CN1688589A - β－内酰胺酶抑制剂前体药物 - Google Patents

β－内酰胺酶抑制剂前体药物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了具有下述结构的6－β－羟甲基青霉烷酸砜的前体药物及其溶剂合物，其中R为H或甲基。本发明还公开了药物组合物，包括本发明的前体药物或其溶剂合物，任选的β－内酰胺抗生素和至少一种药物上可接受的载体。本发明进一步公开了增加β－内酰胺抗生素在哺乳动物体内的治疗有效性的方法，通过给药有效量的β内酰胺抗生素和增加有效性用量的本发明的前体药物或其溶剂合物来进行。另外，本发明公开了治疗哺乳动物细菌感染的方法，通过对需要的哺乳动物给药治疗有效量的本发明药物组合物来进行。

Description

β-内酰胺酶抑制剂前体药物
发明背景
一般为青霉素类和头孢菌素类的β-内酰胺类抗生素已经广泛用于治疗哺乳动物、诸如人的感染，主要是细菌感染。认为某些微生物耐这些抗生素，因为它们产生各种攻击抗生素的β-内酰胺环的β-内酰胺酶，由此使药物无效。
在美国专利US4,287,181中，Kellogg公开了属于β-内酰胺酶的有效抑制剂的各种6β-羟基烷基青霉烷酸类，包括为用于本发明的β-内酰胺酶抑制剂的6-β-羟甲基青霉烷酸砜。Metzger等的英国专利申请GB2053220A和Schneider等的英国专利申请GB2076812同样公开了6-β-羟甲基-青霉烷酸砜为β-内酰胺酶抑制剂。然而，在前期临床研究中，β-内酰胺酶抑制剂6-β-羟甲基-青霉烷酸砜在口服给药时在啮齿动物体内很难吸收。
Kellogg、Metzger等和Schneider等还公开了6-β-羟甲基青霉烷酸砜的酯前体药物，在前期临床研究中，其易于在体内水解且在啮齿动物体内显示比游离酸更好的吸收。
然而，这些酯前体药物中许多仅以油状物或固体合成，它具有低熔点，其在药物制剂中的应用比具有适合于压片、研磨或纯化的熔点的固体前体药物受到更多限制。
此外，当口服给药时，这些酯前体药物一般不会显著吸收。因此，需要较高药物剂量进行口服给药以获得高于更显著吸收所需的前体药物的β-内酰胺酶抑制剂6-β-羟甲基青霉烷酸砜的治疗有效血浆水平。此外，口服给药吸收程度较低的前体药物可以导致发病率增加且当不吸收的前体药物可以在胃肠道内水解成活性药物时，接受者发生重度腹泻，其中任何残留的阿莫西林选择性杀伤正常微生物菌群的主要成分。此外，要求产生所需前体药物的方法为相对低廉。
因此，存在对具有高口服生物利用度的β-内酰胺酶抑制剂6-β-羟甲基青霉烷酸砜的结晶前体药物的需求且更优选具有合适熔点的结晶。
发明概述
本发明涉及具有如下结构的6-β-羟甲基青霉烷酸砜(也称作4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，4，4-二氧化物(2S，5R，6R))的前体药物及其溶剂合物：
其中R为H甲基。本发明的前体药物包括：4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-，(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，-1-(苯甲酰氧基)-甲酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)；4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，-1-(苯甲酰氧基)-乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)；4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(1R)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)；和4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(1S)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)。本发明优选的前体药物为具有如下结构的4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(1R)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)或其溶剂合物
本发明还涉及药物组合物，包括本发明的前体药物或其溶剂合物、任选的β-内酰胺抗生素和至少一种药物上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。优选所述的β-内酰胺抗生素为阿莫西林。还优选用于药物组合物中的前体药物为4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(1R)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)或其溶剂合物。更优选药物组合物包括4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(1R)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)或其溶剂合物、阿莫西林和药物上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
本发明进一步涉及增加β-内酰胺抗生素在哺乳动物体内的治疗有效性的方法，包括向所述的哺乳动物给药有效量的β内酰胺抗生素和增加有效性用量的本发明的前体药物或其溶剂合物。优选所述的β-内酰胺抗生素为阿莫西林。还优选所用的前体药物为4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(1R)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)或其溶剂合物。更优选所用的前体药物为4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(1R)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)或其溶剂合物，且所述的β-内酰胺抗生素为阿莫西林。进一步优选所述的哺乳动物为人。
另外，本发明涉及治疗哺乳动物细菌感染的方法，通过向需要的哺乳动物给药治疗有效量的本发明药物组合物。优选该药物组合物进一步包括β-内酰胺抗生素。优选所述的β-内酰胺抗生素为阿莫西林。还优选所用的前体药物为4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(1R)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)或其溶剂合物。更优选所用的前体药物为4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(1R)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)或其溶剂合物，且所述的β-内酰胺抗生素为阿莫西林。进一步优选所述的哺乳动物为人。
详细说明
用于描述本发明的术语具有下文中的含义。
术语″有效量″指的是当单独或与预防哺乳动物细菌感染发作、缓解其症状、终止其发展或使其消除的本发明的前体药物联用时的β-内酰胺抗生素的用量。
术语″增加有效性用量″指的是当向哺乳动物给药前体药物且随后在体内水解成本发明的β-内酰胺酶抑制剂时增加共同给药的β-内酰胺抗生素的治疗有效性的前体药物用量。
术语″哺乳动物″为属于哺乳类分类成员的个体动物。该类哺乳类包括：例如人、猴、黑猩猩、大猩猩、牛、猪、马、绵羊、狗、猫、小鼠和大鼠。
在本发明，优选的哺乳动物为人。
术语″药物上可接受的″指的是必须与组合物中的其它组分相容且对其接受者而言无害的载体、稀释剂和赋形剂。通过本领域中公知的方法、使用众所周知且易于得到的组分制备本发明的药物组合物。
本发明的前体药物包括实施例3中所述的4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，-1-(苯甲酰氧基)甲酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)和实施例4中所述的4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)。
正如实施例7中进一步描述的，本发明的前体药物在吸收后的胃肠道上部稳定、易于在体内水解成为β-内酰胺酶抑制剂的6-β-羟甲基青霉烷酸砜(下文称作″6-β-HMPAS″)，它可增加β-内酰胺抗生素对产生β-内酰胺酶的细菌的有效性。这种β-内酰胺酶抑制保护了共同给药的β-内酰胺抗生素对β-内酰胺酶(+)菌株的抗菌功效。
当向哺乳动物给药时本发明的前体药物在体内水解并形成游离酸β-内酰胺酶抑制剂6-β-HMPASI时，这些前体药物用于增强共同给药的β-内酰胺抗生素对产生β-内酰胺酶的细菌的功效。
本发明的前体药物可以用于与β-内酰胺抗生素联合疗法中以治疗例如人呼吸道、尿道和软组织的感染。本发明的组合物还用于治疗其它哺乳动物感染，诸如牛的乳腺炎。
适合于用本发明的前体药物、药物组合物和方法治疗的细菌感染包括上呼吸道疾病，包括呼吸道病原体，诸如流感嗜血菌和粘膜炎莫拉氏菌，包括抗生素抗性分离物导致的群体获得性肺炎(CAP)、慢性支气管炎(AECB)的急性加重和急性细菌性鼻窦炎(ABS)。
此外，适合于用含有抗生素的本发明药物组合物治疗的细菌感染特别包括流感嗜血菌或肺炎链球菌，包括药物抗性肺炎链球菌(DRSP)，诸如青霉素抗性肺炎链球菌导致的儿科中耳炎、鼻窦炎、肺炎和成人支气管炎急性加重。
其它适合于用含有抗生素的本发明药物组合物治疗的细菌感染包括由大肠杆菌、肺炎克雷白氏杆菌、肠杆菌属的种类和肠杆菌科的所有其它成员导致的软组织感染。
其它适合于用含有抗生素的本发明药物组合物治疗的感染包括那些由产生β-内酰胺酶的甲氧西林敏感性葡萄球菌和产生β-内酰胺酶的厌氧菌导致的感染。
当本发明的前体药物含有一个以上手性中心时，它们以不同的旋光非对映异构形式存在。更具体地说，本发明的优选前体药物在1-乙基位上含有手性中心。本发明包括4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)，3，3-二甲基-7-氧代-，-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)的1R和1S非对映体且还包括这些非对映体的混合物，诸如外消旋混合物。在本文下面的实施例4-6中进一步描述了这些非对映体形式、其混合物及其相应的合成。
甚至更优选本发明的前体药物包括如实施例5中所述的4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]-庚烷-2-羧酸，6-，(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)的1R非对映体。
本发明的前体药物可以显示多晶型现象。前体药物的多晶型物构成本发明的组成部分且可以通过在不同条件下使本发明的前体药物结晶来制备。例如，使用重结晶所用的不同溶剂或不同溶剂混合物；在不同温度下结晶；结晶过程中各种很快到很慢冷却的冷却方式。还可以通过加热或熔化前体药物，随后逐步或快速冷却而得到多晶型物。可以通过固体探针nmr波谱法、ir光谱法、示差扫描量热法、X射线粉末衍射或其它这类技术测定多晶型物的存在。
本发明的前体药物还可以以溶剂合物、例如水合物形式存在。本发明包括各溶剂合物及其混合物。
就前体药物而言，给药的前体药物最低量为增加共同给药的β-内酰胺抗生素的有效性的用量。给药的前体药物的最高量为单独或与β-内酰胺抗生素联用的毒理学上可接受的用量。
一般来说，就体重至少为40kg的成年和儿童而言，前体药物的每日剂量约为200mg-约1g或1g以上。对体重低于40kg的儿童而言，前体药物的每日剂量约为7mg/kg/天-约20mg/kg/天或约20mg/kg/天以上。然而，这些数字仅为解释性的，而在某些情况中，可能必须使用这些范围以外的剂量。
可以将本发明前体药物的每日剂量分成等剂量每天给药1-4次。
在治疗细菌感染的过程中，将本发明的前体药物与β-内酰胺抗生素共同给药。可以同时或依次给药所述的前体药物和β-内酰胺抗生素。此外，所述的前体药物和抗生素可以包含在分开的药物组合物或单一物组合物中。
与本发明前体药物共同给药的典型β-内酰胺抗生素为对酶降解敏感且通过各种β-内酰胺酶失活的β-内酰胺抗生素。这类β-内酰胺酶敏感性抗生素的实例包括、但不限于：青霉素类，诸如天然青霉素类、阿莫西林和氨苄西林；头孢菌素类，诸如头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、头孢克洛、头孢孟多、头孢尼西(cefoicid)、头孢雷特、头孢丙烯、头孢呋汀、头孢地尼、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松和头孢吡肟；和单菌胺环类，诸如氨曲南。
一般来说，当药物组合物中共同含有时，β-内酰胺抗生素与前体药物的重量比约为15∶1-约1∶1。
优选将本发明的前体药物与阿莫西林共同给药。更优选将阿莫西林与前体药物4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]-庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(1R)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)共同给药。
本文所用的术语″阿莫西林″应指的是阿莫西林或其碱性盐或其水合物，特别是阿莫西林三水合物或(结晶的)阿莫西林钠。除非另有说明，阿莫西林重量指的是相应游离酸的等效重量。此外，可以理解实际上考虑到阿莫西林的功效，应根据常规实践进一步调整混入制剂的阿莫西林重量。
一般来说，就体重至少为40kg的成年人和儿童而言，阿莫西林的有效量约为250mg-约5g的每日剂量水平。对体重低于40kg的儿童而言，增加有效性的阿莫西林用量约为20mg/kg/天-约150mg/kg/天的每日剂量水平。然而，这些数字仅为解释性的，而在某些情况中，可能必须使用这些范围以外的剂量。
可以分等剂量将阿莫西林的每日剂量以即刻、改进或延缓(或缓慢)释放组合物的形式每天给药1-4次。含有阿莫西林的适合于本发明药物组合物的即刻、改进或延缓(或缓慢)释放药物组分的制剂描述在授权给Rooke等的美国专利US4,537,887、授权给Conley等的US6,051,255、授权给Cole等的US6,218,380、授权给Conley等的US6,051,255、Conley等的美国专利申请顺序号09/911,905和Conley等的国际申请号PCT/IB01/01899中。将美国专利US4,537,887、6,051,255、6,218,380、6,051,255、USSN09/911,905和国际申请号PCT/IB01/01899教导的全部内容引入本文作为参考。
在这些组合物中，前体药物和阿莫西林的确切用量取决于对所处理微生物的作用程度。
正如本领域技术人员可以理解的，当口服给药或通过非肠道给药时，某些β-内酰胺化合物是有效的，而在通过非肠道给药时，仅其它β-内酰胺化合物有效。当将本发明的前体药物与通过非肠道给药的β-内酰胺抗生素，即仅适合于在非肠道给药时有效的药物联用时，使用适于非肠道应用的联用制剂。当将前体药物与通过口服或非肠道有效的β-内酰胺抗生素联用时，可以制备适合于口服或非肠道给药的联合用药物。另外，能够通过口服给药所述前体药物的制剂。而同时通过非肠道给药另一种β-内酰胺抗生素；且还能够通过非肠道给药所述前体药物的制剂，而通式通过口服给药另一种β-内酰胺抗生素。
本发明的药物组合物包括本发明的前体药物和至少一种药物上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
所述的药物组合物任选进一步包括β-内酰胺抗生素。优选所述的抗生素为阿莫西林。还优选所述的前体药物为4-硫杂-1-氮杂二环-[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(1R)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)。更优选所述的药物组合物包括4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(1R)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)、阿莫西林和至少一种药物上可接受的载体。
适合于这类药物组合物的赋形剂、稀释剂和载体的实例包括：填充剂和增充剂，诸如淀粉、糖、甘露糖醇和硅酸衍生物；粘合剂，诸如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；增湿剂，诸如甘油；崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；用于延缓溶解的试剂，诸如石蜡；吸收加速剂，诸如季铵化合物；表面活性剂，诸如鯨蜡醇、甘油单硬脂酸酯；吸附载体，诸如高岭土和膨润土；和润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙和硬脂酸镁以及固体聚乙二醇。制剂还可以包括：润滑剂，诸如滑石、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂，诸如羟基苯甲酸甲基酯和羟基苯甲酸丙基酯类；增甜剂；和调味剂。
在制备本发明药物组合物的过程中，通常将前体药物和任选的β-内酰胺抗生素与赋形剂混合、用赋形剂稀释或包封在可以为胶囊、小药囊或其它容器形式的载体中。当赋形剂用作稀释剂时，它可以为起活性组分赋形剂、载体或介质作用的固体、半固体或液体物质。
可以通过口服或非肠道、即通过肌内、皮下、静脉内或腹膜内给药所述的药物组合物。基于所用的给药方式选择载体、赋形剂或稀释剂。例如，当考虑口服给药方式时，可以根据标准药物实践使用片剂、包括口嚼片、胶囊、锭剂、含片、粉剂、糖浆、酏剂、水溶液和混悬液等形式的本发明药物组合物。活性组分与载体的比例自然取决于活性组分的化学性质、溶解性和稳定性以及关注的剂量。然而，含有β-内酰胺抗生素和本发明的前体药物的药物组合物优选含有约20％-约95％的活性组分。就口服用片剂而言，常用的载体包括乳糖、柠檬酸钠和磷酸盐。片剂中常用：各种崩解剂，诸如淀粉；和润滑剂，诸如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石。就胶囊形式的口服给药而言，有用的稀释剂为乳糖和高分子量聚乙二醇类。当需要口服使用的水溶液或混悬液时，可以将活性组分与乳化剂和悬浮剂合并。如果需要，可以加入一些增甜剂和/或调味剂。就非肠道给药而言，通常制备活性组分的无菌溶液且适当调整该溶液的pH并缓冲。就静脉内应用而言，应控制溶质的总浓度以使制剂等渗。
可以通过制药技术领域中的常规方法将本发明的制剂制成口服给药用的固体剂型，例如片剂或粉剂或用于再配制成混悬液或溶液的颗粒产品。
用于制备这类片剂的适宜组分和合适的方法公开在例如国际申请WO92/19227和WO95/28927中，将这些文献教导的全部内容引入本文作为参考。可以使用生产药物制剂和生产用于再配制成这类制剂的干制剂领域中一般常用的技术制备诸如儿科混悬剂这类粉剂或颗粒制剂。例如，合适的技术为将混合干粉状或颗粒状组分装入适宜容器的技术。
为了进行儿科给药，优选将本发明的制剂制成甜味的含水糖浆剂，它一般为含有单位剂量体积、例如5ml或2.5ml中的适宜重量阿莫西林和前体药物的常用制剂(除了新的阿莫西林：前体药物比和应用)，优选为糖浆剂。因此儿科制剂可以包括含在该体积中的这类剂量的溶液或混悬液浓度的大量溶液或混悬液，例如糖浆剂或可以制成这类溶液或混悬液的颗粒或粉末。合适的这类制剂描述在国际申请号PCT EP96/01881(SmithKline Beecham)中。本发明的制剂除含有其活性物质阿莫西林和前体药物外一般还包括用于口服给药的制剂领域中标准的赋形剂且一般以标准比例和一般标准颗粒大小和等级等使用。
就儿科口服混悬液而言，这些赋形剂可以包括悬浮助剂、助流剂(为了辅助填充)、稀释剂、增量剂、调味剂、增甜剂和稳定剂。
所用的适宜赋形剂包括黄原胶(悬浮助剂)、胶态二氧化硅(助流剂)、琥珀酸(稳定剂)、阿司帕坦(增甜剂)、羟丙基甲基纤维素(悬浮助剂)和二氧化硅(前体药物用稀释剂和增量剂)。为适合局部需求，调味剂可以包括常用的调味剂，诸如气泡树胶、橙、香蕉、覆盆子、葡萄和金色糖浆和其混合物。
可以将本发明的药物组合物制成例如使用用于给药这类每日剂量的适宜量的固体单位剂型。例如，单位剂型可以为片剂或含有再配制用颗粒或粉末的小药囊，每天可以将1或2单位剂量给药1-4次。另一方面，可以将单位剂量制成固体或溶液或混悬液、例如制成儿科给药用糖浆剂和已知类型的有利于给药适宜单位剂量制剂的合适测定装置。合适的单位剂量为能够给药上述分成1-4次剂量的每日剂量的单位剂量。
本发明的另一个实施方案为用于实现哺乳动物中抗菌治疗作用的试剂盒，包括：(1)药物组合物，包括本发明的前体药物和任选的β-内酰胺抗生素；和(2)用于以获得所需治疗作用方式给药药物组合物的技术说明材料。
通过下列实施例进一步解释本发明。然而，应理解本发明并非限于本文的详细描述。
实施例1
(R/S)苯甲酸1-氯-乙酯的制备和对映体分离
Figure A0382431600121
如下制备上面所示的(R/S)-苯甲酸1-氯-乙酯。
向在氮气环境下的3-颈圆底烧瓶内搅拌的122g(862mmol.)苯甲酰氯(Aldrich)的溶液中加入2.35g(17.2mmol.)无水氯化锌(Aldrich)。将该反应混合物在室温下搅拌15分钟且然后使用乙二醇/CO2浴冷却至-15℃。向该混合物中缓慢加入37.9g(862mmol.)乙醛(Aldrich)，同时维持内部温度低于0℃。在添加完成后，将该反应混合物温至室温。加入400mL水和400mL CH2Cl2且然后分离各层。分离有机层并用饱和NaHCO3、水、盐水洗涤、用MgSO4干燥、过滤并在真空中浓缩。进行硅胶色谱分离，使用1.75％乙酸乙酯/98.25％己烷洗脱而得到55.4g黄色油状物。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：8.08(d，2H，J＝7.5Hz)，7.61(t，1H，J＝7.5Hz)，7.47(t，2H，J＝7.5Hz)，6.80(q，1H，J＝6Hz)，1.93(d，3H，J＝6Hz)。
通过使用10cm×50cm Chiralcel OJ柱对(+/-)-苯甲酸1-氯-乙酯进行手性分离分离如下所示的(R)-苯甲酸1-氯-乙酯，使用庚烷/IPA(98/2)洗脱且流速为250mL/分钟。收集第二次洗脱下的分析纯的对映体，保留时间为7.123分钟。
1H-NMR(CDCl3，400MHz)：8.08(d，2H，J＝7.5Hz)，7.61(t，1H，J＝7.5Hz)，7.47(t，2H，J＝7.5Hz)，6.80(q，1H，J＝6Hz)，1.93(d，3H，J＝6Hz).[ad]--140(C+0.031，5，CHCl3)。
通过使用10cm×50cm Chiralcel OJ柱对(+/-)-苯甲酸1-氯-乙酯进行手性分离分离如下所示的(S)-苯甲酸1-氯-乙酯，使用庚烷/IPA(98/2)洗脱且流速为250mL/分钟。收集第一次洗脱下的分析纯的对映体，保留时间为5.807分钟。
1H-NMR(CDCl3，400MHz)：8.08(d，2H，J＝7.5Hz)，7.61(t，1H，J＝7.5Hz)，7.47(t，2H，J＝7.5Hz)，6.80(q，1H，J＝6Hz)，1.93(d，3H，J＝6Hz)。[αd]＝+130°(C+0.0345，CHCl3)。
实施例2
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代 -，4，4-二氧化物，一钠盐，(2S，5R，6R)的制备
通过下列四步法制备如上所示的4-硫杂-1-氮杂二环[3，2，0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，4，4-二氧化物，一钠盐，(2S，5R，6R)(下文的″Na-HMPAS″)。
步骤1-6，6-二溴青霉烷酸砜钠的制备
将乙酸乙酯(15.8L)加入到6，6-二溴青霉烷酸砜(2500g)中并加热至50℃。将乙基己酸钠(1044g)和乙酸乙酯(5.0L)搅拌成溶液，然后在60分钟期限内将其加入到6，6-二溴青霉烷酸砜溶液中。使该反应混合物冷却到环境温度并使所得固体粒化1小时。通过过滤收集产物并用乙酸乙酯洗涤而得到2197g(83％)的6，6-二溴-青霉烷酸砜钠。熔点186-187℃。1HNMR(D2O)δ1.30(s，3H)，1.45(s，3H)，4.29.(s，1H)，5.54(s，1H)。
步骤2-6，6-二溴青霉烷酸砜苄酯的制备
Figure A0382431600142
混合二甲基甲酰胺(5.7L)和6，6-二溴青霉烷酸砜钠(3820g)并将该混合物搅拌几分钟，直到所有固体溶解为止。在1小时内向该混合物中加入苄基溴(1400g)。然后将该反应混合物在环境温度下搅拌过夜。加入水(4.5L)和乙酸乙酯(15.0L)以使反应停止。用乙酸乙酯(2×600mL)洗涤水相并用饱和碳酸氢钠水溶液(2×1L)和饱和氯化钠水溶液(2×1L)依次洗涤合并的有机相。用硫酸镁干燥有机层并浓缩以得到3566g(90％)的所需6，6-二溴青霉烷酸砜苄酯，为晶体。熔点146-147℃。1HNMR(CDCl3)δ1.2(s，3H)，1.5(s，3H)，4.5(s，1H)，4.9(s，1H)，5.16(d，1H，J＝12Hz)，5.29(d，1H，J＝12Hz)，7.35-7.40(m，5H)。
步骤3-6-β-羟甲基-6-α-溴青霉烷酸砜苄酯的制备
Figure A0382431600143
在氮气吹扫下在圆底烧瓶中将低聚甲醛加热至160-180℃以除去过量的水。在单独的圆底烧瓶中混合四氢呋喃(8.0L)和6，6-二溴青霉烷酸砜苄酯(1000g)并搅拌至所有固体溶解为止。将该溶液冷却至-78℃并向该溶液中缓慢加入在THF(720mL)中的3M甲基镁化氯，同时维持温度低于-70℃。将该反应混合物搅拌1小时。此时使用氮气流在冷却的反应混合物表面上吹出从第一个圆底烧瓶中放出的甲醛气体。使这种甲醛气体在反应混合物上放出约6小时，同时维持冷却并剧烈搅拌冷却的反应烧瓶。在通过TLC(80∶20 己烷∶乙酸乙酯)测定反应完成时，在-78℃下用乙酸(132mL)在THF(400ML)中的溶液使反应猝灭。将该反应混合物温至环境温度，然后将该反应混合物通过Supercel过滤。将滤液浓缩成油状物(～1000g)。然后将该油状物转入大反应容器并加入和乙酸乙酯(5.0L)/水(2.5L)。搅拌该混合物，然后分离。用乙酸乙酯(2×500mL)洗涤水层。用1N盐酸(3.0L)、水(3×3.0L)和饱和氯化钠水溶液(3×3.0L)依次洗涤合并的有机层。用硫酸镁干燥有机层、通过Supercel过滤、浓缩并储存在冷藏箱内。使所得油状物进行硅胶色谱分离(1Kg/500g产物油状物)并用9∶1 己烷/乙酸乙酯(20.0L)洗脱以除去杂质，然后用4∶1 己烷/乙酸乙酯(4.0-8.0L)且最终用3∶2 己烷/乙酸乙酯(如果需要)洗脱而得到6-β-羟甲基-6-α-溴-青霉烷酸砜苄酯。产量205.5g(23W)。熔点120-121℃。(CDCl3)1HNMRδ1.28(s，3H)，1.57(s，3H)，4.09(d，1H，J＝16Hz)，4.54(s，1H)，4.62(d，1H，J＝16Hz)，4.82(s，1H)，5.1 8(d，1H，J＝16Hz)，5.32(d，1H，J＝16Hz)，7.36-7.42(m，5H)。
步骤4-4-硫杂-1-氮杂二环[3，2，0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7- 氧代-，4，4-二氧化物，一钠盐，(2S，5R，6R)的制备
混合水(163mL)、乙酸乙酯(2000mL)、6-β-羟甲基-6-α-溴青霉烷酸砜苄酯(180g)、三乙胺(90.0g)和5％钯/碳(45g)并在50psi和环境温度下氢化约2小时。对该反应混合物进行的TLC显示反应不完全且由此再加入催化剂(15g)并将该混合物氢化1小时。一旦反应完成，则用硫酸(112.5g)和水(270mL)的混合物使反应猝灭。过滤该反应混合物以除去催化剂并用EtOAc(450mL)洗涤。用EtOAc(3×750mL)洗涤水层。合并有机相并用氯化钙干燥至水含量低于1％。然后过滤出氯化钙并使乙酸乙酯减少到其体积的1/2。然后将新鲜的乙酸乙酯加回到该溶液中并使溶液的水含量为0.09％。混合乙基己酸钠(59g)和EtOAc(450mL)并在环境温度下缓慢加入到有机相中。然后使该混合物粒化30-45分钟。过滤所得固体、用EtOAc(500mL)洗涤并干燥，得到79.0g(66％)的6-β-羟甲基青霉烷酸砜钠。通过从2-丙醇/水中重结晶进一步纯化固体。熔点246-245℃。1HNMR(D2O)δ1.23(s，3H)，1.39(s，3H)，3.82-3.89(m，1H)，3.97-4.10(m，3H)，4.85(s，1H)。
可选的步骤4-4-硫杂-1-氮杂二环[3，2，0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二 甲基-7-氧代-，4，4-二氧化物，一钠盐，(2S，5R，6R)的制备
将6-β-羟甲基-6-α-溴青霉烷酸砜苄酯(1143g)置于大反应容器内。加入苯(6.2L)和氢化三丁基锡(770mL)并将该反应混合物加热至回流温度2-3小时。通过TLC监测反应，溶剂＝1∶1己烷/乙酸乙酯。
在反应完成时，浓缩该混合物至得到油状物以除去苯。在环境温度下用己烷洗涤该油状物，直到除去所有残余的锡副产物为止。将该物质重新加热至回流，加入乙酸乙酯(EtOAc)以便将物质转入单颈烧瓶并浓缩。用己烷(3x)洗涤该物质并在减压条件下干燥产物层。
使一半油状物(549g)进行硅胶色谱分离(1Kg)，使用足量二氯甲烷将油状物制成溶液，使用7∶3己烷/EtOAc-3∶2己烷/EtOAc洗脱。合并产物级分并浓缩。
将油状物(～540g)置于高压釜。加入四氢呋喃(1.9L)、10％钯/碳和水(300mL)并将该反应混合物在50psi和30℃的温度下氢化约1小时。在反应完成时，通过塞力特硅藻土过滤该反应混合物以除去催化剂。
浓缩滤液并用EtOAc(3.0L)稀释。用EtOAc(1.0L)洗涤水层。用氯化钙干燥合并的有机层并浓缩至一半体积。加入EtOAc(2.5L)，随后滴加乙基己酸钠(SEH，250g)和EtOAc(1.05L)的溶液。通过过滤取出所得固体并在真空烘箱内干燥。
向所得固体加入水(6-800mL)并用4M硫酸将pH调节至0.5-1.0。用EtOAc(5×1.0L)提取产物。用氯化钙干燥合并的有机相并通过sparkle滤器过滤。将滤液减少至一半体积并加入SEH(115.3g)和EtOAc(500mL)的溶液。使该混合物粒化。过滤所得固体并用EtOAc洗涤而得到所需产物。
实施例3
前体药物1：4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲 基-7-氧代-，(苯甲酰氧基)甲酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
如下制备如上所示的前体药物1。
向搅拌的3.13g(18.4mmol.)苯甲酸氯甲酯基(Narchem)在200mL丙酮中的溶液中加入13.8g(92.1mmol.)碘化钠(Aldrich)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。向该溶液中加入3.5g(12.3mmol.)4-硫杂-1-氮杂二环[3，2，0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，4，4-二氧化物，一钠盐，(2S，5R，6R)。将该反应混合物在室温下搅拌过夜。然后在真空中浓缩该反应混合物。随后加入200mL水和200mL乙酸乙酯并分离有机层且用盐水洗涤、用Na2SO4干燥、过滤并在真空中浓缩。进行硅胶色谱分离，用1∶1乙酸乙酯/己烷洗脱而得到8.62g油状物。然后使该油状物从乙酸乙酯/己烷中重结晶而得到5.5g结晶固体。母液中仍含有所需化合物。。熔点＝102℃。1H-NMR(DMSO)：7.97(d，2H，J＝7.5Hz)，7.70(t，1H，J＝7.5Hz)，7.56(t，2H，J＝7.5Hz)，6.12(d，1H，J＝6Hz)，5.99(d，1H，J＝6Hz)，5.19(d，1H，J＝5Hz)，5.17(m，OH)，4.62(s，1H)，4.20(m，1H)，4.03(m，1H)，3.73(m，1H)，1.41(s，3H)，1.28(s，3H)。
实施例4
前体药物2：4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基 -7-氧代-，-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
如下制备如上所示的前体药物2。
向搅拌的2.5g(8.77mmol.)4-硫杂-1-氮杂二环[3，2，0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，4，4-二氧化物，一钠盐，(2S，5R，6R)在20mLDMF中的溶液中加入2.1g(11.4mmol.)(+/-)-苯甲酸1-氯-乙酯。然后将所得混合物加热至35℃下3天。加入40mL水和100mL乙酸乙酯并分离各层。用乙酸乙酯提取水层。用水、盐水洗涤合并的有机层、用Na2SO4干燥、过滤并在真空中浓缩。进行硅胶色谱分离，使用1L20％乙酸乙酯/80％己烷、随后用1L 1∶1乙酸乙酯/己烷洗脱而得到1.2g油状物，使其从乙酸乙酯/己烷中重结晶而得到1g白色结晶固体(2种非对映体混合物)。熔点＝133-135℃。1H-NMR(d-DMSO，400MHz)：7.96(d，2H，J＝7.5Hz)，7.71(t，1H，J＝7.5Hz)，7.55(t，2H，J＝7.5Hz)，7.07(q，0.5H，J＝5.4Hz)，7.03(q，0.5H，J＝5.4Hz)，5.19(d，1H，J＝5Hz)，5.15(m，OH)，4.54(s，0.5H)，4.53(s，0.5H)，4.19(m，1H)，4.01(m，1H)，3.73(m，1H)，1.62(d，1.5H，J＝5.4Hz)，1.61(d，1.5H，J＝5.4Hz)，1.44(s，1.5H)1.38(m，4.5H)。
实施例5
前体药物3：4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基 -7-氧代-，(1R)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
通过实施例4的方法、用(S)-苯甲酸1-氯-乙酯取代且仅加热至30℃制备如上所示的前体药物3。熔点＝154℃。1HNMR(d-DMSO，400MHz)：7.96(d，J＝7.5Hz，2H)，7.71(t，J＝7.5Hz，1H)，7.55(t，J＝7.5Hz，2H)，7.03(q，J＝5.4Hz，1H)，5.19(d，J＝5Hz，1H)，5.15(m，OH)，4.53(s，1H)，4.18(m，1H)，4.02(m，1H)，3.72(m，1H)，1.61(d，J＝5.4Hz，3H)，1.39(s，3H)，1.37(s，3H)。
[a]D＝+119(c＝0.0121，CHCl3)
还通过下面的可选路线制备前体药物3。在20℃下混合52.03g(182.4mmol.)4-硫杂-1-氮杂二环[3，2，0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，4，4-二氧化物，一钠盐，(2S，5R，6R)、61.50g(181.1mmol.)硫酸氢四丁铵和15.44g(183.2mmol.)碳酸氢钠。向其中加入400mL二氯甲烷，同时维持温度在20℃。接下来加入100mL水。将所得混合物在20℃下搅拌30分钟。分离有机层并用硫酸钠干燥、过滤且在真空中浓缩。向所得残余物中加入169.4g(917.6mmol.)(S)-苯羧酸1-氯-乙酯，随后加入160mL丙酮。然后将所得溶液在室温下搅拌3天。在真空中浓缩该反应混合物并进行硅胶色谱分离，将40-50％乙酸乙酯/己烷用作洗脱剂。使所得产物从乙醇中重结晶，随后从乙酸乙酯/己烷中重结晶。过滤并在真空中干燥而得到85.9g白色结晶产物。
实施例6
前体药物4：4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲 基-7-氧代-，(1S)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
Figure A0382431600191
通过实施例4的方法、用(R)-苯甲酸1-氯-乙酯取代且仅加热至30℃制备如上所示的前体药物4。1H-NMR(d-DMSO，400MHz)：7.96(d，2H，1J＝7.5Hz)，7.′71(t，1H，J＝7.5Hz)，7.55(t，2H，J＝7.5Hz)，7.07(q，1H，J＝5.4Hz)，5：19(d，1H，J＝5Hz，)，5.15(m，OH)，4.54(s，1H)，4.18(m，1H)，4.01(m，1H)，3.72(m，1H)，1.62(d，3H，J＝5.4Hz)，1.44(s，3H)1.35(s，3H)。MS(m/z)：410(M--1，100)。
实施例7
用于合成4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基 -7-氧代-，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)的对比前体药物的碳酸类的制备
Figure A0382431600192
如下制备如上所示的碳酸氯甲酯异丙酯。在0℃下向搅拌的10克(75.2mmol.)氯甲酸氯甲酯(Fluka)在100mL二氯甲烷中的溶液中加入5.8mL(76mmol.)异丙醇，随后加入11.93g(97.8mmol.)二甲氨基吡啶(Fluka)。然后将所得反应混合物加热至室温并搅拌过夜。随后用水稀释该反应混合物。然后分离各层。用盐水洗涤有机层、用MgSO4干燥、过滤并在真空中浓缩而得到6克澄清油状物。然后使该油状物进行如上所述的步骤。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：5.721(s，2H)，4.95(m，1H，J＝′6.2Hz)，1.33(d，6H，J＝6.2Hz)。注意：当仅使用1.05当量的二甲氨基吡啶时，得到了较好的产率。
Figure A0382431600201
按照与碳酸氯甲酯异丙酯类似的方式，通过用氯甲酸氯乙酯(Fluka)取代制备(+/-)-碳酸1-氯-乙酯异丙酯。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：6.41(q，1H，J＝5.8)，4.94(m，1H，J＝6.2Hz)，1.81(d，3H，J＝5.8)，1.32(m，6H)。
Figure A0382431600202
按照与碳酸氯甲酯异丙酯类似的方式，通过用丙醇(Aldrich)取代制备(+/-)-碳酸1-氯-乙酯丙酯。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：6.41(q，1H，J＝5.8)，4.17(m，2H)，1.81(d，3H，J＝5.8)，1.71(m，2H)，0.96(m，3H)。
按照与碳酸氯甲酯异丙酯类似的方式，通过用正丁醇(Aldrich)取代制备(+/-)-碳酸丁酯1-氯-乙酯。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：6.4 1(q，1H，J＝5.8)，4.20(m，2H)，1.81(d，3H，J＝5.8)，1.67(m，2H)，1.41(m，2H)，0.93(m，3H)。
Figure A0382431600204
按照与碳酸氯甲酯异丙酯类似的方式，通过用丙醇(Aldrich)取代制备碳酸氯甲酯丙酯。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：5.72(s，2H)，4.18(t，2H，J＝6.6Hz)，1.71(m，2H)，0.97(t，3H，J＝7.5Hz)。
按照与碳酸氯甲酯异丙酯类似的方式，通过用正丁醇(Aldrich)取代制备碳酸丁酯氯甲酯。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：5.72(s，2H)，4.23(t，2H，J＝6.6Hz)，1.70(m，2H)，1.41(m，2H)，0.94(t，3H，J＝7.5Hz)。
按照与Tett.Lett.22，34，1981，3269-3272所述类似的方式制备(+/-)-5-溴-5H-呋喃-2-酮。
按照Neuenschwander等在Helvetica Chimica 1978；61：2047-2058中所述方法制备乙酸-1-氯-1-甲基乙酯。
Figure A0382431600213
按照与碳酸氯甲酯异丙酯类似的方式，通过用乙醇取代制备碳酸氯甲酯乙酯。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：5.72(s，2H)，4.28(q，2H，J＝7.1Hz)，1.34(t，3H，J＝7.1Hz)。
实施例8
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代 -，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)的对比前体药物的制备
制备4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-，羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)的前体药物以证实本发明前体药物令人意外改善的生物利用度和物理特性。在这些对比的前体药物中，对比前体药物1描述在美国专利US4,287,181的实施例25中。对比前体药物2-15为新化合物，但属于美国专利US4,287,181中公开的种类范围。
对比前体药物1：
Figure A0382431600221
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代 -，(2，2-二甲基-1-氧代丙氧基)甲酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
向搅拌的2.5g(8.77mmol.)4-硫杂-1-氮杂二环[3，2，0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，4，4-二氧化物，一钠盐，(2S，5R，6R)在20mL DMF中的溶液中加入(11.4mmol.)新戊酸氯甲酯(Aldrich)并在室温下搅拌过夜。然后将所得混合物加热至35℃下3天。加入40mL水和100mL乙酸乙酯并分离各层。用乙酸乙酯萃取水层。用水、盐水洗涤合并的有机层、用Na2SO4干燥、过滤并在真空中浓缩。进行硅胶色谱分离，使用1L 20％乙酸乙酯/80％己烷洗脱，随后使用1L 1∶1乙酸乙酯/己烷洗脱而得到油状物。向该油状物中加入己烷(15mL)并将样品置于冷藏箱内4天，此时固体沉淀。真空浓缩得到110mg白色无定形固体。熔点＝70-73℃。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：5.94(d，1H，1J＝5.4Hz)，5.70，(d，1H，J＝5.4Hz)，4.69(d，1H，J＝4.1Hz)，4.48(s，1H)，4.30(m，1H)，4.15(m，2H)，1.55(s，3H)，1.41(s，3H)，1.21(s，9H)。
另一方面，可以按照美国专利US4,287,181的实施例25所述制备该化合物，也称作6-β-羟甲基青霉烷酸砜新戊酰氧基甲酯。
对比前体药物2：
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代 -，[(乙氧羰基)氧基]甲酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
按照用于制备对比前体药物1的方法制备该前体药物，但用碳酸氯甲酯乙酯替代新戊酸氯甲酯。熔点(无定形固体)＝103-105℃。1H-NMR(MeOD，400MHz)：5.91(d，1H，J＝5.8Hz)，5.76(d，1H，J＝5.8Hz)，4.96(d，1H，J＝4.6Hz)，4.55(s，1H)，4.15-4.25(m，4H)，3.95(m，1H)，1.53(s，3H)，1.41(s，3H)，1.29(t，3H，J＝7.1)。
对比前体药物3：
Figure A0382431600231
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代 -，1，3-二氢-3-氧代-1-异苯并呋喃基酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
按照用于制备对比前体药物1的方法制备该前体药物，但用3-溴-苯并[c]呋喃-2-酮(Aldrich)替代新戊酸氯甲酯。
在用水稀释DMF时，所需产物沉淀为无定形固体并将其过滤且在真空中干燥。MS(m/z)：394(M-)NMR显示非对映体混合物。1H-NMR(d-DMSO，400MHz)：7.8-8.0(m，4H)，7.60(s，0.5H)，7.59(s，0.5H)，5.23(m，1H)，5.16(OH)，4.71(s，0.5H)，4.67(s，0.5H)，4.20(m，1H)，4.02(m，1H)，3.74(m，1H)，1.47(s，1.5H)，1.37(s，1.5H)，1.36(s，1.5H)，1.31(s，1.5H)。
对比前体药物4：
Figure A0382431600232
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代 -，[[(1-甲基乙氧基)羰基]氧基]甲酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
向搅拌的(18.4mmol.)碳酸氯甲酯异丙酯在200mL丙酮中的溶液中加入13.8g(92.1mmol.)碘化钠(Aldrich)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。向该溶液中加入3.5g(12.3mmol.)4-硫杂-1-氮杂二环[3，2，0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，4，4-二氧化物，一钠盐，(2S，5R，6R)(US4,287,181)并将该反应混合物在室温下搅拌过夜。然后在真空中浓缩该反应混合物。加入200mL水和200mL乙酸乙酯并分离有机层且用盐水洗涤、用Na2SO4干燥、过滤并在真空中浓缩。进行硅胶色谱分离，使用1∶1乙酸乙酯/己烷洗脱。终产物为微红色油状物。MS(m/z)：378(M-)。1H-NMR(d-DMSO，400MHz)：5.86(d，1H，J＝5.8Hz)，5.74(d，1H，J＝5.8Hz)，5.20(d，1H，J＝5Hz)，5.17(m，OH)，4.82(m，1H)，4.60(s，1H)，4.20(m，1H)，4.03(m，1H)，3.74(m，1H)，1.42(s，3H)，1.30(s，3H)，1.22(d，6H，J＝6.2Hz)。
对比前体药物5：
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代 -，1-[[(1-甲基乙氧基)羰基]氧基]乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
按照用于制备对比前体药物4的方法制备该前体药物，但用碳酸1-氯-乙酯异丙酯替代碳酸氯甲酯异丙酯。MS(m/z)：392(M-)。NMR为微红色油状物，为2种非对映体的混合物。1H-NMR(d-DMSO，400MHz)：6.71(q，0.5H，J＝5.4Hz)，6.67(q，0.5H，J＝5.4Hz)，5.20(d，1H，J＝5Hz)，4.79(m，1H)，4.51(s，0.5H)，4.49(s，0.5H)，4.20(m，1H)，4.03(m，1H)，3.74(m，1H)，1.48(m，3H)，1.43(s，1.5H)，1.39(s，15H)，1.33(m，3H)，1.22(m，6H)。
对比前体药物6：
Figure A0382431600251
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代 -，1-[(丙氧羰基)氧基]乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
按照用于制备对比前体药物4的方法制备该前体药物，但用碳酸1-氯-乙酯丙酯替代碳酸氯甲酯异丙酯。MS(m/z)：392(M-)。NMR为微红色油状物，为2种非对映体的混合物。1H-NMR(d-DMSO，400MHz)：6.72(q，0.5H，J＝5.4Hz)，6.68(q，0.5H，J＝5.4Hz)，，5.20(m，1H)，4.51(s，0.5H)，4.49(s，0.5H)，4.20(m，1H)，4.03(m，3H)，3.74(m，1H)，1.59(m，2H)，1.48(m，3H)，1.39(s，1.5H)，1.34(s，1.5H)，1.22(m，3H)，0.86(m，3H)。
对比前体药物7：
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代 -，1-[(丁氧羰基)氧基]乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
按照用于制备对比前体药物4的方法制备该前体药物，但用碳酸丁酯1-氯-乙酯替代碳酸氯甲酯异丙酯。MS(m/z)：406(M-)。NMR为淡黄色油状物，为2种非对映体的混合物。1H-NMR(d-DMSO，400MHz)：6.72(q，0.5H，J＝5.4Hz)，6.68(q，0.5H，J＝5.4Hz)，5.20(m，1H)，4.51(s，0.5H)，4.49(s，0.5H)，4.20(m，1H)，4.03(m，3H)，3.74(m，1H)，1.59(m，2H)，1.15-1.55(m，11H)，0.86(m，3H)。
对比前体药物8：
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代 -，[(丙氧羰基)氧基]甲酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
按照用于制备异丙酯的方法制备该前体药物。终产物为无定形白色固体。MS(m/z)：378(M-)。1H-NMR(d-DMSO，400MHz)：5.86(d，1H，J＝6.2Hz)，5.74(d，1H，J＝6.2Hz)，5.20(d，1H，J＝5Hz)，5.17(m，OH)，4.60(s，1H)，4.20(m，1H)，4.10(m，2H)，4.03(m，1H)，3.74(m，1H)，1.60(m，2H)，1.42(s，3H)，1.30(s，3H)，0.86(t，3H，J＝7.5Hz)。
对比前体药物9：
Figure A0382431600262
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代 -，[(丁氧羰基)氧基]甲酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
按照用于制备对比前体药物4的方法制备该前体药物，但用碳酸丁酯氯甲酯替代碳酸氯甲酯异丙酯。终产物为无定形白色固体。MS(m/z)：392(M-)。1H-NMR(d-DMSO，400MHz)：5.86(d，1H，J＝6.2Hz)，5.74(d，1H，J＝6.2Hz)，5.20(d，1H，J＝5Hz)，5.17(m，OH)，4.60(s，1H)，4.20(m，1H)，4.15(m，2H)，4.03(m，1H)，3.74(m，1H)，1.60(m，2H)，1.42(s，3H)，1.30(m，2H)，1.30(s，3H)，0.86(t，3H，J＝7.5Hz)。
对比前体药物10：
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代 -，2，5-二氢-5-氧代-2-呋喃基酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
按照用于制备对比前体药物4的方法制备该前体药物，但用5-溴-5H-呋喃-2-酮替代新戊酸氯甲酯。MS(m/z)：344(M-)。NMR为2种非对映体的混合物。该产物为无定形固体。1H-NMR(d-DMSO，400MHz)：7.81(m，0.5H)，7.73(m，0.5H)，7.14(m，0.5H)，7.10(m，0.5H)，6.61(m，1H)，5.21(m，1H)，5.17(m，OH)，4.67(s，0.5H)，4.63(s，0.5H)，4.20(m，1H)，4.03(m，1H)，3.74(m，1H)，1.42(s，1.5H)，1.40(s，′3H)，1.32(s，1.5H)。
对比前体药物11：
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(1- 氧代丁氧基)甲酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
按照用于制备对比前体药物4的方法制备该前体药物，但用丁酸氯甲酯(Acros organics)替代新戊酸氯甲酯。该产物为澄清油状物。MS(m/z)：362(M-)。1H-NMR(d-DMSO，400MHz)：5.86(d，1H，J＝5.8Hz)，5.74(d，1H，J＝5.8Hz)，5.20(d，1H，J＝5Hz)，5.17(m，OH)，4.55(s，1H)，4.20(m，1H)，4.01(m，1H)，3.74(m，1H)，2.35(m，2H)，1.52(m，2H)，1.40(s，3H)，1.30(s，3H)，0.86(m，3H)。
对比前体药物12：
Figure A0382431600281
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代 -，1，3-二氧-3-氧代-1-异苯并呋喃基酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
通过对275mg对比前体药物3进行使用5％异丙醇/95％二氯甲烷的硅胶色谱分离制备该化合物而得到200mg非对映体混合物，随后得到70mg单一(更极性)非对映体。该产物为无定形固体。MS(m/z)：394(M-)。NMR表示更极性非对映体。1H-NMR(d-DMSO，400MHz)：7.95(d，1H，J＝7.5Hz)，7.90(m，1H)，7.81(d，1H，J＝7.5Hz)，7.77(m，1H)，7.60(s，1H)，5.23(d，1H，J＝5Hz)，5.16(OH)，4.71(s，1H)，4.20(m，1H)，4.02(m，1H)，3.74(m，1H)，1.47(s，3H)，1.37(s，3H)。
对比前体药物13：
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(乙 酰氧基)甲酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
按照用于制备对比前体药物1的方法制备该前体药物，但用乙酸溴甲酯(Aldrich)替代新戊酸氯甲酯。终产物为粘性油状物。MS(m/z)：334(M-)。1H-NMR(d-DMSO，400MHz)：5.82(d，1H，J＝6.2Hz)，5.72(d，1H，J＝6.2Hz)，5.19(d，1H，J＝5Hz)，5.17(m，OH)，4.55(s，1H)，4.20(m，1H)，4.01(m，1H)，3.74(m，1H)，2.08(s，3H)，1.40(s，3H)，1.30(s，3H)。
对比前体药物14：
Figure A0382431600291
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代 -，1-(乙酰氧基)-1-甲基乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)
按照用于制备对比前体药物1的方法制备该前体药物，但用乙酸-1-氯-1-甲基乙酯替代新戊酸氯甲酯。终产物为无定形固体。MS(m/z)：334(M-)。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：4.68(d，1H，J＝5.0Hz)，4.40(s，1H)，4.31(m，1H)，4.15(m，2H)，2.06(s，3H)，1.92(s，3H)，1.82(s，3H)，1.58(s，3H)，1.47(s，3H)。
实施例9
化学(pH)、混悬液和血浆稳定性
评价前体药物3的如下方面：(1)在不同pH溶液中的化学稳定性；(2)在混悬液中维持的功效；和(3)在来自不同哺乳动物的血浆中的化学稳定性，从而评价前体药物3在吸收前的耐水解能力和吸收后快速水解成6-β-HMPAS的能力。
在pH1、2、2.5、4.0、5.0、6.5和7.4下评价前体药物3在溶液中与6-β-HMPAS钠盐(下文的″Na HPMAS″)和克拉维酸锂在溶液中相比的化学稳定性。适当配制缓冲液以获得各次保温所需的pH。保温由990μl适宜pH的缓冲液组成且通过添加10μl 10mM化合物在100％甲醇中的储备溶液(终浓度＝100μM)启动保温。用自动注射器在0、10、20、40、60、120和240分钟时取系列样品(20μl)并直接注射在带有用于分析物检测的LC/MS单四极质谱仪的HPLC线上。通过96-孔加热块调节保温温度。在25℃和37℃下进行保温。使LC/MS系统以负离子模式运转。将对各分析物用的适宜[M-H]-进行的选择性离子检测用于检测每一时间点处剩余的化合物并对其进行定量。将每一时间点处的峰值响应表示为在时间＝0处获得的百分比。通过对时间＝0分钟至时间＝240分钟之间的这些百分比进行回归得到降解速率常数(kd)。然后将表观一级半衰期估计为ln 2/kd。按照一式两份完成这些测定并报导平均值。
正如下表中所示，前体药物3显示出优良的酸稳定性和在接近吸收用的中性pH下的足够稳定性。此外，Na-HMPAS特别在低pH下显示出比克拉维酸盐优良的溶液稳定性。
还评价了前体药物3在混悬液中的稳定性(25℃下未在0.5％甲基纤维素中缓冲)以确定混悬液中的时间对功效的作用。如下所示，前体药物3在室温下储存10天后其保持了大于90％的功效。相反，如果在室温下保持相同的时间，那么使用克拉维酸盐在奥格门汀混悬液中仅保留了40％的功效(参见Mehta，A.C.，S.Hart-Davies，J.Payne和R.W.Lacey，1994.“阿莫西林和克拉维酸钾在共同使用的-阿莫西林-克拉维酸盐口服混悬剂中的稳定性”-J.Clin.Pharm.Ther.19：313-315)。
                      pH
溶液稳定性(100μM) 7.4     6.5     5.0    4.0     2.5     1.2
半衰期(小时)
前体药物3(25℃) 2.7    ＞24     ＞24    ＞24    ＞24    ＞240.6     4.5     ＞24    ＞24    ＞24    ＞24＞24    ＞24    ＞24    ＞24    ＞24    ＞24＞24    ＞24    ＞24    ＞24    ＞24    ＞24＞24    ＞24    ＞24    ＞24    1.2     0.6＞24    ＞24    ＞24    ＞24    0.9     ND
前体药物3(37℃)
Na-HMPAS(25℃)
Na-HMPAS(37℃)
克拉维酸盐(25℃)
克拉维酸盐(37℃)
前体药物3混悬液稳定性 1天      3天     5天     7天    10天
1.51mg/ml**(10mg/kg大鼠剂量制剂) 功效(百分比)*ND       103     98      104     91***
*评价为通过溶解的标准品的LC/MS检测的靶浓度的百分比的功效。数值代表一式两份测定的平均值。ND＝未测定
**起始混悬液的pH～6.8且到第10天时降至4.7
***非对映体混合物基本上未改变～95∶5
使用准备的血浆在小鼠、狗、猴和人血浆中测定前体药物3、Na-HMPAS和克拉维酸锂的血浆稳定性并在使用前进行一次冷冻/融化循环。保温由在37℃下的96-孔加热块中预保温5分钟的990μl的血浆组成。通过添加10μl10mM化合物在100％甲醇中的储备溶液启动保温。取出系列等分试样(100μl)并在0、1、2、5、10、20、30和60分钟时转入200μl 75/25乙腈/3％高氯酸中。离心样品，将上清液转入注射小瓶并将20μl注射在带有LC/MS单四极质谱仪的HPLC线上。使LC/MS系统以负离子模式运转。将对各分析物用的适宜[M-H]-进行的选择性离子检测用于检测每一时间点处剩余的化合物并对其进行定量。将每一时间点处的峰值响应表示为在时间＝0处获得的百分比。通过对时间＝0分钟至时间＝240分钟之间的这些百分比进行回归得到降解速率常数(kd)。然后将表观一级半衰期估计为ln 2/kd。按照一式两份完成这些测定并如下所示报导平均值。
血浆稳定性(100μM) 小鼠 大鼠 狗 猴 人
                          半衰期
前体药物337℃ 2.8分钟 ＜2.0分钟 2.8分钟 3.6分钟 ＜2.0分钟
Na-HMPAS37℃ 3.9小时 3.4小时 ＞4小时 ＞4小时 ＞4小时
克拉维酸盐37℃ ＞4小时 3.3小时 2.8小时 3.6小时 2.6小时
前体药物3显示出极佳的酸稳定性和在接近吸收用的中性pH下的足够稳定性。前体药物3在所有测试种类血浆中的水解速率证实有效的酶水解在吸收时产生6-β-HMPAS。Na-HMPAS特别在低pH下显示出比克拉维酸盐优良的溶液稳定性。仅管化合物在血浆中不稳定，但是Na-HMPAS表现出改善的人血浆稳定性。
实施例10
前体药物3在肠pH值下的抑制活性
认为克拉维酸盐产生人胃肠道腹泻，因为它与残留的阿莫西林结合而选择性杀伤正常菌群的主要成分。克拉维酸盐不是前体药物且由此从肠中未吸收而保留的40％是与吸收入循环的60％相同的活性分子。尽管胃和近小肠的pH为酸性，但是在Berry，V.等的研究中，阿莫西林/克拉维酸盐制剂对由肺炎链球菌导致的大鼠实验性呼吸道感染的药动学功效得到提高，2001年12月16-19日在芝加哥举行的有关抗菌剂与化疗的第41届国际科学研讨会的摘要B988中发现从患有腹泻的受试者中采集的24小时粪便样品的中数pH为6.4(5.4-7.8范围)。
正如实施例7中所示，前体药物3极为稳定且在pH＜6.5下不易转化成6-β-HMPAS。为了比较前体药物3与Na-HMPAS在人大肠中发现的pH条件下的β-内酰胺酶抑制活性，我们测定了两种化合物在pH6.0和7.0下对TEM-1β-内酰胺酶的IC50。数据表明在前体药物不应转化成所述抑制剂的活性形式的pH6.0下，前体药物3对TEM-1β-内酰胺酶无活性(IC50＞100uM)。相反，在前体药物转化成具有33分钟半衰期的活性抑制剂的pH7.0下，所得到的6-β-HMPAS产生了远高于在pH6.0下观察到的对这种β-内酰胺酶的抑制水平。
前体药物3 6-β-HMPAS                    IC50(μM)
大肠杆菌TEM-1 pH 6.0                    ＞100  0.37
大肠杆菌TEM-1 pH 7.0                    2.2    0.12
实施例11
吸收(口服体内生物利用度)
当前体药物3在中性pH下具有30分钟的溶液半衰期且在有酯酶存在的情况下前体药物在几分钟内水解时，确定使用人Caco-2细胞系进行的体外评价不适于测定前体药物吸收。而发现用于吸收的体内模型对评价本发明前体药物的吸收而言更为适当。此外，已经用几种市售活性剂研究了在大鼠体内吸收的级分与在人体内吸收的级分的相关性且已经证实这种相关性十分有益(corr＝0.971)(参见Chiou，W.L.和A.Barve，1998.“人与大鼠之间64种药物吸收的口服剂量的级分的线性相关性”-Pharm.Res.15：1792-1795.)。基于这种相关性，将大鼠用于预测人体吸收。进一步应理解6-β-HMPAS验证了如使用大鼠和人肝细胞提示的最小限度的肝摘除。因此，在大鼠中进行的口服生物利用度评价应与在人体内吸收的级分紧密相关。
各使用安装了经手术植入的颈静脉导管的3只Sprague-Dawley大鼠(200-225gm)的组对Na-HMPAS、前体药物1、2、3和4以及实施例8的14种对比前体药物估计口服生物利用度。对口服研究而言，载体剂量的选择取决于测试化合物的物理状态。除前体药物1外的所有口服给药的化合物均为油或无定形固体形式。照此，以使用70/20/10水/Chremophore/乙醇载体的溶液(PO)剂型形式给药这些化合物。
制备口服前体药物剂量以转运在10ml/kg剂量体积下的10mg/Kg当量剂量的6-β-HMPAS。通过静脉内给药10mg/kg剂量的Na-HMPAS以确定生物利用度估计值(6-β-HMPAS当量)。
在给药后0分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时和5小时取血样。然后将样品处理成血浆并在分析前储存在-20℃下。如下所述检测样品的6-β-HMPAS且然后测定口服与静脉内给药的平均浓度与时间分布的关系。使用线性梯形近似法计算0时至最后可确定的时间点之间血浆浓度与时间关系曲线下的面积(AUC0-t最终)。通过对来自表观消除期开始到最终取样点的血浆浓度数据进行回归估计末端消除速率常数(Kel)。将消除半衰期估计为ln 2/Kel。在Cestt最终/Kel下估计从t最终到无穷大的面积(AUCt最终-∞)，其中Cestt最终代表在最终时间点处的估计浓度，其中基于回归分析对药物定量。将曲线下的总面积(AUC0-∞)估计为AUC0-t最终和AUCt最终-∞的总和。将生物利用度(F)表示为AUC(0-∞)口服×剂量静脉内/AUC(0-∞)静脉内×剂量口服。
发现的平均生物利用度如下所示。
    化合物 平均生物利用度     标准偏差
    Na-HMPAS     6.0     1.6
    前体药物1     113.1     10.7
    前体药物2     102.0     11.1
    前体药物3     92.4     6.0
    前体药物4     111.1     8.8
    对比前体药物1     55.4     4.7
    对比前体药物2     6.2     1.0
    对比前体药物3     27.2     2.6
    对比前体药物4     6.8     0.9
    对比前体药物5     46.5     1.4
    对比前体药物6     60.9     6.1
    对比前体药物7     40.3     10.8
    对比前体药物8     7.9     1.5
    对比前体药物9     12.3     2.0
    对比前体药物10     10.9     1.7
    对比前体药物11     33.1     5.4
    对比前体药物12     20.4     1.0
    对比前体药物13     37.6     3.7
    对比前体药物14     15.4     3.9
如上所示，本发明的前体药物具有显著优于6-β-HMPAS、预先已知的对比前体药物1或一般上述前体药物(对比前体药物2-14)的生物利用度。
试验描述：
在本试验中，在用乙腈沉淀并用氯仿处理后，将所关注的分析物反萃取入水相中。该过程在不使用蒸发和再溶解步骤的情况下得到约2倍浓度因数。
通过使用负离子操作形式的LC/MS/MS提供检测。单一四极操作不足以对分析物进行选择性检测。装载溶剂(95∶5 20mM甲酸铵/乙腈；溶剂A)的pH为～5.0。
分析柱为Pheneomenex AQUAC18 4.6×50mm.6×50mm。
所有样品沉淀均在96-孔1.2mL MARSH-管内完成。如下制备样品。将血浆样品(200μl)加入到含有5μg/ml作为内标的舒巴坦的400μl的95∶5乙腈∶20mM甲酸铵中。在台式离心机中以3000rpm将样品离心10分钟。然后将上清液(400μl)转入洁净的1.2ml MARSH1管。向样品中加入氯仿(600μl)，然后混合且随后以3000rpm离心10分钟。然后从上部取出转入的水相(～100μl)且随后进行分析。
质谱条件：
质谱仪：使用Turbo喷雾(电喷雾)的负离子模式操作的API-3000
电离电压：-3000V
孔电压：-25eV
碰撞能量：30eV
根据需要调节雾化和加热气体
反应监测：
6-β-HMPAS：262＝＞218
舒巴坦(IS)：232＝＞140
阿莫西林：364＝＞223
克拉维酸：198＝＞136
运转时间：3分钟
RT：对所有分析物而言，～2分钟
注射体积：20μl
HPLC条件：
溶剂A：95∶5 20mM甲酸铵∶乙腈
溶剂B：95∶5 乙腈∶20mM甲酸铵
分析流速：1ml/分钟
到达质谱仪的流速：～100μl/分钟
冲击梯度方案：
0-0.5分钟100％A
0.5-1分钟100％A-100％B
1-1.5分钟100％B
1.5-2.0分钟100％B-100％A
对6-β-HMPAS和阿莫西林而言，LLOQ＝0.1μg/ml，0.5μg/ml克拉维酸
ULOQ＝50μg/ml(所有)
回归＝线性1/x权重
柱寿命～300-400次注射
大鼠门静脉研究：
在口服给药100mg/kg剂量的前体药物3后在门静脉插管的大鼠中还评价了该前体药物的全身接触。在给药后5、15和30分钟取样时立即将全血等分试样在冰冷的酸中稳定。在任意样品中没有检测到前体药物3含量(试验LLOQ为100ng/ml)。这些结果提示在吸收时，前体药物3在接触肝和通过身体循环前快速水解产生6-β-HMPAS。
实施例12
体内筛选
对来自呼吸道病原体群的β-内酰胺酶的生化活性：仅存在三种市售的β-内酰胺酶抑制剂：舒巴坦、克拉维酸盐和三唑巴坦。所有三种抑制剂均抑制在广泛范围细菌中发现的A型青霉素酶。在它们中，仅克拉维酸盐定向于对呼吸道感染群体的口服疗法。对通常在耐氨苄西林的流感嗜血菌和粘膜炎莫拉氏菌中发现的不含细胞的青霉素酶收集物测试了NaHMPAS。下表中的数据表明在抗来自流感嗜血菌的ROB-1和TEM-1酶方面Na-HMPAS与克拉维酸锂等效。所有三种β内酰胺酶抑制剂对在粘膜炎莫拉氏菌中发现的BRO-1和BRO-2青霉素酶均极为有效，其中舒巴坦最具活性(表1)。对来自近来30种粘膜炎莫拉氏菌的临床分离物的β-内酰胺酶的更广泛分析表明Na-HMPAS可有效抑制来自所有这些菌株的BRO-1和BRO-2，IC50平均值为0.19μM。
       β-内酰胺酶抑制剂对细胞提取物中β-内酰胺酶的IC50s
 β-内酰胺酶     IC50(μM)*
菌株 类型 舒巴坦 6-β-HMPAS 克拉维酸盐
流感嗜血菌ATCC43334  ROB-1  3.40  0.01  0.04
流感嗜血菌54A1173  TEM-1  4.78  0.03  0.02
粘膜炎莫拉氏菌87A1178ATCC43617  BRO-2  0.03  0.32  0.11
粘膜炎莫拉氏菌87A1115  BRO-1  0.011  0.143  0.14
*在比色试验中测定对生色头孢菌素的所有抑制值。
对来自其它病原体，包括与皮肤感染相关的病原体的β-内酰胺酶的生化 活性：
Na-HMPAS与克拉维酸盐在对广谱的TEMβ-内酰胺酶(ESBLs)的抑制功效方面相差无几，而Na-HMPAS和克拉维酸盐在对ESBLs的功效方面通常相差无几。
    对选择的广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的抑制(IC50，μM)抑制剂
β-内酰胺酶   IC50(μM)*
  菌株 类型 舒巴坦  6-β-HMPA 克拉维酸盐
  大肠杆菌ATCC35218  TEM-1     6.85  0.14     0.05
  大肠杆菌51A1101  TEM-1     4.76  0.07     0.02
  肺炎克雷白氏杆菌CF104  TEM-3     0.55 ＜0.003     ＜0.003
  肺炎克雷白氏杆菌CF504  TEM-5     4.68  0.08     ＜0.003
  肺炎克雷白氏杆菌BL-1  TEM-10     23.19  0.39     ＞100
  肺炎克雷白氏杆菌MCV37  TEM-12     5.86  0.27     ＜0.003
  肺炎克雷白氏杆菌CF1304  TEM-16     5.80  0.09     0.06
  肺炎克雷白  TEM-17     10.36  0.66     0.004
  氏杆菌E264
  肺炎克雷白氏杆菌CF1104  TEM-24     10.48     7.13     0.01
  大肠杆菌CF1609  TEM-25     2.58     0.04     0.02
  肺炎克雷白氏杆菌5657  TEM-26     0.56     0.08     0.02
  沙雷氏菌属S6  Sme-I     15.65     0.68     19.55
*在比色试验中测定对生色头孢菌素的所有抑制值。
一般来说，可以推断Na-HMPA与克拉维酸锂相差无几。
产生β-内酰胺酶的种类流感嗜血菌和粘膜炎莫拉氏菌的敏感性试验：
使用产生β-内酰胺酶的流感嗜血菌和粘膜炎莫拉氏菌的临床分离物评价各种比例的6-β-HMPAS与阿莫西林的体外活性。NCCLS(NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards)批准的用于奥格门汀的敏感性方法使用2∶1固定比例的阿莫西林/克拉维酸盐。结果表明对46种流感嗜血菌的β-内酰胺酶(+)菌株而言，用于阿莫西林/克拉维酸盐和阿莫西林/6-β-HMPAS的阿莫西林MIC50和MIC90值(即防止50％或90％的测试分离物生长所需的最低抑制浓度)分别为1和2μg/ml，而对2∶1阿莫西林/舒巴坦而言，所述值分别为4和8μg/ml。注意数字指的是阿莫西林在混合物中的浓度。
对48种粘膜炎莫拉氏菌分离物而言，阿莫西林/克拉维酸盐的MIC50和MIC90值分别为≤0.125和0.25μg/ml，而对阿莫西林/6-β-HMPAS而言，分别为0.5和1.0μg/ml。阿莫西林/舒巴坦(2∶1)的值分别为0.25和1.0μg/ml。因此，使用全细胞获得的MICs始终与抑制剂对不含细胞的β-内酰胺酶的抑制剂功效不充分相关，因为舒巴坦对在粘膜炎莫拉氏菌中找到的BRO-1/2酶始终更为有效。
产生非-β-内酰胺酶的种类肺炎链球菌的敏感性试验：
比较使用联合用药物与使用单独的阿莫西林观察到的对分类为青霉素敏感性、青霉素中度敏感性和青霉素抗性的肺炎链球菌临床分离物的体外活性。这些菌株中的某些显示出对青霉素和阿莫西林的高水平耐受性，其中MICs在4-8μg/ml范围。正如对具有基于PBP抗性的病原体预计的，肺炎链球菌分离物的结果证实存在抑制剂对阿莫西林MICs没有影响。
对单独的阿莫西林和在2∶1、7∶1和14∶1比例阿莫西林/抑制剂下测试的所有β-内酰胺酶抑制剂的联合用药物而言，21种青霉素抗性菌株的阿莫西林MIC50s和MIC90s(青霉素MICs 1-8μg/ml)为2和4ug/ml。最终对21种青霉素中度敏感性肺炎链球菌组和12种青霉素敏感性分离物组测试了所有联合用药物。此外，两组中的所有MICs反映出了联合用药物中的阿莫西林成分。中度敏感性组的阿莫西林MICs为0.03-1μg/ml且敏感性组的MICs为≤0.0156-0.06μg/ml。
试验方法：
按照1997年12月的NCCLS文件M7-A4和2002年的M100-512中所述的方法进行试验，以需氧方式生长的细菌的稀释抗菌敏感性试验方法-批准的标准。
冷冻储备溶液的制备：使流感嗜血菌生长在巧克力琼脂平板上。将菌落悬浮于已经用1N NaOH将pH调节至7.4并无菌过滤的嗜血菌属测试培养基(HTM，Remel Diagnostics)中。使其与50％甘油混合至终浓度为20％甘油。从绵羊血琼脂平板上刮取生长的肺炎链球菌和粘膜炎莫拉氏菌且置于MuellerHinton肉汤+5％裂解的绵羊血中。为了冷冻，加入50％甘油至终浓度为20％。将所有样品在-70℃下冷冻。
药物平板的制备：将96-孔微量滴定板用于药物稀释。称出足量的全部药物制成4X操作储备溶液。将药物溶于DMSO或其它适宜溶剂、溶解至测试介质中的体积并将100μl通过一系列各含100μl介质起始体积[通过10的柱1]的10个药物孔和不含接种物的1个药物孔[柱11]连续稀释2倍。柱12为不含药物的细菌接种物对照孔。各孔中的终体积为100μl。
用已经用1N NaOH将pH调节至7.4并无菌过滤的HTM连续稀释流感嗜血菌的药物平板。用Mueller Hinton肉汤+5％裂解的马血稀释其它两个种类。对照化合物进行各试验。将药物平板在-70℃下冷冻并在使用当天融化。
接种物的生长：使在37℃下的5％CO2培养箱中过夜的流感嗜血菌在含有1％血红蛋白和1％GCHI[巧克力琼脂平板]的MuellerHinton琼脂平板上生长过夜。使肺炎链球菌和粘膜炎莫拉氏菌生长在相同条件下的含有5％绵羊血的Mueller Hinton琼脂上。
接种物的制备：取来自琼脂平板的过夜生长物并重新悬浮于适宜的测试培养基中。在应用嗜血菌属测试培养基(HTM)、流感嗜血菌肉汤或阳离子补充的Mueller Hinton肉汤+5％裂解的马血(对肺炎链球菌和粘膜炎莫拉氏菌)至相当于0.5McFarland标准混悬液的浊度(约1-2×10CFU/ml)的试验当天使用分光光度法将所有混悬液调节至标准OD。该混悬液具有的OD625为0.14。为了获得孔中2-7×105cfu/ml的最终接种物(终体积为200μl)，由McFarland储备溶液制备稀释液：
将所有流感嗜血菌菌株按1/100稀释入HTM。
将所有个肺炎链球菌和粘膜炎莫拉氏菌按1∶100稀释入阳离子补充的含有5％裂解的马血的Mueller Hinton肉汤。
平板接种：将100μl稀释的接种物加入到无菌测试平板中的各100μl稀释药物中。测试用的总体积为200μl/孔。适当稀释(参见上文)入微量滴定孔的菌株含有2-7×105CFU/ml的最终接种物。在随机平板上通过在0时对孔进行存活率计数验证这些细胞接种物。易于通过从孔中取出10μl并将其用10ml无菌生理盐水稀释(按1∶1000稀释)进行上述过程。
涡旋后，将100μl稀释的混悬液涂布在有流感嗜血菌存在的血琼脂平板或巧克力琼脂平板上。保温后，存在的50个菌落显示出的接种物密度为5×105CFU/ml。在用于接种入微量滴定盘的培养物中给单菌落划线并观察典型的菌落形态。
微量滴定板的保温：在将塑料盖置于平板上后，将微量滴定板在受控湿度培养箱内的塑料盒中保温以防止从孔中蒸发。将平板按照不超过4个平板高进行堆放。将所有微量滴定板在35℃下以需氧方式保温24小时。
保温所有平板并在24小时后读取且仅记录结果，条件是用于NCCLS型菌株流感嗜血菌ATCC49766和肺炎链球菌ATCC49619的对照药物在公布的范围内(NCCLS，M100-S12，2002)。
实施例13
体内功效
对在我们的前期临床感染模型中评价的β-内酰胺酶(+)病原体测定6-β-HMPAS的体内β-内酰胺酶抑制活性。这些选择的分离物的数据表明6-β-HMPAS对来自呼吸道病原体流感嗜血菌和粘膜炎莫拉氏菌的β-内酰胺酶一般与克拉维酸盐等效。
沙土鼠中耳炎：在该模型中，用肺炎链球菌或流感嗜血菌攻击蒙古沙土鼠。用以50μL体积转运入左鼓泡的log5-6CFU流感嗜血菌或肺炎链球菌攻击雌性蒙古沙土鼠(50-60g)。攻击后18小时，用以500uL体积的0.5％甲基纤维素载体转运剂量的阿莫西林和前体药物3(7∶1)的联合用药物启动剂量反应治疗方案(t.i.d.，持续2天)。在攻击后的第4天根据细菌清除率数据计算ED50s。
阿莫西林/前体药物3和奥格门汀的联合用药物在清除这种病原体方面等效，其中ED50s为6-10mg/kg且对7∶1和14∶1的联合用药物而言结果相同。阿莫西林作为单一活性剂对这种病原体无效。
鼠全身感染模型：在这种模型中，用分别悬浮于肉汤、10％粘蛋白或3％酿造酵母并以500μL体积转运的log2-6CFU肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌或粘膜炎莫拉氏菌经腹膜内攻击雌性CF-1或DBA/2小鼠(18-20g)。攻击后1小时，使用以200uL体积的0.5％甲基纤维素载体转运剂量的阿莫西林和前体药物3(7∶1)的联合用药物启动剂量反应治疗方案(b.i.d.，持续1天)。在攻击后的第4天根据细菌存活率数据计算ED50s。
阿莫西林/前体药物3的联合用药物可有效防止小鼠因所有这些β-内酰胺酶(+)菌株而死亡。一般来说，阿莫西林/前体药物3联合用药物的活性与奥格门汀相差无几(即对流感嗜血菌等效且对粘膜炎莫拉氏菌稍低)。7∶1的联合用药物一般比14∶1的联合用药物更为有效。下表中还包括了皮肤和皮肤结构病原体金黄色葡萄球菌/肺炎链球菌和大肠杆菌的数据。
鼠肺炎模型：在该模型中，用肺炎链球菌或流感嗜血菌攻击蒙古沙土鼠。用以40μL体积转运的log5-6CFU肺炎链球菌攻击雌性CF-1(18-20g)且在攻击后18小时，用以200uL体积的0.5％甲基纤维素载体转运剂量的阿莫西林和前体药物3(7∶1)的联合用药物启动剂量反应治疗方案(b.i.d.，持续2天)。在攻击后的第10天根据存活率数据计算ED50s。
阿莫西林、阿莫西林/前体药物3和奥格门汀对耐青霉素(PD50s of22-25mg/kg)和青霉素敏感性肺炎球菌菌株(PD50s为2.7-3.3mg/kg)等效。由于耐青霉素的肺炎球菌菌株不含P-内酰胺酶，所以阿莫西林的活性没有因存在6-β-HMPAS或克拉维酸盐而得到改善(也没有被其拮抗)。使用耐青霉素菌株与青霉素敏感性菌株注意到的较高PD50s与较高的MIC一致。
总之，以头头方式比较阿莫西林/前体药物3(7∶1和14∶1)联合用药物与奥格门汀在沙土鼠中耳炎模型和腹膜炎和肺炎小鼠模型中的口服体内活性。阿莫西林/前体药物3联合用药物在这些模型中对呼吸道病原体(流感嗜血菌、粘膜炎莫拉氏菌和肺炎链球菌)和皮肤以及软组织病原体(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷白氏杆菌)表现出与奥格门汀度相差无几的体内活性。当在MIC试验中以2∶1比例检测时，阿莫西林/前体药物3的体内性能与该联合用药物的体外活性一致。
体内抗菌活性(口服)-呼吸道和皮肤和皮肤结构病原体(ED50，mg/kg)
病原体 阿莫西林 前体药物3 阿莫西林/前体药物3(7/1比) 奥格门汀(7/1比)
                            沙土鼠中耳炎模型
流感嗜血菌(54A1218)2     ＞50     ＞25     8.9/1.31    9.9/1.4
                            鼠系统性模型
流感嗜血菌(54A1218)粘膜炎莫拉菌氏(87A1115)金黄色葡萄球菌(01A0400)肺炎克雷白氏杆菌(53A0031)大肠埃希氏     ＞100＞100＞100＞200＞200     ＞25＞100＞12.5＞25＞100     9.8/1.437.6/5.430.6/4.420.2/2.962.2/8.9    13.4/1.912.6/1.817.8/2.513.0/1.8146/20.8
    杆菌(51A0257)
                            小鼠肺炎模型
肺炎链球菌(02J1095)肺炎链球菌(02J1016)     253.3     ＞25＞25  21.8/3.12.66/0.38   21.8/3.12.66/0.38
1第一个值表示阿莫西林浓度，而第二个值为β-内酰胺酶抑制剂。
2括号内的数字表示Pfizer菌株ID号。
体内抗菌活性(口服)-呼吸道和皮肤和皮肤结构病原体(ED50，mg/kg)
病原体 阿莫西林 前体药物3 阿莫西林/前体药物3(14/1比) 奥格门汀(14/1比)
                           沙土鼠中耳炎模型
流感嗜血菌(54A1218)     ＞50     ＞25   10.5/0.731  5.8/0.4
                             鼠系统性模型
流感嗜血菌(54A1218)粘膜炎莫拉氏(87A1115)金黄色葡萄球菌(01A0400)肺炎克雷白氏杆菌(53A0031)     ＞100＞100＞100＞200     ＞25＞100＞12.5＞25   12.3/0.8842.5/3.094.2/6.723.4/1.7  37.9/2.723.6/1.724.4/1.723.4/1.7
大肠埃希氏杆菌(51A0257)     ＞200     ＞100  134/9.6   196/14
                           小鼠肺炎模型
肺炎链球菌(02J1095)肺炎链球菌(02J1016)     253.3     ＞25＞25  23.6/1.71.6/0.11   17.8/11.8/0.12
1第一个值表示阿莫西林浓度，而第二个值为β-内酰胺酶抑制剂。
2括号内的数字表示Pfizer菌株ID号。

Claims (15)

1.具有如下结构的前体药物及其溶剂合物：
其中R为H或甲基。
2.权利要求1的前体药物，选自下列化合物组成的组：
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，-1-(苯甲酰氧基)-甲酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)，
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，-1-(苯甲酰氧基)-乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)，
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(1R)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)，和
4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3/3-二甲基-7-氧代(1S)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)。
3.具有如下结构的前体药物及其溶剂合物：
4.组合物，包括：
(a)权利要求1的前体药物或其溶剂合物；和
(b)至少一种药物上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
5.权利要求4的药物组合物，进一步包括β-内酰胺抗生素。
6.权利要求5的药物组合物，其中所述的β-内酰胺抗生素为阿莫西林。
7.权利要求6的药物组合物，其中所述的前体药物为4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(1R)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)或其溶剂合物。
8.药物组合物，包括：
(a)4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代，(1R)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)或其溶剂合物；
(b)阿莫西林；和
(c)药物上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
9.增加β-内酰胺抗生素在哺乳动物体内的治疗有效性的方法，包括向所述的哺乳动物给药有效量的β-内酰胺抗生素和增加有效性用量的权利要求1的前体药物或其溶剂合物。
10.权利要求9的方法，其中所述的β-内酰胺抗生素为阿莫西林。
11.权利要求9-10的方法，其中所述的前体药物为4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(1R)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)或其溶剂合物。
12.治疗哺乳动物细菌感染的方法，通过向所述的哺乳动物给药有效量的β-内酰胺抗生素和增加有效性用量的权利要求1的前体药物或其溶剂合物。
13.权利要求12的方法，其中所述的β-内酰胺抗生素为阿莫西林。
14.权利要求12-13的方法，其中所述的前体药物为4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，6-(羟甲基)-3，3-二甲基-7-氧代-，(1R)-1-(苯甲酰氧基)乙酯，4，4-二氧化物(2S，5R，6R)或其溶剂合物。
15.治疗哺乳动物细菌感染的方法，通过向需要的哺乳动物给药治疗有效量的权利要求4、5或6的药物组合物。
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