进行偕二膦酸酯化合物的接枝。

按照另一个有利的方面，在颗粒表面上接枝的通式(l)化合物的活性基团X，对于生物媒介具有很好的反应性，这使得能够得到高的偶联产率。因此，这使得能够降低所用生物媒介的损耗，因此降低了最终得到的特定的磁性颗粒的成本。

另一个特别有利的方面是测定在用通式(l)化合物接枝的磁性颗粒(p)上偶联生物媒介的偶联度。实际上，对用通式(l)化合物接枝的磁性颗粒(p)进行元素分析(C、P、Fe)测定的组成，使得能够精确地测定磷/铁比，对在其上面接枝了生物媒介的最终颗粒进行的元素分析，使得能够以同样的方式确定氮/磷比或碳/磷比，这就使得能够计算出每个颗粒上的生物媒介数。在由Molday合成得到的涂有比如糊精的聚合物并在其上面接枝有特异亲和性分子的磁性颗粒中，由于涂布聚合物的多分散性的本性，此类分析是完全不可能的。

包括使被偕二膦酸酯化合物络合的磁性颗粒(p)与足够量的生物媒介相接触的步骤(ii)一般是在铁磁流体介质中，在环境温度下和在搅拌下进行几个小时，使用的生物媒介的量被固定为希望得到的偶联度的函数。

在步骤ii)的末尾，可以进行过滤步骤，以将被生物媒介偶联的磁性颗粒(p)与可能的没有反应的生物媒介分离。

按照一个优选的实施方案，在步骤(i)中使用的酸性磁性颗粒(p)是按照包括如下步骤的方法得到的：

a)制备酸性铁磁流体的胶体溶液；

b)用硝酸溶液处理在步骤a)中得到的溶液；

c)将在步骤b)中得到的酸性絮凝物分离；

d)进行胶溶作用。

在此实施方案中，步骤a)～c)相当于如上所述的步骤i.1)和i.2)。

在步骤a)中进行的制备酸性铁磁流体胶体溶液是公知的，在许多参考文献中都有叙述。特别可以提到法国专利FR 7918842和出版物C.R.Acad.Sc.Paris(7/07/1980)，t.291-系列C和IEE Transactionon Magnetics，1981，vol.MAG-17，n°2，p.1247。

作为指导，“酸性”和“碱性”铁磁流体一般是通过将含有适当比例Fe²⁺和Fe³⁺盐的水溶液与碱性溶液，一般是氨水接触而得到的。

用酸性溶液，一般是高氯酸或硝酸得到的凝胶沉淀，其胶溶作用或消聚集作用导致得到“酸性”铁磁流体，而用四甲基氢氧化铵(TMAOH)溶液导致得到“碱性”铁磁流体。

“碱性”铁磁流体并不适合于本发明，因为得到它的方法使其流体动力学尺寸不容易控制，而且在接枝通式(l)化合物之后，需要很长和复杂的提纯步骤，比如渗析或在树脂上过滤。另外，由于TMAOH是有毒的，得到的碱性铁磁流体的生物医学应用意味着必须进行进一步的处理，目的是除去全部极少量的TMAOH。

另一方面，可以设想，在本发明的范围内，使用了按照特别在下面的文献中叙述的方法由碱性铁磁流体转化的“酸性”铁磁流体：R.Massart、V.Cabuil(Journalde Chimie-Physique，1987，84，n°7-8，p.967-973)、R.Massart，CR Acad.Sc.Paris，t，291(1980年7月7日)，系列C1。

按照本发明方法的一个优选实施方案，在步骤a)中使用的酸性铁磁流体含有基于铁氧体，优选基于磁赤铁矿或磁铁矿的磁性颗粒。

在此范围内，特别优选基由于用Fe(NO₃)₃溶液进一步处理得到的铁氧体的酸性铁磁流体。此进一步处理是在步骤a)结束时进行的，使得能够进行基于铁氧体的磁性颗粒(p)的核心氧化，有利地减少与存在Fe²⁺离子有关的细胞毒性现象。另外，此处理使得能够增加在步骤d)末尾得到的最终铁磁流体溶液的稳定性。

在步骤b)中使用的处理，有利地能够控制在步骤a)中得到的磁性颗粒的流体动力学尺寸。

因此，本发明人意外地发现，在步骤a)得到的磁性颗粒的尺寸可以减小，条件是要调节用硝酸进行的处理的浓度和时间。

在步骤b)中使用的硝酸溶液优选具有1.5～4mol/L的浓度。特别是在此情况下，进行处理的时间一般为1～48h，优选至少等于2h，优选短于24h。

在此处理结束时，在步骤c)中有利地通过简单磁性分离分离得到絮凝物，并用比如丙酮的有机溶剂洗涤几次。

最后，将在步骤c)中分离的絮凝物悬浮在一定量的水性溶剂中，任选在允许进行胶溶作用的水相容性有机溶剂存在下，这就是说，进行絮凝物的消凝聚并得到酸性铁磁流体的胶体溶液。

因此本发明的目标还是一种组合物，其中含有被通式(l)化合物络合而且与生物媒介偶联的酸性磁性颗粒(p)，它可以通过包括步骤(i)和(ii)的方法而得到。

按照本发明的另一方面，其目标是一种组合物，其中含有被可以在按照本发明的方法的步骤(i)中得到的通式(l)化合物络合的酸性磁性颗粒(p)。

在本发明中还包括含有这种磁性颗粒和与生物媒介偶联的磁性颗粒的混合物。

应用

本发明还涉及医用磁共振成像用的对比化合物，它包括任选与生物媒介偶联，任选与可药用载体和可药用添加剂组合的酸性磁性颗粒(p)的组合物。

当此颗粒没有与生物媒介偶联时，要对偕二膦酸酯化合物的基团X进行选择，使得其在活体内不会诱发毒性反应。在此范围内，对于基团X特别优选表示-COOH或-NH₂。在不与生物媒介偶联的情况下，被通式(l)化合物络合的磁性颗粒(p)的组合物可以比如用作MRI血管造影的对比剂，也可以用于其他MRI的应用。

被通式(l)化合物络合又与生物媒介偶联的磁性颗粒(p)组合物特别可用于特异的磁共振成像(MRI)，特别是器官或病理的磁共振成像。

在没有与生物媒介偶联时，被通式(l)化合物络合的磁性颗粒(p)的组合物可以比如用作MRI血管造影的对比剂，还可应用于其他非特异性MRI应用中。

磁性对比化合物的松弛度(relaxivity)r₁和r₂给出了其磁效率的度量，使得能够获得其对所记录信号的影响。

在此范围内，本发明人发现，被偕二膦酸酯化合物络合的磁性颗粒(p)的组合物表现出有利的松弛度r₁和r₂，使其能够在质子松弛率(relaxation rate)(R₁＝1/T1和R₂＝1/T2)上获得很大的增加。对松弛率的这种影响使得能够在目标区域得到很好的MRI对比度。

当磁性颗粒与生物媒介偶联时，特别是与给定的生物学靶受体具有特异性的配体偶联时，本发明的组合物可以用作特异性MRI造影的对比剂，特别用来在许多病理中的表征和治疗监测：作为指导可以提到心血管疾病(粥样硬化斑块造影)、癌症(肿瘤、转移)、炎性和退行性病变(多发硬化症、类风湿性关节炎、早老性痴呆等)。

因此，按照本发明的另一方面，其目标是一种诊断或治疗监测的方法，其中给病人施用任选与至少一种生物媒介偶联的酸性磁性颗粒(p)的组合物，使得能够通过磁共振来观察病人的器官或病理。

作为例子，使用的生物媒介是叶酸衍生物、金属蛋白酶抑制剂或抗体，比如抗CEA或抗粘蛋白型抗体的最终颗粒组合物作为MR I对比剂特别有用，在肿瘤学中用来检查和表征肿瘤以及用来得到癌扩展(转移)的总体图像。

类似地，偶联了生物媒介，比如磷脂酰丝氨酸衍生物的最终颗粒组合物，使得能够以炎性和退行性病变、粥样硬化斑块或应激反应为靶。

类似地，偶联了比如含有RGD(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸)序列的肽的生物媒介的最终颗粒组合物，使得能够以在血管发生的过程中，以及在血栓形成和炎性现象中表达的整联蛋白为靶。因此，它们可在肿瘤学或血管学中的抗血栓形成治疗中通过MRI监测抗血管发生治疗的效果。

一般说来，使用比如单克隆抗体或其片段(Fab、Fab’₂、sFv)等生物媒介，使得能够对于活体内的病理区域寻靶达到高的特异性，在此区域内对应于所用抗体的受体是被过量表达的。

有利地发现，与没有生物媒介的中间体相比，被通式(l)化合物络合并与生物媒介偶联的颗粒(p)，其松弛度并没有改变。此外还发现，这些组合物的有效性与和被通式(l)化合物络合的颗粒(p)偶联的生物媒介的种类无关。

可以和生物媒介偶联，也可以没有偶联的磁性颗粒的组合物，也可以用核医学中，在合成的过程中使用放射性铁的同位素。

按照其另一方面，按照本发明的与生物媒介偶联的酸性磁性颗粒(p)组合物，可用于通过磁性寻靶进行给药。在此范围内，将磁性颗粒(p)与具有药理学和/或细胞毒性性能的生物媒介偶联，在目标区中的射频场作用下任选能够释放出这些生物媒介。

因此，本发明的一个目标是一种治疗方法，其中给需要这种治疗的病人给予含有与至少一种生物媒介偶联的酸性磁性颗粒的组合物，同时还含有可药用的载体。

按照本发明的与生物媒介偶联的酸性磁性颗粒(p)组合物，也可以用于通过使发病区高热进行的治疗。在此范围内，一般选择的生物媒介对在靶区存在的受体具有特异的亲合性，而且对着所述靶区要施加射频场，优选是外交边射频场(outside alternatingradiofrequency field)。

按照本发明的与生物媒介偶联的磁性颗粒(p)的组合物，还可以用于细胞标记，特别是干细胞标记，这可以在活体外进行，也可以在活体内进行。

因此，按照其另一方面，本发明的目标是一种在体外检出和/或分离细胞的方法，它包括：

i)使细胞与含有与至少一种能够标记细胞的生物媒介偶联的酸性磁性颗粒(p)的组合物接触；以及

ii)检出和/或分离得到的标记细胞。

此生物媒介优选是对由待标记的细胞所表达的生物学受体具有特异性的配体。

在此范围内，使能够与干细胞受体进行特异性结合的生物媒介与磁性颗粒(p)偶联。将如此被标记的干细胞投给病人，在施加磁场的情况下，就能够通过MRI观察跟踪外源细胞的运动、位置和生存情况。此应用特别可用于检出与细胞功能障碍有关的疾病。

因此，本发明的一个目标是用来诊断与细胞功能障碍有关的疾病的方法，该方法包括：

i)按照如上所述的方法，在活体外对采自病人的干细胞进行标记；

ii)将被标记的干细胞施用给所述病人；

这使得在施加了磁场的情况下，能够通过MRI观察跟踪外源细胞的运动、位置和生存情况，如此就检测出与细胞功能障碍有关的疾病。

最后，与生物媒介偶联的磁性颗粒(p)的组合物特别可用于在活体外进行细胞的磁性分类。在此情况下，生物媒介一般是经选择的配体，使得载有对于所述生物媒介的受体的化合物与不载有所述受体的化合物区别开和/或分离。作为例子，此生物媒介可以表示特异性的膜联蛋白，这是一种在Ca²⁺存在下能够与磷脂酰丝氨酸(PS)或磷脂酰乙醇胺(PE)结合的配体。在此情况下，按照本发明的应用，能够使显示出异常状态的细胞被区分开和/或分离，这就是说，能够使可以与膜联蛋白生物媒介偶联的磁性颗粒(p)相结合的细胞与不能结合这些颗粒的正常细胞相区分或分离。

术语“可药用的”指的是当以适当的方法对动物或人给药时，不产生任何变态反应、副反应或不良反应的组合物或分子实体。

在本发明的范围内，术语“可药用载体”可以表示溶剂、分散介质、抗菌剂和抗真菌剂。这些介质和药剂的使用本领域技术人员能够处理。

除非传统的介质或药剂与被通式(1)化合物络合并与生物媒介偶联的磁性颗粒(p)是不相容的，其在该诊断组合物中的应用都是可以设想的。在按照本发明的组合物中也可以加入另外的活性成分。

应该理解，在本发明的治疗方法中，以治疗有效的量对组合物给药，本领域技术人员可以根据目标疾病、病人的条件，病人的体重和病人的年龄对此数量进行调节。

优选经肠道外，或者经口服对本发明的组合物进行给药，然而并不排除其他的给药途径，比如直肠给药，特别优选以静脉注射的方式给药。

当设想口服给药时，本发明的组合物呈明胶胶囊、泡腾片、裸片或包衣片、袋剂、糖衣片、口服安瓿或溶质、微胶囊或缓释或控制释放的形式。

当设想肠道外给药时，本发明的组合物呈待重新配制的冻干粉的形式或可注射溶质和包装在安瓿或瓶子中的悬浮液形式，或者预先装在注射器中，用于缓慢的静脉灌注或静脉团注。

用于口服给药的剂型是通过将任选与生物媒介偶联，特别是与活性物偶联的磁性颗粒(p)与各种类型的赋形剂或载体，比如填充剂、崩解剂、胶粘剂、染色剂、风味增强剂等混合，然后在胶囊中，特别是控制释放的胶囊中进行混合物的配合而制备的。

本发明颗粒的水溶解性能和低重量摩尔渗透压浓度，使得能够制备高浓度，而且其粘度适合于注射的等渗水溶液。

通过传统的方式，将任选与生物媒介偶联的磁性颗粒(p)与缓冲剂、稳定剂、防腐剂、助溶剂、等渗剂和悬浮剂混合就得到肠道外给药的形式。然后按照已知的技术，将这些混合物灭菌，包装成静脉注射或待在灭菌可药用载体中重新配制的冷冻干粉的形式。

可以由含有任选与生物媒介偶联的磁性颗粒(p)，和任选的添加剂和灭菌溶剂的冷冻干粉即时制备溶液，或者由于与生物媒介偶联的磁性颗粒在溶液中有比较大的稳定性，可以在瓶子、安瓿、注射器或袋子中将溶液提供给放射科医生。

为了制备锭剂，可以以本身是已知的方法，将按照本发明的磁性颗粒与适当的基础组分比如聚乙二醇或半合成的甘油酯混合。

单位剂量将取决于与生物媒介偶联的磁性颗粒(p)的组成、取决于给药途径、取决于待确定的诊断的类型，还取决于病人。对于平均体重(75kg)的个体，单位剂量一般为0.01～100μmol的磁性颗粒。

正如在实施例中所指出的，本发明人使用偕二膦酸酯化合物作为覆盖物成功地得到既稳定而又具有特异性的化合物。更为普遍地是，本申请人专门研究了能够首先与磁性颗粒结合，然后与至少一种生物媒介结合的覆盖物。研究了通式为Y1-Y2-Y3的各种覆盖物，Y1是至少一个能够与纳米级颗粒偶联的基团，Y3是能够与至少一种生物媒介相互反应的至少一个基团，而可以有也可以没有的Y2是在Y1和Y3之间的链接。在Y1中，特别研究了偕二膦酸酯以外的膦酸酯、磷酸酯、双膦酸酯和类似物，异羟肟酸酯或偕异羟肟酸酯。

在后面的文字中，以说明的方式叙述了按照本发明的组合物的制备实施例。

在下面的实施例中，规定了如下的通则。

在下面，缩写M、M/L、理论M、N和M/z、ES+、ES-、kD和TLC具有如下的含意：

M或M/L：摩尔浓度(mol/L)；

理论M：理论分子量；

N：标准状态；

M/z：由质谱确定的质量电荷；

ES⁺：正电模式的电喷射；

ES^-：负电模式的电喷射；

TFA：三氟乙酸

kD：分子量单位(千道尔顿)；

TLC：薄层色谱；

Z_平均：由PCS测量的流体动力学直径；

Polyσ：由PCS测量的多分散性。

后面的化学命名来源于按照IUPAC规则的ACD/NAME(AdvancedChemistry Development Inc，Toronto，Canada)软件。

总铁测试

在用浓盐酸矿化和相对于标准的铁离子范围(0、5、10、15和20ppm)稀释以后，用原子吸收分光光度计(VARIAN AA10分光光度计)测试铁。

颗粒尺寸：

—接技颗粒的流体动力学尺寸(Z _平均 )＝PCS尺寸：

对用水稀释到≈1mmol的试样，由PCS(Malvern 4700 device，laser 488nm at 90°)测试经过0.22μm过滤的注射制剂。

PCS＝光子校正分光光度计—参考：R.Pecora在J.of Nano.Res.(2000)，2，p.123-131。

—磁性颗粒(p)直径(接枝前)

在各种温度下通过对磁化曲线(在SQUID磁强计进行测量)去褶合测定[参考：R.W.Chantrell在IEEE Transactions on Magnetics(1978)，14(5)，p.975-977]。

由微量分析测定接枝度：

化合物A：表示为每100mol总铁的mol数。

其他化合物：表示为每100mol铁的mol数和每100mol化合物A的mol数。

结构分析：

用带有电喷射源的质谱仪(MICROMASS VG Quattro ll装置)。

松弛度测量：

通过标准的操作程序在20MHz(0.47T)和37℃下，用Minispec120装置(Bruker)测定松弛时间T1和T2。使用逆向复原顺序测定纵向松弛时间T1，通过CPMG技术测定横向松弛时间T2。

对于在37℃下的水溶液，在不同的总金属浓度(0.1×10^-3～1×10^-3mol/L)下计算出松弛率R1(＝1/T1)和R2(＝1/T2)。R1或R2之间作为浓度的函数是线性的，而斜率表示松弛度r₁(R1/C)或r₂(R2/C)，其单位是(1/sec)(1/mmol/L)，即(mM^-1·s^-1)。

通式(l)化合物的实施例

实施例1：制备化合物A：

1)二乙基-1-[乙氧基磷酰基]乙烯基膦酸酯

在加热的条件下，在250mL甲醇中溶解13g(0.433mol)多聚甲醛和10mL(0.097mol)二乙胺。然后加入24g(8.67×10^-2mol)二乙基[乙氧基(丙基)磷酰基]甲基膦酸酯。将混合物回流24h。在真空下浓缩反应介质。用250mL甲苯处理浓缩物两次，然后在真空下浓缩。

将得到的油状物溶解于125mL甲苯中。加入0.14g对甲苯亚磺酸。用Dean-Stark阱将混合物回流24h，然后在真空下浓缩至干。

用500mL二氯甲烷萃取产物，然后用250mL水洗涤两次。用MgSO₄干燥有机相，在真空下浓缩。

在625gMerck Geduran硅胶(40～63μm)上提纯粗产物。洗脱：CH₂Cl₂/丙酮-50/50(TLC-SiO₂：Rf＝0.45)。

分离18.4g，产率71％。

质谱：M/z＝301.4(ES+)理论M＝300.2。

C¹³谱：(s)148.8ppm，(t)134.8-131.5-128.2ppm，(s)

62.2ppm，(s)16.7ppm

H¹谱：(t)6.9-6.8-6.6ppm，(未解析峰)3.9ppm，(t)1.15ppm。

2)二乙基2-[2，2-双(二乙基磷酰基)乙基]丙二酸酯

在15mL乙醇中搅拌1.6g(0.01mol)丙二酸二乙酯、0.07g(0.001mol)乙醇钠和3g(0.01mol)二乙基[乙氧基(丙基)磷酰基]乙烯基膦酸酯15分钟。[TLC：SiO₂；洗脱液CH₂Cl₂/丙酮50/50-Rf＝0.6]。

在乙醇溶液中加入5mL饱和NH₄Cl溶液。在真空下浓缩混合物。用30mL乙酸乙酯萃取残渣，用5mL水洗涤两次。用MgSO₄干燥有机相，然后蒸发至干。

在200gMerck Geduran硅胶(40～63μm)提纯得到的油状物。洗脱液：CH₂Cl₂/丙酮-50/50Rf＝0.6

分离3.8g，产率82％。

质谱：M/z 460.9(ES+)，理论M＝460。

3)4，4-二膦酰基丁酸

在350mL盐酸[5N]中回流7g(15.7×10^-2mol)二乙基2-[2，2-双(二乙基磷酰基)乙基]丙二酸酯8h。

在60g硅烷化的氧化硅60(0.063～0.200mm)上用水洗脱[HPLC监测]提纯得到的棕色的油状物。

分离出3.6g，产率92％。

质谱：M/z 249(ES+)，理论M＝248

HPLC：柱子：Hypercarb 250×4mm检出：202nm

无梯度洗脱99/1：0.034N H₂SO₄/CH₃CN-Tr＝8min。

实施例2～7：制备生物媒介

实施例2：制备化合物B：

1)2.5-二氧代-2.5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸乙酯

在5℃下，在50mL乙酸乙酯和1.1mL N-甲基吗啉中溶解9.7g(0.1mol)马来酰胺。

滴加1.1mL氯甲酸乙酯。搅拌混合物0.5h。过滤除去不溶物。用50mL水洗涤滤液。用硫酸镁干燥有机相，然后在真空下浓缩。在MerckGeduran硅胶(40～63μm)上提纯得到的油状物。洗脱液：二氯甲烷/ACOEt 66/34。

分离出16.9g产率50％。

质谱：M/z＝170.1(ES+)理论M＝169。

2)3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1基)丙基氨基甲酸叔丁酯

在20mL饱和碳酸氢钠中溶解0.515g(2.96×10^-3mol)化合物B1)。通过孔隙度0.45μm的过滤器过滤溶液，然后冷却到0℃。

滴加在25mL四氢呋喃中的0.5g(2.96×10^-3mol)乙基羰基马来酰亚胺溶液。搅拌此溶液15min。

加入25mL四氢呋喃，搅拌反应介质45min。用适量的HCl[1N]将pH值调节至6。用2×200mL乙酸乙酯萃取产物。用硫酸镁干燥有机相，然后进行真空浓缩。

分离出737mg，产率98％。

3)1-(3-氨基丙基)1H-吡咯-2，5-二酮

在25mL盐酸[2N]中搅拌0.7g(2.75×10^-3mol)化合物B2)24h。

在真空下浓缩此溶液。得到500mg产物，产率88％。

质谱：M/z＝155.1(ES+)理论M＝154.1。

实施例3：制备化合物C

1-脱氧-1-[(2，3-二氢丙基)氨基]乙糖醇

在1L甲醇中溶解173g(1.9mol)3-氨基-1，2-丙二醇。加入360g(2mol)葡萄糖。在环境温度下搅拌混合物24h。在20bar的氢气下用50g焦炭载钯和450mL水，在60℃下还原此溶液6h。

在35℃下，在clarcel上过滤反应介质。将过滤母液浓缩至850mL。将浓缩液注入用热水浴保持在35℃下的3L异丙醇中。过滤出沉淀并在真空下干燥。分离出272g产物，产率53％。

质谱：M/z＝2564(ES+)理论M＝253.3。

实施例4：制备化会物D：N-[(2，3-二羟基丙基)-(2，3，4，5，6- 五羟基己基)]-2，4，6-三溴-5-(甘氨酰氨基)间苯二甲酰胺

在80℃下，在30min中将255g(1.9mol)化合物C溶解于2.5L1-甲基-2-吡咯烷酮中。将反应介质冷却到40℃，然后加入在170℃下干燥过的67.1g(0.635mol)碳酸钠和407.8g(0.635mol)5-邻苯二甲酰胺基(乙酰胺基)-2，4，6-三氨基邻苯二甲酰氯，保持温度低于45℃。

在40℃下保持介质2h，然后将其冷却到20℃，再在Clarcel上过滤出无机盐。

在过滤液中加入610mL水，将混合物加热到70℃，然后添加44.8mL水合肼(0.889mol)。将反应介质在90℃下加热2h。

用适量的盐酸[12N]将pH值调节到1。过滤除去形成的沉淀。将过滤母液注入30L乙醇中。

将得到的产物溶解于3.6L水中，用适量的氢氧化钠[2N]将pH值调节到6.5，并且将溶液渗滤。用HPLC监测提纯。HPLC纯度＝98.2％。

HPLC条件：

柱子：C18 Symetry 250×4mm(5μm)。检出：254nm

恒溶剂洗脱：99/1：硫酸0.034N/CH₃CN

溴测试＝23.6％(即纯度97.2％)

实施例5：制备化合物E：N，N’-[双(2，3，4，5，6-五羟基己基)]-2，4，6-三溴-5-(甘氨酰氨基)间苯二甲酰胺

可以按照在专利EP 0 922 700A1中所述的操作程序制备化合物E。

实施例6：制备化合物F：(18S)-1-氨基-18{[(2-氨基-4-氧代 -3，4-二氢蝶啶-6-基)甲基]氨基}苯甲酰基)氨基]-15-氧代-4-三氧杂 -14-氮杂十九烷-19-酸

在环境温度下，将9.74g(0.0214mol)的(2S)-2-[(4-{[(2-氨基-4-氧代-3，4-二氢蝶啶-6-基)甲基]氨基}苯甲酰基)氨基]-5-甲氧基-5-氧代戊酸(可以按照在J.Am.Chem.Soc.，1997，119，10004-10013中叙述的操作程序制备)溶解于60mLDMSO中。加入235mL(1.07mol)de 4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺。在环境温度下搅拌混合物48h。

将反应介质注入1.5L乙腈和1.5L乙醚的混合物中。过滤出得到的沉淀，在真空下干燥。

将粗产物溶解于100mL吡啶[0.1N]中，在1kg的硅烷化氧化硅60(0.063～0.200mm)上，用9/1的吡啶[0.1N]-甲醇[HPLC监测]洗脱提纯。分离出2.7g产物，产率26％，HPLC纯度97.3％。

HPLC条件：

柱子：C18Symetry 250×4mm(5μm)。检出：254nm

恒溶剂洗脱：99/1：0.034N硫酸/乙腈。

实施例7：制备化合物G：

L-丙基-L-亮氨酰-N ¹ -羟基甘氨酰胺

将1g(2.3×10^-3mol)1-[(苄氧基)羰基]-L-丙基-L-亮氨酰-N1-羟基甘氨酰胺溶解于100mL甲醇中。

在溶液中加入100mg50％的水合Pd/C。在50PSI的氢气下，在环境温度下搅拌混合物6h。

过滤除去催化剂，在真空下浓缩过滤液。产物储存在4℃下。

定量的产率。

质谱：M/z＝371.2(ES-)理论M＝372.4。

实施例8和实施例9：制备酸性磁性颗粒(p)胶体溶液的实例

实施例8：

将36g(0.181mol)FeCl₂·4H₂O和20mL37％盐酸在150mL水中的溶液加入到由3L水和143mL(0.302mol)27％的FeCl₃组成的混合物中。伴随着剧烈的搅拌迅速地加入250mL25％的NH₄OH。将混合物搅拌30min。通过磁性分离除去母液。连续用2L水洗涤铁磁流体3次。

与200mL HNO₃[2M]一起搅拌硝酸铁磁流体15min，通过磁性分离除去上层清液。

将硝酸铁磁流体与600mL水和200mLFe(NO₃)₃[1M]一起回流30min。通过磁性分离除去上层清液。

用3L丙酮洗涤硝酸铁磁流体3次，然后用400mL水进行处理。在真空下蒸发溶液，直至最终得到250mL的体积。

浓度M/L	Z_平均nm	Polyσ	直径SQUID	MsEmu/Gm³
浓度M/L	Z_平均nm	Polyσ	直径SQUID	MsEmu/Gm³	4.85	40nm	0.22	8.5nm	275

Ms(emu/cm³)＝饱和时磁化度

Z_平均＝单峰模式PCS测定的流体动力学尺寸

Polyσ：PCS测定的峰的多分散性

SQUID＝由在SQUID磁强计测量的磁化曲线去褶合所估计的未接枝颗粒(p)的直径。

实施例9：

将108g(0.543mol)FeCl₂·4H₂O在450mL水中的溶液加入到4L水429mL(0.906mol)27％的FeCl₃的溶液中。伴随着搅拌(1200rpm)迅速地加入750mL 25％的NH₄OH。将混合物搅拌30min。通过磁性分离除去母液。相继用3L水洗涤铁磁流体2次。

与3L HNO₃[2M]一起搅拌硝酸铁磁流体1/4h，通过磁性分离除去上层清液。

将硝酸铁磁流体与1,300mL水和700mL Fe(NO₃)₃[1M]一起回流30min(600rpm)。通过磁性分离除去上层清液。

与3L HNO₃[2M]一起搅拌硝酸铁磁流体15min，通过磁性分离除去上层清液。

用3L丙酮洗涤硝酸铁磁流体3次，然后用600mL水进行处理。在真空下蒸发溶液，直至最终得到250mL的体积。

◆在此阶段，得到如下的特征：

产率％	浓度M/L	Z_平均(nm)	Polyσ
产率％	浓度M/L	Z_平均(nm)	Polyσ	81.8	4.45	31.3	0.21

Z_平均＝单峰模式PCS测定的流体动力学尺寸

◆处理：

在2.4L硝酸中搅拌200mL前面的溶液4h。通过磁性分离除去上清液。用3L丙酮洗涤硝酸铁磁流体2次，用400mL水进行处理。在真空下蒸发溶液，直至最终得到250mL的体积。

产率％	浓度M/L	Z_平均(nm)	Polyσ
产率％	浓度M/L	Z_平均(nm)	Polyσ	77	2.742	23.3	0.20

实施例10～12：用通式(1)化合物络合磁性颗粒(p)的实例

实施例10：

在3L水中稀释50mL浓度为4.85M/L的实施例8的物质。滴加1.3g(5.24×10^-3mol)来源于实施例1的化合物A在100mL水中的溶液。保持搅拌30min。通过磁性分离分离絮凝物，然后用3L水洗涤3次。

将其重新溶解于700mL水中，用适量的NaOH[1N]将pH值调节到7.2。通过0.22μm的膜过滤最终的溶液。

铁滴定＝0.252M/L PCS尺寸＝67.9nm

Fe＝61.7％质量/质量(m/m)

P＝1.21％质量/质量(m/m)

C＝1.04％质量/质量(m/m)

接枝度[化合物A/Fe]＝1.86％mol/mol

实施例11

在3L水中稀释50mL浓度为4.73M/L的实施例8的物质。滴加1.3g(5.24×10^-3mol)来源于实施例1的化合物A在80mL水中的溶液。保持搅拌30min。通过磁性分离分离絮凝物，然后用3L水洗涤3次。

将其重新溶解于700mL水中，用适量的NaOH[1N]将pH值调节到11，然后用适量HCl[1N]将pH稳定在7.2。通过0.22μm的膜过滤最终的溶液。

铁滴定＝0.279M/L PCS尺寸＝40.3nm Polyσ＝0.19

Fe＝63.9％m/m

P＝1.38％m/m

C＝1.07％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝1.95％mol/mol

实施例12：

在3L水中稀释100mL浓度为2.742M/L的实施例9的物质(PCS尺寸＝21.3nm)。

滴加1.5g(6.03×10^-3mol)来源于实施例1的化合物A在100mL水中的溶液。保持搅拌30min。通过磁性分离分离絮凝物，然后用3L水洗涤3次。

铁滴定＝0.285M/L PCS尺寸＝25.6nm

Fe＝62.9％m/m

P＝1.32％m/m

C＝1.22％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝1.90％mol/mol

松弛度：

20MHz(0.47T)—37℃—在水溶液中

r₁(mM^-1·s^-1)	r₂(mM^-1·s^-1)
r₁(mM^-1·s^-1)	r₂(mM^-1·s^-1)	35±2	103±5

实施例13～18：用生物媒介偶联被通式(1)化合物络合的酸性磁性颗粒(p)

实施例13：

在50mL浓度为0.252M/L的实施例10的物质中溶解36mg(1.88×10^-4mol)化合物B。用适量的盐酸[1N]将pH值调节到5.8。

在反应介质中加入一滴三乙胺和72mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，在环境温度下搅拌混合物18h。

通过截留阈为30kD的PALL的搅拌室将溶液进行超过滤。取出600mL过滤液以得到35mL的最终溶液。

[Fe]＝0.212M/L PCS尺寸＝69.2nm

Fe＝62.8％m/m

P＝1.21％m/m

C＝2.23％m/m

N＝0.48％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝1.74％mol/mol

接枝度[化合物B/Fe]＝1.37％mol/mol

接枝度[化合物B/化合物A]＝78.6％。

实施例14：

将0.193g(7.6×10^-4mol)来源于实施例3的化合物C溶解于13.55mL浓度为0.279M/L的实施例11的溶液中。将pH值调节到6.2。

加入171mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。在环境温度下搅拌混合物24h。通过截留阈为30kD的PALL的搅拌室将溶液进行超过滤。取出500mL过滤液。将滞留物调节到30mL。

[Fe]＝0.155M/L PCS尺寸＝43.7nm

Fe＝58.4％m/m

P＝1.17％m/m

C＝2.80％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝1.80％mol/mol

接枝度[化合物C/Fe]＝1.67％mol/mol

接枝度[化合物C/化合物A]＝93％。

实施例15：

将0.358g(3.78×10^-4mol)来源于实施例4的化合物D溶解于13.55mL浓度为0.279M/L的实施例11的溶液中。

加入86mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。在环境温度下搅拌混合物24h。通过截留阈为30kD的PALL的搅拌室将溶液进行超过滤。取出500mL过滤液将滞留物调节到30mL。

[Fe]＝0.134M/L PCS尺寸＝41.3nm

Fe＝51.2％m/m

P＝1.16％m/m

C＝5.79％m/m

Br＝3.07％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝2％mol/mol

接枝度[化合物D/Fe]＝1.4％mol/mol

接枝度[化合物D/化合物A]＝68.4％。

实施例16：

将0.853g(7.6×10^-4mol)来源于实施例5的化合物E溶解于13.55mL浓度为0.279M/L的实施例11的溶液中。将pH值调节到6.2。

加入171mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。在环境温度下搅拌混合物24h。通过截留阈为30kD的PALL的搅拌室将溶液进行超过滤。取出500mL过滤液将滞留物调节到30mL。

[Fe]＝0.132M/L PCS尺寸＝41.6nm Polyσ＝0.22

Fe＝52.3％m/m

P＝0.77％m/m

C＝5.86％m/m

Br＝2.65％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝1.33％mol/mol

接枝度[化合物E/Fe]＝1.18％mol/mol

接枝度[化合物E/化合物A]＝89％。

实施例17：

将90mL含有1.35g/L来源于实施例6的化合物F的溶液加入到66.3mL浓度为0.285M/L的实施例12的溶液中。加入121.7mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。将pH值调节到6.8，在环境温度下搅拌混合物18h。

通过截留阈为30kD的PALL的搅拌室将反应介质进行超过滤。将残留物调节到100mL，然后通过0.22μm过滤。

[Fe]＝0.213M/L PCS尺寸＝29nm

Fe＝59.6％m/m

P＝1.29％m/m

C＝2.67％m/m

N＝0.38％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝1.95％mol/mol

接枝度[化合物F/Fe]＝0.28％mol/mol

接枝度[化合物F/化合物A]＝14.5％。

松弛度：

20MHz(0.47T)—37℃—在水溶液中

r₁(mM^-1·s^-1)	r₂(mM^-1·s^-1)
r₁(mM^-1·s^-1)	r₂(mM^-1·s^-1)	36±2	105±5

此结果表明，生物媒介的偶联没有改变未偶联中间体(实施例12)的松弛度。

实施例18：

经过PALL30kD搅拌室将100mL浓度为0.285M/L的实施例12的溶液进行超过滤。在此溶液中加入202mg来源于实施例7的化合物G。用适量的HCl[0.1N]将pH值调节到6.1。

加入203mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，在环境温度下搅拌混合物6h。

通过截留阈为30kD的PALL的搅拌室将反应介质进行超过滤。取出800mL滤液。将残留物调节到140mL，然后通过0.22μm过滤。

[Fe]＝0.223M/L PCS尺寸＝28.4nm

Fe＝57.9％m/m

P＝1.37％m/m

C＝3.49％m/m

N＝0.89％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝2.13％mol/mol

接枝度[化合物G/Fe]＝1.5％mol/mol

接枝度[化合物G/化合物A]＝71％。

实施例19～21：来源于“碱性”铁磁流体前体的与来源于“酸性” 铁磁流体前体的被偕二膦酸酯化合物络合并与生物媒介偶联的磁性颗粒的比较

实施例19：在TMAOH介质中制备“碱性”铁磁流体

将由2.96mL的27％FeCl₃溶液和0.6gFeCl₂·4H20在40mL水中溶液组成的混合物迅速注入到200mL四甲基氢氧化铵[1M]中。在环境温度下搅拌混合物1h。将此溶液通过0.22μm的膜过滤，并在氮气中保持在4℃下。

[Fe]：0.0403M/L PCS尺寸＝68.2 多分散性σ＝0.48

实施例20：用来源于实施例1的偕二膦酸酯化合物络合来源于实施例19的“碱性”铁磁流体

在25mL实施例19的溶液中加入由416mg来源于实施例1的化合物在5mL水中组成的溶液。将混合物搅拌1h，然后通过截留阈30kD的PALL搅拌室进行超过滤。

取出600mL过滤液。将残留物调节到40mL，然后通过0.22μm的膜进行过滤。

实施例21：用来源于实施例5的化合物E偶联来源于实施例20的络合磁性颗粒

在40mL来源于实施例20的溶液中加入1.7g化合物E。将pH值调节到6.2。然后添加345mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，在环境温度下搅拌混合物24h。

通过截留阈30kD的PALL搅拌室对反应介质进行超过滤。

取出700mL过滤液。将残留物调节到40mL，然后通过0.22μm的膜进行过滤。

PCS尺寸＝60nm 多分散性σ＝0.60

Fe＝37.9％m/m

P＝1.70％m/m

C＝12.96％m/m

N＝1.84％m/m

Br＝6.42％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝4.04％mol/mol

接枝度[化合物E/Fe]＝3.95％mol/mol

接枝度[化合物E/化合物A]＝97.7％。

前体

	N°	尺寸Z_平均(nm)	多分散性σ
	N°	尺寸Z_平均(nm)	多分散性σ	酸性铁磁流体	实施例8	40	0.22
碱性铁磁流体	实施例19	68.2	0.48	酸性铁磁流体	实施例8	40	0.22

最终分子(酸性或碱性铁磁流体+偕二膦酸酯化合物(la)+生物媒介化合物E)：

	N°	尺寸Z_平均(nm)	多分散性σ
	N°	尺寸Z_平均(nm)	多分散性σ	酸性方法	实施例16	41.6	0.22
碱性方法	实施例21	60	0.60	酸性方法	实施例16	41.6	0.22

结论：

对于实施例19和21，本发明人有利地发现，当使用的碱性铁磁流体与在文献J.of Coll.And Interf.，Science，2001，238，pp.37-42中使用的相当时，来自前体步骤(碱性铁磁流体-实施例19)的流体动力学尺寸更大，而多分散性(σ＝0.48)高于酸性铁磁流体(σ＝0.22)；这就影响到最终产物(化合物la接枝和生物媒介-化合物E偶联以后)的流体动力学尺寸，同时甚至于多分散性也更大(σ＝0.6)。在分别来源于酸性铁磁流体或碱性铁磁流体的两种类型最终颗粒之间的％差(化合物A/铁)表明当使用“碱性”前体时肯定形成了双层的化合物l(偕二膦酸酯)，它对于良好的稳定性是不利的。在按照本发明的方法中，90％的点被通式(l)的化合物接枝，有利地形成了单层。

实施例22～25：制备其他生物媒介

实施例22：制备化合物H：

1)5{[(2R)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-3-(1H-吲哚-3- 基)丙酰基]氨基}戊基氨基甲酸苄酯

在环境温度下，将15.63g((2R)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸)溶解于300mL四氢呋喃中。

加入10g苄基-5-氨基戊基氨基甲酸酯，然后加入5.1mL三乙胺。在环境温度下搅拌混合物5min。

在反应介质中依次加入5.94g羟基-1-苯并三唑水合物和8.43g1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。在环境温度下搅拌混合物24h。

过滤除去不溶物。在真空下浓缩过滤液。

将得到的油状物注入150mL水中，在环境温度下搅拌1h。

过滤出得到的沉淀，在环境温度下伴随着剧烈的搅拌在100mL水中洗涤30min。

过滤出沉淀，然后用200mL乙醚洗涤，然后在真空下干燥。分离出22.78g产物，产率96.4％。

Rf＝0.94，在硅胶(MERCK)上用二氯甲烷/甲醇(8/2)洗脱

HPLC：Waters C18 symmetry柱子，5μm(250mm×4.6mm)

梯度：水-TFA(pH值2.95)/乙腈：

λ＝210nm

时间min	流速(mL/min)	％水-TFApH值2.95	％乙腈
时间min	流速(mL/min)	％水-TFApH值2.95	％乙腈	0	1	98	2
50	1	10	90	0	1	98	2
50	1	10	90	55	1	5	95

预期产物的保留时间：42min

质谱：M/z＝645.3(ES+模式)(理论M＝644)

2)5-{[(2R)-2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基]氨基}戊基氨基甲酸苄酯

在环境温度下，将20g 5-{[(2R)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基]氨基}戊基氨基甲酸苄酯溶解于280mL四氢呋喃中。

然后加入41.4mL哌啶和20mL水。在环境温度下搅拌混合物3h。在真空下浓缩反应介质。

在1400gMerck Geduran硅胶(40～63μm)上提纯得到的油状物。洗脱液：二氯甲烷/甲醇(95/5)。

分离出12.77g产物，产率97.4％。

Rf＝0.94，在硅胶(MERCK)上用二氯甲烷/甲醇(95/5)洗脱

HPLC：Waters C18 symmetry柱子，5μm(250mm×4.6mm)

梯度：水-TFA(pH值2.95)/乙腈：

λ＝210nm

时间min	流速(mL/min)	％水-TFApH值2.95	％乙腈
时间min	流速(mL/min)	％水-TFApH值2.95	％乙腈	0	1	98	2
17	1	66	34	0	1	98	2
17	1	66	34	19	1	64	36
50	1	0	100	19	1	64	36

预期产物的保留时间：18.2min

质谱：M/z＝423.2(ES+模式)(理论M＝422)

3)(12R)-12(1H-吲哚-3-基甲基)-15-异丁基-3，11，14-三氧代-1- 苯基-2-氧杂-4，10，13-三氮杂化十七烷-17-酸叔丁酯

将9.16g按照在J.Med.Chem.，1998，vol 41(2)：p.209中叙述的操作程序合成的(2-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-4-甲基戊酸于环境温度下溶解于160mL四氢呋喃中。

一次加入16.81g(0.039mo1)5-{[(2R)-2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基]氨基}戊基氨基甲酸苄酯在165mL四氢呋喃中组成的均相溶液，接着相继加入8.3mL三乙胺、6.45g羟基-1-苯并三唑水合物和9.5g1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

在环境温度下搅拌混合物12h。过滤除去不溶物。在真空下浓缩过滤液。

在1900gMerck Geduran硅胶(40～63μm)上提纯得到的油状物。用二氯甲烷/甲醇(98/2)洗脱正确产品。

分离出24g产物，产率95.3％。

Rf＝0.42，在硅胶(MERCK)上用二氯甲烷/甲醇(95/5)洗脱

HPLC：Waters C18 symmetry柱子，5μm(250mm×4.6mm)

梯度：水-TFA(pH值2.95)/乙腈：

λ＝220nm

时间min	流速(mL/min)	％水-TFApH值2.95	％乙腈
时间min	流速(mL/min)	％水-TFApH值2.95	％乙腈	0	1	98	2
30	1	0	100	0	1	98	2

预期产物的保留时间：25.7min

质谱：M/z＝635.6(ES+模式)(理论M＝634)

4)(12R)-12-(1H-吲哚-3-基甲基)-15-异丁基-3，11，14-三氧代 -1-苯基-2-氧杂-4，10，13-三氮杂十七烷-17-羧酸

在由100mL二氯甲烷和100mL三氟乙酸组成的溶液中加入1.4g二硫代赤藓糖醇。然后加入10g(12R)-12-(1H-吲哚-3-基甲基)-15-异丁基-3，11，14-三氧代-1-苯基-2-氧杂-4，10，13-三氮杂十七烷-17-羧酸叔丁酯。在环境温度下搅拌混合物30min，然后在真空下浓缩。

在700g Merck Geduran硅胶(40～63μm)上提纯得到的油状物。用二氯甲烷/甲醇(98/2)洗脱正确产品。

分离出6.19g产物，产率68％。

Rf＝0.57，在硅胶(MERCK)上用二氯甲烷/甲醇(8/2)洗脱

HPLC：Waters C18 symmetry柱子，5μm(250mm×4.6mm)

梯度：水-TFA(pH值2.95)/乙腈：

λ＝210nm

预期产物的保留时间：20.8min

质谱：M/z＝579.0(ES+模式)(理论M＝578)

5)(8R)-8-(1H-吲哚-3-基甲基)-11-异丁基-7，10，13-三氧代-16- 苯基-15-氧杂-6，9，14-三氮杂十六烷-1-基氨基甲酸苄酯

在环境温度下将6.11g(12R)-12-(1H-吲哚-3-基甲基)-15-异丁基-3，11，14-三氧代-1-苯基-2-氧杂-4，10，13-三氮杂十七烷-17-酸溶解于160mL四氢呋喃中。将反应介质冷却到0℃。

将1.69gO-苄基羟基胺盐酸盐、3mL三乙胺、1.86g羟基-1-苯并三唑水合物，然后是2.63g1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐相继添加到反应介质中，然后在环境温度下搅拌混合物24h。

过滤除去不溶物。在真空下浓缩过滤液。

将得到的油状物注入200mL水中。过滤出得到的沉淀，在环境温度下在100mL水中洗涤。

过滤出沉淀并在真空下干燥

过滤出5.7g产物，产率79.2％。

Rf＝0.29，在硅胶(MERCK)上用二氯甲烷/CH₃CN(5/5)洗脱

HPLC：Waters C18 symmetry柱子，5μm(250mm×4.6mm)

梯度：水-TFA(pH值2.95)/乙腈：

λ＝210nm

预期产物的保留时间：22.7min

质谱：M/z＝684.3(ES+模式)(理论M＝683)

6)N ¹ -[(1R)-2-[(5-氨基戊基)氨基]-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-2- 氧代乙基]-N ⁴ -羟基-2-异丁基琥珀酰胺

将0.32g(8R)-8-(1H-吲哚-3-基甲基)-11-异丁基-7，10，13-三氧代-16-苯基-15-氧杂-6，9，14-三氮杂十六烷-1-基氨基甲酸苄酯溶解于30mL甲醇中。在此溶液中加入半刮刀50％水合Pd/C。

在50PSI的氢气和环境温度下搅拌此混合物4h30min。在clarcel上过滤除去催化剂，在真空下浓缩过滤液。定量的产率。

在5g Merck硅烷化的硅胶60(63～200μm)上提纯得到的产物。用水洗脱预期的产物。

分离出0.11g产物，产率51％。

HPLC：Waters C18 symmetry柱子，5μm(250mm×4.6mm)

梯度：水-TFA(pH值2.95)/乙腈：

λ＝220nm

预期产物的保留时间：9.4min

质谱：M/z＝460.3(ES+模式)(理论M＝459)

实施例23：制备化合物I：

1)O-(2-对甲苯磺酰乙基)-O’-甲基聚乙二醇1100

将16.2g平均质量1100的聚乙二醇单甲醚(Fluka)溶解于25mL二氯甲烷中。将此溶液冷却到5℃。

然后，在5℃下，加入0.4g三乙基苄基氯化铵、10.4mL 30％氢氧化钠水溶液以及随后加入2.94g对甲苯磺酰氯在15mL CH₂Cl₂中的溶液。

在环境温度下持续反应24h。对反应介质进行萃取，在用镁干燥和蒸发以后得到17.2g固体。产率是95％。

TLC：Merck SiO₂洗脱液：二氯甲烷/甲醇：9/1

检出：UV254nm和Draggendorf：Rf＝0.4

红外：1356cm^-1(v：R-O-SO₂-R)

2)O-(2-叠氮乙基)-O’-甲基聚乙二醇1100

在环境温度下，将12.4g O-(2-对甲苯磺酰乙基)-O’-甲基聚乙二醇1100溶解于90mL DMF中。然后加入2g叠氮钠。在环境温度下保持搅拌18h。用二氯甲烷萃取反应介质，在蒸发之后得到4.4g化合物。产率是40％。

TLC：MerckSiO2洗脱液：二氯甲烷/甲醇：9/1

检出：UV 254nm，Draggendorf Rf＝0.39

◆红外：2104cm^-1(v：N₃)

3)O-(2-氨基乙基)-O’-甲基聚乙二醇1100

在高压釜中加入4.3g O-(2-叠氮乙基)-O’-甲基聚乙二醇1100和0.4gPd/C(5％)在100mL乙醇中的溶液。在25℃和2.5bar的氢气压力下进行反应4h。

用塞里塑料过滤除去催化剂，在蒸发以后分离出3.5g产物，产率是85％。

TLC：MerckSiO2洗脱液：二氯甲烷/甲醇：9/1

检出：“伯胺”特异性水合茚三酮

◆红外：3390cm^-1(v NH₂)。

实施例24：制备化合物J：

1)3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酸叔丁酯

借助于滴液漏斗在溶解于100mL二氟甲烷中的15g3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}-1-丙胺中加入5g溶解于50mL二氯甲烷中的二碳酸二叔丁酯。

在环境温度下搅拌反应介质18h，然后进行半浓缩，使得可用水(50mL)洗涤、干燥和浓缩。在MERCK Geduran硅胶(40～63μm)上用乙酸乙酯，随后用甲醇过滤得到的溶液。

得到4.7g产物，产率是64％。

质谱：M/z＝321.3(ES+) 理论M＝320.4

TLC：Rf＝0.05；硅胶SiO₂；洗脱液＝CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OH(93/7/极少量)

2)16-氯-15-氧代-4，7，10-三氧杂-14-氮杂十六烷-1-基氨基甲酸叔丁酯

在装有丙酮-冰浴的三颈烧瓶中，将10g 3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酸叔丁酯溶解于50mL二氯甲烷中。借助于滴液漏斗滴加溶解于50mL水中的5g K₂CO₃和溶解于50mLCH₂Cl₂中的5g氯乙酰氯。在添加的过程中，将介质的温度保持在0℃。

当反应剂全部加完时，在环境温度下用磁性搅拌器保持搅拌反应介质1h。

将得到的两相分离，然后用水洗涤二氯甲烷相，直至呈中性的pH值，用Na₂SO₄干燥，过滤，然后进行浓缩。

得到11.2g产物，产率是90％。

质谱：M/z＝397.4(ES+) 理论M＝396.9

TLC：Rf＝0.6；硅胶SiO₂；洗脱液＝CH₂Cl₂/MeOH(9/1)

3)30-氨基-15-氧代-4，7，10，21，24，27-六氧杂-14，17-二氮杂三十烷-1-基氨基甲酸叔丁酯

在碳酸钾存在下，在50mL乙腈中稀释6.8g 3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙胺。借助于滴液漏斗在此悬浮液中加入3.5g溶解于25mL乙腈中的16-氯-15-氧代-4，7，10-三氧杂-14-氮杂十六烷-1-基氨基甲酸叔丁酯。

将反应介质回流2h，然后放置在环境温度下准备在烧结玻璃上过滤。然后将过滤液蒸发至干。

将得到的残渣溶解于50mL二氯甲烷中，以用20mL水洗涤4次。用硫酸钠干燥二氯甲烷相，过滤并充分浓缩以直接在Merck Geduran硅胶(40～63μm)上用二氯甲烷/MeOH(50/50)洗脱(保留因子Rf＝0.15)提纯。

得到1.8g产物，产率是50％。

HPLC：C18 Symmetry柱子(3.5μm)50×2.1mm

—检出器：UV201nm

—移动相：A：水+TFA(pH值2.8)

B：乙腈

时间min	流速mL/min	％A	％B
时间min	流速mL/min	％A	％B	0	1	98	2
4	1	0	100	0	1	98	2
4	1	0	100	5	1	0	100

预期产物的保留时间＝1.8min

质谱：M/z＝581(ES+) 理论M＝580.7

4)30-[(2-乙氧基-3，4-二氧代-1-环丁烯-1-基)氨基]-15-氧代 -4，7，10，21，24，27-六氧杂-14，17-二氮杂三十烷-1-基氨基甲酸叔丁酯

将0.25g 30-氨基-15-氧代-4，7，10，21，24，27-六氧杂-14，17-二氮杂三十烷-1-基氨基甲酸叔丁酯溶解于1.5mL二氯甲烷中。加入57.5μL 3，4-二乙氧基-3-环丁烯-1，2-二酮。

在环境温度下用磁性搅拌器搅拌反应介质18h。此中间体不用分离。

HPLC：C18 Symmetry柱子(3.5μm)50×2.1mm

—检出器：UV201nm

—移动相：A：水+TFA(pH值2.8)

B：乙腈

预期产物的保留时间2.30min。

5)17-乙酰基-30-[(2-乙氧基-3，4-二氧代-1-环丁烯-1-基)氨基]-15-氧代-4，7，10，21，24，27-六氧杂-14，17-二氮杂三十烷-1-基氨基甲酸叔丁酯

将40.6μL乙酸酐加入到在步骤4)中得到的反应介质中。在环境温度下搅拌反应介质，然后在大气压下，在5g Merck Geduran硅胶(40～63μm)上用二氯甲烷/EtOH(9/1)洗脱进行直接提纯。

得到0.27g油状物产物，产率60％。

质谱：M/z＝748(ES+) 理论M＝746.9

6)1-({2-[(14-乙酰基-34，34-二甲基-16，32-二氧代 -4，7，10，21，24，27，33-七氧杂-14，17，31-三氮杂-三十五烷-1-基)氨基]-3，4-二氧代-1-环丁烯-1-基}氨基)-18-[(4-{[(2-氨基-4-氧代 -3，4-二氢-6-蝶啶基)甲基]氨基}苯甲酰基)氨基]-15-氧代-4，7，10- 三氧杂-14-氮杂十九烷-19-酸

将0.16g17-乙酰基-30-[(2-乙氧基-3，4-二氧代-1-环丁烯-1-基)氨基]-15-氧代-4，7，10，21，24，27-六氧杂-14，17-二氮杂三十烷-1-基氨基甲酸叔丁酯和0.205g实施例6的化合物(化合物F)溶解于3mL水中。

在此介质中加入被碳酸钠饱和的几滴水，使得得到的pH值＝9.2。用磁性搅拌搅拌反应介质18h，然后通过Whatmann滤纸进行过滤，用1N的盐酸中和并在15mL二氯甲烷中进行处理。

用1mL水洗涤二氯甲烷相，然后在硫酸钠上干燥，过滤并蒸发。

将残渣溶于10mL EtOH以从100mL Et₂进行沉淀。

得到0.2g结晶(藏红花橙色)，产率69％。

HPLC：C18Symmetry柱子(3.5μm)50×2.1mm

—检出器：UV201nm

—移动相：A：水+TFA(pH值2.8)

B：乙腈

预期产物的保留时间2.40min。

质谱：M/z＝673(z＝2；ES+) 理论M＝1344.5

7)1-({2-[(14-乙酰基-30-氨基-16-氧代-4，7，10，21，24，27-六氧杂-14，17-二氮杂三十烷-1-基)氨基]-3，4-二氧代-1-环丁烯-1-基}氨基)-18-[(4-{[(2-氨基-4-氧代-3，4-二氢-6-蝶啶基)甲基]氨基}苯甲酰基)氨基]-15-氧代-4，7，10-三氧杂-14-氮杂十九烷-19-羧酸

在环境温度下将0，2g 1-({2-[(14-乙酰基-34，34-二甲基-16，32-二氧代-4，7，10，21，24，27，33-七氧杂-14，17，31-三氮杂三十五烷-1-基)氨基]-3，4-二氧代-1-环丁烯-1-基}氨基)-18-[(4-{[(2-氨基-4-氧代-3，4-二氢-6-蝶啶基)甲基]氨基}苯甲酰基)氨基]-15-氧代-4，7，10-三氧杂-14-氮杂十九烷-19-羧酸溶解于2mL三氟乙酸中。

然后在20mL Et₂O中沉淀反应介质，过滤并用乙醚充分洗涤。

得到0.18g结晶，产率78％。

HPLC：C18 Symmetry柱子(3.5μm)50×2.1mm

—检出器：UV201nm

—移动相：A：水+TFA(pH值2.8)

B：乙腈

预期产物的保留时间1.9min。

质谱：M/z＝1245(ES+) 理论M＝1244.4

实施例25：制备化合物K：

1)35-[(2-乙氧基-3，4-二氧代-1-环丁烯-1-基)氨基]-3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33-十一氧杂三十五烷-1-基氨基甲酸叔丁酯

在环境温度下，将0.8g 35-氨基-3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33-十一氧杂三十五烷-1-基氨基甲酸叔丁酯溶解于4mL乙醇中。在此溶液中加入165μL的3，4-二乙氧基-3-环丁烯-1，2-二酮。

在环境温度下搅拌混合物18h。在蒸发掉溶剂以后，将得到的残渣溶解于5mL二氯甲烷中，使得能够在30g Merck Geduran硅胶(4～63μm)上用二氯甲烷/甲醇(95/5)组成的洗脱液洗脱进行提纯。

得到0.6g油状物，产率70％

TLC：Rf＝0.5；硅胶SiO2；洗脱液＝二氯甲烷/甲醇(9/1)

HPLC：C18 Symmetry柱子(3.μm)50×2.1mm

—检出器：UV201nm

—移动相：A：水+TFA(pH值2.8)

B：乙腈

预期产物的保留时间2.78min。

质谱：M/z＝769.5(ES+) 理论M＝768.9

2)18-[(4-{[(2-氨基-4-氧代-3，4-二氢-6-蝶啶基)甲基]氨基} 苯甲酰基)氨基]-1-({2-[(39，39-二甲基-37-氧代 -3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，38-十二氧杂-36-氮杂四十烷-1- 基)氨基]-3，4-二氧代-1-环丁烯-1-基}氨基)-15-氧代-4，7，10-三氧杂-14-氮杂十九烷-19-羧酸

将0.3g 35-[(2-乙氧基-3，4-二氧代-1-环丁烯-1-基)氨基]-3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33-十一氧杂三十五烷-1-基氨基甲酸叔丁酯和0.34g实施例6的化合物(化合物F)溶解于4.5mL水和0.7mL乙醇中。

用几滴饱和了碳酸钠的水使介质的pH增加到9.2。在环境温度下搅拌反应介质48h，同时保持9.2的pH值。

在蒸发掉乙醇以后，在带有K026033药筒(RP18；25～40μm)的“Supervarioflash”色谱柱系统上用水/乙腈(98/2)以20mL/min的流速洗脱，将得到的水溶液进行提纯。

得到100mg产物，产率25％

HPLC：C18 Symmetry柱子(3.5μm)50×2.1mm

—检出器：UV(275nm)

—移动相：A：水+TFA(pH值2.8)

B：乙腈

预期产物的保留时间2.40min。

质谱：M/z＝684(z＝2；ES+) 理论M＝1366.5

3)18-[(4-{[(2-氨基-4-氧代-3，4-二氢-6-蝶啶基)甲基]氨基} 苯甲酰基)氨基]-1-({2-[(35-氨基 -3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33-十一氧杂三十五烷-1-基)氨基]-3.4-二氧代-1-环丁烯-1-基}氨基)-15-氧代-4，7，10-三氧杂 -14-氨杂十九烷-19-羧酸

将0.3g 18-[(4-{[(2-氨基-4-氧代-3，4-二氢-6-蝶啶基)甲基]氨基}苯甲酰基)氨基]-1-({2-[(39，39-二甲基-37-氧代-3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，38-十二氧杂-36-氮杂四十烷-1-基)氨基]-3，4-二氧代-1-环丁烯-1-基}氨基)-15-氧代-4，7，10-三氧杂-14-氮杂十九烷-19-羧酸溶解于0.3mL三氟乙酸中。

在环境温度下搅拌15min以后，蒸发反应介质，然后在30mL乙醚中进行处理。

在过滤、用乙醚洗涤和干燥以后，得到0.29g产物。

HPLC：C18Symmetry柱子(3.5μm)50×2.1mm

—检出器：UV(275nm)

—移动相：A：水+TFA(pH值2.8)

B：乙腈

预期产物的保留时间1.87min。

质谱：M/z＝1267(ES+) 理论M＝1266.4

实施例26～37：用生物媒介偶联被通式(I)化合物络合的酸性磁性颗粒(p)

实施例26：

1)在50mL浓度为0.285M/L的实施例12的物质中加入102.5mg来源于实施例6的化合物F。加入76.6mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。将pH值调节到6.2并在环境温度下搅拌混合物18h。

通过截留阈30kD的PALL搅拌室直接进行反应介质的超过滤。将残留物调节到65mL，然后通过0.22μm进行过滤。

Fe＝67％m/m

P＝1.29％m/m

C＝1.95％m/m

N＝0.26％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝1.74％mol/mol

接枝度[化合物F/Fe]＝0.17％mol/mol

接枝度[化合物F/化合物A]＝9.8％。

2)在50mL在步骤1)中得到的溶液A中加入3g来源于实施例5的化合物E。加入600mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。将pH值调节到6.2并在环境温度下搅拌混合物18h。

通过截留阈30kD的PALL搅拌室直接进行反应介质的超过滤。将残留物调节到40mL，然后通过0.22μm进行过滤。

[Fe]：0.289M/L PCS尺寸＝29.6nm

Fe＝56.6％m/m

P＝1.1％m/m

C＝7.27％m/m

N＝1.1％m/m

Br＝2.6％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝1.75％mol/mol

接枝度[化合物E/Fe]＝1.07％mol/mol

接枝度[化合物E/化合物A]＝61％。

实施例27：

在30mL浓度为0.285M/L的实施例12的物质中加入36.5mg来源于实施例22的化合物H。将pH值调节到6.2并加入18mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。在环境温度下搅拌混合物18h。

[Fe]：0.292M/L PCS尺寸＝32.2nm

Fe＝66.0％m/m

P＝1.48％m/m

C＝3.35％m/m

N＝0.69％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝2.02％mol/mol

接枝度[化合物H/Fe]＝0.83％mol/mol

接枝度[化合物H/化合物A]＝41％。

实施例28：

1)6-(膦酰氧基)己基氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯

将1.33mL POCl₃和1.83mL三乙胺溶解于9mL庚烷中。在前面的溶液中滴加3g 6-(FMOC-氨基)-1-己醇在30mL二氯甲烷中的溶液，保持温度在0℃。

在0℃下搅拌反应介质1h，然后在环境温度下搅拌18h。加入30mL水并在环境温度下搅拌混合物2h。

用水洗涤有机相，然后在真空下浓缩。将得到的固体溶于水，过滤并干燥。

得到3g产物，产率81％，HPLC纯度60％。

HPLC：C18X-TERRA柱子(5μm)250×4.6mm

—检出器：UV201nm

—移动相：A：碳酸铵溶液，pH＝9

B：乙腈

时间min	流速mL/min	％A	％B
时间min	流速mL/min	％A	％B	0	1	98	2
30	1	2	98	0	1	98	2

预期产物的保留时间14.1min。

2)15-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-(9H-芴-9-基)-12-羟基-3-氧代 -2，11，13-三氧杂-4-氮杂-12-磷杂十六烷-16-羧酸叔丁酯12-氧化物

将3g 6-(膦酰氧基)己基氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯和3.73g Boc-丝氨酸-OtBu溶解于54mL吡啶中。滴加6.49g三异丙基苯磺酰氯在42mL吡啶中的溶液。在环境温度下搅拌混合物48h。

加入30mL水，搅拌混合物4h，然后在真空下浓缩。将得到的残渣在100mL乙醚中处理。

过滤除去不溶物。在真空下浓缩过滤液，然后在硅胶上提纯(洗脱液：95％二氯甲烷-5％甲醇)

HPLC：C18X-TERRA柱子(5μm)250×4.6mm

—检出器：UV201nm

—移动相：A：碳酸铵溶液，pH＝9

B：乙腈

预期产物的保留时间20min。

3)3-{[[(6-氨基己基)氧](羟基)磷酰基]氧}-2-[(叔丁氧基羰基) 氨基]丙酸叔丁酯

在环境温度下，在0.62mL吡啶和3mL水中搅拌3g 15-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-(9H-芴-9-基)-12-羟基-3-氧代-2，11，13-三氧杂-4-氮杂-12-磷杂十六烷-16-羧酸叔丁酯12-氧化物。过滤反应介质，用50mL乙腈洗涤得到的结晶两次，然后在100mL乙腈中进行重结晶。

质谱：M/z＝441.3(ES+) 理论M＝440

4)16-(叔丁氧基羰基)-13-羟基-20，20-二甲基-13-氧桥-4，18- 二氧代-1-膦酰基-12，14，19-三氧杂-5，17-二氮杂-13-磷杂二十一烷 -1-基膦酸

在50mg来源于实施例1的化合物A在4mL水中的溶液里加入106mg 3-{[[(6-氨基己基)氧](羟基)磷酰基]氧}-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙酸叔丁酯在2mL水中的溶液。将pH值调节到6.2，加入60mg1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。在环境温度下搅拌混合物24h。

在Merck硅烷化硅胶60(63～200μm)上用梯度洗脱(水/甲醇)提纯得到的产物，用HPLC监测。

得到70mg产物，产率52％。

质谱：M/z＝671.2(ES+) 理论M＝670

5)17-氨基-1，1，14-三羟基-5-氧代-2-膦酰基-13，15-二氧杂-6- 氮杂-1λ ⁵ ，14-二磷杂十八烷-18-羧酸1，14-二氧化物

在1mL TFA中搅拌60mg 16-(叔丁氧基羰基)-13-羟基-20，20-二甲基-13-氧桥-4，18-二氧代-1-膦酰基-12，14，19-三氧杂-5，17-二氮杂-13-磷杂二十一烷-1-基膦酸2h。

在真空下蒸发溶液，得到46mg产物，定量产率。

质谱：M/z＝515.1(ES+) 理论M＝514

6)在100mL水中稀释的1mL浓度为2.742M/L实施例9的溶液(酸性铁磁流体)中滴加31mg17-氨基-1，1，14-三羟基-5-氧代-2-膦酰基-13，15-二氧杂-6-氮杂-1λ⁵，14-二磷杂十八烷-18-羧酸1，14-二氧化物在10mL水中的溶液。在环境温度下搅拌混合物20min，并将pH值调节到7.2。

通过截留阈30kD的PALL搅拌室将得到的溶液进行超过滤。取出300mL过滤液使得得到10mL最终溶液。

[Fe]＝0.262M/L PCS尺寸＝28.1nm

Fe＝67.6％m/m

P＝1.9％m/m

C＝3.15％m/m

N＝0.57％m/m

实施例29：

在30mL浓度为0.285M/L的实施例12的物质中溶解1.75g来源于实施例23的化合物I，将pH值调节到6.5。加入368mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。在环境温度下搅拌混合物24h。通过截留阈30kD的PALL搅拌室将得到的溶液进行超过滤。取出800mL过滤液。将残留物调节为15mL。

[Fe]＝0.496M/L PCS尺寸＝27.1nm

Fe＝59.2％m/m

P＝1.09％m/m

N＝0.32％m/m

C＝6.8％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝1.66％mol/mol

接枝度[化合物I/Fe]＝0.97％mol/mol

接枝度[化合物I/化合物A]＝54％。

实施例30

将0.9g化合物O-(2-氨基乙基)-O’-甲基聚乙二醇750[Amino-PEG750；Fluka]溶解于22mL浓度为0.285M/L的实施例12的物质中，将pH值调节到6.5。加入280mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。在环境温度下搅拌混合物24h。通过截留阈30kD的PALL搅拌室将得到的溶液进行超过滤。取出800mL过滤液。将残留物调节为20mL。

[Fe]＝0.285M/L PCS尺寸＝24.9nm

Fe＝53.2％m/m

P＝1.30％m/m

N＝0.35％m/m

C＝5.87％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝2.2％mol/mol

接枝度[化合物Amino-PEG750/Fe]＝1.33％mol/mol

接枝度[化合物Amino-PEG750/化合物A]＝60.3％。

实施例31

将3.15g化合物O-(2-氨基乙基)-O’-甲基聚乙二醇2000[Amino-PEG 2000；Fluka]溶解于30mL浓度为0.285M/L的实施例12的物质中，将pH值调节到6.2。加入368mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。在环境温度下搅拌混合物24h。通过截留阈30kD的PALL搅拌室将得到的溶液进行超过滤。取出800mL过滤液。将残留物调节为25mL。

[Fe]＝0.290M/L PCS尺寸＝32.2nm

Fe＝46.3％m/m

P＝1.07％m/m

N＝0.3％m/m

C＝10.3％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝2.08％mol/mol

接枝度[化合物Amino-PEG2000/Fe]＝1.07％mol/mol

接枝度[化合物Amino-PEG2000/化合物A]＝50.4％。

实施例32

将180mg来源于实施例24的化合物J加入到46mL实施例12的物质(浓度：铁为0.285mol/L)中，将pH值调节到6.2。

在此溶液中加入50mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。在环境温度下搅拌混合物8h。在反应介质中再加入50mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，并保持搅拌16h。

通过截留阈30kD的PALL搅拌室将反应介质直接进行超过滤。

将残留物调节为55mL，然后通过0.22μm进行过滤。

[Fe]＝0.273M/L PCS尺寸＝72.4nm

Fe＝62.4％m/m

P＝1.16％m/m

C＝2.31％m/m

N＝0.37％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝1.68％mol/mol

接枝度[化合物J/Fe]＝0.185％mol/mol

接枝度[化合物J/化合物A]＝11.0％。

实施例33：

将750mg化合物O-(2-氨基乙基)-O’-甲基聚乙二醇750[Amino-PEG甲酯750^；Fluka]溶解于20mL铁浓度为0.273M/L的实施例32的物质中，将pH值调节到6.2。

加入200mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。在环境温度下搅拌混合物8h。再在反应介质中加入200mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，然后保持反应介质搅拌16h。

通过截留阈30kD的PALL搅拌室直接将反应介质进行超过滤。将残留物调节为25mL，然后通过0.22μm的过滤。

[Fe]＝0.268M/L PCS尺寸＝69nm

Fe＝59.7％m/m

P＝1.06％m/m

C＝6.3％m/m

N＝0.65％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝1.6％mol/mol

接枝度[化合物Amino-PEG750/Fe]＝1.9％mol/mol

接枝度[化合物J/Fe]＝0.19％mol/mol。

实施例34：

将1.13g实施例5的化合物(化合物E)加入到20mL浓度为0.273M铁/L的实施例32的物质中，将pH值调节到6.2。

在此溶液中加入200mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。在环境温度下搅拌混合物8h。

在反应介质中再加入200mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，并保持搅拌16h。

通过截留阈30kD的PALL搅拌室将反应介质直接进行超过滤。

将残留物调节为25mL，然后通过0.22μm进行过滤。

[Fe]＝0.188M/L PCS尺寸＝79nm

Fe＝55.1％m/m

P＝0.91％m/m

C＝7.21％m/m

N＝1.09％m/m

Br＝3.08％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝1.5％mol/mol

接枝度[化合物E/Fe]＝1.3％mol/mol

接枝度[化合物J/Fe]＝0.19％。

实施例35：

将0.29g来源于实施例25的化合物K加入到74mL实施例12的物质(浓度：0.285M铁/L)中，将pH值调节到6.2。

在此溶液中加入82mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。在环境温度下搅拌混合物8h。在8h以后，在反应介质中再加入82mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，并保持搅拌16h。

通过截留阈30kD的PALL搅拌室将反应介质直接进行超过滤。将残留物调节为75mL，然后通过0.22μm进行过滤。

[Fe]＝0.273M/L PCS尺寸＝60.8nm

Fe＝63.1％m/m

P＝1.23％m/m

C＝4.1％m/m

N＝0.37％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝1.76％mol/mol

接枝度[化合物K/Fe]＝0.22％mol/mol

接枝度[化合物K/化合物A]＝12.5％。

实施例36：

将1g化合物O-(2-氨基乙基)-O’-甲基聚乙二醇750[Amino-PEG甲酯750；Fluka]溶解于25mL实施例35的物质(C＝0.273M/L铁)中，将pH值调节到6.2。

在此溶液中加入274mg1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。在环境温度下搅拌混合物8h。8h以后，再在反应介质中加入274mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，并保持搅拌16h。

[Fe]＝0.261M/L PCS尺寸＝59nm

Fe＝62.4％m/m

P＝1.13％m/m

C＝7.56％m/m

N＝0.8％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝1.63％mol/mol

接枝度[化合物Amino-PEG750/Fe]＝1.59％mol/mol

接枝度[化合物K/Fe]＝0.22％mol/mol。

实施例37：

将1.61g实施例5的化合物(化合物E)加入到25mL实施例35的物质(C＝0.273M/L铁)中，将pH值调节到6.2。

在此溶液中加入274mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。在环境温度下搅拌混合物8h。8h以后，再在反应介质中加入274mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，并保持搅拌16h。

通过截留阈30kD的PALL搅拌室直接将反应介质进行超过滤。将残留物调节为28mL，然后通过0.22μm的过滤。

[Fe]＝0.240M/L PCS尺寸＝65.6nm

Fe＝61.5％m/m

P＝1.02％m/m

C＝8.0％m/m

N＝1.21％m/m

Br＝3.8％m/m

接枝度[化合物A/Fe]＝1.5％mol/mol

接枝度[化合物E/Fe]＝1.4％mol/mol

接枝度[化合物K/Fe]＝0.22％mol/mol。

对于某些生物学靶，用生物媒介偶联的被通式(I)化合物络合的酸性磁性颗粒(p)的亲合性测试。

1/用BiaCore技术对实施例17的物质对叶酸酯结合蛋白质(FBP) 的亲合性测试

试剂

化合物	供应商	符号
化合物	供应商	符号	叶酸	Avogado	14300
FBP	Sigma	F-0504	叶酸	Avogado	14300
FBP	Sigma	F-0504	Chip CM5	BIAcore	批号1121065和11210007

HBS缓冲液：10mM Hepes，pH7.4，0.15M NaCl，4.3mM EDTA和0.005％NP20

PGM缓冲液：100mM KH₂PO₄、10％甘油和4mMβ-巯基乙醇

按照BIAcore对于与胺偶联所推荐的操作程序，在PGM缓冲液中以1mg/mL进行FBP的固定。在此之后，用pH值＝8的1M乙醇胺使剩下的活性羧酸化基团饱和。附着的FBP的量相当于大约1.5ng/mm²。

实施例17的浓度为0.170mol铁/L，这相当于1.9×10^-5mol颗粒/L(认为结晶是7.5nm，即8900个铁原子/颗粒)。

随后以4种不同的浓度(125、250、500和1000μM)附着上叶酸酯，而在10μm和在10nM下(以mol颗粒/L表示)实施实施例17的物质。在25μL/min的流量研究结合和解离。结合和解离期都是5min。

结果

产物	结合速度ka	解离速度kd	亲合性常数KD
产物	结合速度ka	解离速度kd	亲合性常数KD	叶酸	10³M^-1s^-1	1.610^-3s^-1	1.6μM
实施例17	＞10⁶M^-1s^-1	＜10^-6s^-1	＜1pM	叶酸	10³M^-1s^-1	1.610^-3s^-1	1.6μM

这些结果表明，实施例17的物质对叶酸酯结合蛋白质(FBP)的亲合性是很高的，具有低于pmol的亲合性常数KD(以mol颗粒/L表示)。

已知叶酸受体(在此用FBP表示)对于某些肿瘤细胞(卵巢癌、肺癌、结肠癌和乳腺癌)和在炎性点(特别是在类风湿关节炎中)是非常高过量表达的，实施例17的物质在肿瘤学和炎性疾病中可以有利地被用作特异性的MRI对比剂。

2/实施例27的物质对于人类金属蛋白酶MMP-1和MMP-3的抑制活性

实施例27的物质在其表面上被来源于llomastat的生物媒介(实施例22：化合物H)覆盖，这是一种假肽，被承认是一种很强的锌金属蛋白酶(基质金属蛋白酶：MMP)抑制剂。

在活体外评价实施例27的物质对人类基质金属蛋白酶MMP-1和MMP-3的抑制活性。将其与实施例12的物质(没有被化合物H官能化的颗粒)和与参照的肽llomastat进行比较。用来测量各种产品对MMP-1的抑制作用的操作程序如下：

—原理：用荧光计(λex＝340nm，λem＝440nm；测量由底物DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys-(n-Me-Abz)-NH₂裂解形成的Cys(Me)-His-Ala-Lys(n-Me-Abz)-NH₂)，对被测试产品对人类MMP-1(从来自于类风湿滑液的人成纤维细胞分离)的抑制作用进行定量评估；操作程序在参考文献Bickett等人的(1993)Anal.Biochem.；212：58中叙述。

在测试时的参照化合物是GM6001(llomastat，Galardin IC₅₀＝1.9×10^-9M)。

更准确地说，在含有7nM的MMP-1，pH值＝7的缓冲溶液中加入被测试的化合物，或者参照物，或者水。立即借助于平板阅读机(GeminiXS，Molecular Devices)在λex＝340nm和在λem＝440nm处评估此介质的荧光强度。在t＝0时的此测量用来校验产品对荧光检测的任何可能的干扰。然后加入浓度为10μM的底物DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-Hi s-Ala-Lys-(n-Me-Abz)-NH₂引发酶反应。在37℃下培养40min以后，在与前面同样的条件下再次评价荧光(t＝40min)。从在t＝40min时测量的信号中减去在t＝0时测量的信号，就确定了酶的活性。最终的结果表示为酶活性的％抑制率。

测量各种产品对MMP-3的抑制作用的操作程序如下：

—原理：用荧光计(λex＝340nm，λem＝405nm；测量由底物Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met-Lys(DNP)-NH₂(NFF2)裂解形成的Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala，对被测试产品对人类MMP-3(使用被sF9细胞系表达的重组酶)的抑制作用进行定量评估；操作程序在参考文献Nagase等人的(1994)J.Biol.Chem.；269：20952中叙述。

在测试时的参照物是GM6001(llomastat，Galardin IC₅₀＝1.3×10^-7M)。

更准确地说，在含有6nM的MMP-3，pH值＝6的缓冲溶液中加入被测试的产品，或者参照物，或者水。在37℃下进行30min的预培养之后，借助于平板阅读机(GeminiXS，Molecular Devices)在λex＝340nm和在λem＝405nm处评估此介质的荧光强度。在t＝0时的此测量用来校验产品对荧光检测的任何可能的干扰。然后加入浓度为10μM的底物NFF-2引发酶反应。在37℃下培养90min以后，在与前面同样的条件下再次评价荧光(t＝90min)。从在t＝90min时测量的信号中减去在t＝0时测量的信号，就确定了酶的活性。

最终的结果表示为酶活性的％抑制率。

实施例27的物质对人类MMP-1和人类MMP-3的抑制结果如在表1中所示。

表1

MMP	铁的浓度[M]	生物媒介浓度：化合物H[M]	对照值的抑制％
MMP	铁的浓度[M]	生物媒介浓度：化合物H[M]	对照值的抑制％	MMP-1	1.03×10^-8	0.86×10^-10	9
1.03×10^-6	0.86×10^-8	86			1.03×10^-8	0.86×10^-10	9
1.03×10^-6	0.86×10^-8	86	1.03×10^-4		0.86×10^-6	103
MMP-3	1.03×10^-8	0.86×10^-10	1.03×10^-4		0.86×10^-6	103	0
	1.03×10^-8	0.86×10^-10	1.03×10^-6	0.86×10^-8	-1		0
	1.03×10^-4	0.86×10^-6	1.03×10^-6	0.86×10^-8	-1	68

实施例27抑制MMP-1在0.87×10^-10～0.87×10^-8M之间(表示为化合物H的浓度)，这是与对于参照肽-llomastat得到的实验数据(IC50＝1.9×10^-9M)相符合的。

实施例27抑制MMP-3在0.87×10^-8～0.87×10^-6M之间(表示为化合物H的浓度)，这是与对于参照肽-llomastat得到的实验数据(IC50＝1.3×10^-7M)相符合的。

实施例27的物质对MMP-1和MMP-3所得到的结果表明，申请人制备的氧化铁颗粒的行为与参照肽(llomastat)很类似。实施例27的化合物可以用作对金属蛋白酶(MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9)的广谱抑制剂，还可以被用作对于给各种MMP被过量表达的病理区域造影的很有用的对比剂。

Claims

1.含有基于铁化合物的酸性磁性颗粒(p)的组合物，所述酸性磁性颗粒(p)被一种或几种通式(I)的偕二膦酸酯化合物所络合：

X-L-CH(PO₃H₂)₂ (I)

其中：

-L表示将基团X与偕二膦酸根-CH(PO₃H₂)₂连接起来的有机基团；

-X表示能够与生物媒介反应的化学基团；所述颗粒的全部或部分基团X任选与生物媒介相偶联。

2.如权利要求1的组合物，其中全部或部分基团X与生物媒介偶联。

3.如权利要求1或2的组合物，其中L选自脂肪族基团、脂环族基团、芳香族基团、脂环-脂肪族基团、芳香族-脂肪族基团，对于所述基团，任选可被甲基、羟基、甲氧基、乙酰氧基、酰胺基或氯、碘或溴原子取代；或者是基团-L₁-NHCO-L₂，这里L₁和L₂相同或不同，表示脂肪族基团、脂环族基团、芳香族基团、脂环-脂肪族基团或芳香族-脂肪族基团，对于所述基团，任选可被甲基、羟基、甲氧基、乙酰氧基、酰胺基或氯、碘或溴原子取代。

4.如权利要求3的组合物，其中L表示任选取代的亚苯基，对于X和偕二膦酸酯基团，可以位于邻位、间位或对位。

5.如权利要求3的组合物，其中基团L表示脂肪族基团。

6.如权利要求5的组合物，其中基团L表示基团-(CH₂)_p-，这里p是1～5的整数。

7.如权利要求3的组合物，其中基团L表示L₁-CONH-L₂，L₁和L₂如在权利要求3中所定义。

8.如权利要求7的组合物，其中L表示基团-(CH₂)_m-CONH-(CH₂)_n，这里m和n表示0～5的整数。

9.如权利要求1～8中任何一项的组合物，其中X选自-COOH、-NH₂、-NCS、-NH-NH₂、-CHO、马来酰亚胺基、烷基焦羰基、酰叠氮基、亚胺基碳酸根、乙烯基磺酰基、吡啶基二磺酰基、卤代乙酰基、二氯三嗪基和卤素。

10.如权利要求9的组合物，其中X表示-COOH或-NH₂。

11.如权利要求6和10的组合物，其中全部或部分通式(I)化合物具有如下的通式(Ia)：

HOOC(CH₂)₂-CH(PO₃H₂)₂ (Ia)。

12.如权利要求1～11中任何一项的组合物，其中颗粒(p)平均在其至少90％的质子化位置上被通式(I)的化合物所络合。

13.如权利要求1～12中任何一项的组合物，其中该质子化位置被至少两种具有不同结构的通式(I)偕二膦酸酯化合物所络合。

14.如权利要求1～13中任何一项的组合物，其中质子化位置被至少两种具有相同结构的通式(I)化合物所络合。

15.如权利要求1～14中任何一项的组合物，其中全部或部分磁性颗粒(p)由氢氧化铁、氢氧化铁水合物、铁氧体、混合氧化铁或它们的混合物组成。

16.如权利要求15的组合物，其中全部或部分磁性颗粒(p)由铁氧体组成。

17.如权利要求16的组合物，其中该铁氧体是磁赤铁矿或磁铁矿或它们的混合物。

18.如权利要求1～17中任何一项的组合物，其中该颗粒(p)是超顺磁的。

19.如权利要求1～18中任何一项的组合物，其中1～70％，优选1～50％的通式(I)化合物的基团X与生物媒介偶联。

20.如权利要求1～19中任何一项的组合物，其中通式(I)化合物的基团X与至少两种不同的生物媒介偶联。

21.如权利要求1～20中任何一项的组合物，其中的生物媒介选自任选是重组的或者突变的蛋白质、糖蛋白、凝集素、生物素、维生素、磷脂、叶酸衍生物、抗体或抗体片段、肽及其衍生物、单糖或多糖、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白链霉素、受体底物或抑制剂、类固醇及其类似物、低聚核苷酸、核糖核酸序列、脱氧核糖核酸序列、激素或类激素物质、氨基酸和衍生物、具有药理活性的有机分子、氨基醇、整联蛋白靶向剂和MMP靶向剂等。

22.如权利要求21的组合物，其中生物媒介表示肽衍生物，优选是整联蛋白靶向剂或MMP靶向剂。

23.如权利要求21的组合物，其中生物媒介表示反叶酸或叶酸衍生物。

24.如权利要求21的组合物，其中生物媒介表示磷脂衍生物，特别是磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇或鞘磷脂衍生物或神经酰胺衍生物。

25.如权利要求21的组合物，其中生物媒介表示蛋白质，任选是重组的或突变的。

26.如权利要求21的组合物，其中生物媒介表示抗体或抗体片段，它们任选是被官能化的。

27.如权利要求21的组合物，其中生物媒介表示任选官能化的药效基团。

28.如权利要求21的组合物，其中生物媒介选自通式(II)的氨基醇：

其中R₁和R₂相同或不同，表示含有2～6个碳原子，优选被6～10个羟基取代的脂肪族烃基链，或者当R₁和/或R₂被氧原子隔开时，被4～8个羟基取代。

29.如权利要求21的组合物，其中生物媒介选自氨基聚乙二醇。

30.如权利要求28的组合物，其中R₁表示-(CH₂)-(CHOH)₄-CH₂OH或-(CH₂)-CHOH-CH₂OH，并且R₂表示-CH₂(CHOH)₄-CH₂OH。

31.如权利要求1～30中任何一项的组合物，其中基团X与生物媒介形成如下类型的共价键：-CONH-、-COO-、-NHCO-、-OCO、-NH-CS-NH-、-C-S-、-N-NH-CO、-CO-NH-N-、-CH₂NH-、-N-CH₂-、-N-CS-N-、-CO-CH₂-S-、-N-CO-CH₂-S-、-N-CO-CH₂-CH₂-S-、-CH＝NH-NH-、-NH-NH＝CH-、-CH＝N-O-或-O-N＝CH-，以及如下结构式：