EA007540B1 - Пролекарство ингибитора бета-лактамазы - Google Patents

Abstract

Описаны пролекарства сульфона 6-β-гидроксиметилпенициллановой кислоты, имеющие структуругде R представляет Н или метил и их сольваты. Описаны также фармацевтические композиции, содержащие пролекарство согласно данному изобретению или его сольват, по выбору, бета-лактамный антибиотик и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Кроме того, описан способ повышения терапевтической эффективности бета-лактамного антибиотика у млекопитающего посредством введения эффективного количества бета-лактамного антибиотика и пролекарства согласно данному изобретению или его сольвата в количестве, повышающем эффективность указанного антибиотика. Дополнительно описан способ лечения бактериальной инфекции у млекопитающего посредством введения нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества фармацевтической композиции согласно данному изобретению.

Description

Предшествующий уровень техники

Бета-лактамные антибиотики, которые в основном представлены пенициллинами и цефалоспоринами, широко использовались для лечения инфекций, главным образом бактериальных, у млекопитающих, таких как человек. Некоторые микроорганизмы, как полагают, устойчивы к этим антибиотикам, потому что они продуцируют разнообразные бета-лактамазные ферменты, которые разрушают беталактамное кольцо антибиотика, делая тем самым лекарственное средство неэффективным.

В патенте США № 4287181 Ке11 показал, что различные 6-3-гидроксиалкилпенициллановые кислоты, включая сульфон б-З-гидроксиметилпенициллановой кислоты, который является ингибитором бета-лактамазы, используемым в настоящем изобретении, являются потенциальными ингибиторами бета-лактамазы. В патентной заявке Великобритании (3Β2053220Α, Ме1г§ег е! а1., и патентной заявке Великобритании СВ2076812, 8сЬпе1кег е! а1. также показали, что сульфон 6-3-гидроксиметилпенициллановой кислоты является ингибитором бета-лактамаз. Однако ингибитор бета-лактамаз, сульфон 6-βгидроксиметилпенициллановой кислоты, плохо всасывается ΐη νίνο, что было обнаружено во время предклинических испытаний на грызунах, когда его вводили перорально.

Ке11, Μείζβετ е! а1. и ЗсИпеМег е! а1. также раскрыли пролекарства, представляющие собой сложные эфиры сульфона б-З-гидроксиметилпенициллановой кислоты, которые легко гидролизовались ΐη νίνο во время предклинических исследований, и которые показали лучшее всасывание у грызунов, чем в форме свободной кислоты.

Однако многие из этих сложноэфирных пролекарств можно было синтезировать только в виде ма сел или в виде твердых веществ, которые имеют низкую температуру плавления, пригодность которых для фармацевтических препаратов более ограничена, чем была бы у твердого пролекарства с температурой плавления, подходящей для таблетирования, измельчения и очистки.

Кроме того, эти сложноэфирные пролекарства обычно не обладают высокой всасываемостью при пероральном приеме. Таким образом, были бы необходимы более высокие дозы лекарств для перорального приема, чтобы получить терапевтически эффективный уровень ингибитора бета-лактамазы сульфона 6-3-гидроксиметилпенициллановой кислоты, чем были бы необходимы для пролекарства с более высокой всасываемостью. Кроме того, пероральный прием менее всасывающихся пролекарств может приводить к повышению числа случаев и тяжести диареи, испытываемой реципиентом, так как невсосавшееся пролекарство может гидролизоваться в желудочно-кишечном тракте с образованием активного лекарственного вещества, и любое остаточное количество амоксициллина селективно убивает часть представителей нормальной микрофлоры. К тому же желательно, чтобы способ производства желаемого пролекарства был относительно недорогим.

Поэтому существует потребность в кристаллическом пролекарстве ингибитора бета-лактамаз, сульфона 6-3-гидроксиметилпенициллановой кислоты, которое обладает высокой биодоступностью при пероральном приеме, и более предпочтительно, является кристаллическим веществом с подходящей температурой плавления.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к пролекарствам сульфона 6-3-гидроксиметилпенициллановой кислоты, (также называемого 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4,4-диоксид (28,5К,6К.)) 4-тиа-1азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, имеющий строение

и его сольваты, где К является Н или метилом. Пролекарства данного изобретения включают 1(бензоилокси)метиловый эфир 4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 1-(бензоилокси)метиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4,4-диоксид (28,5К,6К); 1-(бензоилокси)этиловый эфир 4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гепган-2-карбоновой кислоты, 1-(бензоилокси)этиловый эфир б-(гидроксиметил)3,3-диметил-7-оксо-4,4-диоксид (28,5К,6К); (1К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, (1 К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7оксо-4,4-диоксид (28,5К,6К); и (18)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гепган-2карбоновой кислоты, (18)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4,4-диоксид (28,5К,6К). Предпочтительным пролекарством, согласно данному изобретению, является (1 К)-1(бензоигюкси)этиловый эфир 4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, (Ш)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4,4-диоксид (28,5К,6К), который имеет строение

- 1 007540

или его сольват.

Данное изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим пролекарство согласно данному изобретению или его сольват, по выбору бета-лактамный антибиотик и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или растворитель. Предпочтительно, когда бета-лактамным антибиотиком является амоксициллин. Также предпочтительно, чтобы пролекарством, используемым в фармацевтической композиции, являлся (1К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 4тиа-1-азабицикло[3.2.0.]гептан-2-карбоновой кислоты, (1К)-1-(бензо ило кси)этиловый эфир 6(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4,4-диоксид (2§,5К,6К) или его сольват. Более предпочтительно, когда фармацевтическая композиция содержит (1К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 4-тиа-1азабицикло[3.2.0.]гептан-2-карбоновой кислоты, (1К)-1-(бензо ило кси)этиловый эфир б-(гидроксиметил)3,3-диметил-7-оксо-4,4-диоксид (2§,5К,6К) или его сольват, амоксициллин и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или растворитель.

Данное изобретение, кроме того, относится к способу повышения терапевтической эффективности бета-лактамного антибиотика у млекопитающих, включающему введение указанному млекопитающему эффективного количества бета-лактамного антибиотика и повышающего эффективность пролекарства согласно данному изобретению или его сольвата в количестве повышающем эффективность антибиотика. Предпочтительно, бета-лактамным антибиотиком является амоксициллин. Также предпочтительно, если используемым пролекарством является (1К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 4-тиа-1азабицикло[3.2.0.]гептан-2-карбоновой кислоты, (1К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир б-(гидроксиметил)3,3-диметил-7-оксо-4,4-диоксид (2§,5К,6К) или его сольват. Более предпочтительно, когда пролекарством является (1К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 4-тиа-1-азабицикло[3.2.0.]гептан-2-карбоновой кислоты, (1К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4,4-диоксид (2§,5К,6К) или его сольват, а бета-лактамным антибиотиком является амоксициллин. Кроме того, предпочтительно, когда млекопитающим является человек.

Данное изобретение также относится к лечению бактериальной инфекции у млекопитающего путем введения терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции согласно данному изобретению млекопитающему, нуждающемуся в этом. Предпочтительно, данная фармацевтическая композиция дополнительно содержит бета-лактамный антибиотик. Предпочтительно бета-лактамный антибиотик является амоксициллином. Также предпочтительно используемым пролекарством является (1К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 4-тиа-1-азабицикло[3.2.0.]гептан-2-карбоновой кислоты, (1К)-1(бензоилокси)этиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4,4-диоксид (2§,5К,6К) или его сольват. Более предпочтительно, когда пролекарством является (1К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 4тиа-1-азабицикло[3.2.0.]гептан-2-карбоновой кислоты, (1К)-1-(бензо ило кси)этиловый эфир 6(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4,4-диоксид (2§,5К,6К) или его сольват, а бета-лактамным антибиотиком является амоксициллин. Кроме того, предпочтительно млекопитающим является человек.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Термины, используемые для описания данного изобретения, имеют здесь следующие значения.

Термин «эффективное количество» означает количество бета-лактамного антибиотика, которое, когда применяется отдельно или в комбинации с пролекарством согласно данному изобретению, предотвращает начало, облегчает симптомы, останавливает прогрессирование или устраняет бактериальную инфекцию у млекопитающего.

Термин «количество, повышающее эффективность» означает такое количество пролекарства, которое при введении млекопитающему и последующем гидролизе ίη νίνο с образованием ингибитора беталактамазы согласно данному изобретению, повышает терапевтическую эффективность одновременно вводимого бета-лактамного антибиотика.

Термин «млекопитающее» представляет отдельное животное, которое является представителем таксономического класса «млекопитающие» (МаттаПа). Класс «млекопитающие» включает, например, людей, мартышек, шимпанзе, горилл, крупный рогатый скот, свиней, лошадей, овец, собак, кошек, мышей и крыс.

В данном изобретении предпочтительным млекопитающим является человек.

Термин «фармацевтически приемлемый» означает, что носитель, растворитель и наполнители должны быть совместимы с другими ингредиентами композиции, и они не должны быть вредными для реципиента. Фармацевтические композиции согласно данному изобретению получены методами, известными специалистам в данной области, с использованием хорошо известных и легко доступных ингредиентов.

-2007540

Пролекарства согласно данному изобретению включают 1-(бензоилокси)метиловый эфир 4-тиа-1азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 1-(бензоилокси)метиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3диметил-7-оксо-4,4-диоксид (28,5К, 6К), который описан в примере 3, и 1-(бензоилокси)этиловый эфир

4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 1-(бензоилокси)этиловый эфир 6(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4,4-диоксид (28,5К,6К), который описан в примере 4.

Пролекарства согласно данному изобретению, которые далее описаны в примере 7, стабильны в верхних отделах ЖК тракта, но после всасывания легко гидролизуются ίη νίνο с образованием сульфона

6-в-гидроксиметилпенициллановой кислоты (здесь далее называемой «6-в-СГМПК»; «6-Р-НМРА8»), который является ингибитором бета-лактамаз, повышая эффективность бета-лактамных антибиотиков в отношении продуцирующих бета-лактамазу бактерий. Это подавление бета-лактамазы сохраняет антибактериальную активность совместно вводимого бета-лактамного антибиотика против бета-лактамаза (+) штаммов.

Так как пролекарства согласно данному изобретению гидролизуются ίη νίνο и образуют свободную кислоту ингибитора бета-лактамаз 6-в-СГМПК, эти пролекарства полезны тем, что когда их вводят млекопитающему, эффективность совместно вводимого бета-лактамного антибиотика против продуцирующих бета-лактамазу бактерий будет повышена.

Пролекарства согласно данному изобретению можно использовать при комбинированной терапии бета-лактамными антибиотиками для лечения инфекций, например, респираторного тракта, мочевыводящего тракта и мягких тканей у людей. Композиции согласно данному изобретению можно также использовать для лечения инфекций у других млекопитающих, таких как мастит у коров.

Бактериальные инфекции, поддающиеся лечению пролекарством, фармацевтической композицией и способом по данному изобретению, включают заболевания верхних дыхательных путей, включая бытовые пневмонии (БП; САР), обострения хронического бронхита (ОХБ) и острый бактериальный синусит (ОБС), вызываемые такими возбудителями респираторных инфекций, как Наеторйу1и8 шПиеп/ае и Могахе11а СаШатгйайк, включая антибиотикорезистентные штаммы.

Кроме того, бактериальные инфекции, поддающиеся лечению фармацевтическими композициями данного изобретения, которые содержат антибиотик, включают, в частности, отит среднего уха у детей, синусит, пневмонию и обострения бронхита у взрослых, вызванные Н. 1пПиепхае или 81гер1ососси8 рпеитошае, включая лекарственнорезистентные 8. Рпеитошае (ЛР8Р; ЭК8Р), такие как пенициллинорезистентные 8. Рпеитошае.

Другие бактериальные инфекции, поддающиеся лечению фармацевтическими композициями данного изобретения, которые содержат антибиотик, включают инфекции мягких тканей, вызываемые Е. Сой, К1еЙ81е11а рпеитошае, Еп1егоЬас1ег врр. и других представителей семейства Еп1егоЬас1епасеае.

Другие инфекции, поддающиеся лечению фармацевтическими композициями по данному изобретению, которые содержат антибиотик, включают инфекции, вызываемые продуцирующими беталактамазы чувствительными к метициллину стафилококками и продуцирующими бета-лактамазу анаэробами.

Так как пролекарства согласно данному изобретению содержат более одного хирального центра, они могут существовать в разных оптически активных диастереомерных формах. Более конкретно, предпочтительные пролекарства по данному изобретению содержат хиральный центр у 1-этил-положения. Данное изобретение включает как 1К, так и 18-диастереомеры 1-(бензоилокси)этиловый эфир 4-тиа-1азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 1-(бензоилокси)этиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3диметил-7-оксо- 4,4-диоксида (28,5К,6К), и также включает смеси этих диастереомеров, такие как рацемические смеси. Эти диастереомерные формы, их смесь и соответствующий их синтез дополнительно описаны здесь в следующих далее примерах 4-6.

Еще предпочтительнее, когда пролекарство по данному изобретению содержит 1К диастереомер 1(бензоилокси)этиловый эфир 4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 1-(бензоилокси)этиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4,4-диоксид (28,5К,6К), который описан в примере 5.

Пролекарства согласно данному изобретению могут проявлять полиморфизм. Полиморфные формы пролекарств образуют часть данного изобретения и могут быть получены кристаллизацией пролекарства по данному изобретению в разных условиях. Например, можно использовать разные растворители или разные смеси растворителей для кристаллизации, кристаллизацию при разных температурах, разные способы охлаждения, изменяемые от очень быстрого до очень медленного охлаждения во время кристаллизации. Полиморфные формы можно также получить нагреванием или плавлением пролекарства с последующим постепенным или быстрым охлаждением. Наличие полиморфных форм может быть определено с помощью ЯМР спектроскопии твердой пробы, ИК спектроскопии, дифференциальной сканирующей калориметрии, порошковой рентгеновской дифракции или других подобных методов.

Пролекарства по данному изобретению могут также существовать в виде сольватов, например, гидратов. Данное изобретение включает каждый сольват или их смеси.

- 3 007540

Для пролекарства минимальное количество вводимого пролекарства является таким количеством, которое будет повышать эффективность совместно вводимого бета-лактамного антибиотика. Максимальное количество вводимого пролекарства является таким количеством, которое или отдельно, или в сочетании с бета-лактамным антибиотиком является токсикологически приемлемым.

Обычно для взрослых и детей, весящих по меньшей мере 40 кг, количество в суточной дозе пролекарства находится между примерно 200 мг до примерно 1 г или более. Для детей, весящих менее 40 кг, количество в суточной дозе пролекарства находится между примерно 7 мг/кг/сутки и примерно 20 мг/кг/сутки или более. Однако эти цифры являются только иллюстративными, и в некоторых случаях может быть необходимо использовать дозировки, выходящие за эти пределы.

Суточную дозу пролекарства по данному изобретению можно вводить за от 1 до 4 раз в сутки в равных дозах.

При лечении бактериальной инфекции пролекарство по данному изобретению вводят вместе с беталактамным антибиотиком. Данное пролекарство и бета-лактамный антибиотик можно вводить одновременно или последовательно. Кроме того, данное пролекарство и антибиотик могут быть включены в отдельные фармацевтические композиции или в одну фармацевтическую композицию.

Типичными бета-лактамными антибиотиками, вместе с которыми вводят пролекарство данного изобретения, являются бета-лактамные антибиотики, которые чувствительны к ферментному разрушению и инактивации разными бета-лактамазными ферментами. Примеры таких чувствительных к беталактамазам антибиотиков включают, но не ограничиваются этим, пенициллины, такие как природные пенициллины, амоксициллин и ампициллин; цефалоспорины, такие как цефадроксил, цефазолин, цефалексин, цефалотин, цефапирин, цефрадин, цефаклор, цефамандол, цефоицид, цефоранид, цефпрозил, цефуроксим, цефдинир, цефоперазон, цефотаксим, цефподоксим, цефтазидим, цефтибутен, цефтизоксим, цефтриаксон и цефепим; и монобактамы, такие как азтреонам.

Обычно, когда они содержатся вместе в фармацевтической композиции, массовое отношение беталактамного антибиотика к пролекарству находится в интервале между примерно 15:1 и примерно 1:1.

Предпочтительно, пролекарство согласно данному изобретению вводят вместе с амоксициллином. Более предпочтительно амоксициллин вводят вместе с пролекарством (1К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, (1К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 6(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4,4-диоксида (28,5К,6К).

Термин «амоксициллин», в соответствии с описанием, будет означать амоксициллин или щелочную соль, или их гидрат, такой как, в частности, амоксициллина тригидрат или (кристаллизованный) натрий амоксициллин. Если не указано иначе, масса амоксициллина относится к массе, эквивалентной массе соответствующей свободной кислоты. Кроме того, будет понятно, что на практике масса амоксициллина, которая подлежит включению в лекарственную форму, будет дополнительно скорректирована в соответствии с общепринятой практикой, с учетом активности амоксициллина.

Обычно эффективное количество амоксициллина для взрослых и детей, весящих по меньшей мере 40 кг, представляет суточную дозировку на уровне от примерно 250 мг до примерно 5 г. Для детей, весящих менее 40 кг, повышающее эффективность количество амоксициллина представлено суточной дозой на уровне от примерно 20 мг/кг/сутки до примерно 150 мг/кг/сутки. Однако эти цифры являются только иллюстративными и в некоторых случаях может быть необходимо использовать дозы за этими пределами.

Суточную дозу амоксициллина можно вводить за от 1 до 4 раз в сутки в равных дозах в виде композиций с немедленным, модифицированным или замедленным (или медленным) высвобождением. Препараты фармацевтических композиций с немедленным, модифицированным или замедленным (или медленным) высвобождением, содержащие амоксициллин, которые пригодны для фармацевтической композиции по данному изобретению, и их получение описаны в патентах Соединенных Штатов №№ 4537887, выданного Кооке с1 а1., 6051255, выданного Соп1еу с1 а1., 6218380, выданного Со1е с1 а1., 6051255, выданного Соп1еу е1 а1., патентной заявке США, регистрационный № 09/911905, Соп1еу е1 а1., и международной заявке № РСТ/1В01/01899, Соп1еу е! а1. Содержание патентов США №№ 4537887, 6051255, 6218380, 6051255, заявки υδδΝ 09/911905 и международной патентной заявки № РСТ/1В01/01899 включено сюда во всей полноте в виде ссылки.

В этих композициях точное количество пролекарства и амоксициллина будет зависеть до некоторой степени от микроорганизма, от которого нужно лечить.

Как будет понятно специалисту в данной области, некоторые бета-лактамные соединения эффективны, когда их вводят перорально или парентерально, тогда как другие эффективны только тогда, когда их вводят парентерально. Когда пролекарство по данному изобретению комбинируют с парентерально вводимым бета-лактамным антибиотиком, фармацевтически приемлемым, который эффективен только при парентеральном введении, будет применяться комбинированная лекарственная форма, пригодная для парентерального введения. Когда данное пролекарство нужно комбинировать с бета-лактамным антибиотиком, который эффективен при пероральном и парентеральном введении, могут быть изготовлены комбинации, пригодные для или перорального приема, или для парентерального введения. Кроме того, возможно вводить препараты данного пролекарства перорально, вводя дополнительно в то же самое

- 4 007540 время бета-лактамный антибиотик парентерально; и также возможно вводить препараты данного пролекарства парентерально, с дополнительным пероральным приемом в то же самое время бета-лактамного антибиотика.

Фармацевтическая композиция в соответствии с данным изобретением содержит пролекарство по данному изобретению и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или растворитель (разбавитель).

По желанию фармацевтическая композиция дополнительно содержит бета-лактамный антибиотик. Предпочтительно, бета-лактамным антибиотиком является амоксициллин. Также предпочтительно, когда пролекарством является (1К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2карбоновой кислоты, (1К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4,4диоксид (2Б,5К,6К). Более предпочтительно, когда фармацевтическая композиция содержит (1К)-1(бензоилокси)этиловый эфир 4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, (1К)-1(бензоилокси)этиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4,4-диоксид (2Б,5К,6К), амоксициллин и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.

Примеры наполнителей, растворителей и носителей, которые пригодны для таких фармацевтических композиций, включают наполнители и разбавители, такие как крахмал, сахара, маннит и производные кремния; связывающие вещества, такие как карбоксиметилцеллюлоза и другие производные целлюлозы, альгинаты, желатин и поливинилпирролидон; увлажняющие вещества, такие как глицерин; дезинтеграторы, такие как агар-агар, карбонат кальция и бикарбонат натрия; средства для замедления растворения, такие как парафин; ускорители всасывания, такие как соединения четвертичного аммония; поверхностно-активные вещества, такие как цетиловый спирт, моностеарат глицерина; адсорбционные носители, такие как каолин и бентонит, и улучшающие скольжение вещества, такие как тальк, стеарат кальция и магния, и твердые полиэтиленгликоли. Лекарственные формы могут дополнительно включать: смазывающие вещества, такие как тальк, стеарат магния и минеральное масло; смачивающие вещества; эмульгирующие и суспендирующие вещества; консервирующие вещества, такие как метил- и пропилгидроксибензоаты; подсластители и улучшающие вкус и запах вещества.

При изготовлении фармацевтической композиции согласно данному изобретению, пролекарство и, по выбору, бета-лактамный антибиотик обычно смешивают с наполнителем, разбавленным наполнителем или включенным в носитель, который может быть в виде капсулы, пакетика или другого контейнера. Когда наполнитель служит разбавителем, он может быть твердым веществом, полутвердым веществом или жидким веществом, которое действует как носитель или как среда для активного ингредиента.

Фармацевтическую композицию можно вводить перорально или парентерально, т. е. внутримышечно, подкожно, внутривенно или внутрибрюшинно. Носитель, наполнитель или растворитель (разбавитель) выбирают в зависимости от предназначенного способа введения. Например, когда предполагается пероральный способ введения, фармацевтическую композицию согласно данному изобретению можно использовать в форме таблеток, включая жевательные таблетки, капсул, лепешек, драже, порошков, сиропов, эликсиров, водных растворов и суспензий, и тому подобного, в соответствии с обычной фармацевтической практикой. Пропорциональное отношение активного ингредиента к носителю будет, естественно, зависеть от химической природы, растворимости и стабильности активных ингредиентов, а также предполагаемой дозировки. Однако фармацевтические композиции, содержащие бета-лактамный антибиотик и пролекарство данного изобретения, будут предпочтительно содержать от примерно 20 до примерно 95% активных ингредиентов. В случае таблеток для перорального приема, носители, которые обычно используют, включают лактозу, цитрат натрия и соли фосфорной кислоты. В таблетках обычно используют разнообразные дезинтеграторы, такие как крахмал, улучшающие скольжение вещества, такие как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк. Для перорального введения в форме капсул подходящими разбавителями являются лактоза и полиэтиленгликоли с высокой молекулярной массой. Когда для перорального приема необходимы водные растворы или суспензии, активный ингредиент может быть объединен с эмульгирующими или суспендирующими средствами. Если желательно, можно добавить известные подсластители и улучшающие вкус и запах средства. Для парентерального введения обычно готовят стерильные растворы активных ингредиентов, и соответственно доводят рН данных растворов и добавляют буферы. Для внутривенного использования общая концентрация растворенных веществ должна быть отрегулирована так, чтобы сделать препарат изотоничным.

Препараты данного изобретения могут быть изготовлены в виде твердых дозированных форм для перорального приема способом, общепринятым в области фармацевтической технологии, например, таблетки, порошки или гранулированные продукты для восстановления в суспензию или раствор.

Подходящие ингредиенты и подходящие способы для изготовления таких таблеток описаны, например, в международных заявках АО 92/19227 и АО 95/28927, указания которых включены сюда во всей их полноте в виде ссылки. Порошковые или гранулированные препараты, такие как препараты детских суспензий, могут быть произведены с использованием методик, которые обычно приняты в области производства фармацевтических препаратов и при производстве сухих препаратов для воспроизведения в такие суспензии. Например, подходящим методом является способ смешивания сухих порошковых или гранулированных ингредиентов для заполнения подходящего контейнера.

- 5 007540

Для дозирования детям препараты данного изобретения предпочтительно изготавливают в виде препаратов сладких водных сиропов с вкусовыми добавками общепринятой рецептуры (за исключением нового соотношения в них амоксициллина:пролекарства и предназначенного использования), содержащих подходящее массовое количество амоксициллина и пролекарства в единице дозируемого объема, например 5 или 2,5 мл, предпочтительно в виде сиропа. Детская лекарственная форма может поэтому содержать общий объем раствора или суспензии, например, сироп или гранулы, или порошок, которые могут быть превращены в такой раствор или суспензию с концентрацией раствора или суспензии, при которой содержится такая доза в таком объеме. Такие соответствующие препараты описаны в международной заявке № РСТ ЕР96/01881 (ЗтйНКНпе ВеесНат). Препарат данного изобретения будет обычно, в дополнение к его активным веществам, амоксициллину и пролекарству, также включать наполнители, которые являются стандартными в области изготовления препаратов для дозированного перорального приема и используются обычно в стандартных количественных соотношениях и с обычно стандартным размером частиц и стандартного качества и т.д.

В случае суспензий для перорального приема для детей эти наполнители могут содержать суспендирующие вспомогательные средства, улучшающие скольжение вещества (для улучшения заполнения), разбавители, наполнители, вкусовые добавки, подсластители и стабилизаторы.

Подходящие для использования вспомогательные вещества включают ксантановую смолу (суспендирующее средство), коллоидную двуокись кремния (улучшающее скольжение вещество), янтарную кислоту (стабилизатор), аспартам (подсластитель), гидроксипропилметилцеллюлозу (суспендирующее средство) и двуокись кремния (разбавитель для пролекарства или наполнитель). Вкусовые добавки могут состоять из обычных вкусовых добавок, таких же, что и для жевательной резинки, апельсинового, бананового, малинового, виноградного сиропов и светлой патоки или их смесей, чтобы удовлетворять местным требованиям (вкусам).

Фармацевтическая композиция данного изобретения может, например, быть представлена в твердых комплектных дозированных формах, включающих соответствующее количество для введения такой суточной дозы. Например, комплектная дозированная форма может представлять собой таблетки, пакетики, содержащие гранулы или порошки для восстановления, одна(ин) или две(а) из которых должны быть приняты 1-4 раза в день. Альтернативно, комплектная (порционная) доза может быть представлена в виде общего количества твердого вещества или раствора, или суспензии, например, в виде сиропа для приема детьми, вместе с подходящим отмеряющим устройством известного типа для облегчения введения соответствующего количества на одну дозу данного препарата. Соответствующим количеством на одну дозу является количество, которое обеспечивает прием вышеназванного количества суточной дозы, разделенного на 1-4 приема.

Еще одно воплощение данного изобретения представляет набор для получения антибактериального терапевтического эффекта у млекопитающего, включающий (1) фармацевтическую композицию, которая содержит пролекарство данного изобретения и, по выбору, бета-лактамный антибиотик, и (2) указания по применению фармацевтической композиции таким образом, чтобы достигался желаемый терапевтический эффект.

Данное изобретение будет дополнительно проиллюстрировано посредством последующих примеров. Нужно понимать, что приведенные примеры не предназначены для ограничения данного изобретения описанными здесь частными воплощениями.

Пример 1. Получение и разделение энантиомеров (К/8) 1-хлорэтилового эфира бензойной кислоты

(К/8) 1-хлорэтиловый эфир бензойной кислоты, представленный выше, получали следующим образом.

К перемешиваемому раствору 122 г (862 ммоль) бензоилхлорида (Αΐάτίοΐι) в атмосфере азота в 3-х горлой круглодонной колбе добавляли 2,35 г (17,2 ммоль) безводного хлорида цинка (Αΐάήοΐι). Реакционную смесь перемешивали в течение 15 мин при комнатной температуре и затем охлаждали в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем охлаждали до -15°С, используя баню с этиленгликолем/СО₂. В эту смесь медленно добавляли 37,9 (862 ммоль) ацетальдегида (А1с1пс11) при поддержании внутренней температуры ниже 0°С. После того, как добавление завершалось, реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры. Добавляли 400 мл воды и 400 мл СН₂С12, а затем слои разделяли. Органический слой отделяли и промывали насыщенным раствором ИаНСОз, водой, насыщенным раствором соли, сушили над М§80₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Хроматография на силикагеле с элюированием 1,75% этилацетата/98,25% гексана давала 55,4 г желтого масла.

^-ЯМР (СОС1₃, 400 МГц) δ: 8,08 (д, 2Н, 1=7,5 Гц), 7,61 (т, 1Н, 1=7,5 Гц), 7,47 (т, 2Н, 1=7,5 Гц), 6,80 (кв., 1Н, 1=6 Гц), 1,93 (д, ЗН, 1=6 Гц).

-6007540 (К)-1-хлорэтиловый эфир бензойной кислоты, представленный ниже, выделяли хиральным разделением (+/-)-1-хлорэтилового эфира бензойной кислоты с использованием 10-50 см колонки СЫга1се1 ΟΙ, элюируя гептаном/ИПА (98/2) и со скоростью потока 250 мл/мин. Собирали энантиомер, элюируемый вторым с аналитической чистотой и временем удержания 7,123 мин.

^-ЯМР (СОС1₃, 400 МГц) δ: 8,08 (д, 2Н, 1=7,5 Гц), 7,61 (т, 1Н, 1=7,5 Гц), 7,47 (т, 2Н, 1=7,5 Гц), 6,80 (кв., 1Н, 1=6 Гц), 1,93 (д, ЗН, 1=6 Гц). [ос_а] = -140° (С+0,0315; СНС1₃).

(8)-1 -хлорэтиловый эфир бензойной кислоты, показанный ниже, выделяли хиральным разделением (+/-)-1-хлорэтилового эфира бензойной кислоты с использованием 10-50 см колонки СЫга1се1 ΟΙ, элюируя гептаном/ИПА (98/2) и со скоростью потока 250 мл/мин. Собирали энантиомер элюируемый первым с аналитической чистотой и временем удержания 5,807 мин.

^-ЯМР (СОС1₃, 400 МГц) δ: 8,08 (д, 2Н, 1=7,5 Гц), 7,61 (т, 1Н, 1=7,5 Гц), 7,47 (т, 2Н, 1=7,5 Гц), 6,80 (кв., 1Н, 1=6 Гц), 1,93 (д, ЗН, 1=6 Гц), [ос_а] = +130° (С+0,0345; СНС1₃).

Пример 2. Получение мононатр иевой соли 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксида (28,5К,6К)

Мононатриевую соль 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2карбоновой кислоты, 4,4-диоксида (28,5К,6К), представленную выше, (здесь далее «№-ГМПАС») получали, следуя четырехстадийному методу.

Стадия 1. Получение сульфона натрий-6,6-дибромпеницилланата

Этилацетат (15,8 л) добавляли к сульфону 6,6-дибромпенициллановой кислоты (2500 г) и нагревали до 50°С. Этилгексаноат натрия (1044 г) и этилацетат (5,0 л) перемешивали для получения раствора, затем добавляли к раствору сульфона 6,6-дибромпенициллановой кислоты в течение 60-минутного периода. Реакционной смеси давали остыть до комнатной температуры и полученные твердые вещества гранулировали в течение периода, равного 1 ч. Продукт собирали фильтрованием и промывали этилацетатом с получением 2197 г (83%) сульфона натрий-6,6-дибромпеницилланата.

Т.пл. 186-187°С. Ή-ΉΜΡ(ϋ₂Ο) δ: 1,30 (с, ЗН), 1,45 (с, ЗН), 4,29 (с, 1Н), 5,54 (с, 1Н).

Стадия 2. Получение сульфона бензил-6,6-дибромпеницилланата

Диметилформамид (5,7 л) и сульфон натрий-6,6-дибромпеницилланата (3820 г) соединяли и смесь перемешивали в течение нескольких минут, до тех пор, пока все твердые вещества не растворялись. К этой смеси добавляли бензилбромид (1400 г) в течение 1-часового периода. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Добавляли воду (4,5 л) и этилацетат (15 л), чтобы подавить реакцию. Водную фазу промывали этилацетатом (2 х 600 мл), и объединенные органические фазы последовательно промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (2 х 1 л) и водным раствором хлорида натрия (2x1 л). Органический слой сушили над сульфатом магния и концентри ровали с получением 3566 г (90%) целевого сульфона бензил-6,6-дибромпеницилланата в виде кристаллов. Т.пл. 146-147°С.

^-ЯМР (СЭС1₃) δ: 1,2 (с, ЗН), 1,5 (с, ЗН), 4,5 (с, 1Н), 4,9 (с, 1Н), 5,16 (д, 1Н, 1=12 Гц), 5,29 (д, 1Н, 1=12 Гц), 7,35-7,40 (м, 5Н).

Стадия 3. Получение сульфона бензил-6-3-гидроксиметил-6-ос-бромпеницилланата

НО

ыу Ме

Η ^ζΟΟ₂Βη

В круглодонной колбе нагревали параформальдегид под потоком азота до 160-180°С для устранения избытка воды. В отдельной круглодонной колбе тетрагидрофуран (8,0 л) и сульфон бензил-6,6дибромпенициллината (1000 г) соединяли и перемешивали до тех пор, пока все твердые вещества не растворялись. Раствор охлаждали до -78°С и к раствору медленно добавляли ЗМ раствор метилмагнийхлорида в ТГФ (720 мл) при поддержании температуры менее -70°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч. В это время газообразный формальдегид, выпускаемый из первой круглодонной колбы, пропускали по поверхности охлажденной реакционной смеси с использованием потока азота. Этот газообразный формальдегид пропускали над реакционной смесью в течение примерно 6 ч при сохранении охлаждения и энергичном перемешивании охлаждаемой реакционной колбы. По завершении реакции, определяемом ТСХ (80:20 гексан: этил ацетат) реакцию гасили при -78°С раствором уксусной кислоты (132 мл) в ТГФ (400 мл). Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры, затем реакционную смесь фильтровали через 8ирегсе1. Фильтрат концентрировали до масла (-1000 г). Затем масло переносили в большой реакционный сосуд и добавляли этилацетат (5,0 л)/воду (2,5 л). Смесь перемешивали, затем разделяли. Водный слой промывали этилацетатом (2 х 500 мл). Объединенные органические слои последовательно промывали 1н. соляной кислотой (3,0 л), водой (3 х 3,0 л) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (3 х 3,0 л). Органический слой сушили сульфатом магния, фильтровали через 8ирегсе1, концентрировали и хранили в холодильнике. Полученное масло подвергали хроматографии через силикагель (1 кг на 500 г продукта в виде масла) и элюировали гексаном/этилацетатом 9:1 (20 л) с удалением примесей, затем гексаном/этилацетатом 4:1 (4,0-8,0 л) и в конце гексаном/этилацетатом (3:2) (когда необходимо) до тех пор, пока не удалялся сульфон 6-3-гидроксиметил-6-ос-бромпенициллината. Выход 205,5 г (23%). Т.пл. 120-121°С. (СЭС1₃) ^-ЯМРССЭСЦ) δ: 1,28 (с, ЗН), 1,57 (с, ЗН), 4,09 (д, 1Н,

1=16 Гц), 4,54 (с, 1Н), 4,62 (д, 1Н, 1=16 Гц), 4,82 (с, 1Н), 5,18 (д, 1Н, 1=16 Гц), 5,32 (д, 1Н, 1=16 Гц) 7,367,42 (м, 5Н).

Стадия 4. Получение мононатриевой соли 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1азабицикло[3.2.0]тептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксида (28,5К,6К)

Воду (163 мл), этилацетат (2000 мл), сульфон бензил-6-3-гидроксиметил-6-ос-бромпеницилланата (180 г), триэтиламин (90,0 г) и 5% палладий на угле (45 г) объединяли и гидрировали при 50 фунт/дюйм² и комнатной температуре в течение примерно 2 ч. ТСХ реакционной смеси показала, что реакция не завершена, поэтому добавляли дополнительно катализатор (15 г) и смесь гидрировали в течение одного часа. Когда реакция завершалась, реакцию гасили смесью серной кислоты (112,5 г) и воды (270 мл). Реакционную смесь фильтровали для удаления катализатора и промывали ЕЮАс (450 мл). Водный слой промывали ЕЮАс (3 х 750 мл). Органические фазы объединяли и сушили хлоридом кальция до содержания воды менее 1%. Хлорид кальция затем отфильтровывали и этилацетат доводили до 1/2 его объема. Затем к раствору снова добавляли свежий этилацетат, и содержание воды в растворе теперь составляло 0,09%. Этилгексаноат натрия (59 г) и ЕЮАс (450 мл) объединяли и медленно добавляли к органической фазе при комнатной температуре. Смеси затем давали гранулироваться в течение периода от 30 до 45 мин. Полученные твердые вещества отфильтровывали, промывали ЕЮАс (500 мл) и сушили с получением 79,0 г (66%) сульфона 6-3-гидроксиметилпеницилланата натрия. Твердые вещества дополнительно очищали перекристаллизацией из 2-пропанола/воды. Т.пл. 246-245°С.

^-ЯМР (ϋ₂Ο) δ: 1,23 (с, ЗН), 1,39 (с, ЗН), 3,82-3,89 (м, 1Н), 3,97-4,10 (м, ЗН), 4,85 (с, 1Н).

Альтернативная стадия 4. Получение мононатриевой соли 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4тиа-1 -азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксида (28,5К,6К)

Сульфон бензил-6-3-гидроксиметил-6-ос-бромпеницилланата (1143 г) помещали в большой реакционный сосуд. Добавляли бензол (6,2 л) и гидрид трибутилолова (770 мл) и реакционную смесь нагревали с обратным холодильником при температуре дефлегмации в течение 2-3 ч. Реакцию контролировали ТСХ, растворитель = гексан/этилацетат 1:1.

По завершении реакции смесь концентрировали до масла с удалением бензола. Масло промывали гексаном при комнатной температуре до тех пор, пока не удалялся весь остаток побочных продуктов олова. Вещество повторно нагревали с обратным холодильником; добавляли этилацетат (ЕЮАс), чтобы перенести вещество в одну колбу, и концентрировали. Вещество промывали гексаном (3 х), и слой продукта сушили под пониженным давлением.

Половину масла (549 г) подвергали хроматографии на силикагеле (1 кг) с достаточным количеством дихлорметана для перевода масла в раствор, элюируя гексаном/ЕЮАс 7:3, доводя до гексан/ЕЮАс 3:2. Фракции продукта объединяли и концентрировали.

Масло (-540 г) помещали в автоклав. Добавляли тетрагидрофуран (1,9 л), 10% палладия на угле и воду (300 мл), и реакционную смесь гидрировали при 50 фунт/дюйм², при температуре 30°С в течение примерно 1 ч. По завершении реакции реакционную смесь фильтровали через целит для удаления катализатора.

Фильтрат концентрировали и разбавляли ЕЮАс (3,0 л). Водный слой промывали ЕЮАс (1,0 л). Объединенные органические слои сушили хлоридом кальция и концентрировали до половины объема. Добавляли ЕЮАс (2,5 л) с последующим добавлением каплями раствора этилгексаноата натрия (ЭГН, (БЕН) 250 г) и ЕЮАс (1,05 л). Полученные твердые вещества удаляли фильтрованием и сушили в вакуум-шкафу.

К полученным твердым веществам добавляли воду (6-800 мл) и рН доводили до значений между 0,5 и 1,0 с помощью 4М серной кислоты. Данный продукт экстрагировали ЕЮАс (5 х 1,0 л). Объединенные органические фазы сушили хлоридом кальция и фильтровали через стеклянный (зрагИе) фильтр. Объем фильтрата снижали наполовину и добавляли раствор БЕН (115,3 г) и ЕЮАс (500 мл). Смеси позволяли гранулироваться. Полученные твердые вещества фильтровали и промывали ЕЮАс с получением целевого продукта.

Пример 3.

Пролекарство 1: (бензоилокси)метиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1азабицикло[3.2.0]-гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

Пролекарство 1, представленное выше, получали следующим образом. К перемешиваемому раствору 3,13 г (18,4 ммоль) хлорметилбензоата (№гс11ет) в 200 мл ацетона добавляли 13,8 г (92,1 ммоль) йодида натрия (АШпсй). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. К этому раствору добавляли 3,5 г (12,3 ммоль) мононатриевой соли 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-

4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксида (28,5К,6К). Реакционную смесь затем концентрировали в вакууме. Последовательно добавляли 200 мл воды и 200 мл этилацетата, и органический слой отделяли и промывали насыщенным раствором соли, сушили над Ха₂БО₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Хроматография на силикагеле с элюированием этилацетатом/гексаном 1:1 давала 8,62 г масла. Масло затем перекристаллизовывали из этилацетата/гексана с выходом 5,5 г кристаллического твердого вещества. Маточная жидкость еще содержала целевое соединение. Температура плавления = 102°С.

Ή-ЯМР (ДМСО) δ: 7,97 (д, 2Н, 1=7,5 Гц), 7,70 (т, 1Н, 1=7,5 Гц), 7,56 (т, 2Н, 1=7,5 Гц), 6,12 (д, 1Н, 1=6 Гц), 5,99 (д, 1Н, 1=6 Гц), 5,19 (д, 1Н, 1=5 Гц), 5,17 (м, ОН), 4,62 (с, 1Н), 4,20 (м, 1Н), 4,03 (м, 1Н), 3,73 (м, 1Н), 1,41 (с, ЗН), 1,28 (с, ЗН).

Пример 4.

Пролекарство 2: 1-(бензоилокси)этиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1азабицикло[3.2.0]-гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

Пролекарство 2, представленное выше, получали следующим образом. К перемешиваемому раствору 2,5 г (8,77 ммоль) мононатриевой соли 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксида (28,5К,6К) в 20 мл ДМФ добавляли 2,1 г (11,4 ммоль) 1-хлорэтилового эфира (+/-)-бензойной кислоты. Полученную смесь затем нагревали до 35°С в течение 3 дней. Добавляли 40 мл воды и 100 мл этилацетата и слои разделяли. Водный слой экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои промывали водой, насыщенным раствором соли, сушили над №₂8О₄, фильтровали и концентрировали под вакуумом. Хроматография на силикагеле с элюированием 1 л 20% этилацетата/80% гексана с последующим элюированием 1 л этилацетата/гексана 1:1 давала 1,2 г масла, которое перекристаллизовывали с использованием этилацетата/гексана с получением 1 г белого кристаллического вещества (смесь из 2 диастереомеров). Температура плавления = 133-135°С.

-9007540 'Н-ЯМР (б-ДМСО, 400 МГц) δ: 7,96 (д, 2Н, 1=7,5 Гц), 7,71 (т, 1Н, 1=7,5 Гц), 7,55 (т, 2Н, 1=7,5 Гц), 7,07 (кв., 0,5Н, 1=5,4 Гц), 7,03 (кв., 0,5Н, 1=5,4 Гц), 5,19 (д, 1Н, 1=5 Гц), 5,15 (м, ОН), 4,54 (с, 0,5Н), 4,53 (с, 0,5Н), 4,19 (м, 1Н), 4,01 (м, 1Н), 3,73 (м, 1Н), 1,62 (д, 1,5Н, 1=5,4 Гц), 1,61 (д, 1,5Н, 1=5,4 Гц), 1,44 (с, 1,5Н), 1,38 (м, 4,5Н).

Пример 5.

Пролекарство 3: (1 К)-1-(бензоил окси)этиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

Пролекарство 3, представленное выше, получали способом из примера 4 путем замены 1хлорэтилового эфира (З)-бензойной кислоты и только нагреванием до 30°С. Температура плавления = 154°С.

^-ЯМР (б-ДМСО, 400 МГц) δ: 7,96 (д, 1=7,5 Гц, 2Н), 7,71 (т, 1=7,5 Гц, 1Н), 7,55 (т, 1=7,5 Гц, 2Н), 7,03 (кв., 1=5,4 Гц, 1Н), 5,19 (д, 1=5 Гц, 1Н), 5,15 (м, ОН), 4,53 (с, 1Н), 4,18 (м, 1Н), 4,02 (м, 1Н), 3,72 (м, 1Н), 1,61 (д, 1=5,4, Гц, ЗН), 1,39 (с, ЗН), 1,37 (с, ЗН). [а]_о = +119° (с = 0,0121; СНС1₃)

Пролекарство 3 также получали по следующему альтернативному пути. 52,03 г (182,4 ммоль) мононатриевой соли 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксида (28,5К,6К), 61,50 г (181,1 ммоль) гидросульфата тетрабутиламмония и 15,44 г (183,2 ммоль) гидрокарбоната натрия соединяли при 20°С. К этому добавляли 400 мл дихлорметана при сохранении температуры, равной 20°С. Затем добавляли 100 мл воды. Полученную смесь перемешивали при 20°С в течение 30 мин. Органический слой отделяли и сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме. К полученному остатку добавляли 169,4 г (917,6 ммоль) 1-хлорэтилового эфира (З)-бензойной кислоты с последующим добавлением 160 мл ацетона. Полученный раствор затем перемешивали в течение 3 дней при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрировали в вакууме и подвергали хроматографии на силикагеле, используя 40-50% этилацетат/гексан в качестве элюента. Полученный продукт перекристаллизовывали из этанола с последующей перекристаллизацией из этилацетата/гексана. Фильтрование и сушка в вакууме давали 85,9 г белого кристаллического продукта.

Пример 6.

Пролекарство 4: (18)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа1-азабицикло-[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

Пролекарство 4, представленное выше, получали способом из примера 4 путем замены 1хлорэтилового эфира (К)-бензойной кислоты и только нагреванием до 30°С.

Ή-ЯМР (б-ДМСО, 400 МГц) δ: 7,96 (д, 2Н, 1=7,5 Гц), 7,71 (τ, 1Н, 1=7,5 Гц), 7,55 (τ, 2Н, 1=7,5 Гц), 7,07 (кв., 1Н, 1=5,4 Гц), 5,19 (д, 1Н, 1=5 Гц), 5,15 (м, ОН), 4,54 (с, 1Н), 4,18 (м, 1Н), 4,01 (м, 1Н), 3,72 (м, 1Н), 1,62 (д, ЗН, 1=5,4 Гц), 1,44 (с, ЗН), 1,35 (с, ЗН). МС (ш/ζ): 410 (Μ’ -1, 100)

Пример 7. Получение карбоновых кислот для синтеза сравниваемых про лекарств 6(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло-[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4диоксида (28,5К,6К)

Изопропиловый эфир хлорметилового эфира карбоновой кислоты, представленный выше, получали следующим образом. К перемешиваемому раствору 10 г (75,2 ммоль) хлорметилхлорформиата (Пика) в 100 мл дихлорметана при 0°С добавляли 5,8 мл (76 ммоль) изопропилового спирта с последующим добавлением 11,93 г (97,8 ммоль) диметиламинопиридина (Пика). Полученной реакционной смеси затем давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь затем разбавляли водой. Слои затем разделяли. Органический слой промывали насыщенным раствором соли, сушили над М§80₄, фильтровали и концентрировали в вакууме с выходом 6 г прозрачного масла. Затем масло использовали далее как есть.

^-ЯМР (СОС1₃, 400 МГц) δ: 5,72 (с, 2Н), 4,95 (м, 1Н, 1=6,2 Гц), 1,33 (д, 1Н, 1=6,2 Гц).

- 10007540

Примечание: Лучший выход достигается, если использовать только 1,05 эквивалента диметиламинопиридина.

Изопропиловый эфир 1-хлорэтилового эфира (+/-)-карбоновой кислоты получали аналогично изопропиловому эфиру хлорметилового эфира (+/-)-карбоновой кислоты путем замены хлорэтилхлорформиата (Пика).

'Н-ЯМР (СОС1₃, 400 МГц) δ: 6,41 (кв., 1Н, 1=5,8), 4,94 (м, 1Н, 1=6,2 Гц), 1,81 (д, ЗН, 1=5,8), 1,32 (м,

6Н).

С1

Пропиловый эфир 1-хлорэтилового эфира (+/-)-карбоновой кислоты получали аналогично изопропиловому эфиру хлорметилового эфира карбоновой кислоты путем замены пропанолом (А1с1псй).

'Н-ЯМР (СОС1₃, 400 МГц) δ: 6,41 (кв., 1Н, 1=5,8 Гц), 4,17 (м, 2Н), 1,81 (д, ЗН, 1=5,8), 1,71 (м, 2Н), 0,96 (м, ЗН).

С1‘

1-хлорэтиловый эфир бутилового эфира (+/-)-карбоновой кислоты получали аналогично изопропиловому эфиру хлорметилового эфира карбоновой кислоты путем замены н-бутанолом (Αΐάπείι).

'Н-ЯМР (СОС1₃, 400 МГц) δ: 6,41 (кв., 1Н, 1=5,8 Гц), 4,20 (м, 2Н), 1,81 (д, ЗН, 1=5,8 Гц), 1,67 (м, 2Н), 1,41 (м, 2Н), 0,93 (м,ЗН).

Пропиловый эфир хлорметилового эфира карбоновой кислоты получали аналогично изопропиловому эфиру хлорметилового эфира карбоновой кислоты путем замены пропанолом (А1с1псй).

'Н-ЯМР (СОС1₃, 400 МГц) δ: 5,72 (с, 2Н), 4,18 (т, 2Н, 1=6,6 Гц), 1,71 (м, 2Н), 0,97 (т, ЗН, 1=7,5 Гц).

Хлорметиловый эфир бутилового эфира карбоновой кислоты получали аналогично изопропиловому эфиру хлорметилового эфира карбоновой кислоты путем замены н-бутанолом (Αΐάπείι).

'Н-ЯМР (СОС1₃, 400 МГц) δ: 5,72 (с, 2Н), 4,23 (т, 2Н, 1=6, 6 Гц), 1,70 (м, 2Н), 1,41 (м, 2Н), 0,94 (т, ЗН, 1=7,5 Гц).

Вт (+/-)-5-Бром-5Н-фуран-2-он получали аналогично способу из Тей. Гей. 22, 34, 1981, 3269-3272.

С1‘

Этиловый эфир 1 -хлор- 1-метилового эфира уксусной кислоты получали как у Хеиеп8с1т\¥ап(1ег е! а1., НеХейса СЫписа 1978; 61: 2047-2058.

СГ

Этиловый эфир хлорметилового эфира карбоновой кислоты получали аналогично изопропиловому эфиру хлорметилового эфира путем замены этанолом.

'Н-ЯМР (СОС1₃, 400 МГц) δ: 5,72 (с, 2Н), 4,28 (кв., 2Н, 1=7,1 Гц), 1,34 (т, ЗН, 1=7,1 Гц).

Пример 8.

Получение пролекарств 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-Газабицикло[3.2.0]гептан-2карбоновой кислоты, 4,4-диоксида (28,5К,6К) для сравнения

Пролекарства 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксида (28,5К,6К) получали для демонстрации неожиданно улучшенной биодоступности, физических свойств пролекарств данного изобретения. Из этих лекарств для сравнения пролекарство сравнения 1 описано в примере 25 патента США № 4287181. Пролекарства для сравнения 2-15 являются новыми соединениями, но охватываются объемом группы, описанной в патенте США № 4287181.

Пролекарство сравнения 1

2,2-диметил-1-оксопропокси метиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-дим етил-7-оксо-4-тиа-1азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

К перемешиваемому раствору 2,5 г (8,77 ммоль) мононатриевой соли 6-(гидроксиметил)-3,3диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксида (28,5К,6К) в 20 мл ДМФ добавляли (11,4 ммоль) хлорметилпивалата (АМпсй) и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Полученную смесь затем нагревали до 35°С в течение 3 ч. Добавляли 40 мл воды и 100 мл этилацетата и слои разделяли. Водный слой экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои промывали водой, насыщенным раствором соли, сушили над Νβ₂8Ο₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Хроматография на силикагеле с элюированием 1 л 20% этилацетата/80% гексана с последующим элюированием 1 л этилацетата/гексана 1:1 давала масло. К маслу добавляли гексан (15 мл) и образец помещали в холодильник на 4 дня, где твердое вещество выпадало в осадок. Затем его концентрировали в вакууме с получением 110 мг белого аморфного вещества. Температура плавления = 7073°С.

¹Н-ЯМР(СОС1₃, 400 МГц) δ: 5,94 (д, 1Н, 1=5,4 Гц), 5,70 (д, 1Н, 1=5,4 Гц), 4,69 (д, 1Н, 1=4,1 Гц), 4,48 (с, 1Н), 4,30 (м, 1Н), 4,15 (м, 2Н), 1,55 (с, ЗН), 1,41 (с, ЗН), 1,21 (с, 9Н).

Альтернативно это соединение, которое называется также сульфоном пивалоилоксиметил-6-βгидроксиметилпенициллината, может быть получено, как описано в примере 25 патента США № 4287181.

Пролекарство сравнения 2

Этоксикарбонилоксиметиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

Это пролекарство получали по методу, примененному для получения пролекарства сравнения 1, за исключением того, что хлорметилпивалат заменяли этиловым эфиром хлорметилового эфира карбоновой кислоты. Температура плавления = 103-105°С.

'Н-ЯМР (МеОЭ, 400 МГц) δ: 5,91 (д, 1Н, 1=5,8 Гц), 5,76 (д, 1Н, 1=5,8 Гц), 4,96 (д, 1Н, 1=4,6 Гц), 4,55 (с, 1Н), 4,15-4,25 (м, 4Н), 3,95 (м, 1Н), 1,53 (с, ЗН), 1,41 (с, ЗН), 1,29 (т, ЗН, 1=7,1 Гц).

- 12007540

Пролекарство сравнения 3

1,3-дигидро-3-оксо-1 -изобензофураниловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3- диметил-7-оксо-4-тиа-1 азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

Это пролекарство получали по методу, примененному для получения пролекарства сравнения 1, за исключением того, что хлорметилпивалат заменяли 3-бромфталидом (Αΐάποίι).

При разбавлении ДМФ водой желаемый продукт осаждался в виде аморфного твердого вещества и его отфильтровывали и сушили в вакууме. МС (ш/ζ): 394 (М‘) ЯМР показывает смесь диастереомеров. 'Н-ЯМР (ά-ДМСО, 400 МГц) δ: 7,8-8,0 (м, 4Н), 7,60 (с, 0,5Н), 7,59 (с, 0,5Н), 5,23 (м, 1Н), 5,16 (ОН), 4,71 (с, 0,5Н), 4,67 (с, 0,5Н), 4,20 (м, 1Н), 4,02 (м, 1Н), 3,74 (м, 1Н), 1,47 (с, 1,5Н), 1,37 (с, 1,5Н), 1,36 (с, 1,5Н), 1,31 (с, 1,5Н).

Пролекарство сравнения 4

-метилэтоксикарбонилоксиметиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3 -диметил-7-оксо-4-тиа-1 азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

К перемешиваемому раствору (18,4 ммоль) изопропилового эфира хлорметилового эфира карбоновой кислоты в 200 мл ацетона добавляли 13,8 г (92,1 ммоль) йодида натрия (АМпсй). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. К этому раствору добавляли 3,5 г (12,3 ммоль) мононатриевой соли 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2карбоновой кислоты, 4,4-диоксида (И8 4287181), и реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Затем реакционную смесь концентрировали в вакууме. Добавляли 200 мл воды и 200 мл этилацетата и органический слой отделяли и промывали насыщенным раствором соли, сушили над №₂8О₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Продукт подвергали хроматографии на силикагеле с элюированием этилацетатом/гексаном 1:1. Конечный продукт представлял собой красноватое масло. МС (ш/ζ): 378 (М‘).

'Н-ЯМР (ά-ДМСО, 400 МГц) δ: 5,86 (д, 1Н, 1=5,8 Гц), 5,74 (д, 1Н, 1=5,8 Гц), 5,20 (д, 1Н, 1=5 Гц),

5,17 (м, ОН), 4,82 (м, 1Н), 4,60 (с, 1Н), 4,20 (м, 1Н), 4,03 (м, 1Н), 3,74 (м, 1Н), 1,42 (с, ЗН), 1,30 (с, ЗН), 1,22 (д, 6Н, 1=6,2 Гц).

Пролекарство сравнения 5

1-[[(1-метилэтокси)карбонил]окси]этиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

Это пролекарство получали по методу, примененному для получения пролекарства сравнения 4, за исключением того, что изопропиловый эфир хлорметилового эфира карбоновой кислоты заменяли изопропиловым эфиром 1-хлорэтилового эфира карбоновой кислоты. МС (ш/ζ): 392 (М-). ЯМР показал, что красноватое масло является смесью 2 диастереомеров.

-13007540 'Н-ЯМР (ά-ДМСО, 400 МГц) δ: 6,71 (кв., 0,5Н, 1=5,4 Гц), 6,71 (кв., 0,5Н, 1=5,4 Гц), 6,67 (кв., 0,5Н, 1=5,4 Гц), 5,20 (д, 1Н, 1=5 Гц), 4,79 (м, 1Н), 4,51 (с, 0,5Н), 4,49 (с, 0,5Н), 4,20 (м, 1Н), 4,03 (м, 1Н), 3,74 (м, 1Н), 1,48 (м, ЗН), 1,43 (с, 1,5Н), 1,39 (с, 1,5Н), 1,33 (м, ЗН), 1,22 (м, 6Н).

Пролекарство сравнения 6

6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-11 - [(1 -пропоксикарбонил)окси]этиловый азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

Это пролекарство получали по методу, примененному для получения пролекарства сравнения 4, за исключением того, что изопропиловый эфир хлорметилового эфира карбоновой кислоты заменяли пропиловым эфиром 1-хлорэтилового эфира карбоновой кислоты. МС (ητ/ζ): 392 (М‘). ЯМР показал, что красновато-желтое масло является смесью 2 диастереомеров.

^-ЯМР (ά-ДМСО, 400 МГц) δ: 6,72 (кв., 0,5Н, 1=5,4 Гц), 6,68 (кв., 0,5Н, 1=5,4 Гц), 5,20 (м, 1Н), 4,51 (с, 0,5Н), 4,49 (с, 0,5Н), 4,20 (м, 1Н), 4,03 (м, ЗН), 3,74 (м, 1Н), 1,59 (м, 2Н), 1,48 (м, ЗН), 1,39 (с, 1,5Н), 1,34 (с, 1,5Н), 1,22 (м, ЗН), 0,86 (м, ЗН).

Пролекарство сравнения 7

6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-11 -[(1 -бутоксикарбонил)окси]этиловый азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

Это пролекарство получали по методу, примененному для получения пролекарства сравнения 4, за исключением того, что изопропиловый эфир хлорэтилового эфира карбоновой кислоты заменяли 1хлорэтиловым эфиром бутилового эфира карбоновой кислоты. МС (ητ/ζ): 406 (М‘). ЯМР показал, что красновато-желтое масло является смесью 2 диастереомеров.

^-ЯМР (ά-ДМСО, 400 МГц) δ: 6,72 (кв., 0,5Н, 1=5,4 Гц), 6,68 (кв., 0,5Н, 1=5,4 Гц), 5,20 (м, 1Н), 4,51 (с, 0,5Н), 4,49 (с, 0,5Н), 4,20 (м, 1Н), 4,03 (м, ЗН), 3,74 (м, 1Н), 1,59 (м, 2Н), 1,15-1,55 (м, ИН), 0,86 (м, ЗН).

Пролекарство сравнения 8

- 14007540

Пропоксикарбонилоксиметиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1 -азабицикло [3.2.0] гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

Это пролекарство получали по методу, примененному в отношении р: изопропилового эфира. Конечный продукт был аморфным белым твердым веществом. МС (τη/ζ): 378 (М‘). Ή-ЯМР (ά-ДМСО, 400 МГц) δ: 5,86 (д, 1Н, 1=6.2 Гц), 5,74 (д. 1Н, 1=6,2 Гц), 5,20 (д, 1Н, 1=5 Гц), 5,17 (м, ОН), 4,60 (с, 1Н), 4,20 (с, 1Н), 4,10 (м, 2Н), 4,03 (м, 1Н), 3,74 (м, 1Н), 1,60 (м, 2Н), 1,42 (с, ЗН), 1,30 (с, ЗН), 0,86 (т, ЗН, 1=7,5 Гц).

Пролекарство сравнения 9

Бутоксикарбонилоксиметиловый эфир 6-(гидроксиметил )-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло [3.2.0] гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

Это пролекарство получали по методу, примененному для получения пролекарства сравнения 4, за исключением того, что изопропиловый эфир хлорметилового эфира карбоновой кислоты заменяли 1хлорметиловым эфиром бутилового эфира карбоновой кислоты. Конечный продукт был аморфным белым твердым веществом. МС (τη/ζ): 392 (М‘).

Ή-ЯМР (ά-ДМСО, 400 МГц) δ: 5,86 (д, 1Н, 1=6,2 Гц), 5,74 (д, 1Н, 1=6,2 Гц), 5,20 (д, 1Н, 1=5 Гц),

5,17 (м, ОН), 4,60 (с, 1Н), 4,20 (м, 1Н), 4,15 (м, 2Н), 4,03 (м, 1Н), 3,74 (м, 1Н), 1,60 (м, 2Н), 1,42 (с, ЗН), 1,30 (м, 2Н), 1,30 (с, ЗН), 0,86 (т, ЗН, 1=7,5 Гц).

Пролекарство сравнения 10

2,5-дигидро-5-оксо-2-фураниловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло [3.2.0] гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

Это пролекарство получали по методу, примененному для получения пролекарства сравнения 4, за исключением того, что хлорметилпивалат заменяли 5-бром-5Н-фуран-2-оном. МС (τη/ζ): 344 (М‘). ЯМР показал смесь 2 диастереомеров. Конечный продукт был аморфным твердым веществом.

¹Н-ЯМР(б-ДМСО, 400 МГц) δ: 7,81 (м, 0,5Н), 7,73 (м, 0,5Н), 7,14 (м, 0,5Н), 7,10 (м, 0,5Н), 6,61 (м, 1Н), 5,21 (м, 1Н), 5,17 (м, ОН), 4,67 (с, 0,5Н), 4,63 (с, 0,5Н), 4,20 (м, 1Н), 4,03 (м, 1Н), 3,74 (м, 1Н), 1,42 (с, 1,5Н), 1,40 (с, ЗН), 1,32 (с, 1,5Н).

Пролекарство сравнения 11

-оксобутоксиметиловый эфир 6-(гидроксиметил )-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1 -азабицикло [3.2.0] гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

Это пролекарство получали по методу, примененному для получения пролекарства сравнения 4, за исключением того, что хлорметилпивалат заменяли хлорметилбутиратом (Асгоз огдашсз). Продукт был прозрачным маслом. МС (τη/ζ): 362 (М‘).

-15007540 'Н-ЯМР (б-ДМСО, 400 МГц) δ: 5,86 (д, 1Н, 1=5,8 Гц), 5,74 (д, 1Н, 1=5,8 Гц), 5,20 (д, 1Н, 1=5 Гц),

5,17 (м, ОН), 4,55 (с, 1Н), 4,20 (м, 1Н), 4,01 (м, 1Н), 3,74 (м, 1Н), 2,35 (м, 2Н), 1,52 (м, 2Н), 1,40 (с, ЗН), 1,30 (с, ЗН), 0,86 (м, ЗН).

Пролекарство сравнения 12

1,3-дигидро-3-оксо-1 -изобензофураниловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1 азабицикло-[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

Полученные хроматографией на силикагеле 275 мг пролекарства сравнения 3 с использованием 5% изопропилового спирта/95% метиленхлорида давали 200 мг смеси диастереомеров с последующим выделением 70 мг одного (более полярного) диастереомера. Данный продукт был аморфным твердым веществом. МС (ш/ζ): 394 (М‘). ЯМР представлял более полярный изомер.

'Н-ЯМР (б-ДМСО, 400 МГц) δ: 7,95 (д, 1Н, 1=7,5 Гц), 7,90 (м, 1Н), 7,81 (д, 1Н, 1=7,5 Гц), 7,77 (м, 1Н), 7,60 (с, 1Н), 5,23 (д, 1Н, 1=5 Гц), 5,16 (ОН), 4,71 (с, 1Н), 4,20 (м, 1Н), 4,02 (м, 1Н), 3,74 (м, 1Н), 1,47 (с, ЗН), 1,37 (с, ЗН).

Пролекарство сравнения 13

-ацетилоксиметиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3 -диметил-7-оксо-4-тиа-1 -азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

Это пролекарство получали по методу, примененному для получения пролекарства сравнения 1, за исключением того, что хлорметилпивалат заменяли бромметилацетатом (А1бпс11). Конечный продукт был вязким маслом. МС (ш/ζ): 334 (М‘).

'Н-ЯМР (б-ДМСО, 400 МГц) δ: 5,82 (д, 1Н, 1=6,2 Гц), 5,72 (д, 1Н, 1=6,2 Гц), 5,19 (д, 1Н, 1=5 Гц),

5,17 (м, ОН), 4,55 (с, 1Н), 4,20 (м, 1Н), 4,01 (м, 1Н), 3,74 (м, 1Н), 2,08 (с, ЗН), 1,40 (с, ЗН), 1,30 (с, ЗН).

Пролекарство сравнения 14

6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицик1 -ацетилокси-1 -метилэтиловый ло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К)

Это пролекарство получали по методу, примененному для получения пролекарства сравнения 1, за исключением того, что хлорметилпивалат заменяли 1-хлор-1-метилэтиловым эфиром уксусной кислоты. Конечный продукт был аморфным твердым веществом. МС (ш/ζ): 362 (М‘).

'Н-ЯМР (СЭС1₃, 400 МГц) δ: 4,86 (д, 1Н, 1=5,0 Гц), 4,40 (с, 1Н), 4,31 (м, 1Н), 4,15 (м, 2Н), 2,06 (с, ЗН), 1,92 (с,ЗН), 1,82 (с, ЗН), 1,58 (с, ЗН), 1,47 (с, ЗН).

Пример 9. Химическая устойчивость в зависимости от рН в суспензии и плазме

Стабильность пролекарства 3 оценивали в отношении (1) химической стабильности в растворах с разным рН, (2) сохранения активности в суспензии и (3) химической стабильности в плазме разных млекопитающих, чтобы оценить способность пролекарства 3 противостоять гидролизу до всасывания и затем быстро гидролизоваться с образованием ό-β-СГМПК (6-β-ΗΜΡΑ8) после всасывания.

- 16007540

Химическую стабильность пролекарства 3 в растворе по сравнению с натриевой солью ό-β-СГМПК (здесь далее «№ СГМПК») и клавуланатом лития в растворе оценивали при рН 1, 2, 2,5, 4,0, 5,0, 6,5 и 7,4. Буферы были составлены соответственно, чтобы получить желаемое рН для каждой смеси для инкубации. Смесь для инкубации состояла из 990 мкл буфера для соответствующего рН и ее инициировали добавлением 10 мкл стандартного раствора соединения в 100% метаноле (конечная концентрация =100 мкМ). Отбирали серийные образцы (20 мкл) через 0, 10, 20, 40, 60, 120 и 240 мин автоинжектором и впрыскивали непосредственно в совмещенную для ВЭЖХ и ЖХ/МС единую систему квадропольного масс-спектрометра, используемую для аналитического определения. Температуру инкубации регулировали с помощью 96-ячеечного блока для нагревания. Инкубацию производили при 25 и 37°С. Система ЖХ/МС работала в режиме отрицательных ионов. Селективный контроль иона соответствующего [М-Н]' для каждого анализируемого вещества использовали для обнаружения и количественного определения остающегося соединения в каждый момент времени. Максимальная реакция в каждый момент времени выражалась в виде процента от реакции, полученной через срок = 0. Константу скорости разложения (к_а) получали путем регрессии этих процентов от срока = 0 мин до срока = 240 мин. Выявляемый полупериод первого порядка затем мог быть установлен как 1п 2/к_а. Эти определения выполняли в двух повторностях и среднее значение регистрировали.

Как показано в следующей далее таблице, пролекарство 3 продемонстрировало превосходную устойчивость к кислоте и адекватную стабильность при рН, близком к нейтральному, в отношении всасывания. А также показана превосходная стабильность №-СГМПК в растворе по сравнению с клавуланатом, особенно при низком рН.

Также оценивали стабильность пролекарства 3 в суспензии (незабуференной в 0,5% метилцеллюлозе при 25°С), чтобы определить влияние времени хранения на суспензию в отношении активности. Как показано ниже, пролекарство 3 сохраняло более 90% его активности после хранения при комнатной температуре в течение 10 дней. По контрасту, только 40% активности оставалось у клавуланата в суспензии аугментина, если ее оставляли при комнатной температуре на тот же самый период времени (см., МеЫа, А.С., 8. Наг1-Оау1е8,1. Раупе апб Κ.λΥ. Басеу, 1994. 81аЫН1у о£ ашохюШш апб ро1а88шш с1ауи1апа!е ΐη соашох1С1Шп-с1ауи1апа1е ога! зизрепмоп. I. С1т. РИагт. ТИег. 19:313-315).

	рН
Стабильность раствора (100 мкМ)	7,4	6,5	5,0	4,0	2,5	1,2
	Полупериод разложения (часы)
Пролекарство 3 (25°С)	2,7	>24	>24	>24	>24	>24
Пролекарство 3 (37°С)	0,6	4,5	>24	>24	>24	>24
Ца-СГМПК (25°С)	>24	>24	>24	>24	>24	>24
Ыа-СГМПК (37°С)	>24	>24	>24	>24	>24	>24
Клавуланат (25°С)	>24	>24	>24	>24	1,2	0,6
Клавуланат (37°С)	>24	>24	>24	>24	0,9	НО
Стабильность пролекарства 3 в	День	День	День	День	День
суспензии	1	3	5	7	10
		Активность	(процент)*
1,51 мг/мл** (доза препарата 10 мг/кг крысе)	НО	103	98	104	91***

* Активность оценивали как процент от номинальной концентрации по оценке ЖХ/МС растворенных стандартов. Оценки представляют среднее значение от двукратных определений. НО = не определялось ** рН исходных суспензий ~6,8 и падал до 4,7 к 10-му дню *** смесь диастереомеров по существу не изменялась -95:5

Стабильность в плазме пролекарства 3, №-СГМПК и клавуланата лития определяли в плазме мышей, крыс, собак, обезьян и человека, которую получали и подвергали одному циклу замораживания/оттаивания перед использованием. Инкубируемый образец состоял из 990 мкл плазмы, предварительно инкубированной в течение 5 мин при 37°С в 96-ячеечном блоке для нагревания. Инкубируемый образец инициировали добавлением 10 мкл 10 мМ стандартного раствора соединения в 100% метаноле. Серийные аликвотные образцы (100 мкл) отбирали и переносили в 200 мкл 75/25 ацетонитрила/3% перхлорной кислоты через 0, 1, 2, 5, 10, 20, 30 и 60 мин. Образцы центрифугировали, надосадочную жидкость переносили в сосуды для инжекции, и 20 мкл впрыскивали в совмещенную для ВЭЖХ и ЖХ/МС единую систему квадропольного масс-спектрометра. Система ЖХ/МС работала в режиме отрицательных ионов. Селективный контроль иона соответствующего [М-Н]' для каждого анализируемого вещества использовали для обнаружения и количественного определения остающегося соединения в каждый момент

- 17 007540 времени. Максимальная реакция в каждый момент времени выражалась в виде процента от реакции, полученной через срок = 0. Константу скорости разложения (к_а) получали путем регрессии этих процентов от срока = 0 мин до срока = 240 мин. Выявляемый полупериод первого порядка затем мог быть установлен как 1п 2/ка. Эти определения выполняли в двух повторностях и регистрировали средние значения, которые представлены ниже.

Стабильность в плазме (100 мкМ)	Мышь Крыса Собака Обезьяна Человек
Пролекарство 3 37°С Ыа-СГМПК 37°С Клавуланат 3 7 °С	Полупериод разложения 2.8 мин <2,0 мин 2,8 мин 3,6 мин <2,0 мин 3.9 час 3,4 час >4 час >4 час >4 час >4 час 3,3 час 2,8 час 3,6 час 2,6 час

Пролекарство 3 проявило превосходную стабильность в кислоте и адекватную стабильность при примерно нейтральном рН в отношении всасывания. Степень гидролиза пролекарства 3 в плазме у всех видов испытуемых показал эффективный ферментативный гидролиз в плазме с получением ό-β-СГМПК после всасывания. №-СТМПК проявил превосходную стабильность в растворе по сравнению с клавуланатом, особенно при низком рН. Хотя оба соединения являются лабильными в плазме, №-СТМПК проявляет улучшенную стабильность в человеческой плазме.

Пример 10. Подавляющая активность пролекарства 3 при значениях рН кишечника

Полагают, что клавуланат вызывает диарею при действии в ЖКТ людей, так как он в комбинации с остаточным амоксициллином селективно убивает существенные составляющие нормальной микрофлоры. Клавуланат не является пролекарством, и таким образом, 40%, которые остаются невсосавшимися из кишечника, являются такими же активными молекулами, что и 60%, которые всасываются в кровоток. Так как рН в желудке и проксимальном отделе тонкого кишечника является кислым, при исследованиях Веггу, V. Εΐ а1., ЕШсасу о£ рйагтасоктейсаПу епНапсеб £опни1абоп о£ атох1С111п1/с1ауи1апа1е а^атз! ехрептеЩа1 гезрпаЮгу Рас! тГесйоп ίη га!§ саизеб Ъу МгерШсоссиз рпеитошае, АЬ§1гас1 В988, 4 Г¹ 1Щегзс1епсе СопГегепсе оп Апйт1сгоЫа1 А^етЛз апб СНетобтегару, ЭесетЬег 16-19¹¹¹, 2001 СЫса^о, ΙΕ., обнаружено, что средний рН образцов 24-часового стула, собранных у субъектов с диареей, был равен 6,4 (интервал 5,4-7,8).

Как показано в примере 7, пролекарство 3 является очень стабильным и нелегко превращается в 6β-СГМПК при рН <6,5. Чтобы сравнить подавляющую бета-лактамазы активность пролекарства 3 и №СГМПК в условиях рН, обнаруживаемых в толстом кишечнике человека, определена 1С50 обоих соединений в отношении бета-лактамазы ТЕМ-1 при рН 6,0 и 7,0. Эти данные показывают, что при рН 6,0, когда не должно быть превращения пролекарства в активную форму ингибитора, пролекарство 3 является неактивным в отношении бета-лактамазы ТЕМ-1 (1С₅₀ >100 мкМ). В противоположность этому, при рН 7,0, когда превращение пролекарства в активный ингибитор происходит с полупериодом, равным 33 мин, получающийся ό-β-СТМПК давал в результате намного больший уровень подавления этой беталактамазы, чем наблюдаемый при рН 6,0.

1Сбо

Пролекарство 3 6-/?-СГМПК

ТЕМ-1	Е.	соИ, рН	6, 0	>100	0,37
ТЕМ-1	Е.	соИ, рН	7,0	2,2	0,12

Пример 11. Всасывание (Биодоступность ίη νίνο при пероральном введении)

Так как пролекарство 3 имеет полупериод существования в растворе, равный 30 мин при нейтральном рН, и в присутствии эстераз пролекарство гидролизуется в пределах нескольких минут, то оценка ίη νίίτο с использованием линии человеческих клеток Сасо-2, как было установлено, непригодна для количественной оценки всасывания пролекарства. Вместо этого, как было установлено, для оценки всасывания пролекарств данного изобретения более пригодна модель всасывания ίη νίνο. Кроме того, корреляция всосавшейся фракции у крыс с таковой у человека была изучена на нескольких продаваемых лекарственных средствах, и как было показано, корреляция была вполне надежной (корр. = 0,971) (См., СЫои, λΥΑ. апб А. Ватуе, 1998. Ешеаг согге1айоп о£ Йте йасбоп о£ ога1 бозе аЪзогЪеб о£ 64 бти§з ЪеЕуееп Нит ап з апб га!з. РНагт. Кез. 15:1792-1795.). На основе этой корреляции крыс использовали для предсказания всасывания у людей. Кроме того, должно быть понятно, что ό-β-СГМПК проявляет минимальное выведение через печень, как предполагается гепатоцитами крысы и человека. Таким образом, оценка био доступности при пероральном приеме у крыс должна хорошо коррелировать с всасывающейся фракцией у людей.

Оценку био доступности при пероральном приеме проводили для №-СТМПК, пролекарств 1, 2, 3 и 4, а также четырнадцати пролекарств для сравнения из примера 8, с использованием в каждом случае групп из трех крыс 8рга§ие-Оам4еу (200-225 г), с хирургически имплантированными в шейную вену ка

- 18007540 тетерами. Выбор дозы носителей для исследований с пероральным введением зависел от физического состояния соединения, которое нужно испытать. Все соединения, которые вводили перорально, за исключением пролекарства 1, были в виде масла или аморфного твердого вещества. Как таковые, эти соединения вводили в дозированной форме в виде раствора (ПО) с использованием носителя вода/СЬгеторЬоге/этанол 70/20/10.

Дозы пролекарства для перорального введения готовили так, чтобы ввести дозу, эквивалентную 10 мг/кг ό-β-СГМПК в дозируемом объеме, равном 10 мл/кг. Иа-СГМПК вводили внутривенно в дозе 10 мг/кг, чтобы установить оценки био доступности (эквивалент ό-β-СГМПК).

Образцы крови отбирали через 0, 15, 30 мин, 1, 2, 3 и 5 ч после введения дозы. Образцы затем обрабатывали с получением плазмы и хранили при -20°С до анализа. Образцы анализировали на количественное ό-β-СГМПК, как описано ниже, и затем определяли зависимость средней концентрации от времени при пероральном и внутривенном введении. Площадь под кривой зависимости концентрации в плазме от времени (ППК; АГГС о-шосл) подсчитывали с времени 0 до последнего оценочного момента времени, используя линейное трапециедальное приближение. Константу терминальной скорости выведения (К_эл) устанавливали по данным регрессии концентрации в плазме от очевидного начала фазы элиминации до момента отбора последнего образца. Полупериод элиминации устанавливали как 1п2/К_эл. Площадь от 1_посл до бесконечности (ППК _1||ОСЛ^) устанавливали при Сует_1посл/К_эл, где Сует_1посл представляет, концентрацию, установленную в последний момент времени, в который лекарственное вещество определяли количественно на основе регрессионного анализа. Общая площадь под кривой (ППК₀ ^) определяли, как сумму ППКо__1посл и ППК_1||ОСЛ ^. Биодоступность (Г) выражали как ППК(₀ ^)по х Доза_|!|!/ППК(о,Д.|. х Доза_по.

Средние значения найденной биодоступности показаны ниже.

Соединение	Средняя биодоступность	Стандартное отклонение
Ца-СГМПК	6,0	1,6
Пролекарство 1	113,1	10,7
Пролекарство 2	102,0	11,1
Пролекарство 3	92,4	6,0
Пролекарство 4	111,1	8,8
Пролекарство сравнения 1	55,4	4,7
Пролекарство сравнения 2	6,2	1,0
Пролекарство сравнения 3	27,2	2,6
Пролекарство сравнения 4	6,8	0,9
Пролекарство сравнения 5	46,5	1,4
Пролекарство сравнения б	60,9	6,1
Пролекарство сравнения 7	40,3	10,8
Пролекарство сравнения 8	7,9	1,5
Пролекарство сравнения 9	12,3	2,0
Пролекарство сравнения 10	10,9	1,7

Пролекарство сравнения 11	33,1	5,4
Пролекарство сравнения 12	20,4	1,0
Пролекарство сравнения 13	37,6	3,7
Пролекарство сравнения 14	15,4	3,9

Как показано выше, пролекарства данного изобретения обладают значительно большей биодоступностью, чем у ό-β-СГМПК, ранее известного пролекарства сравнения 1 или в основном ранее описанных лекарственных средств (пролекарства сравнения 2-14).

Описание исследования

При этом исследовании анализируемые вещества, представляющие интерес, экстрагировали обратно в водную фазу после ацетонитрильного осаждения и обработки хлороформом. Это обеспечивало показатель примерно 2-кратного концентрирования без выпаривания и стадии обратного воспроизведения.

Определение производили посредством использования ЖХ/МС/МС в режиме работы с отрицательными ионами. Одна квадрапольная операция была недостаточна для селективного определения анализируемого вещества.

- 19007540

Показатель рН загружаемого растворителя (20 мМ формиат аммония/ацетонитрил 95:5; растворитель А) был равен 5,0.

Аналитическая колонка представляла собой Рйепеотепех Арил С18 4,6 х 50 мм.

Всю подготовку образца выполняли в 96-луночных планшетах из 1,2 мл МАК8Н-пробирок. Образцы готовили следующим образом. Образец плазмы (200 мкл) добавляли к 400 мкл ацетонитрила:20 мМ формиата аммония 95:5, содержащим 5 мкг/мл сулбактама в качестве внутреннего стандарта. Образцы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин в настольной центрифуге. Надосадочную жидкость (600 мкл) затем переносили, чтобы очистить 1,2 мл пробирки МАК8Н®. К образцам добавляли хлороформ (600 мкл), которые затем перемешивали, и затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Затем сверху отбирали переносимую водную фазу (~100 мкл) и затем анализировали.

Условия масс-спектрометрии:

Масс-спектрометр: АР1-3000, работающий в режиме отрицательных ионов с использованием турбовпрыскивания (электровпрыскивание)

Напряжение ионизации: 3000 V

Напряжение на выходе: -25 эВ

Энергия соударений: 30 эВ

Когда необходимо, регулировали небулизацию и нагрев газа.

Контроль реакции:

6-в-СГМПК: 262218

Сулбактам (18): 232140

Амоксициллин: 364223

Клавулановая кислота: 198136

Время цикла (ВТ): 3 мин

КТ: ~ 2 мин для всех анализируемых веществ

Впрыскиваемый объем: 20 мкл

Условия ВЭЖХ:

Растворитель А: 95:5 20мМ формиат аммония:ацетонитрил

Растворитель В: 95:5 ацетонитрил:20 мМ формиат аммония

Аналитический поток: 1 мл/мин

Поток в масс-спектрометр: ~100 мкл/мин

Режим баллистического градиента:

0-0,5 мин 100% А

0,5-1 мин 100% А до 100% В

1-1,5 мин 100% В

1,5 - 2,0 мин 100% В до 100% А

БТОО = 0,1 мкг/мл для

6-в-СГМПК и амоксициллина, 0,5 мкг/мл для клавулановой кислоты

О .ОС) = 50 мкг/мл (для всех)

Регрессия = линейная 1/х коэффициент умножения

Срок работы колонки ~ 300 - 400 инжекций

Исследования через воротную вену крыс: Системное воздействие пролекарства 3 оценивали также на крысах со вставленным в воротную вену катетером после перорального введения пролекарства в дозе 100 мг/кг. Все аликвотные образцы крови стабилизировали в кислоте температуры льда сразу после отбора образца через 5, 15 и 30 мин после введения дозы.

Никаких уровней пролекарства 3 не было обнаружено ни в одном из образцов (исследование БТОО 100 нг/мл). Эти результаты говорят о том, что после всасывания пролекарство 3 подвергается быстрому гидролизу с получением 6-в-СГМПК перед воздействием на него в печени и кровообращении в организме.

Пример 12. Отбор по исследованиям ίη νίΐτο

Биохимическая активность в отношении β-лактамаз возбудителей неспецифических респираторных заболеваний:

ингибиторы бета-лактамаз только трех видов молекул присутствуют на рынке: сульбактам, клавуланат и тазобактам. Все три подавляют пенициллиназы типа А, обнаруженные у широкого круга бактерий. Из них только клавуланат предназначен для пероральной терапии неспецифических респираторных инфекций. Иа-СГМПК испытывали в отношении коллекции бесклеточных пенициллиназ, обычно обнаруживаемых у Н. шПиеп/ае и М. Са1аггйа115. которые устойчивы к пенициллину. Данные в следующей таблице показывают, что Иа-СГМПК является эквивалентным клавуланату лития в отношении ферментов КОВ-1 и ТЕМ-1 из Н. шПиеп/ае. Все три ингибитора бета-лактамаз были очень активными в отношении пенициллиназ ВКО-1 и ВКО-2, обнаруженных в М. саΐа^^йа1^8, причем сулбактам является наиболее активным (таблица 1). Более широкий анализ β-лактамаз из 30 свежевыделенных клинических

- 20 007540 штаммов М. са!аггНаН§ показал, что №-СГМПК был эффективным при подавлении ферментов ВКО-1 и ВКО-2 из всех трех штаммов со средней 1С₅₀, равной 0,19 мкМ.

1С5о ингибиторов бета-лактамаз в отношении β-лактамаз в экстрактах клеток
	β-лактамаза	1С50 (мкМ) *
Штаммы	Тип	Сулбактам	6-0-СГМПК	Клавуланат
Н. 1п£1иепгае АТСС43334	КОВ-1	3,40	0,01	0,04
Н. 1п£1иепгае 54А1173	ТЕМ-1	4,78	0,03	0,02
М. сабаггИаНэ 87А1178 АТСС43617	ВКО-2	0,03	0,32	0,11
М. сабаггЬаНз 87А1115	ВКО-1	0,011	0,143	0,14

*Все значения подавления определены в отношении хромогенного цефалоспорина в колориметрическом исследовании.

Биохимическая активность против β-лактамаз из других возбудителей, включающих возбудители, связанные с кожными инфекциями.

№-СГМПК был сравним с клавуланатом по его подавляющей активности против широкого ряда бета-лактамаз с широким спектром действия ТЕМ (Е8ВБ; БЛШСД), тогда как №-СГМПК и клавуланат обычно были сравнимы по активности в отношении БЛШСД.

Подавление избранных β-лактамаз с широким спектром действия (БЛШСД) (1С50, мкМ)
	β- лактамаза	Ингибитор 1С50 (мкМ)
Штаммы	Тип	Сулбактам	6-0-СГМПК	Клавуланат
Е.соИ АТСС35218	ТЕМ-1	6,85	0,14	0,05
Е.соИ 51А1101	ТЕМ-1	4,76	0,07	0,02
К. рпеишоп1ае СР104	ТЕМ-3	0,55	<0,003	<0,003
К. рпеитопгае В СР504	ТЕМ-5	4,68	0,08	<0,003
К. рпеитоп1ае Ь-1	ТЕМ-10	23,19	0,39	>100
К. рпеитоп1ае МСУ37	ТЕМ-12	5,86	0,27	<0,003
К. рпеитоп1ае СР1304	ТЕМ-16	5,80	0,09	0,06
К. рпеитоп1ае Е264	ТЕМ-17	10,36	0,66	0,004
К. рпеитоп1ае СР1104	ТЕМ-24	10,48	7,13	0,01
Е.СО11 СР1609	ТЕМ-25	2,58	0,04	0,02
К. рпеитоптае 5657	ТЕМ-26	0,56	0,08	0,02
ЗеггаШа 36	Зте-1	15,65	0,68	19,55

*Все значения подавления определены в отношении хромогенного цефалоспорина в колориметрическом исследовании.

В основном можно заключить, что Νη-СГМПК сравним с клавуланатом лития.

Исследования чувствительности продуцирующих β-лактамазу видов Н. шПиепгае и М. са1аггНаНз. Активность ίη νίίτο разных соотношений ό-β-СГМПК и амоксициллина оценивали с использованием клинических штаммов Н. шйиепгае и М. са1аггНаНз, которые продуцируют β-лактамазу. По одобренному N06X8 (Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам) способу определения чувствительности для аугментина используется фиксированное отношение амоксициллина/клавуланата 2:1. Результаты показали, что для 46 бета-лактамазо (+) штаммов Н. шЛиепгае МПК₅₀ амоксициллина и значения МПК90 (т.е. минимальные подавляющие концентрации, необходимые для предотвращения роста или 50%, или 90% испытанных штаммов) как для амоксициллина/клавуланата, так и амоксициллина/6-βСГМПК были равны 1 и 2 мкг/мл, соответственно, тогда как значения для амоксициллина/сулбактама 2:1 были равны 4 и 8 мкг/мл. Отметим, что числа относятся к концентрации амоксициллина в смеси.

Для 48 штаммов М. са1аггНаНз значения МПК₅₀ и МПК₉₀ для амоксициллина/клавуланата были равны <0,125 и 0,25 мкг/мл и 0,5 и 0,1 мкг/мл для амоксициллина/ ό-β-СГМПК, соответственно. Значения

-21 007540 амоксициллина/сулбактама (2:1) были равны 0,25 и 1,0 мкг/мл. Таким образом, МПК, полученные с целыми клетками, не всегда хорошо коррелируют с активностью против бесклеточных бета-лактамаз, так как сулбактам был одинаково более активен в отношении ферментов ΒΚΌ 1/2, найденных в М. са1аггйа118.

Исследования чувствительности не продуцирующих β-лактамазу видов 81гер1ососси§ рпеишошае: Активность ίη νίΐτο комбинации сравнивали с активностью, наблюдаемой у одного амоксициллина в отношении клинических штаммов 8. рпеишошае, которые были классифицированы как чувствительные, среднечувствительные и устойчивые к пенициллину. Некоторые из этих штаммов показали высокий уровень устойчивости к пенициллину и амоксициллину с МПК в интервале 4-8 мкг/мл. Как и ожидалось в отношении возбудителя с устойчивостью на основе ПСБ, результаты для штаммов 8. Рпеишошае, подтвердили, что присутствие ингибиторов не оказывало влияния на МПК амоксициллина.

МПК₅₀ и МПК₉₀ амоксициллина для 21 устойчивого к пенициллину штамма (МПК пенициллина от 1 до 8 мкг/мл) равнялись 2 и 4 мкг/мл для одного амоксициллина и для всех испытанных комбинаций с ингибитором бета-лактамазы с соотношениями 2:1, 7:1 и 14:1. И, наконец, все комбинации были испытаны в отношении группы из 21 штамма 8. рпеишошае со средней чувствительностью к пенициллину и 12 чувствительных к пенициллину штаммов. И опять все МПК в обеих группах отражали компонент амоксициллина в комбинации. МПК амоксициллина для группы со средней (промежуточной) чувствительностью находились в интервале от 0,03 до 1 мкг/мл, а МПК для чувствительной группы составляли от <0,0156 до 0,06 мкг/мл.

Методология исследования: Исследование выполняли по методу, описанному в документе ИССЬ8 М7-А4, декабрь 1997, и М100-812, 2002, Методы разведения для испытания чувствительности к антимикробным веществам для бактерий, которые растут в аэробных условиях - Утвержденный стандарт (ЫССЬ8 ЭоситеШ М7-А4, ЭесешЬег 1997 и М100-812, 2002, МеШобк £ог Эбибоп Апйш1сгоЫа1 8и8серйЬббу Тей5 £ог Вас1епа, 11а1 Сго\у Ае^οЬ^са11у-Арр^ονеб 81апбагб.

Получение замороженных стандартов

Н. шПиепхае выращивают в чашках с шоколадным агаром. Колонии суспендируют в среде для испытаний для НаешорЫ1и8 (НТМ, Кеше1 О1адпо81Ю8), рН которой доводят до 7,4 1н. ЫаОН и стерилизованной фильтрованием. Эту смесь перемешивают с 50% глицерином до конечной 20% концентрации глицерина. Рост 81гер1ососси§ рпеишошае и Могахе11а са1аггйа118 снимают с поверхности кровяного агара в чашках и помещают в бульон Мюллера Хинтона с 5% лизированной овечьей крови. Для замораживания добавляют 50% глицерин до конечной концентрации, равной 20%. Все замораживают при -70°С.

Подготовка чашек с лекарственным препаратом

Для разведения лекарственного препарата используют 96-луночные микротитровальные планшеты. Все лекарственные препараты взвешивают в достаточном количестве, чтобы получить 4Х рабочие стандартные растворы. Лекарственный препарат солюбилизируют в ДМСО или другом подходящем растворителе, растворяют до объема в среде для испытаний и 100 мкл серийно двукратно разводят по сериям из 10 лунок с лекарственным препаратом, причем каждая содержит первоначальный объем, равный 100 мкл среды [колонки с 1 по 10] и 1 лунка с лекарственным средством незасеянная [колонка 11]. Колонка 12 является контрольной лункой бактериального посевного материала, не содержащей лекарственного препарата. Конечный объем в каждой лунке равен 100 мкл.

В планшетах с лекарственным препаратом для Н. шПиепхае помещены серийные разведения ГТМ (НТМ), рН которых была доведена до 7,4 с помощью 1н. ЫаОН, и стерилизованные фильтрованием. Для других двух видов делают разведения в бульоне Мюллера Хинтона плюс 5% лизированной крови лошади. Все операции проводят и с контрольными соединениями при каждом исследовании. Планшеты с лекарственным препаратом замораживают при -70°С и оттаивают в день использования.

Выращивание посевного материала

Н. шПиепхае выращивают в течение ночи в чашках с агаром Мюллера-Хинтона с 1% гемоглобина и с 1% ОСН1 [чашки с шоколадным агаром] в термостате с 5% СО₂ в течение ночи при 37°С. 8. рпеишошае и М. са1агг11а115 выращивают на агаре Мюллера-Хинтона, содержащему 5% овечьей крови в тех же условиях.

Приготовление посевного материала

Культуру, выращенную в течение ночи с агара в чашках, собирали и снова суспендировали в соответствующей среде для испытаний. Все суспензии доводили до стандарта ОП с помощью спектрофотометрии в день исследования, используя среду для испытания для Наешорйу1и8 (НТМ), бульон для Н. шПиепхае или дополненный катионами бульон Мюллера Хинтона с 5% лизированной крови лошади (для 8. рпеишошае и М. са1аггйа1щ) до мутности, соответствующей 0,5 стандарта суспензии МакФарланд (МсРаг1апб) (примерно 1-2 х 10⁸ КОЕ/мл). Эта суспензия имела ОП₆₂₅, равную 0,14. Чтобы получить конечную посевную среду из 2-7 х 10⁵ КОЕ/мл в лунке (конечный объем равен 200 мкл), были сделаны следующие разведения из стандартной суспензии по МакФарланд:

Суспензии всех штаммов Н. шПиепхае разводили 1/100 в НТМ.

- 22 007540

Суспензии всех 8. Рпеитошае и М. сайаггйайк разводили 1:100 в дополненном катионами бульоне Мюллера Хинтона, содержащем 5% лизированной крови лошади.

Посев в планшеты: 100 мкл разведенного посевного материала добавляют в каждые 100 мкл разведения лекарственного препарата в стерильном планшете для испытания. Общий объем для испытания составляет 200 мкл на лунку. Штаммы, которые были соответственно разведены (см. выше) в микротитровальных лунках, будут иметь конечную посевную концентрацию 2-7 х 10⁵ КОЕ/мл. Эту плотность посева по клеткам подтверждают путем выполнения подсчета жизнеспособных клеток в лунках плат по случайной выборке в момент времени 0. Это легко осуществляется путем отбора 10 мкл из лунки и разбавления 10 мл стерильного физиологического раствора (1:1000). После перемешивания вращением 100 мкл разбавленной суспензии распределяют по кровяному агару в чашке или шоколадному агару в чашке в случае Н. шПиеп/ае. После инкубации наличие 50 колоний показывает плотность посева 5 х 10⁵ КОЕ/мл. Культуры, использованные для посева в микротитровальные планшеты, наносят штрихом на питательную среду, чтобы получить отдельные колонии, и отмечают типичную морфологию колоний.

Инкубация микротитровальных планшет

После помещения пластиковых крышек на планшеты микротитровальные планшеты инкубируют в пластиковых боксах в термостате с регулируемой влажностью, чтобы предотвратить испарение из лунок. Планшеты ставят друг на друга не более, чем четыре в стопку. Все микротитровальные планшеты инкубируют в аэробных условиях при 35°С в течение 24 ч.

Все планшеты инкубируют и считывают через 24 ч, и результаты регистрируют только в том случае, если результаты с контрольными лекарственными препаратами для штамма Н. шПиеп/ае АТСС 49766 типа Ж.’СЪ8 и 8. рпеитошае АТСС 49619 находятся в опубликованном интервале (Νί.’ί.Τ8. М100812, 2002).

Пример 13. Эффективность ίη νίνο

Ингибирующую активность в отношении β-лактамаз 6-в-СГМПК определяли для β-лактамазо (+) возбудителей, которые оценивали на предклинических моделях инфекций. Данные в отношении этих избранных штаммов показали, что 6-в-СГМПК в основном эквивалентен клавуланату в отношении βлактамаз из возбудителей респираторных инфекций Н. шПиеп/ае и М. саШаггайк.

Модель отита среднего уха на песчанках:

По этой модели монгольских песчанок заражали 8. рпеитошае и Н. шПиеп/ае. Самок монгольских песчанок (50-60 г) заражали 1од 5-6 КОЕ Н. шПиеп/ае или 8. рпеитошае, вводимыми в 50 мкл объеме в левую барабанную буллу. Через восемнадцать часов после заражения начинали терапевтический режим (три раза в день, в течение 2 дней) комбинацией амоксициллина и пролекарства 3 (7:1) с введением дозы в объеме 500 мкл носителя из 0,5% раствора метилцеллюлозы для определения зависимости ответа на лечение от дозы. ЭД50 рассчитывали по данным освобождения от бактерий на 4 день после заражения.

Комбинации амоксициллин/пролекарство 3 и аугментин были одинаково эффективны для устранения этого возбудителя с ЭД50 6-10 мг/кг и результаты для комбинаций 7:1 и 14:1 были эквивалентными. Амоксициллин в виде единственного действующего средства был неэффективен против этого возбудителя.

Мышиная модель системной инфекции:

По этой модели самок мышей СЕ-1 или ΌΒΑ/2 (18-20 г) заражали внутрибрюшинно 1од 2-6 КОЕ 8. рпеитошае, 8. аигеик или М. са1аггйаЙ8, суспендированными в бульоне, 10% муцине или 3% экстракте пивных дрожжей (Вге^егк), соответственно, и вводили в 500 мкл объеме. Через один час после заражения начинали терапевтический режим введения (два раза в день в течение 1 дня) комбинацией амоксициллина/пролекарства 3 (7:1), вводя дозу в 200 мкл объеме носителя из 0,5% раствора метилцеллюлозы для определения зависимости ответа на лечение от дозы. ЭД50 рассчитывали по данным выживания на 4 день после заражения.

Комбинация амоксициллин/пролекарство 3 была эффективна для предотвращения гибели мышей от всех из этих β-лактамазо (+) штаммов. В основном активность комбинации амоксициллина/пролекарства 3 была сравнима с активностью аугментина (т.е. эквивалентна в отношении Н. шПиеп/ае и слегка менее в отношении М. са1аггйай§). Комбинации 7:1 были обычно более эффективны, чем комбинации 14:1. Данные для возбудителей инфекций кожи и кожных структур 8. аигеик, К. рпеитошае и Е. сой также включены в следующие таблицы.

Мышиная модель пневмонии:

По этой модели самок мышей СЕ-1 (18-20 г) заражали интраназально 1од 5-6 КОЕ 8. Рпеитошае, вводимых в 40 мкл объеме, и через восемнадцать часов после заражения начинали терапевтический режим (дважды в день в течение 2 дней) комбинацией амоксициллина/пролекарства 3 (7:1), вводя дозу в 200 мкл объеме носителя из 0,5% раствора метилцеллюлозы. ЭД50 рассчитывали по данным выживания на 10-й день после заражения.

Амоксициллин, амоксициллин/пролекарство 3 и аугментин были одинаково эффективны против толерантного к пенициллину (РЭ₅₀ = 22-25 мг/кг) и чувствительного к пенициллину штаммов пневмококка (РЭ₅₀ = 2,7-3,3 мг/кг). Так как толерантные к пенициллину штаммы пневмококков не обладают β

- 23 007540 лактамазой, активность амоксициллина не улучшается (и не наблюдалось антагонизма в отношении нее) при наличии ό-β-СГМПК или клавуланата. Более высокие ΡΏ₅ο, отмеченные у толерантного к пенициллину штамма по сравнению с чувствительным к пенициллину штаммом, согласуются с более высокой МПК.

В кратком изложении, активность ίη νΐνο при пероральном введении комбинации амоксициллина/пролекарства 3 (7:1 и 14:1) была сравнима при непосредственном сравнении с аугментином на модели отита среднего уха у песчанок и на моделях перитонита и пневмонии у мышей. Комбинация амоксициллин/пролекарство 3 ίη νΐνο проявила активность, сравнимую с активностью аугментина в отношении возбудителей инфекций респираторного тракта (Н. шйиепгае, М. са1аггНаН§ и 8. рпеитошае) и возбудителей инфекций кожи и мягких тканей (8. аигеиз, Е. соН и К. рпеитошае) на этих моделях. Действие ίη νΐνο амоксициллина/пролекарства 3 согласуется с активностью этой комбинации ίη νίΐτο, когда ее оценивали при соотношении 2:1 при определении МПК.

Антибактериальная активность ίη νΐνο (пероральное введение) в отношении возбудителей инфекций респираторного тракта, а также кожи и кожных структур (ЭД50, мг/кг)

Амоксициллин/ _ „ _ пролекарство 3

Амоксициллин Пролекарство 3 , (отношение 7/1)

Возбудитель

Аугментин (отношение 7/1)

Модель отита среднего уха у песчанок
НаеторЬПиз 1п£1иепгае (54А1218)2	>50	>25	8,9/1,3* 1	9,9/1,4
Модель	системной инфекции у мышей
НаеторЬПиз 1п£1иепгае (54А1218)	>100	>25	9,8/1,4	13,4/1,9
Могахе11а сабаггЬаНз (87А1115)	>100	>100	37,6/5,4	12,6/1,8
3£арИу1ососсиз аигеиз (01А0400)	>100	>12,5	30,6/4,4	17,8/2,5
К1еЬз1е11а рпеитопбае (53А0031)	>200	>25	20,2/2,9	13,0/1,8
ЕзсПеггсЫа соИ (51А0257)	>200	>100	62,2/8,9	146/20,8
Модель	пневмонии у мышей
Збгербососсиз Рпеитопгае (02Л095)	25	>25	21,8/3,1	21,8/3,1
Збгербососсиз Рпеитопгае (02Л016)	3,3	>25	2,66/0,38	2,66/0,38

¹ Первое значение показывает концентрацию амоксициллина, а второе значение представляет ингибитор бета-лактамазы.

² Числа в скобках показывают числа ИД (ГО) для штамма по Ρίΐζετ.

Антибактериальная активность ίη νΐνο (пероральное введение) в отношении возбудителей инфекций респираторного тракта, а также кожи и кожных структур (ЭД50, мг/кг)

Амоксициллин/ „ „ „ _ пролекарство 3

Возбудитель Амоксициллин Пролекарство 3 , (отношение

14/1)

Аугментин (отношение 14/1)

Модель отита среднего уха у песчанок

НаеторЬПиз 1п£1иепгае (54А1218)2	>50	>25	10,5/0,731	5,8/0,4
Модель системной	инфекции у мышей
НаеторЬПиз 1п£1иепгае (54А1218)	>100	>25	12,3/0,88	37,9/2,7
МогахеИа сабаггЬаПз (87А1115)	>100	>100	42,5/3,0	23,6/1,7
3£арЬу1ососсиз аигеиз (01А0400)	>100	>12,5	94,2/6,7	24,4/1,7
К1еЬз1е11а рпеитопгае (53А0031)	>200	>25	23,4/1,7	23,4/1,7
ЕзсЬегхсЫа соИ (51А0257)	>200	>100	134/9,6	196/14
	Модель пневмонии у мышей
ЗЬгербососсиз Рпеитогыае (02Л095)	25	>25	23,6/1,7	17,8/1,3
ЗЬгербососсиз Рпеитопъае (02Л016)	3,3	>25	1,6/0,11	1,8/0,12
1 Первое значение	показывает	концентрацию	амоксициллина, а

второе значение представляет ингибитор бета-лактамазы.

² Числа в скобках показывают числа ИД (Ю) для штамма по Ρίίζβτ.

Claims (15)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Пролекарство, имеющее структуру

   -24 007540 где К представляет собой Н или метил, и его сольваты.
2. 2. Пролекарство по п.1, выбранное из группы, состоящей из

   1-(бензоилокси)метилового эфира 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксида (28,5К,6К);

   1-(бензоилокси)этилового эфира 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксида (28,5К,6К);

   (1К)-1-(бензоилокси)этилового эфира 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксида (28,5К,6К); и (18)-1-(бензоилокси)этилового эфира 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксида (28,5К,6К).
3. 3. Пролекарство, имеющее структуру и его сольваты.
4. 4. Фармацевтическая композиция, содержащая:

   (a) пролекарство по π. 1 или его сольват и, (b) по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.
5. 5. Фармацевтическая композиция по п.4, дополнительно содержащая бета-лактамный антибиотик.
6. 6. Фармацевтическая композиция по п.5, где указанным бета-лактамным антибиотиком является амоксициллин.
7. 7. Фармацевтическая композиция по п.6, где указанное пролекарство представляет собой (1К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К) или его сольват.
8. 8. Фармацевтическая композиция, содержащая:

   (a) (1К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4-диоксид (28,5К,6К) или его сольват, (b) амоксициллин и (c) фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.
9. 9. Способ повышения терапевтической эффективности бета-лактамного антибиотика у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества беталактамного антибиотика и пролекарства по π. 1 или его сольвата в количестве, повышающем эффективность указанного антибиотика.
10. 10. Способ по п.9, где указанным бета-лактамным антибиотиком является амоксициллин.
11. 11. Способ по п.9 или 10, где указанным пролекарством является (1К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 6-(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа- 1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4диоксид (28,5К,6К) или его сольват.
12. 12. Способ лечения бактериальной инфекции у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества бета-лактамного антибиотика и пролекарства по π. 1 или его сольвата в количестве, повышающем эффективность указанного антибиотика.
13. 13. Способ по п. 12, где указанным бета-лактамным антибиотиком является амоксициллин.
14. 14. Способ по п.12 или 13, где пролекарством является (1К)-1-(бензоилокси)этиловый эфир 6(гидроксиметил)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло [3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты, 4,4диоксид (28,5К,6К) или его сольват.
15. 15. Способ лечения бактериальной инфекции у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп.4, 5 или 6.