ES2321709T3 - Nueva composiciones de particulas magneticas recubiertas de derivados gem-bisfofonatos. - Google Patents

Abstract

Composición que comprende partículas magnéticas ácidas (p) a base de un compuesto de hierro, estando dichas partículas magnéticas ácidas (p) acomplejadas por uno o varios compuestos gem-bisfosfonatos, de fórmula (I): X-L-CH(PO 3H 2) 2 en la que: - L representa un grupo orgánico que relaciona la función X a la función gem-bisfosfonato -CH(PO3H2)2; seleccionado entre un grupo -(CH2)p- en el que p es un número entero de 1 a 5; un grupo fenileno opcionalmente sustituido, pudiendo estar los grupos X y gem-bisfosfonatos en posición orto, meta o para; una cadena alifática lineal que comprende de 1 a 6 átomos de carbono sustituida por un grupo aromático; un grupo -L1-NHCO-L2 en el que L1 y L2 son idénticos o diferentes y representan un grupo alifático lineal que comprende de 1 a 6 átomos de carbono o una cadena alifática lineal que comprende de 1 a 6 átomos de carbono sustituida por un grupo aromático, pudiendo estar dichos grupos opcionalmente sustituidos por un grupo metilo, hidroxi, metoxi, acetoxi, amido o un átomo de cloro, de yodo o de bromo, X representa una función química susceptible de formar un enlace covalente con un biovector seleccionado entre -COOH, -NH2, -NCS, -NH-NH2, -CHO, maleimidilo, alquilpirrocarbonilo, acilazidilo, iminocarbonato, vinilsulfurilo, piridil-disulfurilo, haloacetilo, diclorotriazinilo, halógeno, estando eventualmente acopladas dichas funciones X de dichas partículas en todo o parte a un biovector.

Description

Nuevas composiciones de partículas magnéticas recubiertas de derivados gem-bisfosfonatos.

La invención se refiere a composiciones de partículas magnéticas recubiertas de moléculas que comprenden por una parte, una función gem-bisfosfonato unida a la superficie de la partícula y, por otra parte, una función reactiva susceptible de unir por enlace covalente una entidad de reconocimiento denominada biovector. La invención apunta igualmente su procedimiento de preparación y su utilización principalmente como producto de contraste para el diagnóstico por imagen por resonancia magnética nuclear (IRM).

El IRM permite la observación de órganos internos en seres vivos y constituye pues un auxiliar y una guía potente en el diagnóstico, el tratamiento médico y la cirugía.

La administración de productos de contraste contribuye a mejorar la resolución de imágenes obtenidas por esta técnica y la precisión del diagnóstico.

Así, el efecto de contraste puede ser acentuado por la presencia, en el medio de órganos sometidos a examen, de diversas especies magnéticas, por ejemplo paramagnéticas, ferromagnéticas o superparamagnéticas.

Las sustancias paramagnéticas que comprenden determinados metales como el hierro, el manganeso, el gadolinio en estado iónico u organometálico. Las sustancias de contraste ferromagnéticas comprenden generalmente partículas de agregado magnéticas de tamaño microscópico o submicroscópico, es decir no inferior a 100-200 nm, por ejemplo partículas de ferritas, de las cuales principalmente magnetita (Fe_{3}O_{4}), maguemita (\gamma-Fe_{2}O_{3}) y otros compuestos minerales magnéticos de elementos de transición que se comportan como imanes permanentes. Las partículas superparamagnéticas habitualmente son partículas muy pequeñas de ferrita, de las cuales principalmente la magnetita (Fe_{3}O_{4}), la maghemita (\gamma-Fe_{2}O_{3}) y otros compuestos minerales magnéticos de los elementos de transición, de tamaño inferior a alrededor 100-150 nm. Al contrario que las partículas ferromagnéticas, las partículas superparamagnéticas no se comportan como pequeños imanes autónomos por el hecho de que su tamaño es inferior a un valor crítico, es decir que se alinean en una dirección preferente únicamente cuando se someten a un campo magnético externo. Las partículas superparamagnéticas presentan ventajosamente una densidad de eficacia más elevada con relación a las partículas ferromagnéticas.

Para obtener soluciones coloidales de las partículas magnéticas, denominadas aún ferrofluidos en lo siguiente, estables en medio fisiológico, es necesario acondicionar la superficie de las partículas magnéticas.

Muy a menudo, las partículas magnéticas utilizadas en el diagnóstico médico por la imagen están recubiertas de macromoléculas tales como carbohidratos como el dextrano, proteínas como la albúmina o polímeros de síntesis como los metacrilatos y los organosilanos. Las síntesis que permiten obtener este tipo de partículas se efectúan generalmente según el procedimiento denominado "de Molday" (Referencia: Robert S. Molday y D. Mackenzie; J. of Immunological Methods (1982), 52, págs 353-367) y necesitan purificaciones laboriosas y costosas.

En muchas aplicaciones médicas de las partículas magnéticas, es necesario acoplar estas últimas a una molécula de afinidad específica, de manera que estas partículas se unan específicamente a las células diana y a los tejidos. Este reconocimiento está asegurado con frecuencia por la formación de un complejo de afinidad entre un ligando (biovector) fijado a la partícula y un receptor a la superficie de la célula diana o a un tejido. Esta molécula de afinidad específica puede adsorberse directamente a la superficie de las partículas o estar unida por covalencia.

De manera general, el injerto covalente de la molécula de afinidad específica en una macromolécula requiere preferentemente una activación química, por ejemplo por oxidación, de manera que genere puntos de fijación en la macromolécula.

Sin embargo, el número de puntos de fijación generado en la macromolécula es generalmente difícil de dominar y, como consecuencia, el injerto ulterior de una molécula de afinidad específica no puede controlarse.

Ahora bien, el control de la cantidad de molécula de afinidad específica injertada es importante para modular la afinidad de la solución final de las partículas de cara a la diana, pero también para modular la farmacocinética, la biodistribución y opcionalmente el metabolismo, la excreción y la inocuidad de estas partículas. Además, desde un punto de vista industrial, es interesante poder minimizar la cantidad de molécula de afinidad específica, cuyo coste es en general muy elevado.

Además, las funciones reactivas en la superficie de la macromolécula que no han reaccionado con dicha molécula de afinidad específica, son susceptibles de producir reacciones tóxicas in vivo.

Incluso, en general, el injerto de una molécula de afinidad específica por quimiabsorción es difícil de controlar desde un punto de vista físico-químico y, además, es mucho menos estable en el medio biológico. Además, la quimiabsorción produce un equilibrio con una fracción libre de la molécula de afinidad específica. Esta fracción libre es perjudicial al contrario que en IRM.

Las partículas magnéticas recubiertas de moléculas orgánicas de débil peso molecular se han descrito igualmente hasta la fecha.

El documento J. of Coll. and Interf. Science 2001, 238, págs. 37-42 da a conocer visto el recubrimiento de partículas magnéticas por moléculas orgánicas que conlleva una parte de bisfosfonato permite obtener objetos de pequeño tamaño (inferior a 15 nm) y estables en un gran intervalo de pH.

Sin embargo, la medición del tamaño hidrodinámico de las partículas recubiertas de compuestos bisfosfonatos por PCS (Photon Correlation Spectroscopy) descrita en este documento requiere una etapa de filtración previa en filtros de 100 nm, para eliminar los agregados y no aislar más que las partículas de pequeño tamaño hidrodinámico. Esta medición no refleja por consiguiente el tamaño hidrodinámico real de las partículas obtenidas que, de hecho, es mucho más elevado.

Además, la purificación de las partículas magnéticas recubiertas por compuestos gem-bisfosfonatos por el procedimiento descrito en este documento necesita la ejecución de una etapa de diálisis o de tratamiento por resinas, lo que parece laborioso, poco reproducible y muy difícilmente explotable a escala industrial. Se recuerda que los gem-bisfosfonatos son los grupos -CH(PO_{3}H_{2})_{2}.

Este procedimiento no permite por consiguiente controlar ni el injerto de los compuestos gem-bisfosfonatos en la superficie de las partículas magnéticas, ni el tamaño hidrodinámico de la partícula resultante, sin recurrir a purificaciones laboriosas. Además, este documento no describe ni sugiere acoplar entidades de reconocimiento específico a partículas recubiertas de compuestos bisfosfonatos, y en particular de gem-bisfosfonatos, para aplicaciones biomédicas específicas, lo que hace su utilización muy inadaptada para este reconocimiento.

El diámetro hidrodinámico, en el sentido de la presente invención, hace referencia al diámetro de la partícula en solución rodeada de su capa de hidratación, tal como se determina por difusión de la luz según la técnica PCS (Espectroscopia de Autocorrelación de fotón, Photon Corrélation Spectroscopy: Référence: R. Pecora - J. of Nanoparticle Research (2000), vol. 2, págs. 123-131).

La publicación WO 97/01760 describe partículas magnéticas recubiertas de ácido dimercaptosuccínico (ADMS), acopladas a una entidad de reconocimiento específico, la anexina, mediante las funciones tioles del ADMS.

Sin embargo, en las condiciones de pH y de fuerza iónica habituales, las funciones tioles del ADMS presentes en la superficie de la partícula tienen tendencia a oxidarse y a formar puentes disulfuro, lo que conduce a la formación de agregados. De ello resulta un tamaño hidrodinámico elevado así como una fuerte polidispersión.

Además, el injerto de la anexina necesita, previamente, regenerar las funciones tioles por reducción de puentes disulfuro.

Por último, el injerto de la anexina está mal controlado. Se deduce que después del acoplamiento, parece necesario desactivar las funciones tioles residuales por reacción con la BSA (Bovin Serum Albumin) de manera que se eviten las reacciones tóxicas in vivo o la agregación posterior de las partículas obtenidas.

Continúa habiendo necesidad de obtener partículas a la vez eficaces para un diagnóstico específico, poco polidispersadas y estables.

Actualmente se ha descubierto que se puede controlar a la vez el injerto de compuestos gem-bisfosfonatos funcionalizados en partículas magnéticas y el acoplamiento de las partículas resultantes a los biovectores, gracias a la utilización combinadas de dichos compuestos gem-bisfosfonatos y a las partículas magnéticas ácidas. Este doble control presenta la ventaja de permitir principalmente el dominio del tamaño hidrodinámico de las partículas resultantes, es decir de las partículas magnéticas ácidas (p) injertadas por compuestos gem-bisfosfonatos, que están acoplados o no a biovectores. La invención se refiere así principalmente a:

-

\vtcortauna las partículas ácidas sobre las que se injertan los gem-bisfosfonatos, estas partículas una vez injertadas son capaces de unirse al menos a un biovector;

-

\vtcortauna estas partículas injertadas por los gem-bisfosfonatos y acopladas al menos a un biovector.

En este ámbito, se demuestra que el procedimiento de obtención de dichas partículas magnéticas comprende un número limitado de etapas y es a la vez sencillo de ejecutar y reproducible. Además, no requiere purificaciones laboriosas y se caracteriza por muy buenos rendimientos.

En el sentido de la presente invención, se entiende por "partícula magnética ácida" las partículas magnéticas del tipo de las presentes en el seno de los ferrofluidos denominados "ácidos", conocidos en el estado de la técnica, pero cuya asociación a los gem-bisfosfonatos no estaba descrita ni sugerida.

\newpage

Estos ferrofluidos "ácidos" al igual que los ferrofluidos "alcalinos", están muy descritos en la bibliografía, principalmente en la publicación Massart et al., C.R. Acad. Sc. Paris, t. 291, 7/07/1980, serie C e IEE, Transactions on Magnetics, 1981, vol. MAG-17, nº 2, pág. 1247.

Se describe generalmente las partículas magnéticas ácidas de los ferrofluidos ácidos presentando puntos de hidroxilos protonados en la superficie, en medio ácido.

Por el contrario, las partículas magnéticas de los ferrofluidos alcalinos se describen presentando generalmente zonas acomplejadas por iones OH^{-} en medio ácido.

Esta representación desde el punto de vista de las zonas corresponde de hecho a un modelo que además ha sido fortalecido por diferentes trabajos que demuestran que las partículas magnéticas ácidas y básicas se comportan como poliácidos y/o polibases débiles.

De manera ventajosa, los inventores han demostrado que, al contrario que los ferrofluidos "alcalinos", los ferrofluidos "ácidos" son muy estables y no presentan el fenómeno de agregación de partículas, de donde un mejor control del tamaño hidrodinámico del precursor (es decir de la partícula no injertada) y posteriormente de partículas injertadas por compuestos gem-bisfosfonatos, después, dado el caso, de dichas partículas acopladas a biovectores, sin etapa de purificación laboriosa.

De manera sorprendente, los inventores han demostrado además que se puede obtener un recubrimiento muy bueno de la partículas magnéticas por los compuestos gem-bisfosfonatos, pudiendo estar potencialmente injertado cada punto hidroxilado protonado en la superficie de la partícula ácida por una molécula de agente acomplejante gem-bisfosfonato. Esta interacción permite, ventajosamente, enmascarar la superficie de la partícula de manera homogénea, lo que puede permitir, en particular, impedir el reconocimiento ulterior de la partícula por el sistema inmunita-
rio.

De manera específica, los inventores han descubierto además un procedimiento que permite reducir el tamaño hidrodinámico de las partículas magnéticas ácidas y obtener en consecuencia partículas magnéticas de muy pequeño tamaño. De manera ventajosa, el injerto controlado de estas partículas por agentes gem-bisfosfonatos sigue opcionalmente al acoplamiento, igualmente controlado, con biovectores que permiten obtener partículas magnéticas finales de pequeño tamaño hidrodinámico sin ninguna etapa de purificación laboriosa, y tener pues al final, un procedimiento de preparación robusto, reproducible y por consiguiente, industrializable.

Los inventores han estudiado además el acomplejamiento de partículas magnéticas ácidas (p) por compuestos que conllevan, por una parte, una función X susceptible de unir por enlace covalente un biovector y por otra parte una función disfosfonato en lugar y sitio de la función gem-bisfosfonato.

Se han obtenido así partículas estables, lo que es ya una mejora distintiva con relación a la técnica anterior, pero el acoplamiento a un biovector es significativamente menos eficaz que con un gem-bisfosfonato. En particular, cuando se utiliza un compuesto difosfonato HOOC-CH_{2}-N(CH_{2}(PO_{3}H_{2}))_{2}, por razones no totalmente aclaradas, las partículas presentan un índice de acoplamiento con el biovector dos veces más pequeño que con un gem-bisfosfonato. Resulta por consiguiente que el coste de producción de las partículas magnéticas injertadas por difosfonatos y acopladas a los biovectores sería mucho más elevado.

La presente invención apunta pues a proponer composiciones de partículas magnéticas injertadas de manera controlada por derivados gem-bisfosfonatos y opcionalmente acopladas de manera controlada, mediante estos derivados, a especies de tipo de entidad de reconocimiento específico (biovector).

De manera más específica, la invención apunta igualmente a proporcionar un procedimiento de preparación de dichas composiciones.

Según un primer aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende partículas magnéticas ácidas (p) a base de un compuesto de hierro, estando cada una de dichas partículas magnéticas ácidas (p) acomplejada por uno o varios compuestos gem-bisfosfonatos, de fórmula (I):

(I)X-L-CH(PO_{3}H_{2})_{2}

en la que:

\bullet

\vtcortauna L representa un grupo orgánico que une la función X a la función gem-bisfosfonato -CH(PO_{3}H_{2})_{2};

\bullet

\vtcortauna X representa una función química susceptible de reaccionar con un biovector; estando eventualmente acopladas dichas funciones X de dichas partículas (p) en todo o parte a un biovector.

Bajo la expresión "estando cada una acomplejada", el experto en la materia comprenderá que la composición puede comprender asimismo partículas magnéticas (p) no acomplejadas por compuestos de fórmula (I), lo que principalmente por razones de distribución estáticas y/o en razón del procedimiento de preparación de dicha composición se describe a continuación.

La composición se presenta en forma de una solución estable de nanopartículas.

En estas composiciones, el índice de acomplejamiento del compuesto (I) en las partículas es superior al 70%, y con preferencia superior al 80, 90 o 95%, entendiéndose que la expresión "índice de acomplejamiento" en la presente descripción se refiere con preferencia a la cantidad de compuestos de fórmula (I), con relación a la cantidad de puntos protonados presentes en las partículas magnéticas ácidas (p).

Se prefiere particularmente que las partículas magnéticas ácidas (p) estén acomplejadas en al menos el 90% de sus puntos protonados por compuestos de fórmula (I), por lo que se obtiene provechosamente un buen recubrimiento de la partícula, apto en particular para asegurar una buena estabilidad de la partícula, para impedir el reconocimiento de la partícula por el sistema inmunitario y para realizar el eventual acoplamiento ulterior con un biovector más eficaz.

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Partícula magnética (P)

Se entiende por "partículas a base de un compuesto de hierro", en el sentido de la presente descripción, las partículas constituidas en todo o parte por un derivado de hierro, que comprende generalmente hierro (III), generalmente un óxido o un hidróxido de hierro.

Por regla general, las partículas magnéticas ácidas (p) están compuestas en todo o parte por hidróxido de hierro; óxido de hierro hidratado; ferritas; óxidos de hierro mixtos tales como los óxidos de hierro mixtos de cobalto, níquel, manganeso, berilio, magnesio, calcio, bario, estroncio, cobre, cinc o platino; o una mezcla de éstos.

En el sentido de la presente invención; el término "ferrita" designa los óxidos de hierro de fórmula general [xFe_{2}O_{3} y MO_{z}], en la que M designa un metal magnetizable bajo el efecto de un campo magnético tal como Fe, Co, Ru, Mg, Mn, pudiendo ser el metal magnetizable eventualmente radioactivo.

De manera preferente, las partículas magnéticas ácidas (p) de las composiciones de la invención que comprenden una ferrita, principalmente la maghemita (\gammaFe_{2}O_{3}) y la magnetita (Fe_{3}O_{4}) o incluso las ferritas mixtas de cobalto (Fe_{2}CoO_{4}) o de manganeso (Fe_{2}MnO_{4}).

En este ámbito, se prefieren muy particularmente partículas magnéticas ácidas (p) compuestas en todo o en parte, y con preferentemente esencialmente, de maghemita o de magnetita o de una mezcla de éstas.

Las partículas magnéticas ácidas (p) de las composiciones según la invención presentan una superficie de puntos hidroxilados protonados en medio ácido, que corresponde más exactamente al espacio Fe-OH_{2}^{+} resultante de una interacción muy fuerte entre un ión Fe^{3+} en la superficie de la partícula y una molécula de agua ácida (H_{3}O^{+}). Estos protones pueden considerarse como constitutivos de la partícula según los trabajos de J. Lyklema et al., Materials Science Research, 1984, 17, págs. 1-24. El porcentaje de puntos protonados en una partícula ácida está comprendido por lo general entre 1,3 y 2,5% (moles de puntos/moles de hierro).

Según una variante particularmente preferida, las partículas ácidas (p) son superparamagnéticas.

Las partículas magnéticas (p) poseen entonces, un diámetro hidrodinámico comprendido entre 5 y 300 nm, con preferencia entre 5 y 60 nm, todavía con preferencia entre 5 y 30 nm.

Preferentemente, la composición de la invención es una suspensión de partículas magnéticas ácidas (p) que presenta ventajosamente, dado el caso, una concentración adaptada a la formación de una solución coloidal estable (suspensión acuosa de nanopartículas estable), a saber, en general, una concentración de partículas magnéticas (p) que oscila entre 2 \mumoles l^{-1} y 4 moles l^{-1}, expresada en número de moles de iones metálicos totales.

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Compuestos de fórmula (I)

Los compuestos de fórmula (I) según la invención conllevan una función gem-bisfosfonato que asegura la fijación del compuesto de fórmula (I) en la superficie de la partícula magnética ácida.

Más exactamente, los inventores han demostrado que cada función gem-bisfosfonato interactúa con un solo punto hidroxilo protonado en la superficie de la partícula ácida.

Los compuestos de fórmula (I) de la invención que comprenden un enlazador (L) que permite unir y/o espaciar la función gem-bisfosfonato y la entidad reactiva X capaz de asegurar el injerto covalente de un biovector.

A título preferido, el enlazador L representa un grupo divalente.

Con preferencia, el enlazador L se selecciona entre:

-

\vtcortauna un grupo alifático, alicíclico: alicíclico-alifático; aromático; aromático-alifático; estando opcionalmente dichos grupos alifáticos, alicíclicos y aromáticos sustituidos por un grupo metilo, hidroxi, metoxi, acetoxi, amido o un átomo de cloro, de yodo o de bromo;

-

\vtcortauna un grupo -L_{1}-NHCO-L_{2} en el que L_{1} y L_{2} son idénticos o diferentes y representan un grupo alifático; alicíclico; aromático; alicíclico-alifático o aromático-alifático, pudiendo estar dichos grupos eventualmente sustituidos por un grupo metilo, hidroxi, metoxi, acetoxi, amido o un átomo de cloro, de yodo o de bromo.

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Un grupo alifático, en el sentido de la presente invención, designa una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que conlleva con preferencia de 1 a 16 átomos de carbono, mejor aún de 1 a 6 átomos de carbono. Ejemplos de ello son principalmente los radicales metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, terc-butillo, isobutilo, pentilo y hexilo.

El término "alicíclico" designa una cadena hidrocarbonada cíclica que conlleva con preferencia de 3 a 8 átomos de carbono. A título de ejemplo, se citará principalmente el ciclopropilo y el ciclohexilo.

El término "aromático" representa un grupo hidrocarbonado mono- o policíclico aromático que comprende preferentemente de 5 a 20 átomos de carbono, mejor aún de 6 a 18. Ejemplos de esto son principalmente los radicales fenilos y 1- ó 2-naftilos. Según una variante específica, un grupo "aromático" en el sentido de la invención puede integrar 1 o varios heteroátomos tales como el azufre, el oxígeno o el nitrógeno. En este caso particular, el grupo "aromático" designa un grupo heteroaromático mono- o policíclico.

Los grupos "alifático-alicíclico" y "alifático-aromático" representan cadenas alifáticas que responden a la definición mencionada anteriormente, sustituidos respectivamente por un grupo alicíclico o aromático tales como los definidos anteriormente. A título de ejemplo de grupo alifático-aromático, se puede citar principalmente el bencilo.

Según una variante preferida, L representa un grupo fenileno opcionalmente sustituido, pudiendo estar los grupos X y gem-bisfosfonatos en posición orto, meta o para.

Según un modo de realización particularmente preferido, L representa un grupo alifático sustituido o no, y más preferentemente un grupo -(CH_{2})_{p}-, o p es un número entero de 1 a 5.

Según otro modo preferente, L representa un grupo L_{1}-CONH-L_{2} y más preferentemente un grupo -(CH_{2})_{n}-NHCO-(CH_{2})_{m}- o n y m representan un número entero de 0 a 5.

El extremo X del compuesto gem-bisfosfonato de fórmula (I) se elige de tal modo que sea susceptible de reaccionar y de formar un enlace covalente con una función presente en el biovector. Para más informaciones referentes a estos acoplamientos, se puede citar principalmente la obra Bioconjugate techniques, Greg T. Hermanson, 1995, editor: Academic, San Diego, Calif.

A título de grupos X preferidos, se pueden citar principalmente:

-

\vtcortauna COOH,

-

\vtcortauna -NH_{2}, -NCS, -NH-NH_{2}, -CHO, alquilpirrocarbonilo (-CO-O-CO-alk), acilazidilo (-CO-N_{3}), iminocarbonato (-O-C(NH)-NH_{2}), vinilsulfurilo (-S-CH=CH_{2}), piridildisulfurilo (-S-S-Py), haloacetilo, maleimidilo, diclorotriazinilo, halógeno,

-

\vtcortauna prefiriéndose particularmente los grupos -COOH y -NH_{2}.

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El término "alk" designa en el sentido de la presente descripción un radical etilo en C_{1}-C_{6}, designando el término "Py" en cuanto a él un radical piridilo.

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El radical maleimidilo designa un radical cíclico de fórmula:

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El radical diclorotriazinilo designa un radical de fórmula:

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Entre los grupos halógenos, se puede citar principalmente el cloro, el bromo, el flúor y el yodo, siendo particularmente preferidos el cloro y el bromo.

Por "haloacetilo", en el sentido de la presente descripción, se entiende un radical acetilo CH_{3}-CO-, uno de cuyos átomos de hidrógeno está sustituido por un átomo de halógeno, siendo éste tal como se definió anteriormente.

Con preferencia, X representa un grupo -COOH o -NH_{2} y L un grupo alifático sustituido o no, mejor aún un grupo -(CH_{2})_{p}-, en el que p es un número entero de 1 a 5.

Se prefiere muy particularmente el compuesto de fórmula (Ia)

(Ia)HOOC-(CH_{2})_{2}-CH(PO_{3}H_{2})_{2}

Según otro modelo preferente, L representa un grupo L_{1}-CONH-L_{2} y más preferentemente un grupo -(CH_{2})_{n}-NHCO-(CH_{2})_{m}- en el que n y m representan un número entero de 0 a 5 y X representa -COOH o -NH_{2}.

Bien entendido, entra asimismo en el ámbito de la invención el acoplamiento de la función X y del biovector de manera indirecta, es decir mediante un reactivo homobifuncional o heterobifuncional. A título ilustrativo de reactivo homobifuncional, el glutaraldehído puede convenir para realizar el acoplamiento, por ejemplo, de una función X = -NH_{2} con una función -NH_{2} del biovector.

Según una variante preferida de la invención, las funciones X forman un enlace covalente L_{3} con el biovector de tipo -CONH-, -COO-, -NHCO-, -OCO-, -NH-CS-NH-, -C-S-, -N-NH-CO-, -CO-NH-N-, -CH_{2}-NH-, -N-CH_{2}-, -N-CS-N-, -CO-CH_{2}-S-, -N-CO-CH_{2}-S-, -N-CO-CH_{2}-CH_{2}-S-, -CH=NH-NH-, -NH-NH=CH-, -CH=N-O-, -O-N=CH- o que responden a las formulas siguientes:

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Según un modo de realización particular, se puede considerar el acoplar dos biovectores en una misma función X mediante un enlace de tipo:

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Los puntos protonados de las partículas magnéticas ácidas (p) según la invención pueden acomplejarse por medio de dos compuestos de fórmula (I) de estructuras idénticas o diferentes.

Según un modo preferido, las partículas magnéticas (p) están acomplejadas por una o varias moléculas de dos compuestos de fórmula (I) de estructuras diferentes, principalmente de funciones X diferentes. Esto permite con ventaja el injerto ulterior de biovectores que poseen funciones susceptibles de reaccionar con funciones X diferentes.

Según un modo preferente, toda o parte de las funciones X del compuesto gem-bisfosfonato están acopladas a un biovector.

La invención se refiere así igualmente a una composición (utilizable como producto de contraste para IRM) que comprende una suspensión acuosa estable de de nanopartículas ácidas (p) de la cual al menos el 90% de los puntos protonados están acomplejados por uno o varios compuestos gem-bisfosfonatos idénticos o diferentes de fórmula (I):

(I)X-L-CH(PO_{3}H_{2})_{2}

en la que las funciones X están acopladas en todo o en parte al menos de un biovector.

Mediante la expresión "en todo o en parte", se entiende que todas las funciones X del compuesto gem-bisfosfonato no están necesariamente acopladas a un biovector, pero que el índice de acoplamiento es suficiente para que la especificidad de diagnóstico investigada se obtenga con el o los biovectores utilizados. Se precisa también que si se utilizan varios X y/o varios biovectores, los X y/o los biovectores pueden ser idénticos o diferentes.

La partícula vectorizada de este modo se escribe:

(III)(RAMA)_{r}-PARTÍCULA ÁCIDA

en la que r representa el número de ramas injertadas por partícula y RAMA definida por:

[((BIOVECTOR) - L_{3})_{s}-L-CH(PO_{3}H_{2})_{2}], siendo L_{3} un enlace covalente tal como se definió anteriormente resultante del acoplamiento de la función X del compuesto de fórmula (I) y del biovector, opcionalmente mediante un reactivo homobifuncional o heterobifuncional; s representa del número de biovectores acoplados por función X, y puede ser principalmente igual a 1, 2 ó 3.

Biovector

Por "biovector", en el sentido de la presente invención, se entiende preferentemente una entidad de reconocimiento específico (generalmente un ligando), es decir que posee una afinidad específica por un tejido y/o por un receptor biológico y/o un transportador y/o una matriz biológica dianas dadas.

Los pares de afinidades receptores/ligandos son múltiples y la invención tal como se define podrá ser aplicada fácilmente por un experto en la materia a diferentes ligandos susceptibles de formar un par de afinidad con un receptor diana tales como los pares anticuerpos/antígenos, lectinas/polisacáridos, biotina/avidina, ácidos nucleicos (cadena +
y -), debiendo entenderse que ligando puede estar acoplado por enlace covalente ya sea directamente en el extremo X del compuesto de fórmula (I) o indirectamente mediante un reactivo bifuncional.

Por extensión, en el sentido de la presente descripción, el término "biovector" puede comprender asimismo moléculas orgánicas que tienen actividad farmacológica y/o citotóxica, o más generalmente farmacóforos útiles en los procedimientos del tratamiento terapéutico o profiláctico.

El término "farmacóforo" comprende en el sentido de la presente invención moléculas orgánicas con actividad farmacológica y/o citotóxica, así como sus análogos estructurales, pudiendo estos últimos poseer o no una actividad farmacológica y/o citotóxica.

En el sentido de la presente descripción, un "biovector" designa por extensión moléculas biocompatibles que poseen un carácter hidrófilo marcado, tales como los aminoalcoholes.

A título de biovectores preferidos, se puede citar principalmente las proteínas opcionalmente recombinantes o mutadas, las glucoproteínas, las lectinas, la biotina, las vitaminas, los derivados pteroicos o los aminopteroicos, los derivados del ácido fólico y antifólico, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, los péptidos y sus derivados, los mono- o polisacáridos, la avidina, los inhibidores o sustratos de receptores (membranarios o nucleares), los fosfolípidos, los esteroides y sus análogos, los oligonucleótidos, las secuencias del ácido ribonucleicos, las secuencias del ácido desoxirribonucleico, las hormonas o sustancias análogas a las hormonas, los aminoácidos, las moléculas orgánicas con actividad farmacológica, los farmacóforos, las proteínas opcionalmente recombinantes o mutadas, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, los aminoalcoholes, los derivados de fosfolípidos, los farmacóforos; los derivados del ácido fólico y antifólico, siendo particularmente preferidos los agentes de reconocimiento de integrinas o de MMP.

Los biovectores, de los cuales principalmente los anticuerpos y los farmacóforos pueden estar opcionalmente funcionarizados de manera que puedan reaccionar con las funciones X y formar un enlace covalente con preferencia de tipo -CONH-, -COO-, -NHCO-, -OCO-, -NH-CS-NH-, -C-S-, -N-NH-CO-, -CO-NH-N-, -CH_{2}-NH-, -N-CH_{2}-, -N-CS-N-, -CO-CH_{2}-S-, -N-CO-CH_{2}-S-, -N-CO-CH_{2}-CH_{2}-S-, -CH=NH-NH-, -NH-NH=CH-, -CH=N-O-, -O-N=CH- o que responden a las fórmulas siguientes:

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La expresión "derivados del ácido fólico y derivados antifólicos" designa moléculas obtenidas por la funcionalización de por lo menos un grupo químico de folato o del ácido pteroico de manera que puedan formar un enlace covalente con las funciones X, en particular del tipo de los mencionados anteriormente. A título de ejemplo de funcionalización, se puede citar principalmente la eterificación de una función hidroxi, la esterificación o la acidificación de una función carboxilato, o la modificación y/o introducción de sustituyentes en el motivo estructural (2-amino-piridimínico) y más específicamente en el motivo estructural (2-amino-pirimidínico) presente en los derivados aminopterínico y pteroico. A título de ejemplos preferidos de derivados del folato, se pueden citar más específicamente los descritos en el artículo de M.P. Costi - Current Drug Targets (2001), vol. 2, págs. 135-166.

A título de ejemplos preferidos de derivados de "fosfolípidos", se pueden citar los derivados de fosfatidilserina, de fosfatidiletanolamina, de fosfatidilcolina, de fosfatidilinositol, de esfingomielina o los derivados de ceramidas, significando aquí el término "derivado" que las moléculas están funcionalizadas de manera que sean capaces de reaccionar covalentemente con las funciones X descritas anteriormente, principalmente con X = -COOH o -NH_{2}.

Por "derivado de péptido", se entiende, en el sentido de la presente descripción, un péptido resultante de aminoácidos naturales o no, cuya estructura natural se ha modificado químicamente por funcionalización de determinadas funciones químicas, de manera que el péptido resultante sea capaz de reaccionar covalentemente con las funciones X, por ejemplo por modificación de un enlace peptídico. A título indicativo, un derivado de péptido puede designar un polipéptido, un pseudo-péptido, un retropéptido, un péptido mimético, un péptido cíclico, péptidos inhibidores de enzimas, péptidos agonistas o péptidos antagonistas. A título de ejemplos preferidos, se pueden citar los péptidos funcionarizados, utilizados en Medicina nuclear (Referencia: S. Liu y D. Scott Edwards; Topics in Current Chemistry (2002), 222, págs. 259-278) y Okarvi, Nuclear Medicine Communication, 1999, 20: 1093-1112) y los inhibidores o sustratos de proteasas, en particular de metalproteasas.

Una clase específica de biovectores son las moléculas con fuerte hidrofilia tales como los aminoalcoholes o los aminopolietilenglicoles. Estos aminoalcoholes son particularmente útiles para obtener partículas magnéticas finales suficientemente hidrófilas desde el punto de vista de estabilidad acuosa y de biocompatibilidad, así como para modular la farmacocinética y la biodistribución.

Entre los aminoalcoholes, se prefiere específicamente los que responden a la fórmula (II) siguiente:

6

en la que R_{1} y R_{2} son idénticos o diferentes y representan una cadena hidrocarbonada alifática que comprende de 2 a 6 átomos de carbono, sustituida preferentemente por 6 a 10 grupos hidroxilo, o bien por 4 a 8 grupos hidroxilo en el caso en que R_{1} y/o R_{2} está interrumpido por un átomo de oxígeno.

En este ámbito, se prefieren generalmente los aminoalcoholes para los que R_{1} representa un grupo -(CH_{2})-
(CHOH)_{4}-CH_{2}OH o -(CH_{2})-CHOH-CH_{2}OH y R_{2} un grupo -CH_{2}(CHOH)_{4}-CH_{2}OH.

Entre los aminopolietilenglicoles, se prefiere particularmente los compuestos de fórmula (II) en la que R_{1} y R_{2}, idénticos o diferentes, representan H, un grupo alquilo o una cadena de polietilenglicol de fórmula-CH_{2}-(CH_{2}-O-
CH_{2})_{k}-CH_{2}OR_{3} en la que k varía entre 2 y 100, y R_{3} se elige entre H, alquilo o -(CO)Alk, designando el término "alquilo" o "alk" un grupo alifático hidrocarbonado, lineal o ramificado, que tiene alrededor de 1 a 6 átomos de carbono en la cadena.

Ejemplos de aminopolietilenglicoles son principalmente los compuestos O-(2-aminoetil)-O'-metilpolietilenglicol 1100, O-(2-aminoetil)-O'-metilpolietilenglicol 2000, O-(2-aminoetil)-O'-metilpolietilenglicol 750.

Según una variante particular de la invención, dado el caso, se acoplan biovectores de naturalezas diferentes mediante las funciones X a la superficie de partículas magnéticas (p). En este contexto, se prefiere muy específicamente acoplar en cada partícula magnética ácida (p) dos biovectores diferentes.

Según un modo específico, se realiza un acoplamiento "mixto" entre un aminoalcohol y un biovector de naturaleza diferente, es decir que presenta ya sea una afinidad específica por una diana dada o una actividad farmacológica y/o citotóxica, de manera que modifica la distribución del producto final.

Se prefiere que 1 a 100% de las funciones X de los compuestos gem-bisfosfonatos estén acoplados al menos a dos biovectores idénticos o diferentes. A título de ejemplo, el 30% de las funciones X pueden estar acopladas a un biovector B1, el 30% a un biovector B2 y el 30% acopladas a un biovector B3, siendo diferentes B1, B2 y B3.

Si puede considerarse acoplar el 100% de las funciones X presentadas en la superficie de las partículas magnéticas ácidas (p) a biovectores, se prefiere generalmente un rendimiento de acoplamiento que limite el aumento del tamaño hidrodinámico de la partícula final, permitiendo asegurar un reconocimiento específico eficaz.

Asimismo, según un modo de realización preferido de la invención, el 1 a 70%, principalmente del 1 al 50% de las funciones X de los compuestos de fórmula (I) están acopladas y principalmente cuando los biovectores son idénticos.

Según una variante asimismo preferida de la invención, en el caso en el que los biovectores sean diferentes, en particular cuando se trata de un aminoalcohol y de un biovector de naturaleza diferente, se acoplan entonces del 1 al 100% de las funciones X de los compuestos de fórmula (I).

De manera más general, un acoplamiento mixto puede ser utilizado por ejemplo con biovectores diferentes pero capaces de reconocer específicamente una misma patología, tales como los péptidos de secuencias diferentes capaces de reconocer diferentes metalproteasas (MMP) sobreexpresadas en una zona patológica cancerosa o cardiovascular.

Se describen ahora más exactamente diferentes biovectores, particularmente utilizables en el contexto de la invención en tres campos:

-

\vtcortauna A) cardiovascular

-

\vtcortauna B) oncología

-

\vtcortauna C) enfermedades inflamatorias y degenerativas

A) Campo cardiovascular y placa de ateroma en riesgo

Diferentes sistemas/mecanismos biológicos presentes en las enfermedades cardiovasculares principalmente las relacionadas con la placa de ateroma son dianas privilegiadas para los agentes de contraste o terapéuticos según la invención principalmente el sistema que hace intervenir a las metalproteasas (MMP), el sistema del trombo, el sistema de la anexina V.

Se sabe que las Matriz Melalproteinasas (MMP) o Matrixinas, son enzimas que poseen la propiedad de degradar los compuestos proteicos de la matriz extracelular. Esta matriz extracelular que rodea las células y los tejidos está constituida por proteínas como el colágeno. Las MMP han sido clasificadas en 3 grupos: las gelatinazas (colagenasas de tipo IV), las estromelisinas y las colagenasas intersticiales.

Las MMP se sobreexpresan en las placas de ateroma. En el campo cardiovascular, numerosos estudios indican que las MMP están implicadas en la remodelación de la matriz extracelular a nivel de la placa. Por lo que se refiere a las placas de ateromas, de manera no exhaustiva al menos ocho MMP están sobreexpresadas en éstas:

7

Las MMP1 y 3 están descritas principalmente en Johnson J. et al., Activation of Matrix-degrading Metalloproteinases by Mast Cell Proteases in Atherosclerotic Plaques, Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol. 1998; 18: 1707-1715.

La invención se refiere así a nanopartículas vectorizadas de fórmula (III) cuyo biovector es un agente capaz de inhibir al menos una MMP, principalmente un inhibidor de MMP, para aplicaciones en el campo cardiovascular. Según una realización preferida, el inhibidor es un derivado del illomastat o un péptido tal como el ejemplificado más adelante. Se preferirán también inhibidores de MMP seleccionados entre los descritos en Current Medicinal Chemistry, 2001, 8, 425-474; Chem. Rev., 1999, 99, 2735-2776. Se podrán utilizar principalmente inhibidores de MMP denominados TIMP recordados en DDT vol. 1, nº 1, enero de 1996, Elsevier Science, 16-17; Bioconjugate Chem., 2001, 12, 964-971.

Para el trombo, es sabido que:

-

\vtcortauna el receptor GpIIb/IIIa es expresado en las plaquetas activadas (se utiliza ya en terapéutica como diana de agentes antiplaquetarios);

-

\vtcortauna la fibrina está asociada a la trombosis.

Más exactamente, en lo que se refiere al trombo, se ha demostrado la intervención de las glucoproteinasas GpIIb/IIIa en las plaquetas activadas. Las plaquetas son fragmentos anucleados de megacariocitos de la médula ósea que desempeñan un papel principal en los procesos de aterosclerosis y de trombosis. Los medicamentos antiplaquetarios clásicos más utilizados son la aspirina, la ticlopidina y el clopidogrel. El conocimiento de los mecanismos moleculares que conducen a la agregación plaquetaria ha permitido el desarrollo de una nueva familia de moléculas dirigidas contra el receptor plaquetario del fibrinógeno, la integrina GPIIb/IIIa. La principal ventaja con relación a los antagonistas citados anteriormente es la de bloquear la etapa final de la activación de las plaquetas, independientemente de la vía de activación de las plaquetas. Siendo crítica la interacción plaqueta-plaqueta para la formación del trombo, la fijación del fibrinógeno (que forma puentes entre las plaquetas) en el complejo GP IIb/IIIa es un acontecimiento clave en la hemostasis y la trombosis. Cuando se activan las plaquetas, los receptores glucoproteicos GP IIb/IIIa que se encuentran en la superficie de las membranas de las plaquetas, experimentan una modificación de su configuración espacial y pueden fijar entonces moléculas de fibrinógeno soluble en el plasma y calcio. El fibrinógeno establece uniones entre las plaquetas mediante puentes Ca^{2+}-fibrinógeno que forman una red en la que van a estar aprisionados los hematíes. La trombina al transformar el fibrinógeno en fibrina vuelve a cerrar las mallas de esta red. Este agregado va a conducir a la formación de un trombo a nivel de la zona dañada. Se han realizado numerosos esfuerzos por consiguiente a fin de identificar en el receptor GP IIb/IIIa, los puntos de interacción de los ligandos. El complejo GP IIb/IIIa es un complejo heterodimérico glucoproteico membranario importante de las plaquetas (alrededor de 50.000 copias por plaqueta).

Se conocen al menos dos series de péptidos, que corresponden a secuencias de aminoácidos presentes de forma natural en el fibrinógeno humano, para inhibir la fijación de las macromoléculas adhesivas en el receptor GPIIb/IIIa: la secuencia Arg-Gly-Asp (RGD) y la cadena gamma Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val.

La secuencia Arg-Gly-Asp (RGD) se ha identificado inicialmente como la secuencia adhesiva de la fibronectina, integrina que representa una función importante en las interacciones plaquetas-plaquetas y plaquetas-vasos sanguíneos después de su liberación por las plaquetas. Esta secuencia está asimismo presente en el fibrinógeno, en el factor von Willebrand y en la vitronectina (función en la fibrinolisis y enlace en los vasos sanguíneos).

El complejo GPIIb/IIIa reconoce esta secuencia que inhibe la fijación de la fibronectina, del fibrinógeno, del factor de von Willebrand y la vitronectina en las plaquetas. Todos estos ligandos contienen al menos una secuencia RGD; mientras que el fibrinógeno contiene dos por media molécula. In vivo, el fibrinógeno es el principal ligando por el hecho de su fuerte concentración en el plasma.

La invención se refiere así a partículas vectorizadas (III):

-

\vtcortauna cuyo biovector es capaz de reconocer el receptor GpIIb/IIIa;

-

\vtcortauna cuyo biovector es capaz de reconocer la fibrina, principalmente por péptidos selectivos de monómeros de fibrina a fin de diferenciar la fibrina de la molécula soluble de fibrinógeno.

La invención se refiere en particular a productos (III) cuyo biovector comprende un motivo RGD, para aplicaciones cardiovasculares.

Se podrán utilizar, por ejemplo, péptidos descritos en las publicaciones WO 2001/9188, US 6 521 211, US 6 403 056, Seminars in nuclear medicine, 1990, 52-67, Nuclear Medicine and Radiology, 28, 2001, 515-526, el bibapcitida Acutect de la sociedad Diatide.

\vskip1.000000\baselineskip

B) Campo oncológico

El diagnóstico por imagen específico obtenido por la presente invención apunta a obtener según una realización un marcado de la neoangiogénesis, un reconocimiento específico de las células tumorales o de las alteraciones de la matriz extracelular, no obtenidos por las técnicas conocidas. Diferentes sistemas (o mecanismos) biológicos asociados al desarrollo tumoral son dianas privilegiadas para los agentes de contraste o terapéutico según la invención: haciendo intervenir el sistema compuestos capaces de unirse a receptores en los folatos, haciendo intervenir en el sistema las MMP, haciendo intervenir en el sistema factores de crecimiento implicados en la angiogénesis.

La invención se refiere según un modo de realización a productos (III) cuyo biovector es un derivado capaz de reconocer un receptor para folato, siendo este biovector capaz de dar lugar a un reconocimiento específico de las células tumorales. Se utilizará principalmente como BIOVECTOR de los derivados del folato de fórmula

\euro

que se escribe:

8

en la que:

a)

G_{1} se selecciona independientemente en el grupo constituido por: halo, R_{f} 2, O R_{f} 2, S R_{f} 3, N R_{f} 4 R_{f} 5; con preferencia G_{1} es NH_{2} u OH;

b)

G_{2} se selecciona independientemente en el grupo constituido por: halo, R_{f} 2, O R_{f} 2, S R_{f} 3, N R_{f} 4 R_{f} 5;

\newpage

c)

G_{3}, G_{4} representan grupos divalentes seleccionados independientemente en el grupo constituido por -(R_{f} 6') C=, -N=, -(R_{f} 6')C(R_{f} 7')-, -N(R_{f} 4')-;

\quad

con preferencia, G_{3} es -N= (ácido fólico) o -CH- (compuestos descritos más adelante: CB3717, raltitrexed, MAI) cuando el ciclo que comprende G_{3} es aromático, y G_{3} es -NH- o -CH_{2}- (compuestos descritos más adelante: AG-2034, lomotrexol) cuando el ciclo que comprende G_{3} no es aromático;

\quad

preferentemente, G_{4} es -CH- o -C(CH_{3})- cuando el ciclo que comprende G_{3} es aromático, y -CH_{2}- o -CH(CH_{3})- cuando el ciclo que comprende G_{3} no es aromático;

e)

G_{5} está ausente (compuesto pemetrexed) o seleccionado entre -(R_{f} 6') C=, -N=, -(R_{f} 6')C(R_{f} 7')-, -N(R_{f} 4')-;

f)

el ciclo J es un ciclo aromático heterocíclico o no con 5 ó 6 eslabones, pudiendo ser C, N, O, S los átomos del ciclo;

g)

G_{6} es N o C (compuesto descrito más adelante: 3-deaza-ICI-198.583);

h)

K_{1} y K_{2} se eligen independientemente en el grupo constituido por -C(Z_{f})-, -C(Z_{f})O-, -OC (Z_{f})-, -N(R_{f} 4'')-, -C(Z_{f})-N(R_{f} 4), -N(R_{f} 4'')-C(Z_{f}), -OC(Z)-N(R_{f} 4'')-, -N(R_{f} 4'')-C(Z_{f})-O-, N(R_{f} 4'')-C(Z_{f})-N(R_{f} 5'')-, -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R_{f} 4'')S(O)2-, -C(R_{f} 6'')(R_{f} 7'')-, -N(C = CH)-, -N(CH_{2}-C \equiv CH)-, alquilo C_{1}-C_{12} y alcoxi C_{1}-C_{12}; en los que Z_{f} es O o S; preferentemente K_{1} es -N(R_{f} 4'')- o -C(R_{f} 6'')(R_{f} 7'')- siendo H R_{f} 4'', R_{f} 6'', R_{f} 7''; estando A_{2} o no unido de manera covalente a un aminoácido;

i)

R_{f} 1 se selecciona en el grupo constituido por: H, halo, alquilo C_{1}-C_{12} y alcoxi C_{1}-C_{12}; R_{f} 2, R_{f} 3, R_{f} 4, R_{f} 4', R_{f} 4'', R_{f} 5, R_{f} 5''', R_{f} 6'' y R_{f} 7'' se seleccionan independientemente en el grupo constituido por: H, halo, alquilo C_{1}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{12}, alcanoílo C_{1}-C_{12}, alquenilo C_{1}-C_{12}, alquinilo C_{1}-C_{12}, (alcoxi C_{1}-C_{12})carbonilo y (alquil C_{1}-C_{12} amino)carbonilo;

j)

R_{f} 6 y R_{f} 7 se seleccionan independientemente en el grupo constituido por: H, halo, alquilo C_{1}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{12}; o R_{f} 6 y R_{f} 7 forman en conjunto O=;

k)

R_{f} 6' y R_{f} 7' se seleccionan independientemente en el grupo constituido por: H, halo, alquilo C_{1}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{12}; o R_{f} 6' y R_{f} 7' forman en conjunto O=;

l)

Lf es un enlace divalente que incluye dado el caso un aminoácido natural o un poliaminoácido natural, unido a K_{2} o a K_{1} por su grupo alfa-amino por un enlace amida;

m)

n, p, r y s son independientemente 0 ó 1.

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La fórmula (E) incluye las formas tautómeras, por ejemplo compuestos para los que G_{1} es OH, SH o NH.

Para los compuestos de la invención en los que al menos uno de los grupos K_{1}, K_{2}, R_{f} 1, R_{f} 2, R_{f} 3, R_{f} 4, R_{f} 4', R_{f} 4'', R_{f} 5, R_{f} 5'', R_{f} 6, R_{f} 7'', R_{f} 6, R_{f} 7, R_{f} 6' y R_{f} 7' comprenden un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, alcoxi, alquilamino, alcanoílo, alquenilo, alquinilo, alcoxicarbonilo, alquilamino carbonilo, el grupo comprende con preferencia 1 a 6 átomos de carbono (C_{1}-C_{6}), aún con preferencia 1 a 4 átomos de carbono (C_{1}-C_{4}).

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Por lo que se refiere a las MMP en el campo oncológico, se conoce que las MMP tienen dos funciones distintas:

a)

participan en la diseminación tumoral destruyendo la matriz extracelular;

b)

crean un medio que favorece el crecimiento y la angiogénesis de tumores primarios y metastasizados.

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Las MMP expresadas en los principales tumores humanos son principalmente las siguientes:

-

\vtcortauna cáncer de seno: MMP-1,2,3,7,9,11,13,14;

-

\vtcortauna cáncer colorrectal: MMP-1,2,3,7,9,11;

-

\vtcortauna cáncer de pulmón: MMP-2,3,7,9,11,14;

-

\vtcortauna cáncer de próstata: MMP-1,2,3,7,9.

\newpage

Existe una correlación frecuente entre el estado de evolución tumoral y el nivel de expresión de las MMP. En general, los tumores malignos expresan una mayor cantidad de MMP que los tumores benignos.

La invención se refiere así a productos (III) cuyo biovector es un inhibidor de MMP, para aplicaciones en el campo oncológico. Según las realizaciones preferidas, se utilizarán inhibidores seleccionados entre los descritos en Current Medicinal Chemistry, 2001, 8, 425-474; Chem. Rev., 1999, 99, 2735-2776. Se podrán utilizar principalmente inhibidores de MMP denominados TIMP recordados en DDT vol. 1, nº 1, enero de 1996, Elsevier Science, 16-17; Bioconjugate Chem., 2001, 12, 964-971.

En lo que se refiere a la angiogénesis, los estudios han demostrado que la angiogénesis es un factor pronóstico en diversos tumores, principalmente el cáncer de seno, de riñón, de próstata, de colon y de cerebro, así como en el melanoma.

La invención se refiere así a productos (III) cuyo vector es capaz de reconocer un marcador de angiogénesis.

Se ha demostrado que determinados factores de crecimiento endoteliales son específicos para los tumores. Las células endoteliales, que constituyen una pared interna de los vasos, no manifiestan ninguna tendencia natural a la proliferación en el adulto sano. Por el contrario, en situaciones patológicas, por ejemplo en el desarrollo de tumores o de la eclosión de metástasis, el aumento de las necesidades en oxígeno y en los aportes nutritivos son vehículos para un crecimiento de la irrigación local. Los tumores derivan así en su provecho una nueva red vascular, proceso conocido con el nombre de angiogénesis.

El factor de crecimiento de las células endoteliales vasculares (VEGF) es un factor de crecimiento angiógeno potente y selectivo. Actúa estimulando al menos tres receptores en la membrana extracelular: VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (Flk-1/-KDR) y NP-1. Los receptores en las VEGF pertenecen a la gran familia de los RTK (receptor de tirosina-cinasa). Estas proteínas de la familia de las integrinas poseen una zona extracelular capaz de unir los ligandos, un dominio transmembranario y una zona citoplásmica que lleva la actividad de tirosina cinasa. En el caso de las VEGFR, el dominio cinasa está interrumpido por una corta secuencia específica en cada receptor.

La invención se refiere así a productos (III) cuyo biovector es un agente capaz de unirse a receptores angiógenos presentes en la superficie de las células endoteliales.

Se podrán utilizar principalmente biovectores (principalmente péptidos obtenidos mediante la presentación del fago) descritos en los documentos WO 01/012809, WO 01/83693, WO 02/057299 (péptidos de 8 aminoácidos que reconocen a VEGFR3); Nuclear Medicine Communications (1999), 20, Pharmacological Review, 179, 206, 2000; Journal of Biological Chemistry, 2000, 275, 13588-13596; Journal of Biological Chemistry, 2002, 277, 45, 43137-43142; J. Mol. Biol., 2001, 316, 769-787; Biochemistry, 1998, 37, 17754-17772; Chem. J. Biochem. Mol. Biol., 2000, 16, 803-806. Se podrán utilizar principalmente (i) inhibidores de la actividad enzimática unidos a las VEGF tales como compuestos quinazolinas, aminotiazoles, antranilamida, (ii) compuestos antagonistas de VEGF, principalmente pequeñas moléculas tales como las dibenzotiofenonas y moléculas de los documentos JP2001-353075, JP2000-395413, anticuerpos. Se podrán utilizar también los biovectores del documento U.S. nº 6.610.269 que describe numerosos agentes de reconocimiento de receptores sobreexpresados en caso de angiogénesis.

Se sabe también que la integrina \alphav\beta3 está poco expresada en el sistema vascular pero está sobreexpresada en las células tumorales (glioblastoma en última fase, carcinoma de ovario, melanoma). La \alphav\beta3 toma parte en la angiogénesis en diferentes fases: la \alphav\beta3 regula la adhesión de las células endoteliales a la matriz, transmite señales a los núcleos de las células y es un receptor proangiogénico cooperando con el receptor del factor de crecimiento de las células endoteliales (VEGFR-2, flk). La \alphav\beta3, actuando con la metalproteinasa-1 de la membrana (MT1-MMP) es responsable de la activación de la metalproteinasa-2 de la matriz en la superficie de las células. El bloqueo de este receptor pero también de la \alphav\beta5 por péptidos RGD o por anticuerpos provoca la apoptosis de las células. La \alphav\beta3 como la \alphav\beta5 interviene sobre todo en la fase de proliferación de la angiogénesis. Numerosas proteínas de la matriz poseen una secuencia común: Arg-Gly-Asp (RGD señalada) que se ha identificado como el punto de interacción con determinadas integrinas. Un gran número de inhibidores de angiogénesis que comprende esta secuencia RGD han sido así desarrollados.

La invención se refiere también a productos (III) cuyo biovector es un péptido RGD apropiado para aplicaciones en oncología.

Para los péptidos RGD que reconocen la \alphav\beta3, los inventores prefieren biovectores que permiten inhibir la angiogénesis que presenta una fuerte afinidad por la \alphav\beta3 (a fin de impedir la fijación de las proteínas de la matriz) pero una débil afinidad por la \alphallb\beta3. En efecto, se ha demostrado que los antagonistas de la \alphallB\beta3 pueden provocar problemas de sangrado indeseables. Los inventores prefieren en particular antagonistas que tengan una secuencia peptídica RGD cíclica más estable frente a la degradación enzimática y una mayor afinidad y selectividad, manteniéndose la configuración del péptido en una posición privilegiada en razón de la restricción de las rotaciones.

Más exactamente, después de un análisis de la estructura la actividad de los péptidos RGD, los inventores prefieren muy particularmente, para estar en condiciones favorables en un mantenimiento de la afinidad por la \alphav\beta3, péptidos RGD cíclicos a fin de prevenir la degradación por las enzimas (exo- y endopeptidasa), con un ciclo bastante corto a fin de que sea más rígido (el ciclo con 5 es preferible a un ciclo con 6 aminoácidos), con un aminoácido de configuración D. La distancia entre los carbonos \beta del ácido aspártico y de la arginina es por lo general inferior a 6,6 \ring{A} para que tenga una selectividad más importante para la \alphav\beta3 que para la \alphallb\beta3 (cuyo zona es más grande que la de \alphav\beta3). Un aminoácido hidrófobo próximo al ácido aspártico favorece además una mejor selectividad. Dicha estructura es óptima para una buena exposición de las funciones hidrófobas e hidrófilas en la zona del receptor. Los inventores prefieren en particular el péptido ciclo(Arg-Gly-Asp-Dphe-Val) también denominado ciclo(RGDfV), las letras minúsculas indican una configuración D del aminoácido correspondiente. Presenta un IC_{50} de orden nanomolar (2 - 2,5 nM). Este péptido es particularmente interesante para la función amina lateral de la lisina que permite reaccionar con un derivado FR. Su síntesis está descrita en X. Dai, Z. Su, J.O. Liu; Tetrahedron Letters (2000), 41, págs. 6295-
6298.

9

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Permite el acoplamiento a las USPIO (partículas funcionalizadas) funcionalizadas principalmente con COOH, escuarato o isotiocianato. Los inventores han tenido que superar las dificultades técnicas relacionadas con la elección de protecciones de los aminoácidos, con la elección del medio de acoplamiento.

Se podrán utilizar también compuestos que presentan una configuración de flexibilidad restringida, estos péptidos tienen una buena afinidad y selectividad por \alphav\beta3:

-

\vtcortauna Péptidos cuyo motivo RGD está situado entre dos cisteínas, aumentando la actividad para la \alphav\beta3, por ejemplo (ciclo(CRGDC)).

-

\vtcortauna Péptidos cuyo grupo RGD no está en el ciclo sino encuadrado por dos ciclos de los cuales al menos uno de entre ellos estaba formado por un puente disulfuro entre 2 cisteínas (documento WO 02/26776).

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Se podrán utilizar también:

-

\vtcortauna biovectores polipéptidos seleccionados de manera tal que interactúan in vivo con al menos unas enzimas principalmente MMP, conduciendo esta interacción a un enlace más fuerte con una proteína diana;

-

\vtcortauna biovectores que comprenden un punto de escisión enzimática, implicando la escisión una modificación de configuración;

-

\vtcortauna biovectores derivados de anticuerpos como el LM609 (Nature Medicine, vol. 4, 5, de mayo de 1998, 623);

-

\vtcortauna biovectores que simulan los péptidos RGD que tienen una estructura de tipo quinolona o benzodiazepina.

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La invención se refiere también a productos (III) cuyo biovector es un péptido mimético del péptido RGD, apropiado para aplicaciones en oncología. Se podrán utilizar:

-

\vtcortauna péptidos con sustitución de uno o dos enlaces peptídicos por enlaces tioamidas (CSNH) o por grupos cetometileno (COCH_{2}) en la medida en que las sustituciones no produzcan cambio de configuración importante;

-

\vtcortauna péptidos (EMD 121974 denominado también Cilengitida: ciclo(RGDf-N(Me)V), que presentan una N-metilación de cada uno de los aminoácidos del péptido cíclico (RGDfV), presentando este péptido una afinidad muy fuerte (IC_{50} = 0,58 nM) y una selectividad muy importante (1.500 veces más importante que para la \alphallb\beta3);

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-

\vtcortauna péptidos que poseen la secuencia siguiente ciclo(Xaa-Yaa-GD-Mamb), siendo el grupo Mamb el ácido N-amino-metil benzoico. Se demuestra que los DXaa-N-MeArg son antagonistas muy activos del \alphallb\beta3 mientras que los antagonistas LXaa-Arg son selectivos del \alphav\beta3;

11

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-

\vtcortauna presentando el péptido cíclico (RGDD(tBuG)Mamb) una afinidad muy importante por el \alphav\beta3 (IC_{50} = 0,6 nM contra 14 \muM para \alphallb\beta3) debido al carácter hidrófobo del aminoácido próximo al ácido aspártico y al grupo Mamb que hace al péptido menos flexible en solución acuosa;

-

\vtcortauna poseyendo el péptido XJ735 (DUPONT) el grupo: ciclo(ARGD-Mamb). Éste permite inhibir la fijación del fibrinógeno al receptor \alphav\beta3 (IC_{50} = 70 nM) pero no bloquea las otras integrinas (\alphav\beta5, \alpha5\beta1);

-

\vtcortauna péptidos obtenidos introduciendo diferentes grupos en lugar de Dphe-Val (o fV) en el péptido de referencia RGDfV.

12

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Estos grupos han sido sintetizados para simular el replegamiento \betaII' pero también para reducir la flexibilidad en la zona de rotación y. El agente más activo es el ciclo(RGD-(R)-ANC) (IC_{50} = 0,8 nM). Se puede introducir también allí azúcares X en lugar de estos dos aminoácidos (fv) en la secuencia ciclo (RGDX) (Lohof E. et al.; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (2000), 39 (15), págs. 2761-2764);

-

\vtcortauna péptidos con introducción de un doble enlace en el ciclo (Kawaguchi, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications (2001), 288(3), págs. 711-717);

13

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-

\vtcortauna péptidos descritos en Chemlibrary.bri.nrc.ca.

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La invención se refiere también a productos (III) cuyo biovector es una molécula no peptídica, que reconoce la integrina \alphav\beta3, apropiada para aplicaciones en oncología. Se podrán utilizar los compuestos de la tabla siguiente, cuya afinidad nanomolar está demostrada.

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14

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Y otros compuestos del documento WO 01/97861

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16

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y otros compuestos del documento WO 9952896

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y otros compuestos del documento Lohof et al., Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 2000, 39(15), págs. 2761-2764

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19

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y otros compuestos a base de acetiltiofeno del documento WO 0000486,

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20

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(y los compuestos SG256, SM256, XJ735 de DuPont Pharmaceuticals)

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21

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y análogos del documento WO 0003973

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y otros compuestos con el grupo pirrotina.

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Se podrán utilizar también los biovectores citados en los documentos U.S. 6.537.520 (biovectores que reconocen a \alphav\beta3 sobreexpresado en el momento de la angiogénesis) y WO 198294 (núcleo indazol). En determinados casos se podrán utilizar varios biovectores diferentes en un mismo compuesto para aumentar las probabilidades de alcanzar una misma diana, por ejemplo un péptido RGD y una benzadiazepina para el \alphav\beta3. Además de los biovectores de tipo RGD o equivalentes funcionales citados anteriormente, se podrán utilizar los compuestos inhibidores de MMP siguientes, sabiendo que la descripción detallada da protocolos experimentales que permiten finalizar un reconocimiento in vitro o in vivo:

-

\vtcortauna péptidos, peptidomiméticos, no péptidos funcionalmente equivalentes, eficaces en el plano de diagnóstico o terapéutico, seleccionados entre los inhibidores comercializados, principalmente en los catálogos 2002 de Bachem, Amersham;

-

\vtcortauna inhibidores descritos en los documentos WO 01/60416, WO 01/60820, WO 2001/92244, EP 558.635, EP 663.823;

\newpage

-

\vtcortauna inhibidores de tipo hidroxamatos, pirrolidinas hidroxamatos, hidroxamatos bicíclicos, hidroxamatos de ciclobutilo, hidroxamatos de succinilo, hidroxamatos de sulfonamidas, hidroxamatos de alanina, tales como los descritos en los documentos EP 793.641, EP 766.665, EP 740.655, EP 689.538, EP 575.844, EP 634.998, WO 99/29667, EP 965.592, EP 922.702, WO 99/52889, WO 99/42443, WO 01/60416 (Dupont; en particular las fórmulas Ia y Ib);

-

\vtcortauna inhibidores a base del ácido fosfínico tales como los descritos en los documentos EP 725.075, U.S. nº 5.679.700, WO 98/03516, EP 716086, WO 2000 74681, WO 2000 04030;

-

\vtcortauna inhibidores a base de imidas cíclicas (documento US nº 5.854.275);

-

\vtcortauna inhibidores a base de sulfonamidas tricíclicas (documento WO 2000 06561);

-

\vtcortauna inhibidores a base de ácido oxobutírico;

-

\vtcortauna derivados de TIMPS (Bioconjugate Chem., 2001, 12, 964-971).

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Siempre en el campo oncológico, los compuestos (III) cuyo biovector es a base de fosfonatos o de bisfosfonatos son muy útiles para el cáncer de los tejidos óseos. Estos compuestos son también útiles para enfermedades asociadas a problemas óseos, debidas a problemas de inmunidad (enfermedades autoinmunitarias como la artritis reumatoide), a enfermedades metabólicas (osteoporosis...), a enfermedades infecciosas.

En estos compuestos, el biovector es, por ejemplo, un biovector descrito en el documento WO 02/062398. Se puede utilizar también un bisfosfonato descrito en las patentes U.S. nº 6.534.488 y U.S. nº 6.509.324, un bisfosfonato comercializado tal como etidronato, clodronato, pamidronato, alendronato, ibandronato, YH 592, EB-1053 y análogos.

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C) Campo de las enfermedades inflamatorias y degenerativas

Se reconocerán principalmente biovectores ligandos de receptores localizados en los macrófagos tales como los receptores SRA (Scavenger Receptor), los receptores Fc (documento U.S. nº 2002/58284).

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La evolución de la aterosclerosis implica la captación de las LDL después de su oxidación a nivel de las placas. La fagocitosis de estas LDL oxidadas por los macrófagos está mediada por un conjunto de receptores reagrupados bajo la denominación de receptores carroñeros o necrófagos (SR). Esta familia de proteínas membranarias desempeña por consiguiente una función principal en la transformación progresiva de los macrófagos en células espumosas. Los SR son proteínas de la superficie membranaria capaces de fijar las células senescentes así como las lipoproteínas modificadas química o biológicamente. Los principales grupos de SR se clasifican en diferentes clases:

1/ Los SR de clase A: tipo I, tipo II y MARCO

2/ Los SR de clase B: tipo I, tipo II y CD36

3/ Los SR de clase D: CD68

4/ Los SR de clase E y F "lectinoides": LOX-1

5/ Los SR recientes no clasificados: SR-PSOX.

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Como se recordó en el documento U.S. A 2002/0127181 y en De Winther et al., ATVB 2000; 20: 290-297; Kunjathoor et al., J. Biol. Chem. 2002; 277: 49982-49988, el receptor SRA es sobreexpresado por los macrófagos en enfermedades cardiovasculares (aterosclerosis, placa de ateroma, enfermedad de arterias coronarias, trombosis, isquemia, infarto de miocardio...). La utilización de productos según la invención para el reconocimiento de SRA asociado a estas patologías forma parte de la invención.

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La invención abarca así igualmente, para el diagnóstico y/o el tratamiento de enfermedades inflamatorias, partículas acomplejadas por compuestos de fórmula (I) asociados:

1)

a biovectores que reconocen el SR, principalmente:

1a)

los biovectores descritos en los documentos U.S. nº 6.255.298, U.S. nº 6.458.845, WO 00/06147 y WO 00/03704;

1b)

lipoproteínas modificadas principalmente de LDL acetilados (acLDL; Gurudutta et al., Nucl. Med. Biol. 2001 28:235-24) y óxidos de LDL (oxLDL);

1c)

ligandos AcLDL, OxLDL, LPS descritos en Esbach et al., Hepatology, 1993, 18: 537; De Rijke et al., J. Biol. Chem. 1994, 269: 824; Van Oosten et al., Infect. Immun. 1998, 66: 5107; Bijsterbosch et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25: 3290; Biessen et al., Mol. Pharmacol. 53: 262, 1998

1d)

péptidos reconocidos por la presentación del fago capaces de unirse al receptor SR-AI;

2)

a biovectores que reconocen receptores en los folatos (estos receptores en los folatos están sobreexpresados en los macrófagos activados) para una utilización en estas patologías que implican una activación de macrófagos;

3)

a péptidos de reconocimiento de placas amiloides que implican principalmente a la enfermedad de Alzheimer (por ejemplo descritos en los documentos WO 01/74374, U.S. nº 6.329.531);

4)

a biovectores de tipo CSF (GCSF, GM-CSF...) descritos por ejemplo en la patente U.S. nº 6.491.893;

5)

a anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que reconocen receptores sobreexpresados en los macrófagos (CD68, MRP8-14...).

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En el campo de las enfermedades inflamatorias, los inventores han utilizado en particular como biovector la fosfatidilserina o un derivado de la fosfatidilserina, para una utilización en el diagnóstico de enfermedades ligadas a macrófagos.

La fosfatidilserina (PS) es un fosfolípido membranario, principalmente localizado en la cara interna de la célula del lado citoplásmico. Su carga global negativa estabiliza su polaridad y la impide difundirse a través de la membrana plásmica. La PS sirve de señal de reconocimiento para el macrófago. La naturaleza de esta señal permanece todavía desconocida (reconocimiento directo, densidad de cargas, receptores múltiples, receptor único inducible). Según los últimos trabajos publicados, se trataría de una interacción directa PS y receptor a la PS (PSR) tras la inducción de este receptor en la superficie de determinados macrófagos presentes en la zona en ruptura de la homeostasia. En determinadas células macrofágicas, la PS interactúa igualmente con los secuestrantes receptores por su punto de unión a los fosfolípidos aniónicos. La PS se expresa a nivel de la cara interna de la membrana de todas las células viables. En caso de dolencia celular o al principio del proceso apoptósico, una translocasa membranaria provoca una oscilación de la PS en la cara extracelular de la célula. Esta expresión extracelular constituye una señal de reconocimiento para los macrófagos que reconocen y fagocitan la célula en espera evitando así una inflamación
local.

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Los inventores han preparado un agente de contraste ligado a la PS o derivado, destinado a ser captado activamente por los macrófagos a fin de diagnosticar por imagen estas diversas patologías. Varias dificultades técnicas químicas se han superado, a fin de preparar los biovectores PS siguientes, estando el quelato acoplado en la función NH_{2} libre:

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25

A fin de controlar perfectamente la estructura de los productos finales, ha sido necesario preparar derivados de PS correctamente funcionalizados. La presencia de un resto aminoácido sobre la parte polar de la PS es una fuente de dificultades complementarias que ha sido preciso manejar practicando una química de protección/desprotección de las funciones amina y ácido libres utilizando métodos químicos compatibles con estas funciones. Los grupos protectores del resto aminoácido son los grupos clásicos utilizados en la química de los aminoácidos (Boc, tBu, Z, Bn...). Las funciones preferidas para asegurar el enlace entre la PS y la partícula superparamagnética son NH_{2}, COOH,
SH.

Los inventores han preparado además productos vectorizados en los que la fosfatidilserina está desprovista de al menos una de las cadenas grasas, no estando la afinidad alterada de manera inoportuna.

Además de estos ya citados anteriormente en la presente solicitud en los campos, se podrán utilizar también:

1)

Los biovectores descritos en los documentos WO 01/97850 (que reconocen receptores VEGF y angiopoyetina), U.S. nº 6.372.194 (polímero tal como la polihistidina), WO 2001/9188 (polipéptido que reconoce la fibrina), WO 01/77145 (péptido de reconocimiento de integrinas), WO 02/26776 (péptido de reconocimiento de la integrina \alphav\beta3), WO 03/062198 (péptidos de reconocimiento de metalproteasas MMP), WO 99/40947 (péptidos que reconocen por ejemplo el receptor KDR/Flk-I cuyo R-X-K-X-H y R-X-K-X-H, o los receptores Tie-1 e 2), WO 02062810 y Müller et al., Eur. J. Org. Chem., 2002, 3966-3973 (glucósidos de sialil Lewis), WO 02/40060 (antioxidantes tales como el ácido ascórbico), U.S. nº 6.524.554 (reconocimiento de la tuftsina), WO 02/094873 (reconocimiento de receptores en la proteína G GPCR, en particular la colecistoquinina), U.S. nº 6.489.333 (asociación antagonista de integrina y símil de la guanidina), U.S. nº 6.511.648 (quinolona que reconoce a \alphav\beta3 o 5), U.S. A 2002/0106325, WO 01/97861 (benzodiazepinas y análogos que reconocen integrinas), biovector de reconocimiento de integrina tal como \alpha5\beta1, WO 01/98294 (imidazoles y análogos), WO 01/60416 (inhibidores de MMP, principalmente de hidroxamatos), WO 02/081497 (péptidos de reconocimiento de \alphav\beta3 tales como RGDWXE), WO 01/10450 (péptidos RGD), U.S. nº 6.261.535 (anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (FGF, TGFb, GV39, GV97, ELAM, VCAM, induccible por TNF o IL), U.S. nº 5.707.605 (molécula de reconocimiento modificada por interacción con su diana), WO 02/28441 (agentes de reconocimiento de depósitos amiloides), WO 02/056670 (péptidos escindidos catepsinas), U.S. nº 6.410.695 (mitoxantrona o quinona), U.S. nº 6.391.280 (polipéptidos que reconocen células epiteliales, U.S. nº 6.491.893 (GCSF), U.S. nº 2002/0128553, WO 02/054088, WO 02/32292, WO 02/38546, WO 2003/6059, U.S. nº 6.534.038, WO 99/54317 (inhibidores de cisteínas proteasas), WO 01/77102, EP 1.121.377, Pharmacological Reviews (52, nº 2, 179; factores de crecimiento PDGF, EGF, FGF...), Topics in Current Chemistry (222, W. Krause, Springer), Bioorganic & Medicinal Chemistry (11, 2003, 1319-1341; derivados tetrahidrobenzazepinonas que reconocen a \alphav\beta3).

2)

Los inhibidores de angiogénesis, principalmente los probados en ensayos clínicos o ya comercializados, principalmente:

-

\vtcortauna los inhibidores de angiogénesis que implican receptores FGFR o VEGFR tales como SU101, SU5416, SU6668, ZD4190, PTK787, ZK225846, compuestos azaciclos (documentos WO 00244156, WO 02059110);

-

\vtcortauna los inhibidores de angiogénesis que implican a MMP tales como el BB25-16 (marimastat), el AG3340 (prinomastat), el solimastat, el BAY12-9566, el BMS275291, el metastat, el neovastat;

-

\vtcortauna los inhibidores de angiogénesis que implican integrinas tales como el SM256, el SG545, moléculas de adhesión que bloquean el EC-ECM (tales como el EMD 121-974 o la vitaxina);

-

\vtcortauna medicamentos con mecanismo de actuación contra la angiogénesis más indirecto tales como el carboxiamidotriazol, el TNF470, la escualamina, el ZD0101;

-

\vtcortauna los inhibidores descritos en el documento WO 99/40947, los anticuerpos monoclonales muy selectivos para el enlace al receptor KDR, los análogos de la somatostatina (WO 94/00489), los péptidos de enlace a la selectina de reconocimiento de VEGF descritos en Nuclear Medicine Communications, 1999, 20;

-

\vtcortauna los péptidos inhibidores del documento WO 02/066512.

3)

Biovectores capaces de reconocer receptores: CD36, EPAS-1, ARNT, NHE3, Tie-1, 1/KDR, Fit-1, Tek, neuropilina-1, endoglina, pleyentropina, endosialina, Axl., alPi, a2ssl, a4P1, a5pl, eph B4 (efrina), receptor laminina A, receptor neutrofilina 65, receptor leptina OB-RP, receptor quimionina CXCR-4 (y otros receptores citados en el documento WO 99/40947), LHRH, bombesina/GRP, receptores gastrina, VIP, CCK, Tln4.

4)

Biovectores de tipo inhibidores de tirosina cinasa.

5)

Los inhibidores del receptor GPIIb/IIIa conocidos, seleccionados entre:

(1)

el fragmento fab de un anticuerpo monoclonal del receptor GPIIb/IIIa, Abciximab (ReoPro^{TM}),

(2)

las pequeñas moléculas pepdíticas y peptidomiméticas inyectadas por vía intravenosa tales como la eptifibatida (Integrilina^{TM}) y el tirofiban (Aggratat^{TM}).

6)

Péptidos antagonistas de receptores al fibrinógeno (documento EP 425 212), péptidos ligandos de receptores IIb/IIIa, ligandos del fibrinógeno, ligandos de la trombina, péptidos capaces de reconocer la placa de ateroma, las plaquetas, la fibrina, péptidos a base de hirudina, derivados a base de guanina que reconocen el receptor IIb/IIIa.

7)

Otros biovectores o fragmentos biológicamente activos de biovectores conocidos por el experto en la materia como medicamentos, una acción antitrombótica, antiagregación plaquetaria, antiaterosclerótica, antiestenótica, anticoagulante.

8)

Otros biovectores o fragmentos biológicamente activos de biovectores que reconocen a \alphav\beta3, descritos en asociación con los DOTA en la patente U.S. nº 6.537.520, seleccionados entre los siguientes: mitomicina, tretinoína, ribomustina, gemcitabina, vincristina, etopósido, cladribina, mitobronitol, metotrexato, doxorrubicina, carbocuona, pentostatina, nitracrina, zinostatina, cetrorelix, letrozol, raltitrexed, daunorrubicina, fadrozol, fotemustina, timalfasina, sobuzoxano, nedaplatino, citarabina, bicalutamida, vinorelbina, vesnarinona, aminoglutetimida, amsacrina, proglumida, acetato de eliptinio, cetanserina, doxifluridina, etretinato, isotretinoína, estreptozocina, nimustina, vindesina, flutamida, drogenil, butocin, carmofur, razoxano, sizolilano, carboplatino, mitolactol, tegafur, ifosfamida, prednimustina, picibanilo, levamisol, tenipósido, improsulfán, enocitabina, lisurita, oximetolona, tamoxifeno, progesterona, mepitiostano, epitiostanol, formestano, interferón-alfa, interferón-2 alfa, interferón-beta, interferón-gamma, factor-1 estimulante de colonias, factor-2 estimulante de colonias, denileucin diftitox, interleucina-2, factor de liberación de la hormona leutinizante.

9)

Determinados biovectores que reconocen tipos particulares de cánceres, por ejemplo los péptidos que reconocen el receptor ST asociado al cáncer colorrectal o el receptor taquiquinina.

10)

los biovectores que utilizan compuestos de tipo fosfinas.

11)

los biovectores de reconocimiento de P-selectina, E-selectina; por ejemplo el péptido de 8 aminoácidos descrito por Morikawa et al., 1996, 951, así como diferentes azúcares.

12)

la anexina V o biovectores que reconocen los procesos apoptósicos.

13)

cualquier péptido obtenido por tecnologías de reconocimiento tales como la presentación del fago, modificado eventualmente por aminoácidos no naturales (http//chemlibrary.bri.nrc.ca), por ejemplo péptidos resultantes de bancos de presentación de fago: RGD, NGR, CRRETAWAC, KGD, RGD-4C, XXXY*XXX, RPLPP, APPLPPR.

14)

otros biovectores peptídicos conocidos de reconocimiento de placas de ateroma citados principalmente en el documento WO 2003/014145.

15)

vitaminas.

16)

ligandos de receptores hormonales como las hormonas y los esteroides.

17)

biovectores que reconocen receptores opioides.

18)

biovectores que reconocen receptores TKI.

19)

antagonistas LB4 y VnR.

20)

compuestos nitriimidazoles y bencilguanidinas.

21)

biovectores recordados en Topics in Current Chemistry, vol. 222, 260-274, Fundamentals of Receptor-based Diagnostic Metallopharmaceuticals, principalmente:

-

\vtcortauna biovectores de reconocimiento de receptores peptídicos sobreexpresados en los tumores (receptores LHRH, bombesina/GRP, receptores VIP, receptores CCK, receptores taquiquinina por ejemplo), principalmente los análogos de somatostatina o de bombesina, péptidos derivados de octreotida opcionalmente glucosilados, los péptidos VIP, los alfa-MSH, los péptidos CCK-B;

-

\vtcortauna péptidos seleccionados entre: péptidos cíclicos RGD, cadena alfa de fibrina, CSVTCR, tuftsina, fMLF, YIGSR (receptor:laminina).

22)

oligosacáridos, polisacáridos y derivados de osas, derivados que reconocen a Glu.

23)

biovectores utilizados por los productos de tipo smart.

24)

marcadores de la viabilidad miocárdica (tetrofosmina y hexakis2metoxi-2-metilpropilisonitrilo).

25)

trazadores del metabolismo de los azúcares y de las grasas.

26)

ligandos de receptores de neurotransmisores (receptores D, 5HT, Ach, GABA, NA).

27)

oligonucleótidos.

28)

el factor tisular.

29)

biovectores descritos en el documento WO 03/20701, en particular el PK11195 ligando del receptor periférico en las benzodiazepinas.

30)

péptidos que unen la fibrina, principalmente las secuencias peptídicas descritas en el documento WO 03/11115.

31)

inhibidores de agregación de placas amiloides descritos en el documento WO 02/085903.

32)

un biovector de tipo fluorocromo utilizable en diagnóstico óptico por imagen.

Dado el caso, se hará variar la longitud del enlazador L del compuesto (I) para optimizar la biodistribución del compuesto (III) y/o favorecer su reconocimiento específico por la diana biológica.

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Partículas finales

En el ámbito de la invención, se da prioridad principalmente a las partículas finales, acomplejadas y opcionalmente acopladas al o a los biovector(es) cuyo diámetro hidrodinámico global está comprendido entre 5 nm y 200 nm, con preferencia comprendidos entre 5 y 60 nm.

Las composiciones de partículas magnéticas (p), opcionalmente acopladas a los biovectores están generalmente en forma de suspensión acuosa, opcionalmente en presencia de un disolvente orgánico miscible en el agua tal como el DMSO, la acetona o el metanol, siendo particularmente preferidas las suspensiones biocompatibles.

Según una variante privilegiada de la invención, las composiciones de partículas magnéticas ácidas (p) acomplejadas y opcionalmente acopladas a biovectores que comprenden uno o varios vehículo(s) y/o aditivo(s) farmacéuticamente aceptables. En este ámbito, son particularmente preferidas las composiciones estériles.

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Procedimiento de preparación de partículas

Según otro aspecto, la invención tiene por objeto un procedimiento de preparación de nanopartículas magnéticas (p) ácidas de las que al menos el 90% de puntos protonados están acomplejados por uno o varios compuestos gem-bisfosfonatos idénticos o diferentes de fórmula (I), siendo susceptibles las funciones X de estar acopladas a al menos un biovector, comprendiendo dicho procedimiento la puesta en contacto de una solución ácida de partículas magnéticas ácidas (p) a base de un compuesto de hierro, con compuestos de fórmula (I) tales como los definidos anteriormente en cantidad suficiente y la recuperación de las partículas acomplejadas obtenidas.

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Según otro aspecto, la invención tiene por objeto un procedimiento de preparación de una composición de nanopartículas magnéticas acomplejadas por compuestos (I) y recubiertas de biovectores, que comprende etapas sucesivas consistentes en:

i)

poner en contacto una solución ácida de partículas magnéticas ácidas (p) a base de un compuesto de hierro con compuestos de fórmula (I) tales como los definidos anteriormente en cantidad suficiente, y recuperación de las partículas acomplejadas obtenidas;

ii)

realizar el acoplamiento de todas o parte de las funciones X de los compuestos de fórmula (I) acomplejados en la superficie de partículas magnéticas (p) con biovectores.

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Preferentemente, la etapa i) comprende las etapas i.1) e i.2) siguientes:

i.1)

preparar una solución ácidas de partículas magnéticas ácidas (p) a base de un compuesto de hierro;

i.2)

poner en contacto la solución de i.1) con compuestos de fórmula (I) tales como los definidos anteriormente en cantidad suficiente, y recuperación de las partículas acomplejadas obtenidas.

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Según una forma de realización preferida del procedimiento según la invención, el ácido ferrofluido ejecutado en la etapa i) comprende partículas magnéticas a base de ferrita, con preferencia de maghemita o de magnetita.

Generalmente, la etapa i) se realiza en medio acuoso, opcionalmente en presencia de un disolvente miscible en el agua, tal como el DMSO, la acetona o el metanol, a un pH ácido, con preferencia a un pH de 1 a 3.

Sin querer limitarse a cualquier teoría, en la etapa de acomplejado de partículas magnéticas (p), los puntos inicialmente protonados de las partículas magnéticas (p) interactúan con la extremidad gem-bisfosfonato de los compuestos de fórmula (I) mediante la expulsión de protones tal como se describe principalmente en la publicación de N. Fauconnier et al.: Prog. Colloid Polym. Sci. (1996), 100, págs. 212-216. Los puntos protonados de las partículas magnéticas ácidas (p) pueden considerarse por consiguiente como "puntos de anclaje a las zonas de fijación" de las funciones gem-bisfosfonatos de los compuestos de fórmula (I) en la superficie de la partícula magnética.

Según un modo de realización particularmente preferido, se opera en presencia de una cantidad que va de 1 a 3 equivalentes molares en relación con el número de moles de los puntos hidroxilos protonados en la superficie de la partícula (p), de manera que se acompleja al menos el 70% y, con preferencia, más del 90% de los puntos protonados de la partícula magnética (p). Esto representa, en general, alrededor de 400 a 200 compuestos de fórmula (I) por partícula según el tamaño de ésta, siendo el número de puntos protonados en la superficie proporcional a la superficie de la partícula magnética ácida (p).

De manera ventajosa, la evaluación del índice de injerto que define la relación del número de moles de los compuestos de fórmula (I) al número de moles de puntos protonados de la partícula magnética ácida (p) puede determinarse fácilmente por métodos convencionales tales como el análisis elemental C, P, Fe. En efecto, la partícula magnética ácida (p) que tiene injerto del compuesto (I) no implica ningún átomo de fósforo ni de carbono. Ahora bien, después del injerto de los compuestos (I) a la superficie de la partícula, la determinación de la relación fósforo/hierro permite conocer el número de moles del compuesto (I) injertado en la partícula magnética ácida
(p).

Además, el número de puntos protonados para la partícula magnética es accesible según las técnicas clásicas conocidas por el experto en la materia, tal como la conductimetría y las dosis ácido-básicas.

Mediante estas herramientas analíticas, es posible ajustar la cantidad de compuesto de fórmula (I) en función del índice de injerto que se desea obtener al final.

Ventajosamente, este procedimiento permite por consiguiente controlar el injerto de la partícula magnética (p) mediante los compuestos de fórmula (I).

Contra toda expectativa, de manera particularmente ventajosa con relación a la técnica anterior que no utilizaba partículas ácidas, los inventores han demostrado más que, contrariamente al caso de un injerto en partículas alcalinas, la partícula magnética ácida (p) injertada de compuestos de fórmula (I) es muy a menudo estable en la gama de pH que va de 3 a 12, y principalmente al pH fisiológico, lo que constituye una ventaja principal para realizar el acoplamiento ulterior de biovectores, principalmente proteínas o anticuerpos sin degradarlos ni desnaturalizarlos. Esta propiedad no era evidente cuando se sabía que, de manera general, el injerto de un agente acomplejante, cualquiera que sea, en la superficie de una partícula modifica la carga superficial de las partículas y por consiguiente su zona de estabilidad en función del pH y de la fuerza iónica.

De manera inesperada, los inventores han observado además una selectividad muy buena entre la función gem-bisfosfonato y la función reactiva X: solamente las funciones gem-bisfosfonatos están acomplejadas en la superficie de la partícula magnética.

Ventajosamente, al contrario que en la técnica anterior, el aislamiento de las partículas magnéticas acomplejadas no requiere etapas de purificaciones laboriosas, por ejemplo por diálisis o tratamiento en una resina.

Tras el acomplejamiento, las partículas magnéticas ácidas (p) acomplejadas por los compuestos de fórmula (I) forman un floculado que puede ser, según un modo preferencial, aislado del medio de reacción mediante una simple decantación magnética.

Antes de la etapa (ii), se procede con preferencia a varios lavados en el agua del floculado recuperado de manera que se eliminen los compuestos de fórmula (I) en exceso que no hayan reaccionado.

Como resultado de la etapa (i), el floculado recuperado se pone generalmente en suspensión en una solución acuosa de pH comprendida entre 6 y 7, conduciendo esto a la degradación del floculado (peptización) y a la obtención de una solución coloidal.

Según una forma de realización preferida, se realiza previamete una etapa que consiste en poner en suspensión el floculado formado en la etapa (i) en la solución acuosa de pH básico comprendido entre 10 y 11, teniendo que volver a un pH comprendido entre 6 y 7. Este tratamiento a pH básico apunta, en efecto, a reforzar el enlace del compuesto gem-bisfosfonato en la superficie de la partícula magnética ácida (p).

Según un aspecto ventajoso, las partículas magnéticas ácidas (p) acomplejadas por los compuestos gem-bisfosfonatos, obtenidos como resultado de la etapa (i) están muy poco dispersadas y presentan un perfil en "tamaño hidrodinámico" muy próximo al del ferrofluido ácido de partida. Esta etapa de acomplejamiento no implica por consiguiente ningún fenómeno de agregación, lo que permite franquear cualquier etapa de filtración complementaria.

Según otro aspecto ventajoso, las partículas magnéticas acomplejadas por los compuestos gem-bisfosfonatos se obtienen con muy buenos rendimientos en hierro, generalmente comprendidos entre 70 y 95%.

Las partículas magnéticas ácidas (p) injertadas por compuestos de fórmula (I) son ventajosamente estables al pH fisiológico en presencia, opcionalmente, de un disolvente, lo que permite realizar el acomplamiento de biovectores directamente en medio ferrofluido.

La técnica anterior no sugeriría de ninguna manera injertar compuestos gem-bisfosfonatos en partículas ácidas.

Según otro aspecto ventajoso, la función reactiva X del compuesto de fórmula (I) injertada en la superficie de la partícula posee una reactividad muy buena frente a los biovectores, y permite obtener rendimientos de acoplamiento elevados. Esto permite por consiguiente disminuir las pérdidas en biovectores utilizados y disminuir también el coste de la partícula magnética específica obtenida al final.

Otro aspecto particularmente ventajoso es la determinación de la tasa de acomplamiento del biovector en la partícula magnética (p) injertada por los compuestos de fórmula (I). En efecto, la composición determinada por análisis elemental (C, P, Fe) de la partícula magnética (p) injertada por los compuestos de fórmula (I) permite conocer exactamente la relación fósforo/hierro y el análisis elemental de la partículas finales sobre las que está injertado un biovector permite de la misma manera determinar la relación nitrógeno/fósforo o carbono/fósforo, lo que permite calcular el número de biovectores en cada partícula. Este tipo de análisis es totalmente imposible en las partículas magnéticas obtenidas por síntesis denominada "de Molday" recubiertas con polímeros como el dextrano sobre las que se han injertado moléculas de afinidad específica, a causa del carácter polidisperso del polímero de
recubrimiento.

La etapa (ii) consiste en poner en contacto las partículas magnéticas (p) acomplejadas por compuestos gem-bisfosfonatos con una cantidad suficiente de biovector, generalmente en medio ferrofluido, en agitación a temperatura ambiente durante algunas horas, estando fijada la cantidad de biovector ejecutado en función de la tasa de acoplamiento que se desee obtener.

Como resultado de la etapa (ii), puede realizarse una etapa de filtración con objeto de separar las partículas magnéticas (p), acopladas con biovectores, no habiendo reaccionado los biovectores eventuales.

Según una variante preferida, las partículas magnéticas (p) ácidas ejecutadas en la etapa (i) se obtienen según un procedimiento que comprende las etapas consistentes en:

a)

preparar una solución coloidal de ferrofluido ácido;

b)

tratar la solución obtenida en la etapa a) con una solución de ácido nítrico;

c)

aislar el floculado ácido obtenido en la etapa b);

d)

realizar una peptización.

Las etapas a) a c) corresponden en esta variante a las etapasa i.1) e i.2) descritas anteriormente.

La preparación de la solución coloidal de ferrofluido ácido realizada en la etapa a) es muy conocida y está descrita en numerosas referencias. Se podrá referirse principalmente a la patente FR 7918842 y a las publicaciones C. R. Acad. Sc. Paris (7/07/1980), t. 291 - serie C e IEE Transactions on Magnetics, 1981, vol. MAG-17, nº 2, pág. 1247.

A título indicativo, los ferrofluidos "ácidos" y "alcalinos" se obtienen generalmente por puesta en contacto de una solución acuosa que contiene sales de Fe^{2+} y de Fe^{3+} en proporciones apropiadas con una solución básica, en general el amoniaco.

La peptización o desagregación de un precipitado gelatinoso obtenido mediante una solución ácida, generalmente de ácido perclórico o nítrico, conduce a la obtención de un ferrofluido "ácido", mientras que la peptización por una solución de hidróxido de tetrametilamonio (TMAOH) conduce a la obtención de ferrofluidos "alcalinos".

Los ferrofluidos "alcalinos" no convienen a la invención porque su procedimiento de obtención es tal que no se puede controlar fácilmente su tamaño hidrodinámico y que después del injerto de los compuestos de fórmula (I), necesitan etapas de purificación largas y laboriosas de tipo diálisis o filtración en resinas. Además, siendo tóxico el TMAOH, la aplicación biomédica de los ferrofluidos alcalinos resultantes necesita proceder con tratamientos complementarios de cara a eliminar cualquier residuo de TMAOH.

Por el contrario, se puede considerar, en el ámbito de la presente invención, la utilización de ferrofluidos "ácidos" resultantes de la conversión de los ferrofluidos "alcalinos" según los procedimientos descritos en la bibliografía, principalmente en las publicaciones siguientes: R. Massart, V. Cabuil (Journal de Chimie-Physique, 1987, 84, nº 7-8, págs. 967-973); R. Massart, CR Acad. Sc. Paris, jt. 291 (7 de julio de 1980), serie C1.

Según un modo de realización preferido del procedimiento según la invención, el ferrofluido ácido ejecutado en la etapa a) comprende partículas magnéticas a base de ferrita, con preferencia de maghemita o de magnetita.

En este ámbito, se prefiere específicamente los ferrofluidos ácidos a base de ferrita resultantes de un tratamiento complementario mediante una solución de Fe(NO_{3})_{3}. Este tratamiento complementario, efectuado como resultado de la etapa a), permite realizar una oxidación en el seno de las partículas magnéticas (p) a base de ferrita, y ventajosamente reducir los fenómenos de toxicidad celular relacionados con la presencia de iones Fe^{2+}. Además, este tratamiento permite aumentar la estabilidad de la solución de ferrofluido final obtenida como resultado de la etapa d).

Ventajosamente, el tratamiento ejecutado en la etapa b) permite controlar el tamaño hidrodinámico de las partículas magnéticas obtenidasa en la etapa a).

Así, los inventores han descubierto de manera inesperada que el tamaño de las partículas magnéticas obtenidas en la etapa a) podría disminuirse con la excepción de adaptar las concentraciones y la duración del tratamiento mediante el ácido nítrico.

Con preferencia, se lleva a cabo en la etapa (b) una solución de ácido nítrico de concentración comprendida entre 1,5 y 4 moles/l. En particular, en este caso, el tratamiento se aplica durante un periodo que varía generalmente de 1 hora a 48 horas y con preferencia durante por lo menos un periodo igual a 2 h y con preferencia inferior a 24 h.

Como resultado de este tratamiento, el floculado obtenido se aísla en la etapa c) ventajosamente por simple decantación magnética y se lava varias veces con disolvente orgánico tal como la acetona.

Por último, el floculado aislado en la etapa c) se pone en suspensión en un volumen de disolvente acuoso, opcionalmente en presencia de un disolvente orgánico miscible en agua durante la peptización, es decir la desagregación del floculado y la obtención de una solución colidal de ferrofluido ácido.

La invención considera igualmente, lo mismo que tales, las composiciones que comprenden partículas magnéticas ácidas (p) acomplejadas por los compuestos de fórmula (I) y acopladas a biovectores, susceptibles de ser obtenidos por el procedimiento que comprende las etapas (i) y (ii).

Según otro aspecto, la invención tiene por objeto como tal una composición que comprende partículas magnéticas ácidas (p) acomplejadas por los compuestos de fórmula (I), susceptible de ser obtenida en la etapa (i) del procedimiento según la invención.

Están comprendidas asimismo en la invención las composiciones que comprenden una mezcla de estas partículas magnéticas con las partículas magnéticas acopladas a biovectores.

Aplicaciones

La invención se refiere también a productos de contraste para el diagnóstico médico por la imagen por resonancia magnética que comprende las composiciones de partículas magnéticas ácidas (p) opcionalmente acopladas a biovectores, opcionalmente asociadas a un vehículo y a aditivos farmacéuticamente aceptables.

En el caso en que la partícula no esté acoplada a un biovector, la función X del compuesto gem-bisfosfonato se selecciona de tal manera que no induzca reacción tóxica in vivo. En este ámbito, se prefiere específicamente que X represente a -COOH o -NH_{2}. En ausencia de acoplamiento a un biovector, las composiciones de partículas magnéticas (p) acomplejadas en los compuestos de fórmula (I) pueden, a título de ejemplo, utilizarse como agente de contraste para la angiografía por IRM, así como para otras aplicaciones de IRM.

Las composiciones de partículas magnéticas (p) acomplejadas en los compuestos de fórmula (I) acoplados a biovectores son particularmente útiles para un diagnóstico por la imagen específico, por resonancia magnética (IRM), principalmente, la detección por la imagen específica de un órgano o de una patología por resonancia magnética.

En ausencia de acoplamiento a un biovector, las composiciones de las partículas magnéticas (p) acomplejadas a los compuestos de fórmula (I) pueden utilizarse, a título de ejemplo, como agente de contraste para la angiografía por IRM, así como para otras aplicaciones IRM no específicas.

Las relaxividades r_{1} y r_{2} de un producto de contraste magnético dan la medida de su eficacia magnética y permiten apreciar su influencia en la señal registrada.

En este ámbito, los inventores han demostrado que las composiciones de partículas magnéticas (p) acomplejadas por los compuestos gem-bisfosfonatos presentan relaxividades r_{1} y r_{2} muy ventajosas, permitiendo obtener un fuerte aumento de las velocidades de relación de los protones (R_{1} = 1/T_{1} y R_{2} = 1/T_{2}). Este efecto sobre las velocidades de relajación permite entonces obtener un contraste muy bueno en la IRM, en las zonas reconocidas.

En el caso en que las partículas magnéticas estén acopladas a biovectores, principalmente a ligandos específicos de un receptor biológico diana dado, las composiciones de la invención podrán utilizarse como agentes de contraste para el diagnóstico por la imagen específico para IRM, en particular para la caracterización y/o el seguimiento terapéutico en numerosas patologías: a título indicativo, podemos citar las enfermedades cardiovasculares (diagnóstico por la imagen de la placa de ateroma), los cánceres (tumores, metástasis), las enfermedades inflamatorias y degenerativas (esclerosis en placa, poliartritis reumatoide, enfermedad de Alzheimer).

Así, según otro aspecto, la invención tiene por objeto un método de diagnóstico o de seguimiento terapéutico en el que se administra a un paciente una composición que comprende partículas magnéticas ácidas (p) opcionalmente acopladas a al menos un biovector, lo que permite observar un órgano o una patología en el paciente por resonancia magnética.

A título de ejemplo, las composiciones de partículas finales para las que el biovector utilizado es un derivado del ácido fólico, un inhibidor de metalproteasas o un anticuerpo, por ejemplo de tipo anti-CEA o antimucinas, podrán ser particularmente útiles como agente de contraste IRM en oncología para la detección, la caracterización de tumores y el balance de extensión de cánceres (metástasis).

De la misma manera, las composiciones de partículas finales sobre las que están acoplados biovectores tales como los derivados de fosfatidilserina permiten reconocer las enfermedades inflamatorias y degenerativas, las placas de ateroma o el estrés.

De la misma manera, las composiciones de partículas finales sobre las que están acoplados biovectores tales como péptidos que contienen la secuencia RGD (arginina-glicina-ácido aspártico) permiten reconocer integrinas expresadas en el curso de la angiogénesis y en los fenómenos de trombosis e inflamatorios. Podrán por consiguiente utilizarse para seguir, por IRM, la eficacia del tratamiento antiangiogénico en cancerología o antitrombótico en cardiolo-
gía.

De manera general, la utilización de biovectores tales como los anticuerpos monoclonales o sus fragmentos (Fab, Fab'_{2}, sFv) permite alcanzar una especificidad muy alta in vivo para reconocer zonas patológicas donde son sobreexpresados los receptores correspondientes a los anticuerpos utilizados.

De manera ventajosa, se ha demostrado que las relaxividades de las partículas (p) acomplejadas por compuestos de fórmula (I) y acopladas con un biovector no se alteran en comparación con las relaxividades del intermedio sin biovector. Además, se ha demostrado que la eficacia de estas composiciones no depende de la naturaleza del biovector acoplado sobre las partículas (p) acomplejadas por compuestos de fórmula (I).

Las composiciones de partículas magnéticas acopladas o no acopladas a biovectores son utilizadas asimismo por la medicina nuclear, utilizando un isótopo de hierro radioactivo en el momento de la síntesis.

Según otro aspecto, las composiciones de partículas magnéticas ácidas (p) acopladas a biovectores según la invención pueden ser utilizadas para administrar un medicamento por reconocimiento magnético. En este ámbito, las partículas magnéticas (p) se acoplan a biovectores que poseen propiedades farmacológicas y/o citotóxicas que pueden opcionalmente ser liberados bajo la acción de un campo de radiofrecuencia en la zona reconocida.

La invención tiene así por objeto un método de tratamiento terapéutico en el que se administra a un paciente que necesita dicho tratamiento una composición que comprende partículas magnéticas ácidas (p) acopladas al menos a un biovector, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones de partículas magnéticas ácidas (p) acopladas a biovectores según la invención se utilizan asimismo para el tratamiento por hipertermia de zonas patológicas. En este ámbito, se seleccióna generalmente un biovector que tiene una afinidad específica para un receptor presente en la zona reconocida y se aplica a un campo de radiofrecuencia, con preferencia a un campo de radiofrecuencia alternativa exterior, con respecto a dicha zona reconocida.

Las composiciones de partículas magnéticas (p) acopladas a biovectores según la invención son igualmente útiles para el marcado celular y, en particular, el marcado de células madre, el cual puede realizarse in vitro o ex vivo.

Así, según otro aspecto, la invención tiene por objeto un método de detección y/o de separación in vitro de células que comprende:

i)

la puesta en contacto de células con una composición que comprende partículas magnéticas ácidas (p) acopladas al menos a un biovector capaz de marcar las células; y

ii)

la detección y/o la separación de las células marcadas obtenidas.

Con preferencia, el biovector es un ligando específico de un receptor biológico expresado por las células a marcar.

En este ámbito, un biovector susceptible de unirse específicamente a un receptor de células madre se acopla sobre las partículas magnéticas (p). Las células madre así marcadas administradas a un paciente, permiten entonces seguir, bajo la aplicación de un campo magnético, el movimiento, la localización y el seguimiento de células exógenas por observación por IRM. Esta aplicación es particularmente útil para detectar patologías ligadas a un disfuncionamiento celular.

La invención tiene así por objeto un método de diagnóstico de patologías ligadas a un disfuncionamiento celular, que comprende:

i)

el marcado ex vivo de células madre de un paciente según el método citado anteriormente;

ii)

la administración de células madre marcadas a dicho paciente;

lo que permite, bajo la aplicación de un campo magnético, seguir el movimiento, la localización y la supervivencia de las células exógenas por observación por IRM y detectar así las patologías ligadas a un disfuncionamiento celular.

Por último, las composiciones de partículas magnéticas (p) acopladas a biovectores son particularmente útiles para el tri magnético celular, realizado in vitro. En este caso, el biovector es generalmente un ligando seleccionado de manera que diferencie y/o separe los compuestos que llevan un receptor de dicho biovector de éstos que no lleva dicho receptor. A título de ejemplo, el biovector puede representar una anexina específica, ligando capaz de unirse a la fosfatidilserina (PS) o a la fosfatidiletanolamina (PE), en presencia de Ca^{2+}. En este caso, la utilización según la invención permite diferenciar y/o separar las células que presentan un estado anormal, es decir capaces de unirse a partículas magnéticas (p) acopladas a biovectores anexinas, células sanas incapaces de unirse a estas partículas.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" hace referencia a una composición o una entidad molecular que no produce reacción alérgica, efectos secundarios o indeseables cuando se administra a un animal o a un ser humano de manera apropiada.

La expresión "vehículos farmacéuticamente aceptables" puede designar en el sentido de la presente descripción un disolvente, un medio de dispersión, agentes antibacterianos y antimicóticos. La utilización de tales medios y agentes pone de manifiesto las competencias del experto en la materia.

A menos que los medios o agentes convencionales no sean incompatibles con las partículas magnéticas (p) acomplejadas por compuestos de fórmula (I), y acopladas a biovectores, puede considerarse su utilización en las composiciones de diagnóstico. Pueden asimismo incorporarse ingredientes activos complementarios en las composiciones según la invención.

Se entiende que, en los métodos de tratamiento de la invención, las composiciones se administran en una cantidad terapéutica eficaz, que puede ser ajustada por el experto en la materia según la patología considerada, el estado del paciente, su peso, su edad, etc.

Las composiciones de la invención se administran preferentemente por vía parenteral, por vía oral, no estando excluidas sin embargo las demás vías de administración, tales como por ejemplo la administración por vía rectal, siendo particularmente preferida la administración en forma de una inyección intravenosa.

Cuando se considera la administración por vía oral, las composiciones de la invención se encuentran en forma de cápsulas, comprimidos efervescentes, comprimidos sin o con recubrimiento, bolsitas, grageas, ampollas o soluciones para beber, microgránulos o formas de liberación prolongada o controlada.

Cuando se considera la administración por vía parenteral, las composiciones de la invención se encuentran en forma de liofilizados listos para ser redisueltos o disoluciones y suspensiones inyectables acondicionadas en ampollas o frascos o jeringuillas prerrellenas, para la perfusión venosa lenta o inyección intravenosa rápida.

Las formas para la administración oral se preparan por mezcla de partículas magnéticas (p) eventualmente acopladas a biovectores, principalmente a una sustancia activa, con diferentes tipos de excipientes o de vehículos tales como cargas, agentes de disgregación, aglutinantes, colorantes, agentes correctores de sabor y análogos, y después, la puesta en forma de mezcla de una cápsula de liberación controlada principalmente.

La solubilidad acuosa y la poca osmolalidad de las partículas de la invención permiten preparar soluciones acuosas isotónicas, de fuerte concentración y de viscosidad aceptable para inyectables.

Las formas para la administración parenteral se obtienen de manera convencional mediante mezcla de partículas magnéticas (p) opcionalmente acopladas a biovectores con tampones, agentes estabilizantes, conservantes, agentes solubilizantes, agentes isotónicos y agentes de puesta en suspensión. Conforme a las técnicas conocidas, estas mezclas se esterilizan a continuación y después se acondicionan en forma de inyecciones intravenosas o de liofilizados listos para ser redisueltos en un vehículo estéril farmacéuticamente aceptable.

Las soluciones pueden prepararse provisonalmente a partir del polvo liofilizado que contienen las partículas magnéticas (p) opcionalmente acopladas a los biovectores y opcionalmente aditivos y un disolvente estéril o, por el hecho de la gran estabilidad de las partículas magnéticas acopladas a los biovectores en solución, las soluciones pueden suministrarse al radiólogo en frascos, ampollas, jeringuillas o bolsitas.

Para la preparación de supositorios, las partículas magnéticas según la invención se mezclan de manera conocida en sí a un constituyente de base apropiada tal como polietilenglicol o glicéridos semisintéticos.

Las dosis unitarias dependerán de la composición de las partículas magnéticas (p), acopladas a biovectores, de la vía de administración, del tipo de diagnóstico a establecer, así como del paciente. Las dosis unitarias serán en general de 0,01 \mumoles a 100 \mumoles de partículas magnéticas para un hombre de talla media (75 kg).

Como se demuestra en los ejemplos, los inventores han conseguido obtener compuestos a la vez estables y específicos utilizando como revestimiento de los compuestos gem-bisfosfonatos. Es preciso que, de manera más general, el peticionario estudie revestimientos capaces de unirse por una parte a las partículas magnéticas y por otra parte al menos a un biovector. Son estudiados diferentes recubrimientos de fórmula Y1-Y2-Y3, siendo Y1 al menos un grupo capaz de acoplarse a nanopartículas, siendo Y3 al menos un grupo capaz de interactuar con al menos un biovector, siendo Y2 presente o ausente un enlazador entre Y1 e Y3. Entre los Y1 se estudia principalmente los fosfonatos, fosfatos, bisfosfonatos y análogos distintos de gem-bisfosfonatos, hidroxamatos o gem-hidroxamatos.

En lo siguiente, se describen a título de ilustración ejemplos de preparación de composiciones.

En los ejemplos que siguen, se precisa las generalidades siguientes.

En lo que sigue, las abreviaturas M, M/L, M teórica, N y M/z, ES^{+}, ES, kD y CCM tienen los significados siguientes:

M o M/L: concentración molar (moles/litro).

M teórica: masa molecular teórica.

N: normalidad.

M/z: masa sobre la carga determinada por espectrometría de masas.

ES^{+}: electroatomización en modo positivo.

ES^{-}: electroatomización en modo negativo.

TFA: ácido trifluoroacético.

kD: unidad de masa molecular (kiloDalton)

CCM: cromatografía en capa fina

Z ave: diámetro hidrodinámico medido por PCS

Poli \sigma: polidispersión medida por PCS.

La nomenclatura química que sigue está sacada del programa informático ACD/NAME (sociedad Avanced Chemistry Development Inc., Toronto, Canadá), según las reglas IUPAC.

Dosificación de hierro total

El hierro se dosifica por espectroscopia de absorción atómica (Espectrofotómetro VARIAN AA10) tras la mineralización por HCl concentrado y dilución con relación a una gama muestra de iones férrico (0, 5, 10, 15 y 20 ppm).

Tamaño de las partículas - Diámetro hidrodinámico de la partícula injertada (Z ave) = tamaño PCS

Determinado por PCS (aparato Malvern 4700, láser 488 nm a 90º) en una muestra diluida a \sim1 milimolar con agua PPI filtrada sobre 0,22 \mum.

PCS = espectroscopia de correlación de fotones = técnica por difusión de luz dinámica - referencia: R. Pecora en J. of Nano. Res. (2000), 2, págs. 123-131.

- Diámetro de la partícula magnética (p) (antes del injerto)

Determinado por desconvolución de las curvas de imantación (medidas efectuadas en un magnetómetro SQUID) a diferentes temperaturas. [Referencia: R. W. Chantrell en IEEE Transactions on Magnetics (1978), 14(5), págs. 975-977].

Determinación de la tasa de injerto por microanálisis

Compuesto A: expresado en mol por ciento de moles de hierro total.

Otros compuestos: expresado en moles por ciento de moles de hierro y en moles por ciento de moles de compuesto A.

Análisis estructurales

Por espectroscopia de masas (aparato MICROMASS VG Quattro II) con una fuente Electrospray.

Medidas de relaxividad

Los tiempos de relajación T_{1} y T_{2} se han determinado para los procedimientos estándar en un aparato Minispec 120 (Bruker) a 20 Mhz (0,47T) y 37ºC. El tiempo de relajación longitudinal T_{1} se mide utilizando una secuencia de inversión de recuperación y el tiempo de relajación transverso T_{2} se mide por una técnica CPMG.

Las velocidades de relajación R_{1} (=1/T_{1}) y R_{2} (=1/T_{2}) se han calculado para diferentes concentraciones en metal total (variando de 0,1.10^{-3} a 1.10^{-3} moles/l) en solución acuosa a 37ºC. La correlación entre R_{1} o R_{2} en función de la concentración es lineal, y la pendiente representa la relaxividad r_{1} (R_{1}/C) o r_{2} (R_{2}/C) expresadas en (1/segundo) \times (1/mmoles/l) o sea (mM^{-1}.s^{-1}).

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Ejemplo de compuestos de fórmula (I)

Ejemplo 1

Preparación del compuesto A

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26

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1) Dietil-1-[etoxifosforil]vinilfosfonato

Se disuelven en caliente 13 g (0,433 moles) de paraformaldehído y 10 ml (0,097 moles) de dietilamina en 250 ml de metanol. Se adicionan a continuación 24 g (8,67 10^{-2} moles) de dietil[etoxi(propil)fosforil]metilfosfonato. El conjunto se lleva a reflujo durante 24 horas. El medio de reacción se concentra al vacío. El concentrado se recoge dos veces mediante 250 ml de tolueno y se concentra a continuación al vacío.

El aceite obtenido se disuelve en 125 ml de tolueno. Se añaden 0,14 g de ácido para-toluensulfónico. La mezcla se lleva a reflujo 24 horas con un Dean-Stark, después se concentra a sequedad al vacío.

Se extrae el producto con 500 ml de CH_{2}Cl_{2}, después se lava 2 veces con 250 ml de agua. La fase orgánica se seca sobre MgSO_{4} y se concentra al vacío.

El producto en bruto se purifica sobre 625 g de gel de sílice Merck Geduran® (40-63 \mum). Elución: CH_{2}Cl_{2}/acetona-50/50 (CCM - SiO_{2}: Rf = 0,45).

Se aíslan 18,4 g con un rendimiento del 71%.

Espectro de masas: M/z = 301,4 (ES+) M teórica = 300,2

Espectro C^{13}: (s) 148,8 ppm, (t) 134,8 - 131,5 - 128,2 ppm, (s) 62,2 ppm, (s) 16,7 ppm

Espectro H^{1}: (t) 6,9 - 6,6 ppm, (masivo) 3,9 ppm, (t) 1,15 ppm.

2) 2-[2.2-bis(dietilfosforil)etil]malonato de dietilo

1,6 g (0,01 moles) de malonato de dietilo, 0,07 g (0,001 moles) de etilato de sodio y 3 g (0,01 moles) de [etoxi(propil)fosforil]vinilfosfonato de dietilo se agitan 15 minutos en 15 ml de etanol. [CCM: SiO_{2}; eluyente CH_{2}Cl_{2}/acetona 50/50 - Rf = 0,6].

5 ml de una solución saturada de NH_{4}Cl se añaden a una solución etanólica. El conjunto se concentra al vacío. Se extrae el residuo con 30 ml de acetato de etilo y se lava dos veces con 5 ml de agua. Se seca la fase orgánica en MgSO_{4} y después se evapora a sequedad.

El aceite obtenido se purifica en 200 g de sílice Merck Geduran® (40-63 \mum). Elución CH_{2}Cl_{2}/acetona 50/50 Rf = 0,6

Se aíslan 3,8 g con un rendimiento del 82%.

Espectro de masas: M/z 460,9 (ES+), M teórica = 460.

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3) Ácido 4,4-difosfonobutanoico

7 g (15,7 10^{-2} moles) de 2-[2,2-bis (dietilfosforil) etil] malonato de dietilo se llevan a reflujo durante 8 horas en 350 ml de HCl [5 N].

El aceite pardo obtenido se purifica en 60 g de gel de sílice j6 silanizado (0,063-0,200 mm) con una elución con agua [seguimiento por HPLC].

Se aíslan 3,6 g con un rendimiento del 92%.

Espectro de masas: M/z 249 (ES+), M teórica = 248

HPLC: Columna: Hypercarb® 250 X 4 mm detección: 202 nm

Eluyente isocrático 99/1: H_{2}SO_{4} 0,034 N/CH_{3}CN - Tr = 8 min.

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Ejemplos 2 a 7: Preparación de biovectores

Ejemplo 2

Preparación del compuesto B 1) 2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-carboxilato de etilo

Se disuelven 9,7 g (0,1 moles) de maleimida en 50 ml de acetato de etilo y 1,1 ml de N-metil morfolina a 5ºC.

Se añaden gota a gota 1,1 ml de cloroformato de etilo. El conjunto se agita ½ hora. Se elimina el insoluble por filtración. Se lava el filtrado con 50 ml de agua. Se seca la fase orgánica sobre MgSO_{4} y después se concentra al vacío. El aceite obtenido se purifica sobre gel de sílice Merck Geduran® (40-63 \mum). Elución: CH_{2}Cl_{2}/ACOEt 66/34.

Se aíslan 16,9 g con un rendimiento del 50%.

Espectro de masas: M/z = 170,1 (ES+) M teórica = 169

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2) 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1il)propilcarbamato de terc-butilo

Se disuelven 0,515 g (2,96 \times 10^{-3} moles) del compuesto B 1) en 20 ml de NaHCO_{3} saturada. Se filtra la solución sobre un filtro de porosidad 0,45 \mum y después se enfría a 0ºC.

Se añaden gota a gota 0,5 g (2,96 10^{-3} moles) de etil carbonil maleimida en solución en 25 ml de tetrahidrofurano. Se agita el conjunto durante 15 minutos.

Se añaden 25 ml de tetrahidrofurano y se agita el medio de reacción 45 min. Se ajusta el pH a 6 con c.s.p. de HCl [1N]. Se extrae el producto con 2 \times 200 ml de acetato de etilo. Se seca la fase orgánica sobre MgSO_{4} y después se concentra al vacío.

Se aíslan 737 mg con un rendimiento del 98%.

3) 1-(3-aminopropil)1H-pirrol-2,5-diona

Se ponen en agitación 0,7 g (2,75 10^{-3} moles) del compuesto B 2) en 25 ml de HCl [2 N] durante 24 horas.

Se concentra la solución al vacío. Se obtienen 500 mg con un rendimiento del 88%.

Espectro de masas: M/z = 155,1 (ES+) M teórica = 154,1

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Ejemplo 3

Preparación del compuesto C 1-desoxi-1-[(2,3-dihidropropil)amino]hexitol

Se disuelven 173 g (1,9 moles) de 3-amino-1,2-propanodiol en 1 litro de metanol. Se añaden 360 g (2 moles) de glucosa. Se agita el conjunto 24 horas a temperatura ambiente. Se reduce esta solución bajo 20 bares de hidrógeno a 60ºC con 50 g de paladio sobre carbón y 450 ml de agua durante 6 horas.

El medio de reacción se filtra sobre Clarcel a 35ºC. Los líquidos de la filtración se concentran hasta un volumen final de 850 ml. Se vierte el concentrado sobre 3 litros de alcohol isopropílico mantenidos a 35ºC mediante un baño de agua caliente. Se filtra el precipitado y se seca al vacío. Se aíslan 272 g con un rendimiento del 53%.

Espectro de masas: M/z = 256,4 (ES+) M teórica = 253,3

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Ejemplo 4

Preparación del compuesto D: N-[(2,3-dihidroxipropil)(2,3,4,5,6-pentahidroxihexil)]2,4,6-tribromo 5-(glicilamino)isoftalamida

Se disuelven a 80ºC 255 g (1,9 moles) del compuesto C en 2,5 litros de 1-metil-2-pirrolidinona durante 30 minutos. Se enfría el medio de reacción a 40ºC antes de la adición de 67,1 g (0,635 moles) de Na_{2}CO_{3} secado a 170ºC y de 407,8 g (0,635 moles) de cloruro del ácido 5-ftalamido(acetamido) 2,4,6 triaminoisoftálico manteniendo la temperatura inferior a 45ºC.

Se mantiene el medio 2 horas a 40ºC y después se enfría a 20ºC antes de la filtración de los minerales sobre Clarcel.

Se añaden 610 ml de agua al filtrado y el conjunto se calienta a 70ºC antes de la adición de 44,8 ml de hidrato de hidrazina (0,889 moles). El medio de reacción se calienta 2 horas a 90ºC.

Se ajusta el pH a 1 con c.s.p. de HCl [12 N]. Se elimina el precipitado formado por filtración. Los líquidos de la filtración se vierten en 30 litros de etanol.

Se disuelve el producto obtenido en 3,6 litros de agua, se ajusta el pH a 6,5 con c.s.p. de sosa [2 N] y se diafiltra la solución. Seguimiento por HPLC de la purificación. Pureza HPLC = 98,2%.

Condiciones de la HPLC

Columna: Symetry® C18 250\times 4 mm (5 \mum). Detección: 254 nm.

Eluyente isocrático: 99/1: H_{2}SO_{4} 0,034 N/CH_{3}CN

Dosis de bromo = 23,6% (sea una pureza del 97,2%)

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Ejemplo 5

Preparación del compuesto E: N-N'-[bis(2,3,4,5,6-pentahidroxihexil)]2,4,6-tribromo 5-(glicilamino)isoftalamida

27

El compuesto E puede prepararse según el modo operatorio descrito en la patente: EP 0 922 700 A1.

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Ejemplo 6

Preparación del compuesto F: Ácido (18S)-1-amino-18{[(2-amino-4-oxo-3,4-dihidropteridin-6-iil)metil]amino} benzoil)amino]-15-oxo-4-trioxa-14 azanonadecan-19-oico

28

Se disuelven en 60 ml de DMSO a temperatura ambiente 9,74 g (0,0214 moles) del ácido (2S)-2-{[(2-amino-4-oxo-3,4-dihidropteridin-6-il)metil]amino}benzoil)amino]-5-metoxi-5-oxopentanoico (pudiendo prepararse según el modo operatorio descrito en J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 10004-10013). Se añaden 235 ml (1,07 moles) de 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina. Se agita el conjunto 48 h. a temperatura ambiente.

El medio de reacción se vierte en una mezcla de 1,5 l de CH_{3}CN y de 1,5 l de éter etílico. El precipitado obtenido se filtra y se seca al vacío.

Se disuelve el producto en bruto en 100 ml de piridina [0,1 N] y se purifica sobre 1 kg de gel de sílice 60 silanizado (0,063-0,200 mm) con una elución de piridina [0,1 N] - metanol 9/1 [seguimiento por HPLC]. Se aíslan 2,7 g con un rendimiento del 26% y una pureza por HPLC de 97,3%.

Condiciones de la HPLC

Columna: Symetry® C18 250\times 4 m (5 \mum). Detección: 254 nm

Eluyente isocrático: 99/1: H_{2}SO_{4} 0,034 N/CH_{3}CN

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Ejemplo 7

Preparación del compuesto G L-propil-L-leucil-N^{1}-hidroxi glicinamida

Se disuelve 1 g (2,3 \times 10^{-3} moles) de 1-[(benciloxi)carbonil]-L-propil-L-leucil-N^{1}-hidroxi glicinamida en 100 ml de metanol.

Se añaden a la solución 100 mg de Pd/C 50% hidratado. Se agita el conjunto 6 horas a temperatura ambiente bajo 3,4 atm. de hidrógeno.

Se elimina el catalizador por filtración y se concentra el filtrado al vacío. Se almacena el producto a 4ºC. Rendimiento cuantitativo.

Espectro de masas: M/z = 371,2 (ES-) M teórica = 372,4

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Ejemplos 8 y 9: Ejemplos de preparación de soluciones coloidales de partículas magnéticas ácidas (p)

Ejemplo 8

Una solución de 36 g (0,181 moles) de FeCl_{2} \cdot 4H_{2}O, 20 ml de HCl al 37% en 150 ml de H_{2}O se introduce en una mezcla constituida por 3 litros de agua y 143 ml (0,302 moles) de FeCl_{3} al 27%. Se introducen rápidamente 250 ml de NH_{4}OH al 25% bajo fuerte agitación. Se agita el conjunto 30 min. Se eliminan los líquidos por decantación magnética. Se lava el ferrofluido 3 veces a continuación con 2 litros de agua.

El ferrofluido nítrico se pone en agitación 15 min. con 200 ml de HNO_{3} [2 M], se elimina el sobrenadante por decantación magnética.

El ferrofluido nítrico se lleva a reflujo con 600 ml de agua y 200 ml de Fe(NO_{3})_{3} [1 M] durante 30 min. Se elimina el sobrenadante por decantación magnética.

El ferrofluido nítrico se pone en agitación 15 min. con 200 ml de HNO_{3} [2 M], eliminándose el sobrenadante por decantación magnética.

El ferrofluido nítrico se lava 3 veces con 3 litros de acetona, después se recoge mediante 400 ml de agua. Se evapora la solución al vacío hasta un volumen final de 250 ml.

29

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Ejemplo 9

Se introducen 108 g (0,543 moles) de FeCl_{2} \cdot 4 H_{2}O en 450 ml de H_{2}O en una solución de 4 litros de agua y 429 ml (0,906 moles) de FeCl_{3} al 27%. Se introducen rápidamente bajo agitación (1200 rev/min.) 750 ml de NH_{4}OH al 25%. Se agita el conjunto 30 min. Se eliminan los líquidos por decantación magnética. Se lava el ferrofluido 2 veces a continuación con 3 litros de agua.

El ferrofluido nítrico se pone en agitación ¼ h. con 3 litros de HNO_{3} [2 M], el sobrenadante se elimina por decantación magnética.

El ferrofluido nítrico se lleva a reflujo con 1.300 ml de agua y 700 ml de Fe(NO_{3})_{3} [1 M] durante 30 min. (600 rev/min.). El sobrenadante se elimina por decantación magnética.

El ferrofluido nítrico se pone en agitación 15 min. con 3 litros de HNO_{3} [2 M], eliminándose el sobrenadante por decantación magnética.

El ferrofluido nítrico se lava 3 veces con 3 litros de acetona, después se recoge mediante 600 ml de agua. Se evapora la solución al vacío hasta un volumen final de 250 ml.

\ding{118}En esta fase, se obtiene como características:

30

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\ding{118}Tratamiento:

Se ponen en agitación 200 ml de la solución en 2,4 litros de HNO_{3} durante 4 horas. Se elimina el sobrenadante por decantación magnética. El ferrofluido nítrico se lava 2 veces con 3 litros de acetona, después se recoge mediante 400 ml de agua. Se evapora la solución al vacío hasta un volumen final de 250 ml.

31

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Ejemplos 10 a 12: Ejemplos de acomplejamiento de partículas magnéticas (p) por compuestos de fórmula (I)

Ejemplo 10

Se diluyen 50 ml del ejemplo 8 a 4,85 M/l en 3 litros de agua. Una solución de 1,3 g (5,24.10^{-3} moles) del compuesto A del ejemplo 1 en 100 ml de agua se introduce gota a gota. Se mantiene la agitación durante 30 minutos. El floculado se aísla por decantación magnética y después se lava 3 veces mediante 3 litros de agua.

Se recoge en solución con 700 ml de agua a pH 7,2 con c.s.p. de NaOH [1 N]. La solución final se filtra sobre membrana de 0,22 \mum.

32

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Ejemplo 11

Se diluyen 50 ml del ejemplo 8 a 4,73 M/l en 3 litros de agua. Una solución de 1,3 g (5,24.10^{-3} moles) del compuesto A del ejemplo 1 en 80 ml de agua se introduce gota a gota. Se mantiene la agitación durante 30 minutos. El floculado se aísla por decantación magnética y después se lava 3 veces mediante 3 litros de agua.

Se recoge en solución con 700 ml de agua a pH 11 con c.s.p. de NaOH [1 N] y después se estabilza a pH 7,2 con c.s.p. de hidrocloruro [1 N].. La solución final se filtra sobre membrana de 0,22 \mum.

33

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Ejemplo 12

Se diluyen 100 ml del ejemplo 9 a 2,742 M/l (talla PCS = 21,3 nm) en 3 litros de agua.

Una solución de 1,5 g (6,03.10^{-3} moles) del compuesto A del ejemplo 1 en 100 ml de agua se introduce gota a gota. Se mantiene la agitación durante 30 minutos. El floculado se aísla por decantación magnética y después se lava 3 veces mediante 3 litros de agua.

Se recoge en solución con 700 ml de agua a pH 7,2 con c.s.p. de NaOH [1 N]. La solución final se filtra sobre membrana de 0,22 \mum.

34

Relaxividades

20 MHz (0,47 T) - 37ºC - en solución acuosa

35

Ejemplos 13 a 18: Acoplamiento de partículas magnéticas ácidas (p) acomplejadas por compuestos de fórmula (I) con biovectores

Ejemplo 13

Se disuelven en 50 ml del ejemplo 10 a 0,252 M/l, 36 mg (1,88.10^{-4}) del compuesto B. Se ajusta el pH a 5,8 con c.s.p. de HCl [1 N].

Se añade al medio de reacción una gota de trietilamina y 72 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y se agita el conjunto 18 horas a temperatura ambiente.

La solución se ultrafiltra en una celda con agitación PALL® que tiene un umbral de corte de 30 kD. Se eliminan 600 ml del filtrado para obtener una solución final de 35 ml.

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100

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Ejemplo 14

Se disuelven 0,193 g (7,6.10^{-4} moles) del compuesto C del ejemplo 3 en 13,55 ml del ejemplo 11 a 0,279 M/l. Se ajusta el pH a 6,2.

Se añaden 171 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Se agita el conjunto a temperatura ambiente durante 24 horas. Se ultrafiltra la solución en una celda con agitación PALL® con un umbral de corte de 30 kD. Se eliminan 500 ml del filtrado. Lo retenido se ajusta a 30 ml.

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101

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Ejemplo 15

Se disuelven 0,358 g (3,78.10^{-4} moles) del compuesto D del ejemplo 4 en 13,55 ml del ejemplo 11 a 0,279 M/l.

Se añaden 86 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Se agita el conjunto a temperatura ambiente durante 24 horas. Se ultrafiltra la solución en una celda con agitación PALL® con un umbral de corte de 30 kD. Se eliminan 500 ml del filtrado. Lo retenido se ajusta a 30 ml.

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102

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Ejemplo 16

Se disuelven 0,853 g (7,6.10^{-4} moles) del compuesto E del ejemplo 5 en 13,55 ml del ejemplo 11 a 0,279 M/l. Se ajusta el pH a 6,2.

Se añaden 171 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Se agita el conjunto a temperatura ambiente durante 24 horas. Se ultrafiltra la solución en una celda con agitación PALL® con un umbral de corte de 30 kD. Se eliminan 500 ml del filtrado. Lo retenido se ajusta a 30 ml.

103

Ejemplo 17

Se introducen 90 ml de una solución en 1,35 g/l del compuesto F del ejemplo 6 en 63 ml del ejemplo 12 a 0,285 M/l. Se añaden 121,7 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Se ajusta el pH a 6,8 y se agita el conjunto 18 horas a temperatura ambiente.

Se ultrafiltra directamente el medio de reacción en una celda en agitación PALL® con un umbral de corte de 30 kD. Lo retenido se ajusta a 100 ml y después se filtra sobre 0,22 \mum..

104

Relaxividades

20 MHz (0,47 T) - 37ºC - en solución acuosa

36

Estos resultados demuestran que el acoplamiento del biovector no modifica las relatividades del intermedio no acoplado (ejemplo 12).

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Ejemplo 18

Se ultrafiltran 100 ml de una solución del ejemplo 12 a 0,285 M/l en una celda con agitación de 30 kD PALL®. A esta solución se añaden, 202 mg del compuesto G del ejemplo 7. Se ajusta el pH a 6,1 con una c.s.p. de hidrocloruro [0,1 N].

Se añaden 203 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y se agita el conjunto 6 horas a temperatura ambiente.

Se ultrafiltra el medio de reacción en una celda en agitación PALL® con un umbral de corte de 30 kD. Se eliminan 800 ml del filtrado. Lo retenido se ajusta a 140 ml y después se filtra en 0,22 \mum.

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105

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Ejemplos 19 a 21: Comparación de partículas magnéticas acomplejadas por un compuesto gem-bisfosfonato y acopladas a un biovector, que derivan de un precursor ferrofluido "alcalino" con las que derivan de un precursor ferrofluido "ácido"

Ejemplo 19

Preparación de un ferrofluido "alcalino" en medio TMAOH

Una mezcla constituida por una solución de 2,96 ml de FeCl_{3} al 27%, y una solución de 0,6 g de FeCl_{2}\cdot4 H_{2}O en 40 ml de agua, se vierte rápidamente en 200 ml de hidróxido de tetrametilamonio [1 M]. Se agita el conjunto 1 hora a temperatura ambiente. Se filtra la solución sobre una membrana de 0,22 \mum y se mantiene bajo nitrógeno a 4ºC.

[Fe]: 0,0403 M/l Tamaño PCS = 68,2 nm polidispersión \sigma = 0,48

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Ejemplo 20

Acomplejamiento del ferrofluido "alcalino" del ejemplo 19 por el compuesto gem-bisfosfonato del ejemplo 1

Una solución constituida por 416 mg del compuesto A del ejemplo 1 en solución en 5 ml de agua se introduce en 25 ml del ejemplo 19. Se agita el conjunto 1 hora y después se ultrafiltra en la celda en agitación PALL® que tiene un umbral de corte de 30 kD.

Se eliminan 600 ml del filtrado. Lo retenido se añade a 40 ml y después se filtra sobre membrana de 0,22 \mum.

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Ejemplo 21

Acoplamiento de partículas magnéticas acomplejadas del ejemplo 20 con el compuesto E del ejemplo 5

Se introducen 1,7 g del compuesto E en los 40 ml de solución del ejemplo 20. Se ajusta el pH a 6,2. Se añaden entonces 345 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y el conjunto se agita 24 horas a temperatura ambiente.

El medio de reacción se ultrafiltra en la celda a agitación PALL® con un umbral de corte de 30 kD.

Se eliminan 700 ml de filtrado. Lo retenido se añade a 40 ml y después se filtra sobre 0,22 \mum.

106

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Precursores

37

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Moléculas finales (ferrofluido ácido o básico + compuesto gem-bisfosfonato (Ia) + biovector compuesto E):

38

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Conclusiones

Para los ejemplos 19 y 21, los inventores han demostrado provechosamente que cuando se utiliza un ferrofluido alcalino comparable al llevado a cabo en el documento J. of Coll. and Interf., Science, 2001, 238, págs. 37-42, el tamaño hidrodinámico es más elevado de la etapa del precursor (ferrofluido alcalino = ejemplo 19) y la polidispersión es fuerte (\sigma = 0,48) comparado con el ferrofluido ácido (\sigma = 0,22). Esto repercute sobre el tamaño hidrodinámico del producto final (después del injerto del compuesto Ia y del biovector - compuesto E), con una polidispersión todavía mayor (\sigma = 0,6). La diferencia de % (compuesto A/hierro) entre los dos tipos de partículas finales resultantes respectivamente de un ferrofluido ácido o básico indica la formación cierta de una doble capa de compuesto I (gem-bifosfonato) en el caso de la realización de un precursor "alcalino", lo que es perjudicial para una buena estabilidad. En el procedimiento según la invención, se tiene el 90% de los puntos injertados con un compuesto de fórmula (I), formando provechosamente una monocapa.

\newpage

Ejemplos 22 a 25: Preparación de otros biovectores

Ejemplo 22

Preparación del compuesto H

39

1) 5-{[(2R)-2-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}3-(1H-indol-3-il)propanoil]amino}-pentilcarbamato de bencilo

Se disuelven 15,63 g de (ácido (2R)-2-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-3-(1H-indol-3-il)propanoico) a temperatura ambiente en 300 ml de tetrahidrofurano.

Se añaden 10 g de (5-aminopentilcarbamato de bencilo) y después 5,1 ml de trietilamina. Se agita el conjunto 5 minutos a temperatura ambiente.

Se añaden a continuación al medio de reacción 5,94 g de hidroxi-1-benzotriazol hidratado y después 8,43 g de clorhidrato de 1-(3-dimetil-aminopropil)-3-etil-carbodiimida. Se agita el conjunto 24 horas a temperatura ambiente.

Se elimina el insoluble por filtración. Se concentra el filtrado al vacío.

El aceite obtenido se vierte en 150 ml de agua y se agita durante 1 hora a temperatura ambiente.

Se filtra el precipitado obtenido y se lava bajo fuerte agitación en 100 ml de agua durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Se filtra el precipitado y después se lava mediante 200 ml de éter etílico, se seca después al vacío. Se aíslan 22,78 g con un rendimiento del 96,4%.

Rf = 0,94 sobre sílice (MERCK) en CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH (8/2)

HPLC: Columna Symmetry Waters C18, 5 \mum, (250 mm \times 4,6 mm) Gradiente: agua-TFA (pH 2,95)/CH_{3}CN: \lambda = 210 nm

40

Tiempo de retención del producto esperado: 42 min.

Espectro de masas: m/z = 645,3 (modo ES^{+}) (M teórica = 644)

2) 5-{[(2R)-2-amino-3-(1H-indol-3-il)propanoil]amino}pentilcarbamato de bencilo

Se disuelven a temperatura ambiente 20 g de (5-{[(2R)-2-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}3-(1H-indol-3-il)propanoil]amino}pentilcarbamato de bencilo) en 280 ml de tetrahidrofurano.

Se añaden a continuación 41,4 ml de piperidina y 20 ml de agua. Se agita el conjunto 3 horas a temperatura ambiente. El medio de reacción se concentra al vacío.

El aceite obtenido se purifica sobre 1.400 g de sílice Merck Geduran® (40-63 \mum). Elución: CH_{2}Cl_{2}/CH_{2}OH (95/5). Se aíslan 12,77 g con un rendimiento del 97,4%.

Rf = 0,64 sobre sílice (MERCK) en CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH (95/5)

HPLC: Columna Symmetry Waters C18, 5 \mum, (250 mm \times 4,6 mm) Gradiente: agua-TFA (pH 2,95)/CH_{3}CN: \lambda = 210 nm

41

Tiempo de retención del producto esperado: 18,2 min.

Espectro de masas: m/z = 423,2 (modo ES^{+}) (M teórica = 422)

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3) (12R)-12-(1H-indol-3-ilmetil)-15-isobutil-3,11,14-trioxo-1-fenil-2-oxa-4,10,13-triaza-heptadecan-17-oato de terc-butilo

Se disuelven a temperatura ambiente en 160 ml de tetrahidrofurano 9,16 g de (ácido 2-(2-terc-butoxi-2-oxoetil)-4-metilpentanoico), sintetizado según el modo operatorio descrito en (J. Med. Chem. 1998, vol. 41 (2): pág. 209).

Se añade de una sola vez una solución homogénea formada por 16,81 g (0,039 moles) de (5-{[(2R)-2-amino-3-(1H-indol-3-il)propanoil]amino}pentilcarbamato de bencilo) en 165 ml de tetrahidrofurano seguido de, sucesivamente, 8,3 ml de trietilamina, 6,45 g de hidroxi-1-benzotriazol hidratado y 9,5 g de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida.

Se agita el conjunto 12 horas a temperatura ambiente. Se elimina el insoluble por filtración. Se concentra el filtrado al vacío.

El aceite obtenido se purifica sobre 1.900 g de sílice Merck Geduran® (40-63 \mum). Elución del producto bueno por CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH (98/2).

Se aíslan 24 g con un rendimiento del 95,3%.

Rf = 0,42 sobre sílice (MERCK) en CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH (95/5)

HPLC: Columna Symmetry Waters C18, 5 \mum, (250 mm \times 4,6 mm) Gradiente: agua-TFA (pH 2,95)/CH_{3}CN: \lambda = 220 nm

42

Tiempo de retención del producto esperado: 25,7 min.

Espectro de masas: m/z = 635,6 (modo ES^{+}) (M teórica = 634)

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4) Ácido (12R)-12-(1H-indol-3-ilmetil)-15-isobutil-3,11,14-trioxo-1-fenil-2-oxa-4,10,13-triazaheptadecan-17-oico

Se añaden 1,4 g de ditioeritritol en una solución compuesta por 100 ml de CH_{2}Cl_{2} y de 100 ml de ácido trifluoroacético. Se añaden a continuación 10 g de ((12R)-12-(1H-indol-3-ilmetil)-15-isobutil-3,11,14-trioxo-1-fenil-2-oxa-4,10,13-triaza-heptadecan-17-oato de terc-butilo). Se agita el conjunto 30 minutos a temperatura ambiente y después se concentra al vacío.

El aceite obtenido se purifica sobre 700 g de sílice Merck Geduran® (40-63 \mum). Elución del producto bueno por CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH (98/2).

Se aíslan 6,19 g con un rendimiento del 68%.

Rf = 0,57 sobre sílice (MERCK) en CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH (8/2)

HPLC: Columna Symmetry Waters C18, 5 \mum, (250 mm \times 4,6 mm) Gradiente: agua-TFA (pH 2,95)/CH_{3}CN: \lambda = 220 nm

43

Tiempo de retención del producto esperado: 20,8 min.

Espectro de masas: m/z = 579,0 (modo ES^{+}) (M teórica = 578)

\vskip1.000000\baselineskip

5) (8R)-8-(1H-indol-3-ilmetil)-11-isobutil-7,10,13-trioxo-16-fenil-15-oxa-6,9,14-triaza-hexadec-1-ilcarbamato de bencilo

Se disuelven a temperatura ambiente en 160 ml de tetrahidrofurano 6,11 g de ácido (12R)-12-(1H-indol-3-ilmetil)-15-isobutil-3,11,14-trioxo-1-fenil-2-oxa-4,10,13-triazaheptadecan-17-oico. El medio de reacción se enfría a 0ºC.

Se añaden sucesivamente al medio de reacción 1,69 g de clorhidrato de O-bencilhidroxilamina, 3 ml de trietilamina, 1,86 g de hidroxi-1-benzotriazol hidratado y después 2,63 g de clorhidrato de 1-(3-dimetil-aminopropil)-3-etilcarbodiimida y el conjunto se agita 24 horas a temperatura ambiente.

Se elimina el insoluble por filtración. Se concentra el filtrado al vacío.

El aceite obtenido se vierte en 200 ml de agua. El precipitado obtenido se filtra, se vuelve a lavar en 100 ml de agua a temperatura ambiente.

Se filtra el precipitado y se seca al vacío.

Se aíslan 5,7 g con un rendimiento del 79,2%.

Rf = 0,29 sobre sílice (MERCK) en CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH (5/5)

HPLC: Columna Symmetry Waters C18, 5 \mum, (250 mm \times 4,6 mm) Gradiente: agua-TFA (pH 2,95)/CH_{3}CN: \lambda = 220 nm

44

Tiempo de retención del producto esperado: 22,7 min.

Espectro de masas: m/z = 684,3 (modo ES^{+}) (M teórica = 683)

\vskip1.000000\baselineskip

6) N^{1}-[(1R)-2-[(5-aminofenil)amino]-1-(1H-indol-3-ilmetil)-2-oxoetil]-N^{4}-hidroxi-2-isobutil-succinamida

Se disuelven 0,32 g de (8R)-8-(1H-indol-3-ilmetil)-11-isobutil-7,10,13-trioxo-16-fenil-15-oxa-6,9,14-triazahexadec-1-ilcarbamato de bencilo en 30 ml de metanol. Se añade a la solución media espátula de Pd/C al 50% hidratado.

Se agita el conjunto 4 horas y treinta minutos a temperatura ambiente bajo 3,4 atm de hidrógeno. Se elimina el catalizador por filtración sobre Clarcel y el filtrado se concentra al vacío. Rendimiento cuantitativo.

El producto obtenido se purifica sobre 5 g de gel de sílice 60 silanizado de Merck (63-200 \mum). Elución del producto esperado por H_{2}O.

Se aíslan 0,11 g con un rendimiento del 51%.

HPLC: Columna Symmetry Waters C18, 5 \mum, (250 mm \times 4,6 mm) Gradiente: agua-TFA (pH 2,95)/CH_{3}CN: \lambda = 220 nm

45

Tiempo de retención del producto esperado: 9,4 min.

Espectro de masas: m/z = 460,3 (modo ES^{+}) (M teórica = 459)

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Ejemplo 23

Preparación del compuesto I 1) O-(2-paratoluensulfoniletil)-O'-metilpolietilenglicol 1100

Se disuelven en 25 ml de diclorometano 16,2 g de polietilenglicol monometiléter de masa media 1100 (Fluka®). Esta solución se enfría a una temperatura de 5ºC.

Se añaden a continuación a 5ºC, 0,4 g de cloruro de trietilbencilamonio, 10,4 ml de una solución acuosa al 30% de hidróxido sódico y después 2,94 g de cloruro de paratoluensulfonilo en solución en 15 ml de CH_{2}Cl_{2}.

Se prosigue la reacción 24 horas a temperatura ambiente. La extracción del medio de reacción conduce, después de secado sobre sulfato de magnesio y evaporación, a 17,2 g de sólido. El rendimiento es del 95%.

CCM: SiO_{2} Merck® Eluyente: diclorometano/metanol: 9/1.

Revelado: UV 254 nm y Draggendorf. Rf = 0,4

\blacklozenge Infrarrojo: 1356 cm^{-1} (v: R-O-SO_{2}-R)

\vskip1.000000\baselineskip

2) O-(2-azidoetil)-O'-metilpolietilenglicol 1100

Se disuelven a temperatura ambiente 12,4 g de O-(2-paratoluensulfoniletil)-O'-metilpolietilenglicol 1100 en 90 ml de DMF. Se introducen a continuación 2 g de azida sódica. Se mantiene la agitación 18 horas a temperatura ambiente. La extracción del medio de reacción por el CH_{2}Cl_{2} conduce, tras la evaporación, a 4,4 g de compuesto. El rendimiento es del 40%.

CCM: SiO_{2} Merck® Eluyente: diclorometano/metanol: 9/1.

Revelado: UV 254 nm y Draggendorf. Rf = 0,4

\blacklozenge Infrarrojo: 2104 cm^{-1} (v: N_{3})

3) O-(2-aminoetil)-O'metilpolietilenglicol 1100

Se introducen en el autoclave 4,3 g de O-(2-azidoetil)-O'-metilpolietilenglicol 1100 y 0,4 g de Pd/C (5%) en solución en 100 ml de etanol. La reacción se conduce bajo una presión de hidrógeno de 2,5 bares, a 25ºC, durante 4 horas.

Se elimina el catalizador por filtración sobre Celite. Tras la evaporación, se aíslan así 3,5 g con un rendimiento del 85%.

CCM: SiO_{2} Merck® Eluyente: diclorometano/metanol: 9/1

Revelado: Nihidrina específica "amina primaria"

\blacklozenge Infrarrojo: 3390 cm^{-1} (v NH_{2})

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Ejemplo 24

Preparación del compuesto J 1) 3-{2-[2-(3-aminopropoxi)etoxi]etoxi}propilcarbamato de terc-butilo

A 15 g de 3-{2-[2-(3-aminopropoxi)etoxi]etoxi}-1-propanamina disuelta en 100 ml de CH_{2}Cl_{2} se añade, mediante un embudo de decantación, una solución de 5 g de dicarbonato de di(terc-butilo) disuelto en 50 ml de CH_{2}Cl_{2}.

Se agita el medio de reacción a temperatura ambiente durante 18 horas y después se concentra hasta la mitad para lavar con agua (50 ml), se seca y se concentra. La solución obtenida se filtra sobre sílice MERCK Geduran® (40-63 \mum) con acetato de etilo y después metanol.

Se obtienen 4,7 g de producto con un rendimiento del 64%.

Espectro de masas: M/z = 321,3 (ES+) M teórica = 320,4.

CCM: Rf = 0,05; sílice SiO_{2}; eluyente = CH_{2}Cl_{2}/MeOH/NH_{4}OH (93/7 vestigios)

\vskip1.000000\baselineskip

2) 16-cloro-15-oxo-4,7,10-trioxa-14-azahexadec-1-ilcarbamato de terc-butilo

En un matraz de tres bocas provisto de un baño de acetona y de hielo se pone en solución 10 g de 3-{2-[2-(3-aminopropoxi)etoxi]etoxi}policarbamato de terc-butilo en 50 ml de CH_{2}Cl_{2}. Por medio de un embudo de decantación se añaden gota a gota y simultáneamente 5 g de K_{2}CO_{3} disuelto en 50 ml de agua y 5 g de cloruro de cloroacetilo disuelto en 50 ml de CH_{2}Cl_{2}. En el curso de la adición, se mantiene a 0ºC la temperatura del medio.

Cuando se ha acabado la adición de los reactivos, se mantiene el medio de reacción en agitación magnética, a temperatura ambiente durante 1 hora.

Se separan las 2 fases obtenidas y después la fase clorometilénica se lava con agua hasta pH neutro, se seca sobre Na_{2}SO_{4}, se filtra y después se concentra.

Se obtienen 11,2 g de producto con un rendimiento del 90%.

Espectro de masas: M/z = 397,4 (ES+) M teórica = 396,9

CCM: Rf = 0,6; sílice SiO_{2}; eluyente = CH_{2}Cl_{2}/MeOH (9/1)

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3) 30-amino-15-oxo-4,7,10,21,24,27-hexaoxa-14,17-diazatriacont-1-ilcarbamato de terc-butilo

Se diluyen 6,8 g de 3-{2-[2-(3-aminopropoxi)etoxi]etoxi}propilamina en 50 ml de CH_{3}CN en presencia de K_{2}CO_{3}. A esta suspensión se añaden, por medio de un embudo de decantación, 3,5 g de 16-cloro-15-oxo-4,7,10-trioxa-14-azahexadec-1-ilcarbamato de terc-butilo disuelto en 25 ml de CH_{3}CN.

Se calienta a reflujo el medio de reacción durante 2 horas y después se pone a temperatura ambiente por filtración sobre vidrio fritado. El filtrado se evapora a sequedad a continuación.

Se disuelve el residuo en 50 ml de CH_{2}Cl_{2} para hacer lavados 4 veces con 20 ml de agua. Se seca la fase clorometilénica sobre Na_{2}SO_{4}, se filtra y se concentra suficientemente para realizar directamente una purificación sobre Silice Merck Geduran® (40-63 \mum) con una elución CH_{2}Cl_{2}/MeOH (50/50) (factor de retención Rf = 0,15).

Se obtienen 1,8 g con un rendimiento del 50%.

HPLC: Columna Symmetry C18 (3,5 \mum) 50\times2,1 mm

- Detector: UV 201 nm

- Fase móvil:

A:

Agua + TFA (pH 2,8)

B:

CH_{3}CN

46

El producto esperado tiene un tiempo de retención = 1,8 min.

Espectro de masas: M/z = 581 (ES+) M teórica = 580,7

\vskip1.000000\baselineskip

4) 30-[(2-etoxi-3,4-dioxo-1-ciclobuten-1-il)amino]-15-oxo-4,7,10,21,24,27-hexaoxa-14,17-diazatriacont-1-ilcarbamato de terc-butilo

Se ponen en solución 0,25 g de 30-amino-15-oxo-4,7,10,21,24,27-hexaoxa-14,17-diazatriacont-1-ilcarbamato de terc-butilo en 1,5 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se añaden 57,5 \mul de 3,4-dietoxi-3-ciclobuteno-1,2-diona.

Se pone en agitación magnética el medio reaccional durante 18 horas a temperatura ambiente. Este intermedio no se aísla.

HPLC: Columna Symmetry C18 (3,5 \mum) 50\times2,1 mm

- Detector: UV 201 nm

- Fase móvil:

A:

Agua + TFA (pH 2,8)

B:

CH_{3}CN

47

El producto esperado tiene un tiempo de retención de 2,30 min.

\vskip1.000000\baselineskip

5) 17-acetil-30-[(2-etoxi-3,4-dioxo-1-ciclobuten-1-il)amino]-15-oxo-4,7,10,21,24,27-hexaoxa-14,17-diazatriacont-1-ilcarbamato de terc-butilo

Al medio de reacción obtenido en la etapa 4) se añaden 40,6 \mul de anhídrido acético. Se agita el medio de reacción a temperatura ambiente y después se purifica directamente sobre 5 g de Silice Merck Geduran® (40-63 \mum) a presión atmosférica, con un eluyente CH_{2}Cl_{2}/EtOH (9/1).

Se obtienen 0,27 g de producto en forma de aceite con un rendimiento del 60%.

Espectro de masas: M/z = 748 (ES+) M teórica = 746,9

\vskip1.000000\baselineskip

6) Ácido 1-({2-[(14-acetil-34,34-dimetil-16,32-dioxo-4,7,10,21,27,33-heptaoxa-14,17,31-triazapentatriacont-1-il)amino]-3,4-dioxo-1-ciclobuten-1-il}amino)-18-[(4-{[(2-amino-4-oxo-3,4-dihidro-6-pteridinil)metil]amino}benzoil)amino]-15-oxo-4,7,10-trioxa-14-azanonadecan-19-oico

Se disuelven en 3 ml de agua 0,16 g de 17-acetil-30-[(2-etoxi-3,4-dioxo-1-ciclo-buten-1-il)amino]-15-oxo-4,7,10,21,24,27-hexaoxa-14,17-diazatriacont-1-ilcarbamato de terc-butilo y 0,205 g del ejemplo 6 (compuesto F).

Se añaden gotas de agua saturada en Na_{2}CO_{3} en el medio para obtener un pH = 9,2. Se mantiene el medio en agitación magnética durante 18 horas y después se filtra sobre papel Whatmann, neutralizado con ayuda de HCl (1 N) y se recoge en 15 ml de CH_{2}Cl_{2}.

La fase clorometilénica se lava con 1 ml de agua y después se seca sobre Na_{2}SO_{4}, se filtra y se evapora. Se recoge el residuo en 10 ml de EtOH para ser precipitado en 100 ml de Et_{2}O.

Se obtienen 0,2 g de cristales (color naranja azafrán) con un rendimiento del 69%.

HPLC: Columna Symmetry C18 (3,5 \mum) 50\times2,1 mm

- Detector: UV 201 nm

- Fase móvil:

A:

Agua + TFA (pH 2,8)

B:

CH_{3}CN

48

El producto esperado tiene un tiempo de retención = 2,40 min.

Espectro de masas: M/z = 673 (z=2; ES+) M teórica = 1344,5

\vskip1.000000\baselineskip

7) Ácido 1-({2-[(14-acetil-30-amino-16-oxo-4,7,10,21,24,27-hexaoxa-14,17-diazatriacont-1-il)amino]-3,4-dioxo-1-ciclobuten-1-il}amino)-18-[(4-{[(2-amino-4-oxo-3,4-dihidro-6-pteridinil)metil]amino}benzoil)amino]-15-oxo-4,7,10-trioxa-14-azanonadecan-19-oico

Se ponen en solución 0,2 g del ácido 1-({2-[(14-acetil-34,34-dimetil-16,32-dioxo-4,7,10,21,27,33-heptaoxa-14,17,31-triazapentatriacont-1-il)amino]-3,4-dioxo-1-ciclo-buten-1-il}amino)-18-[(4-{[(2-amino-4-oxo-3,4-dihidro-6-pteridinil)metil]amino}benzoil)-amino]-15-oxo-4,7,10-trioxa-14-azanonadecan-19-oico en 2 ml de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente.

A continuación se precipita el medio de reacción en 20 ml de Et_{2}O, se filtra y se lava abundantemente con éter etílico.

Se obtienen 0,18 g de cristales con un rendimiento del 78%.

HPLC: Columna Symmetry C18 (3,5 \mum) 50\times2,1 mm

- Detector: UV 201 nm

- Fase móvil:

A:

Agua + TFA (pH 2,8)

B:

CH_{3}CN

49

El producto esperado tiene un tiempo de retención = 1,9 min.

Espectro de masas: M/z = 1245 (ES+) M teórica = 1244,4

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Ejemplo 25

Preparación del compuesto K 1) 35-[(2-etoxi-3,4-dioxo-1-ciclobuten-1-il)amino]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-undecaoxapentatriacont-1-ilcarbamato de terc-butilo

Se disuelven a temperatura ambiente en 4 ml de EtOH, 0,8 g de 35-amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-undecaoxapentatriacont-1-ilcarbamato de terc-butilo. Se añaden a esta solución 165 \mul de 3,4-dietoxi-3-ciclobuteno-1,2-diona.

Se agita el conjunto a temperatura ambiente durante 18 horas. Tras la evaporación del disolvente, se obtiene el residuo en 5 ml de CH_{2}Cl_{2} para ser purificado sobre 30 g de sílice MERCK Geduran® (4-63 \mum) con un eluyente compuesto de CH_{2}Cl_{2}/MeOH (95/5).

Se obtienen 0,6 g de aceite con un rendimiento del 70%.

CCM: Rf = 0,5; sílice SiO_{2}; eluyente = CH_{2}Cl_{2}/MeOH (9/1)

HPLC: Columna Symmetry C18 (3,5 \mum) 50\times2,1 mm

- Detector: UV 201 nm

- Fase móvil:

A:

Agua + TFA (pH 2,8)

B:

CH_{3}CN

50

El producto esperado tiene un tiempo de retención de 2,78 min.

Espectro de masas: M/z = 769,5 (ES+) M teórica = 768,9

\vskip1.000000\baselineskip

2) Ácido 18-[(4-{[(2-amino-4-oxo-3,4-dihidro-6-pteridinil)metil]amino}benzoil)amino]-1-({2-[(39,39-dimetil-37-oxo-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,38-dodecaoxa-36-azatetra-cont-1-il)amino]-3,4-dioxo-1-ciclobuten-1-il}amino)-15-oxo-4,7,10-trioxa-14-azanona-decan-19-oico

Se disuelven en 4,5 ml de agua y 0,7 ml de EtOH, 0,3 g de 35-[(2-etoxi-3,4-dioxo-1-ciclobuten-1-il)amino]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-undecaoxapentatriacont-1-ilcarbamato de terc-butilo y 0,34 g del ejemplo 6 (compuesto F).

El pH del medio se aumenta a 9,2 con gotas de agua saturada en Na_{2}CO_{3}. Se agita el medio de reacción a temperatura ambiente durante 48 horas manteniendo el pH a 9,2.

Tras la evaporación del etanol, se purifica la solución acuosa obtenida en un sistema de columna cromatográfica "Supervarioflash®" con un cartucho K026033 (RP 18; 25-40 \mum) con un eluyente agua/CH_{3}CN (98/2) y un caudal de 20 ml/min.

Se obtienen 100 mg de producto con un rendimiento del 25%.

HPLC: Columna Symmetry C18 (3,5 \mum) 50\times2,1 mm

- Detector: UV (275 nm)

- Fase móvil:

A:

Agua + TFA (pH 2,8)

B:

CH_{3}CN

51

El producto esperado tiene un tiempo de retención de 2,40 min.

Espectro de masas: M/z = 684 (z=2; ES+) M teórica = 1366,5

\vskip1.000000\baselineskip

3) Ácido 18-[(4-{[(2-amino-4-oxo-3,4-dihidro-6-pteridinil)metil]amino}benzoil)amino]-1-({2-[(35-amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-undecaoxapentatriacont-1-il)amino]-3,4-dioxo-1-ciclobuten-1-il}amino)-15-oxo-4,7,10-trioxa-14-azanonadecan-19-oico

Se disuelven en 0,3 ml de ácido trifluoroacético, 0,3 g de ácido 18-[(4-{[(2-amino-4-oxo-3,4-dihidro-6-pteridinil)metil]amino}benzoil)amino]-1-({2-[(39,39-dimetil-37-oxo-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,38-dodecaoxa-36-azatetracont-1-il)amino]-3,4-dioxo-1-ciclobuten-1-il}amino)-15-oxo-4,7,10-trioxa-14-azanonadecan-19-oico.

Después de 15 minutos de agitación a temperatura ambiente, se evapora el medio de reacción y después se recoge en 30 ml de Et_{2}O.

Tras la filtración, lavado con Et_{2}O y secado, se obtienen 0,29 g de producto.

HPLC: Columna Symmetry C18 (3,5 \mum) 50\times2,1 mm

- Detector: UV (275 nm)

- Fase móvil:

A:

Agua + TFA (pH 2,8)

B:

CH_{3}CN

52

El producto esperado tiene un tiempo de retención de 1,87 min.

Espectro de masas: M/z = 1267 (ES+) M teórica = 1266,4

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Ejemplos 26 a 37: Acoplamiento de partículas magnéticas ácidas (p) acomplejadas por compuestos de fórmula (I) con biovectores

Ejemplo 26

1) Se introducen 102,5 mg del compuesto F del ejemplo 6 en 50 ml del ejemplo 12 a 0,285 M/l. Se añaden 76,6 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Se ajusta el pH a 6,2 y se agita el conjunto 18 horas a temperatura ambiente.

Se ultrafiltra directamente el medio de reacción en una célula con agitación PALL® que tiene un umbral de corte de 30 kD. Lo retenido se ajusta a 65 ml y después se filtra sobre 0,22 \mum dando la solución A.

108

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2) Se introducen 3 g del compuesto E del ejemplo 5 en 50 ml de la solución A obtenida en la etapa 1). Se añaden 600 ml de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Se ajusta el pH a 6,2 y se agita el conjunto 18 horas a temperatura ambiente.

Se ultrafiltra directamente el medio de reacción en una celda en agitación PALL® con un umbral de corte de 30 kD. Lo retenido se ajusta a 40 ml y después se filtra sobre 0,22 \mum..

109

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Ejemplo 27

Se introducen 36,5 mg del compuesto F del ejemplo 6 en 30 ml del ejemplo 12 a 0,285 M/l. Se ajusta el pH a 6,2 y se añaden 18 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Se agita el conjunto 18 horas a temperatura ambiente.

Se ultrafiltra directamente el medio de reacción en una célula en agitación PALL® que tiene un umbral de corte de 30 kD. Lo retenido se ajusta a 65 ml y después se filtra sobre 0,22 \mum.

110

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Ejemplo 28

1) 9H-fluoren-9-ilmetil-6-(fosfonooxi)hexilcarbamato

Se ponen en solución en 9 ml de heptano, 1,33 ml de POCl_{3} y 1,83 ml de trietilamina. Se introducen gota a gota a la solución anterior 3 g de 6-(FMOC-amino)-1-hexanol en solución en 30 ml de CH_{2}Cl_{2} manteniendo una temperatura de 0ºC.

Se agita el medio de reacción 1 hora a 0ºC y después 18 horas a temperatura ambiente. Se añaden 30 ml de agua y el conjunto se agita 2 horas a temperatura ambiente.

Se lava la fase orgánica con agua y después se concentra al vacío. Se recoge el sólido resultante con agua, se filtra y se seca.

Se obtienen 3 g de producto con un rendimiento del 81% y una pureza HPLC del 60%.

HPLC: Columna X-TERRA C18 (5 \mum) 250\times4,6 mm

- Detector: UV 201 nm

- Fase móvil:

A:

Solución de carbonato de amonio pH = 9

B:

CH_{3}CN

53

El producto esperado tiene un tiempo de retención = 14,1 min.

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2) 15-[(terc-butoxicarbonil)amino]-1-(9H-fluoren-9-il)-12-hidroxi-3-oxo-2,11,13-trioxa-4-aza-12-fosfahexadecan-16-oato-12-óxido de terc-butilo

Se disuelven 3 g de 6-(fosfonooxi)hexilcarbamato de 9H-fluoren-9-ilmetilo y 3,73 g de Boc-serina-OtBu en 54 ml de piridina. Se añade gota a gota una solución de 6,49 de bencenosulfocloruro de triisopropilo en 42 ml de piridina. Se agita el conjunto a temperatura ambiente durante 48 horas.

Se añaden 30 ml de agua y se agita el conjunto durante 4 horas y después se concentra al vacío. Se recoge el residuo obtenido en 100 ml de éter etílico.

Se elimina por filtración el insoluble. Se concentra al vacío el filtrado y se purifica a continuación sobre sílice (elución: CH_{2}Cl_{2} 95%-MeOH 5%).

HPLC: Columna X-TERRA C18 (5 \mum) 250\times4,6 mm

- Detector: UV 201 nm

- Fase móvil:

A:

Solución de carbonato de amonio pH = 9

B:

CH_{3}CN

54

El producto esperado tiene un tiempo de retención = 20 min.

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3) 3-{[[(6-aminohexil)oxi](hidroxi)fosforil]oxi}-2-[(terc-butoxicarbonil)amino]propanoato de terc-butilo

Se agitan 3 g de 15-[(terc-butoxicarbonil)amino]-1-(9H-fluoren-9-il)-12-hidroxi-3-oxo-2,11,13-trioxa-4-aza-12-fosfahexadecan-16-oato-12-óxido de terc-butilo en 0,62 ml de piperidina y 3 ml de agua durante 12 horas a temperatura ambiente. Se filtra el medio de reacción y se lavan 2 veces los cristales con 50 ml de acetonitrilo y después se recristaliza en 100 ml de acetonitrilo.

Espectro de masas: M/z = 441,3 (ES+) M teórica = 440

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4) Ácido 16-(terc-butoxicarbonil)-13-hidroxi-20,20-dimetil-13-óxido-4,18-dioxo-1-fosfono-12,14,19-trioxa-5,17-diaza-13-fosfahénicos-1-ilfosfónico

Se introducen 106 mg de 3-{[[(6-aminohexil)oxi](hidroxi)fosforil]oxi}-2-[(terc-butoxicarbonil)amino]propanoato de terc-butilo en solución en 2 ml de agua en una solución de 50 ml del compuesto A del ejemplo 1 en 4 ml de agua. Se ajusta el pH a 6,2 y se añaden 60 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Se agita el conjunto 24 horas a temperatura ambiente.

Se purifica el producto obtenido en Silice 60 silanizada Merck (63-200 \mum) con una elución en gradiente (agua/metanol) con un seguimiento por HPLC.

Se obtienen 70 mg con un rendimiento del 52%.

Espectro de masas: M/z = 671,2 (ES+) M teórica = 670

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5) Ácido 17-amino-1,1,14-trihidroxi-5-oxo-2-fosfono-13,15-dioxa-6-aza-1\lambda^{5},14-difosfaoctadecan-18-oico-1,14-dioxido

55

Se ponen en agitación en 1 ml de TFA durante 2 horas 60 mg de ácido 16-(terc-butoxicarbonil)-13-hidroxi-20,20-dimetil-13-óxido-4,18-dioxo-1-fosfono-12,14,19-trioxa-5,17-diaza-13-fosfahénicos-1-ilfosfónico.

Se evapora la solución al vacío y se obtienen 46 mg de producto con un rendimiento cuantitativo.

Espectro de masas: M/z = 515,1 (ES+) M teórica = 514

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6) Se añaden gota a gota 31 mg de ácido 17-amino-1,1,14-trihidroxi-5-oxo-2-fosfono-13,15-dioxa-6-aza-1\lambda^{5},14-difosfaoctadecan-18-oico-1,14-dioxido en solución en 100 ml de agua a una solución de 1 ml del ejemplo 9 (ferrofluido ácido) a 2,742 M/l diluido en 100 ml de agua. Se agita el conjunto durante 20 minutos a temperatura ambiente y se ajusta el pH a 7,2.

La solución obtenida se ultrafiltra en una celda con agitación PALL® que tiene un umbral de corte de 30 kD. Se eliminan 300 ml de filtrado para obtener una solución final de 10 ml.

111

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Ejemplo 29

Se disuelven 1,75 g del compuesto I del ejemplo 23 en 30 ml del ejemplo 12 a 0,285 M/l y se ajusta el pH a 6,5. Se añaden 368 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Se agita el conjunto a temperatura ambiente durante 24 horas. Se ultrafiltra la solución en una solución PALL® en agitación con un umbral de corte de 30 kD. Se eliminan 800 ml de filtrado. Lo retenido se ajusta a 15 ml.

112

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Ejemplo 30

Se disuelven 0,9 g del compuesto O-(2-aminometil)-O'-metilpolietilenglicol 750 [Amino-PEG750; Fluka] en 22 ml del ejemplo 12 a 0,285 M/l y se ajusta el pH a 6,5. Se añaden 280 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Se agita el conjunto a temperatura ambiente durante 24 horas. Se ultrafiltra la solución en una solución PALL® en agitación con un umbral de corte de 30 kD. Se eliminan 800 ml de filtrado. Lo retenido se ajusta a 20 ml.

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113

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Ejemplo 31

Se disuelven 3,14 g del compuesto O-(2-aminometil)-O'-metilpolietilenglicol 2000 [Amino-PEG2000; Fluka] en 30 ml del ejemplo 12 a 0,285 M/l y se ajusta el pH a 6,5. Se añaden 368 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Se agita el conjunto a temperatura ambiente durante 24 horas. Se ultrafiltra la solución en una celda PALL® en agitación con un umbral de corte de 30 kD. Se eliminan 800 ml de filtrado. Lo retenido se ajusta a 25 ml.

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114

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Ejemplo 32

Se introducen 180 mg del compuesto J del ejemplo 24 en 46 ml del ejemplo 12 (concentración: 0,285 moles/l en hierro) y se ajusta el pH a 6,2.

Se añaden a esta solución 50 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilcarbodiimida. Se agita el conjunto 8 horas a temperatura ambiente. Se vuelven a añadir al medio de reacción 50 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilcarbodiimida y se mantiene la agitación 16 horas.

Se ultrafiltra el medio de reacción en una celda PALL® en agitación con un umbral de corte de 30 kD.

Lo retenido se ajusta a 55 ml y después se filtra en 0,22 \mum.

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115

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Ejemplo 33

Se introducen, en 20 ml del compuesto del ejemplo 32, 750 mg de O-(2-aminoetil)-O'-metilpolietilenglicol 750 (éster metílico de amino-PEG 750® - Fluka) a 0,273 M/l en hierro y el pH se ajusta a 6,2.

Se añaden 200 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilcarbodiimida a la solución anterior. Se agita el conjunto 8 horas a temperatura ambiente. Se vuelven a añadir 200 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilcarbodiimida al medio de reacción y se mantiene la agitación 16 horas.

Se ultrafiltra directamente el medio de reacción en una celda PALL® en agitación con un umbral de corte de 30 kD. Lo retenido se ajusta a 25 ml y después se filtra en 0,22 \mum.

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116

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Ejemplo 34

Se introducen 1,13 g (compuesto E) en 20 ml del ejemplo 32 a 0,273 M/l en hierro y se ajusta el pH a 6,2.

Se añaden a esta solución 200 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilcarbodiimida. Se agita el conjunto 8 horas a temperatura ambiente.

Se vuelven a añadir entonces al medio de reacción 200 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilcarbodiimida y se mantiene la agitación 16 horas.

\newpage

Se ultrafiltra directamente el medio de reacción en una celda PALL® en agitación con un umbral de corte de 30 kD. Lo retenido se ajusta a 25 ml y después se filtra en 0,22 \mum.

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118

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Ejemplo 35

Se introducen 0,29 g del compuesto K del ejemplo 2 en 74 ml del ejemplo 12 (concentración: 0,285 moles/l en hierro) y se ajusta el pH a 6,2.

Se añaden a esta solución 82 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilcarbodiimida. Al cabo de 8 horas se vuelven a añadir entonces al medio de reacción 82 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilcarbodiimida y se mantiene la agitación 16 horas.

Se ultrafiltra directamente el medio de reacción en una celda PALL® en agitación con un umbral de corte de 30 kD. Lo retenido se ajusta a 75 ml y después se filtra en 0,22 \mum.

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Ejemplo 36

Se introducen, en 20 ml del compuesto del ejemplo 35, 1 g de O-(2-aminoetil)-O'-metilpolietilenglicol 750 (éster metílico de amino-PEG 750® - Fluka) (C=0,273 M/l en hierro) y el pH se ajusta a 6,2.

Se añaden 274 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilcarbodiimida a esta solución. Se agita el conjunto 8 horas a temperatura ambiente. Al cabo de 8 horas, se vuelven a añadir entonces 274 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilcarbodiimida al medio de reacción y se mantiene la agitación 16 horas.

\newpage

Se ultrafiltra directamente el medio de reacción en una celda PALL® en agitación con un umbral de corte de 30 kD. Lo retenido se ajusta a 26 ml y después se filtra en 0,22 \mum.

120

Ejemplo 37

Se introducen 1,61 g del ejemplo 5 (compuesto E) en 25 ml del ejemplo 35 (C=0,273 M/l en hierro) y se ajusta el pH a 6,2.

Se añaden a esta solución 274 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilcarbodiimida. Se agita el conjunto 8 horas a temperatura ambiente. Al cabo de 8 horas, se vuelven a añadir entonces al medio de reacción 274 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilcarbodiimida y se mantiene la agitación 16 horas.

Se ultrafiltra directamente el medio de reacción en una celda PALL® en agitación con un umbral de corte de 30 kD. Lo retenido se ajusta a 28 ml y después se filtra en 0,22 \mum.

121

Pruebas de afinidad de partículas magnéticas ácidas (p) acomplejadas por compuestos de fórmula (I) y acopladas con biovectores, para determinadas dianas biológicas 1/ Prueba de afinidad del ejemplo 17 para la Folate Binding Protein (FBP) por la técnica BiaCore Reactivos

56

Tampón HBS: Hepes 10 mM pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 4,3 mM y NP20 a 0,005%

Tampón PGM: KH_{2}PO_{4} 100 mM pH 7, glicerol 10% y \beta-mercaptoetanol 4 mM.

La inmovilización de la FBP se ha realizado a 1 mg/ml en el tampón PGM según los protocolos recomendados por BIAcore para el acoplamiento a las aminas. Después, los agrupamientos carboxilados activos restantes son saturados por etanolamina 1 M pH = 8. La cantidad fijada de FBP corresponde aproximadamente a 1,5 ng/mm^{2}.

El ejemplo 17 estaba a una concentración de 0,170 moles/l en hierro lo que corresponde a 1,9.10^{-5} moles de partículas/l (considerando un cristal de 7,5 nm o sea 8900 átomos de hierro/partícula).

La fijación del folato ha sido seguida en cuatro concentraciones diferentes (125, 250, 500 y 1.000 \muM) mientras que la del ejemplo 17 se ha realizado a 10 \muM y a 10 nM (expresada en moles de partículas/l). La asociación y la disociación se han estudiado con un caudal de 25 \mul/min. Las fases de asociación y de disociación son de 5 minutos.

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Resultados

57

Estos resultados demuestran que la afinidad del ejemplo 17 para la Folate Binding Protein (FBP) es muy elevada con una constante de afinidad KD inferior a la picomolar (expresados en moles de partícula/l).

Sabiendo que el receptor al ácido fólico (representado aquí por la FBP) está muy sobreexpresado a nivel de determinadas células tumorales (cáncer de ovario, pulmones, colon y seno) y en puntos inflamatorios (en particular en la poliartritis reumatoide), puede utilizarse el ejemplo 17 con ventaja como agente de contraste IRM específico en oncología y en las enfermedades inflamatorias.

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2/ Actividad inhibidora del ejemplo 27 para metalproteasas MMP-1 y MMP-3 humanas

El ejemplo 27 esta cubierto en su superficie por un biovector (ejemplo 22: compuesto H) derivado del ilomastat, pseudopéptido reconocido como inhibidor potente de metalproteasas con cinc (metalproteinasa de la matriz: MMP).

La actividad inhibidora del ejemplo 27 sobre las metalproteasas de la matriz MMP-1 y MMP-3 humanas se ha evaluado in vitro. Se ha comparado a la del ejemplo 12 (partícula no funcionalizada por el compuesto H) y a la del péptido de referencia, el ilomastat. El protocolo de medición del efecto inhibidor de diferentes productos sobre MMP-1 ha sido el siguiente:

-

Principio: evaluación del efecto inhibidor del producto probado sobre la actividad de una MMP-1 humana (aislada de fibroblastos humanos del líquido sinovial reumatoide), cuantificado por fluorimetría (\lambdaex=340 nm, \lambdaem=440 nm; medición de la formación de Cys(Me)-His-Ala-Lys-(n-Me-Abz)-NH_{2} por escisión del sustrato DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys-(n-Me-Abz)-NH_{2}; protocolo descrito en la referencia bibliográfica Bickett et al. (1993) Anal. Biochem.; 212:58.

El producto de referencia utilizado en esta prueba ha sido el GM6001 (Ilomastat, Galardin IC_{50} = 1,9.10^{-9} M).

Más exactamente, el producto a determinar, o el producto de referencia o agua, se ha añadido a una solución tampón a pH = 7, que contiene 7 nM en MMP-1. La intensidad en fluorescencia de este medio ha sido evaluada inmediatamente a \lambdaex=340 nm y \lambdaem=440 nm mediante un lector de placas (Géminis, Molecular Devices). Esta medición a t=0 sirve para verificar cualquier interferencia eventual de un producto con la detección fluorescente. A continuación se ha iniciado la reacción enzimática añadiendo el sustrato DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys-(n-Me-Abz)-NH_{2} a una concentración de 10 \muM. Tras una incubación de 40 min. a 37ºC, se ha evaluado de nuevo la fluorescencia a en las mismas condiciones que anteriormente (t=40 min.). Se ha determinado la actividad enzimática sustrayendo la señal medida a t=0 de la señal medida a t=40 min. El resultado final se expresa en porcentaje de inhibición de la actividad enzimática.

El protocolo de medición del efecto inhibidor de diferentes productos sobre MMP-3 ha sido el siguiente:

-

Principio: evaluación del efecto inhibidor del producto probado sobre la actividad de una MMP-3 humana (utilización de una enzima recombinante expresada por la estirpe celular sF9), cuantificación por fluorimetría (\lambdaex=340 nm, \lambdaem=405 nm; medición de la formación de Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala por escisión del sustrato Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met-Lys(DNP)-NH_{2}(NFF2); protocolo descrito en la referencia: Nagase et al. (1994) J. Biol. Chem.; 269: 20952.

El producto de referencia utilizado en esta prueba ha sido el GM6001 (Ilomastat, Galardin IC_{50} = 1,3.10^{-7} M).

Más exactamente, el producto a determinar, o el producto de referencia o agua, se ha añadido a una solución tampón a pH = 6, que contiene 6 nM en MMP-3. La fluorescencia de este medio ha sido evaluada a \lambdaex=340 nm y \lambdaem=405 nm mediante un lector de placas (Géminis, Molecular Devices), después de una preincubación de 30 min. a 37ºC (t=0). Esta medición a t=0 sirve para verificar cualquier interferencia eventual de un producto con la detección fluorescente. A continuación se ha iniciado la reacción enzimática añadiendo el sustrato NNF-2 10 \muM. Tras una incubación de 90 min. a 37ºC, se ha evaluado de nuevo la fluorescencia a en las mismas condiciones que anteriormente (t=90 min.). Se ha determinado a continuación la actividad enzimática sustrayendo la señal medida a t=0 de la señal medida a t=90 min.

El resultado final se expresa en porcentaje de inhibición de la actividad enzimática.

Los resultados de la inhibición de las MMP-1 y -3 humanas para el ejemplo 27 se representan en la tabla 1.

TABLA 1

58

El ejemplo 27 inhibe MMP-1 entre 0,87 \times 10^{-10} y 0,87 \times 10^{-8} (expresada en concentración del compuesto H), lo que está de acuerdo con el valor experimental obtenido para el péptido de referencia - Ilomastat -(IC_{50} = 1,9 \times 10^{-9} M).

El ejemplo 27 inhibe MMP-3 entre 0,87 \times 10^{-8} y 0,87 \times 10^{-6} (expresada en concentración del compuesto H), lo que está de acuerdo con el valor experimental obtenido para el péptido de referencia - Ilomastat -(IC_{50} = 1,3 \times 10^{-7} M).

Los resultados obtenidos con el ejemplo 27 en las MMP-1 y MMP-3 demuestran que las partículas de óxido de hierro preparadas por el solicitante se comportan de manera muy similar al péptido de referencia (ilomastat). El compuesto del ejemplo 27 puede utilizarse como inhibidor de amplio espectro frente a las metalproteasas (MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 y MMP-9) y así como agente de contraste IRM específico muy útil para diagnosticar por la imagen zonas patológicas en las que se sobreexpresan estas diferentes MMP.

Claims (40)

1. Composición que comprende partículas magnéticas ácidas (p) a base de un compuesto de hierro, estando dichas partículas magnéticas ácidas (p) acomplejadas por uno o varios compuestos gem-bisfosfonatos, de fórmula (I):

(I)X-L-CH(PO_{3}H_{2})_{2}

en la que:

-

\vtcortauna L representa un grupo orgánico que relaciona la función X a la función gem-bisfosfonato -CH(PO_{3}H_{2})_{2}; seleccionado entre

\quad

un grupo -(CH_{2})_{p}- en el que p es un número entero de 1 a 5;

\quad

un grupo fenileno opcionalmente sustituido, pudiendo estar los grupos X y gem-bisfosfonatos en posición orto, meta o para;

\quad

una cadena alifática lineal que comprende de 1 a 6 átomos de carbono sustituida por un grupo aromático;

\quad

un grupo -L_{1}-NHCO-L_{2} en el que L_{1} y L_{2} son idénticos o diferentes y representan un grupo alifático lineal que comprende de 1 a 6 átomos de carbono o una cadena alifática lineal que comprende de 1 a 6 átomos de carbono sustituida por un grupo aromático,

\quad

pudiendo estar dichos grupos opcionalmente sustituidos por un grupo metilo, hidroxi, metoxi, acetoxi, amido o un átomo de cloro, de yodo o de bromo,

\quad

X representa una función química susceptible de formar un enlace covalente con un biovector seleccionado entre -COOH, -NH_{2}, -NCS, -NH-NH_{2}, -CHO, maleimidilo, alquilpirrocarbonilo, acilazidilo, iminocarbonato, vinilsulfurilo, piridil-disulfurilo, haloacetilo, diclorotriazinilo, halógeno, estando eventualmente acopladas dichas funciones X de dichas partículas en todo o parte a un biovector.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que todas o parte de las funciones X están acopladas a un biovector.

3. Composición según la reivindicación 1, en la que L representa un grupo -(CH_{2})_{m}-CONH-(CH_{2})_{n}, en la que n y m representan un número entero de 0 a 5.

4. Composición según la reivindicación 1, en la que X representa -COOH o -NH_{2}.

5. Composición según las reivindicaciones 1 o 4, en la que todo o parte de los compuestos de fórmula (I) a la fórmula (Ia) siguiente:

(Ia)HOOC-(CH_{2})_{2}-CH(PO_{3}H_{2})_{2}

6. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que las partículas (p) están, por término medio, acomplejadas en al menos el 90% de sus zonas protonadas por compuesto de fórmula (I).

7. Composición según una de las reivindicaciones anteriores, en la que los puntos protonados están acomplejados por al menos dos compuestos gem-bisfosfonatos de fórmula (I) de estructura diferente.

8. Composición según una cualquier de las reivindicaciones anteriores, en la que los puntos protonados están acomplejados por al menos dos compuestos gem-bisfosfonatos de fórmula (I) de estructura idéntica.

9. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que las partículas magnéticas (p) están compuestas en la totalidad o parte por hidróxido de hierro, óxido de hierro hidratado, ferritas, óxidos de hierro mixtos o una mezcla de éstos.

10. Composición según la reivindicación 9, en la que las partículas magnéticas (p) están compuestas en su totalidad o parte por una ferrita.

11. Composición según la reivindicación 10, en la que la ferrita es la maghemita o la magnetita o una mezcla de éstas.

12. Composición según una de las reivindicaciones anteriores, en la que las partículas (p) son superparamagnéticas.

13. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que entre el 1 y el 70%, con preferencia entre el 1 y el 50% de las funciones X de los compuestos de fórmula (I) están acoplados a un biovector.

14. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que las funciones X de los compuestos de fórmula I) están acopladas al menos a dos biovectores diferentes.

15. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el biovector se selecciona entre las proteínas opcionalmente recombinantes o mutadas, las glucoproteínas, las lectinas, la biotina, las vitaminas, los fosfolípidos, los derivados del ácido fólico, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, los péptidos y sus derivados, los mono- o polisacáridos, la avidina, la estreptavidina, los inhibidores o sustratos de receptores, los esteroides y sus análogos, los oligonucleótidos, las secuencias del ácido ribonucleico, las secuencias del ácido desoxirribonucleico, las hormonas o sustancias análogas a las hormonas, los aminoácidos y derivados, las moléculas orgánicas con actividad farmacológica, los aminoalcoholes, los agentes de reconocimiento de integrinas o los agentes de reconocimiento de MMP.

16. Composición según la reivindicación 15, en la que el biovector representa un derivado de péptido, con preferencia un agente de reconocimiento de integrina o de MMP.

17. Composición según la reivindicación 15, en la que el biovector representa un derivado del ácido fólico o antifólico.

18. Composición según la reivindicación 15, en la que el biovector representa un derivado de fosfolípdo, en particular un derivado de fosfatidilserina, de fosfatidiletanolamina, de fosfatidilcolina, de fosfatidilinositol, de esfingomielina o los derivados de ceramidas.

19. Composición según la reivindicación 15, en la que el biovector representa una proteína, opcionalmente recombinante o mutada.

20. Composición según la reivindicación 15, en la que el biovector representa un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo opcionalmente funcionalizados.

21. Composición según la reivindicación 15, en la que el biovector representa un farmacóforo opcionalmente funcionalizado.

22. Composición según la reivindicación 15, en la que el biovector se selecciona entre los aminoalcoholes de fórmula general (II)

59

en la que R_{1} y R_{2} son idénticos o diferentes y representan una cadena hidrocarbonada alifática que comprende de 2 a 6 átomos de carbono, sustituida preferentemente por 6 a 10 grupos hidroxilo, o bien por 4 a 8 grupos hidroxilo en el caso en que R_{1} y/o R_{2} está interrumpido por un átomo de oxígeno.

23. Composición según la reivindicación 15, en la que el biovector se selecciona entre los aminopolietilenglicoles.

24. Composición según la reivindicación 22, en la que R_{1} representa un grupo -(CH_{2})-(CHOH)_{4}-CH_{2}OH o -(CH_{2})-CHOH-CH_{2}OH y R_{2} un grupo -CH_{2}(CHOH)_{4}-CH_{2}OH.

25. Composición según la reivindicación 1, en la que el biovector es el compuesto N-[(2,3-dihidroxipropil)(2,3,4,5,6-pentahidroxihexil)]2,4,6-tribromo 5-(glicilamino)isoftalamida o el compuesto N,N'-[bis(2,3,4,5,6-pentahidroxihexil)]2,4,6-tribromo 5-(glicilamino)isoftalamida.

26. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que las funciones X forman un enlace covalente con el biovector de tipo -CONH-, -COO-, -NHCO-, -OCO-, -NH-CS-NH-, -C-S-, -N-NH-CO-, -CO-NH-N-, -CH_{2}-NH-, -N-CH_{2}-, -N-CS-N-, -CO-CH_{2}-S-, -N-CO-CH_{2}-S-, -N-CO-CH_{2}-CH_{2}-S-, -CH=NH-NH-, -NH-NH=CH-, -CH=N-O-, -O-N=CH- así como las formulas siguientes:

60

600

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27. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que las partículas acomplejadas y acopladas a biovector(es) (x) tienen un diámetro hidrodinámico global comprendido entre 5 nm y 200 nm, con preferencia comprendido entre 5 y 60 nm.

28. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la concentración de las partículas (p) en la suspensión está comprendida entre 2 \mumoles l^{-1} y 4 moles l^{-1}, expresada en número de moles de iones metálicos totales.

29. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende uno o varios vehículo(s) y/o aditivo(s) farmacéuticamente aceptables.

30. Composición según la reivindicación 29, caracterizada porque está esterilizada.

31. Procedimiento de preparación de una composición según las reivindicaciones 1 a 30, comprendiendo dicho procedimiento las etapas sucesivas consistentes en:

(i)

poner en contacto una solución ácida de partículas magnéticas ácidas (p) a base de un compuesto de hierro, con compuestos de fórmula (I) tales como los definidos en la reivindicación 1 en cantidad suficiente y recuperación de las partículas acomplejadas obtenidas; dado el caso,

(ii)

realizar el acoplamiento de toda o parte de las funciones X de los compuestos de fórmula (I) acomplejados en la superficie de las partículas magnéticas (p) con biovectores.

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32. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que las partículas magnéticas (p) preparadas en la etapa (i) se obtienen según un procedimiento que comprende las etapas consistentes en:

a)

preparar una solución coloidal de ferrofluido ácido;

b)

tratar la solución obtenida en la etapa a) con una solución de ácido nítrico;

c)

aislar el floculado ácido obtenido en la etapa b); y

d)

realizar una peptización.

33. Producto de contraste para el diagnóstico por imagen por resonancia magnética que comprende partículas magnéticas opcionalmente acopladas a biovectores tales como las definidas en las reivindicaciones 1 a 30, opcionalmente asociadas a un vehículo farmacéuticamente aceptable.

34. Utilización de las composiciones según las reivindicaciones 1 a 30 para la fabricación de un agente de contraste útil para el diagnóstico por la imagen por Resonancia Magnética.

35. Utilización de las composiciones según las reivindicaciones 1 a 30 para la fabricación de un agente de contraste útil para la medicina nuclear.

36. Utilización de las composiciones según las reivindicaciones 2 a 30, en la que el biovector es un ligando específico de un receptor biológico, para la fabricación de un agente de contraste útil para la caracterización y/o el seguimiento terapéutico, principalmente en las enfermedades cardiovasculares, los cánceres o las enfermedades inflamatorias y degenerativas.

37. Utilización de las composiciones según las reivindicaciones 2 a 30, en la que el biovector es un ligando específico de un receptor biológico, para la diferenciación y/o la separación in vitro, en el seno de una mezcla, de componentes que llevan una diana de dicho biovector y de componentes que no llevan dicha diana.

38. Utilización de partículas magnéticas acopladas a biovectores según las reivindicaciones 2 a 30, en la que el biovector de partículas magnéticas (p) posee propiedades farmacológicas y/o citotóxicas, pudiendo opcionalmente dicho biovector ser liberado bajo la acción de un campo de radiofrecuencia en la zona reconocida.

39. Utilización de las composiciones según las reivindicaciones 2 a 30, en la que el biovector es un ligando específico de un receptor biológico, para el tratamiento por hipertermia de territorios patológicos.

40. Utilización de las composiciones según las reivindicaciones 2 a 30 para el marcado celular, y en particular el marcado de células madre.