CN1668747A

CN1668747A - 转基因生物发光植物

Info

Publication number: CN1668747A
Application number: CN03817064.7A
Authority: CN
Inventors: 布鲁斯·埃里克·胡德金斯
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-07-15
Filing date: 2003-07-10
Publication date: 2005-09-14
Also published as: CA2492038A1; EP1534838A2; WO2004006656A2; AU2003259103A1; WO2004006656A3; EP1534838A4; US7049483B1

Abstract

本发明创建了转基因植物，其中掺入有荧光素酶基因和相应的荧光素底物基因。调节这些基因，从而黑暗后经过一定时间，这些基因被表达而导致生物发光。荧光素/荧光素酶的不同组合可用于这些转基因植物中，这取决于所需的波长和转染的植物物种。

Description

转基因生物发光植物

发明背景

发明领域

本发明涉及转基因生物发光植物。更具体而言，本发明涉及经农杆菌或其他本领域公知的途径已转染有编码荧光素酶和荧光素的核酸分子以致所得植物整体或部分发光的植物细胞。核酸分子可通过该分子已被可操作连接的启动子区进行调节，所述启动子区的设计是调节遗传工程的生物发光的定时和持续时间。

现有技术

本领域已有一段时间知道某些称为荧光素酶的酶在诸如荧光素的底物的存在下会生物发光。荧光素酶包括一大类尤其在细菌、水母、荧火虫以及多种其他生物体产生的蛋白。编码荧光素酶的核酸分子已得以鉴定，而且其生物发光的活性已广泛用于研究基因调节和表达。实际上，通过将荧光素酶蛋白编码序列插入到待研究启动子的下游，人们可容易地告知启动子什么时候已受到所得生物荧光的激活。

荧光素往往是复合有机分子。据认为，其中有些通过复杂代谢途径形成，而有些，诸如腔肠素(coelenterazine)，则由多肽氨基酸的环化产生。直到最近，编码荧光素的核酸分子才是已知的。这意味着，为了检测荧光素酶，将荧光素直接施用于表达荧光素酶的生物体。荧光素不得不被靶吸收，其结果是，细胞和相对稀少的组织培养物，包括非常小的秧苗，是唯一合适的宿主。通常，使表达荧光素酶的生物体裂解，然后与荧光素溶液接触。显而易见，这杀死宿主生物体。

在研究基因表达中改进使用荧光素酶已经做了大量的工作，然而，在实验室环境之外和在更大的生物体中，如果不添加化学物质，就不能产生体内生物发光，所有努力都是有限的。

引作参考的授权给Inouye等的U.S.专利No.5,093,240公开了转基因使用称为水母素及其衍生物的荧光素酶。该专利公开了在设计用于批量生产的载体中使用荧光素酶。该专利提示大量的荧光素酶可生长于细菌培养物中。但该专利未公开生产胞内荧光素的核酸分子，也未预期或公开合适的方法用于将编码荧光素的序列插入到植物细胞中。

引作参考的授权给Cormier的U.S.专利No.5,162,227还公开了其中已插入编码荧光素酶的序列的重组DNA载体。同样，上述专利预期使用这些载体用于在细菌培养物中批量生产荧光素酶。其预计使用荧光素酶基因作为标记基因序列，或选择基因序列。但其未预期将荧光素编码的序列加入载体，体内生物发光或者形成适用于植物细胞的转染载体。

同样在此引作参考的授权给Cormier等的U.S.专利No.5,422,266公开了很相似于上述段落中所述的发明。其公开了将荧光素酶基因插入到适于微生物使用的载体中。同上述专利类似，其未预期另插入荧光素编码的序列，体内生物发光，或使用适于插入到植物细胞中的载体。

引作参考的授权给McElroy等的U.S.专利5,583,024公开了使用在转录分析中有用的第二荧光素酶。该专利预期使用荧光素酶定量确定多种不同的启动子序列的转录水平。它要求转化细胞的裂解，由此死亡。但其未预期体内生物发光或使用荧光素编码的序列。

引作参考的授权给Szalay等的U.S.专利NO.5,976,796公开了包括荧光素酶和发荧光蛋白的融合蛋白。专利预期在转录分析中使用荧光素酶蛋白作为双标记。其未提供胞内荧光素或体内生物发光。

同样引作参考的授权给Legocki等的U.S.专利5,221,623公开了在多种不同启动子的转录分析中使用勒克斯细菌荧光素酶基因。但其未预期成熟植物的体内生物发光或使用荧光素编码序列。此外，勒克斯生物发光机制要求大量的有机醛。该专利公开了给微生物施用醛蒸汽。这在本发明中是不实用的。

引作参考的皆授权给Bryan的U.S.专利5,876,995和6,247,995公开了在多种新型项目中使用生物发光荧光素酶/荧光素机制。将荧光素酶加入到大量产物中，随后加入荧光素。该专利未公开对荧光素酶/荧光素重组DNA的重组用途，然而，该专利的说明书也非常有用，其对整个生物发光领域给出了很详细的课本似的描述。

引作参考的授权给Ward等的U.S.专利No.5,741,668公开了体内能够自发形成荧光素腔肠素的多肽。该专利公开了通过表达编码序列，适当的序列以及收集所得的蛋白而批量生产。其未预期将腔肠素编码序列与荧光素酶组合在单一载体中，以及使用此载体形成生物发光生物体，诸如成熟植物。

因此，想要的是提供使成熟多细胞生物体，诸如植物，生物发光的方法。

还想要的是提供诱导生物发光而无需给生物体施用化学物质的方法。

还想要的是在实验室设置之外以及无需施用特殊的化学物质就能够生物发光的成熟植物。

还想要的是在生物发光的定时受到控制的地方提供能够生物发光的成熟植物。

发明简述

本发明涉及使用生物发光机制创建能够生物发光的转基因生物体，诸如多细胞植物。对诸如粮食作物的生物发光植物有可预知的优势。能够产生光的作物利于夜间收获。一旦收获，它们最终会停止发光。因此，作物可在任何时候，包括在较凉的晚间加以收获。当收获是可能的时候，这利于收获并且延长时间段。

优选的是，温室植物和景观植物用于本发明。本发明增强了景观植物的审美质量。

为了便于植物的生物发光，至少有两个编码序列必须要添加到植物中。第一个编码序列编码荧光素酶，而第二个编码序列编码荧光素酶的底物荧光素。自然界中发现有许多不同类型的荧光素酶。不同的荧光素酶以不同的荧光素作为其底物，而荧光素和荧光素酶的适当配对对本领域专业人员而言是已知的。

荧光素酶和相应的荧光素已在萤火虫，水母和生活在海洋底部的海洋生命。多年以来，这些组合一直被科学家用来研究基因在多种生物体中的调节和表达。由于表达方便检测，荧光素酶用作极好的标记。

在当今的涉及生物发光的基因表达分析中，将荧光素酶编码序列放置在待研究启动子区的下游。然后，该重组DNA插入到载体中，再用于转化植物，动物或细菌细胞。荧光素酶基因的表达或不表达取决于启动子的活性。接着，细胞裂解在生物发光缓冲液中，加入荧光素。测量发射光谱。如果样品发光，则表明启动子区已诱导表达。本领域技术人员会懂得，这些是常见的表达分析。

体内产生荧光素的方法直到最近才已知。这就是为何细胞不得不被裂解并向其中加入荧光素的原因。然而，近来，如授权给Ward等的U.S.专利NO.5,741,668所公开，阐述了形成荧光素coelenterrazine的代谢途径。coelentenazine为一小组水母中发现的荧光素酶的底物。这使得荧光素在活细胞中产生。由于此，通过使用合适的核酸分子，任何易受转化影响的生物体现在可被诱导发光。

根据本发明，荧光素酶和前腔肠素(pre-coelenterazine)在植物细胞内表达。优选的是，它们仅在植物叶子内表达。为了完成此项工作，将荧光素酶和前腔肠素的编码序列借助载体插入植物细胞中。一个使基因表达限制至叶子细胞的方法必须包括仅特异于叶子细胞表达的上游启动子区。已被成功转染的体细胞或其他植物细胞长成成熟植物。从单个植物细胞中生产成熟植物的方法在本领域是众所周知的。将控制序列，诸如rubisco小单元启动子区，或Cab2启动子(另一已知的生物钟启动子)序列插入荧光素酶和前腔肠素编码区的上游。这确保两个基因仅在植物叶子中表达。Rubisco和Cab2在夜晚下调。这意味着两个插入基因在黑暗中也将是下调的。这防止插入基因的表达给植物施加太大的压力。由于腔肠素为易损的有机分子，其半衰期为1.5-2小时，植物的生物发光活性将在黄昏后3-4小时内停止。

在某些情形下，对编码基因需要使用不同的启动子。具体而言，理想的是使用仅在黑暗中诱导表达的启动子。这将导致生物发光夜晚开始和拂晓结束。本领域技术人员会意识到，存在大量的启动子引起下游表达条件。哪种启动子最理想将依赖于植物品种以及独特于考虑之中的情形的额外因素，并且不需在此加以阐述。

为了诱导生物发光，除了荧光素酶外，腔肠素还需要O₂和钙离子。因此，理想的是使荧光素酶和腔肠素肽靶向特异细胞器官。本领域技术人员会意识到，存在多种多样的已知靶序列可被加入到多肽N端。通过把编码靶序列的多核苷酸序列插入编码序列的5’端而完成此项工作。当这被表达时，靶序列会包括在翻译的多肽中。然后，靶序列将导向多肽至特异细胞器官。为了保证存在任何需要的辅助因子，这可能是需要的。此外，所有多肽在最适pH下起作用。某些细胞器官的内在pH可能对荧光素酶和荧光素是更优选的。多种不同的细胞器官还可能提供改进多肽稳定性的环境。本领域技术人员会认识到，这些仅是许多可使荧光素酶和荧光素靶向到特异细胞器官的因子中的一些。

本领域技术人员还会意识到，可能需要将一种或多种其他序列添加到载体中，用于转染。为了活化或钝化，一些用于调节插入的生物发光基因的启动子有可能需要其他蛋白。通常需要转染载体包括选择序列。选择序列编码的基因赋予诸如卡那霉素和链霉素的多种抗生素抗性。这种选择序列一般用于分离已被成功转染的细胞。生物发光也可用作指示剂。因此，使用选择序列是不必要的。已被成功转染的细胞可诱导生物发光，从而从没有被转染的细胞中挑选出来。可能需要包括其他序列，诸如编码转运蛋白或其他目的蛋白的序列。

附图简述

图1为本发明重组DNA载体的简图。

图2为形成本发明转基因植物的方法的简图。

发明详述

在描述本发明时，下列术语将使用如下所述的定义。这些术语对本领域技术人员是众所周知的。

“重组多核苷酸”是指基因组源，cDNA源，半合成源，或合成源的多核苷酸，依据其来源或操作，所述多核苷酸(1)不与所有或部分同其天然相连的多核苷酸相连，和/或(2)与除了同其天然连接之外的多核苷酸连接，或(3)自然界中不出现。

“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚体形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。该术语仅涉及分子的一级结构。因此，该术语包括双链和单链DNA以及双链和单链RNA。这也包括修饰(“修饰”表示，例如，通过甲基化，磷酸化和/或通过加帽而修饰)和未修饰形式的多核苷酸。“复制子”是指任何遗传元件，例如，在细胞内的行为象自动的多核苷酸复制单元一样；即能够在其自我控制下复制的质粒，染色体，病毒。

本发明所用的“载体”是指其中连接着另一多核苷酸区段以使连接的区段复制和/或表达的复制子。载体可具有一个或多个多核苷酸或重组多核苷酸以及一个或多个控制序列，如本发明所用的载体总是包括以可操作连接有编码序列的启动子。

“控制序列”是指多核苷酸序列，其必须对所连接的编码序列的表达和/或分泌施加影响。这类控制序列的性质的差异取决于宿主生物体。在原核生物中，这类控制序列一般包括启动子，核糖体结合位点和终止子。在真核生物中，这类控制序列一般包括启动子，终止子，以及在某些情形下还包括增强子。此外，在原核生物和真核生物中，一些控制序列将表达的多肽导向至细胞内的特定位置或多细胞生物体内的区域。术语“控制序列”最低目的包括所有对表达必要的组分，并且也可包括影响蛋白表达的其他多核苷酸系列。

“启动子”是指表达的多核苷酸上游的多核苷酸序列。启动子序列对细胞机制发信号以表达其下游的多核苷酸。一些启动子象开关一样操作，并且仅向细胞发信号以在一定的条件下表达下游多核苷酸，诸如当生物体受到昆虫/病原体进攻，处于环境中一定温度之上，或在存在诸如IPTG的特殊化学物质的时候。

“宿主细胞”，“微生物细胞”，“细胞”和其他表示微生物或培养成单细胞实体的高级真核细胞系的术语，可交互使用，是指可用作或已用作重组载体或其他转移多核苷酸的受体的细胞，并且包括已被转染的原始细胞的子代。由于意外或故意突变，单个亲本细胞在形态学或基因组或总DNA补体上可以与原始亲本细胞不必完全相同，这是可以理解的。与亲本有足够相似的亲本细胞的子代可表征为相关属性，诸如存在编码目的肽的核苷酸序列，包括在由此定义的子代中，并且由上述术语覆盖。

“转化”或“转染”是指外源多核苷酸插入到微生物细胞，或诸如植物的多细胞生物体的细胞，不管插入所用的方法，例如，直接吸收，转导，f-接合，粒子轰击或细菌介导的基因转移。外源多核苷酸可作为非整合载体，例如质粒，得以维持，或者，可整合到宿主基因组中。

“多肽”是指编码在多核苷酸内的序列的氨基酸产物，而不涉及特定长度的产物。因此，肽，寡肽和蛋白包括在多肽的定义范围内。该术语也不是指多肽的表达后修饰，例如，糖基化作用，乙酰基化作用，磷酸化作用，唾液酸化作用等。然而，多肽可被如此修饰。

“转化多核苷酸”是指本领域已知并用于转化细胞的任何大量的多核苷酸结构。它们包括但不限于，质粒，噬菌粒，粘粒以及细菌人工染色体(BAC)。它们包括Ti质粒和能够转化植物细胞的其他结构，以及其他类型的细胞。

为了多核苷酸的表达需要启动子这样的控制序列。有许多已知的启动子。对给定转基因生物体而言，哪种启动子最好，将取决于表达所需的水平以及转化中的生物体类型。

本领域技术人员会意识到，除了可用于本发明所述技术的各种载体外，还有多种控制序列可添加到多核苷酸序列上。在一些或所有植物中，生物发光有可能通过将荧光素酶和相应的荧光素导向至植物内的特定位置而得以增强。利用在蛋白N端或C端添加氨基酸所产生的控制序列而完成此项工作。这些添加的氨基酸利用植物内的机制以使与它们连接的蛋白导向至植物细胞的特定区域。例如，有些控制序列导向蛋白至叶绿体，而有些导致蛋白连接到细胞膜。利用这些控制序列将某些蛋白导向至特定位置的技术对本领域技术人员而言是众所周知的。

本领域众所周知的是，控制序列也可用于调节多核苷酸序列的翻译和转录。这些控制序列可用于调节蛋白在其表达的生物体内的浓度。给任何给定的载体添加多种类型的这些控制序列是相对简单的程序。

一些控制序列要求添加第二种调节序列。例如，只有在存在抑制剂蛋白时，一些控制序列抑制基因翻译。在此情形下，必须把编码抑制剂蛋白的序列添加到载体中。该抑制剂蛋白序列在其上游或下游又有自己的控制序列。为了正确发挥作用，对抑制剂蛋白序列而言，甚至有可能具有要求第二抑制剂蛋白序列的控制序列。此外，就象有要求抑制剂蛋白的控制序列一样，也有要求增加基因翻译的活化蛋白的控制序列。这些控制序列要求添加活化蛋白。

还有在转录阶段调节编码序列表达的控制序列。这些序列抑制或促进核糖体对mRNA的活性。所有这些机制对本发明技术人员而言都是众所周知的。

哪种控制序列，启动子和载体可用于特定植物将取决于转化的方法，载体导入的植物以及个人判断力。

“荧光素酶”是指多种使相应的荧光素氧化从而导致生物发光的任何酶。本发明通常被吸引到某些水母中所发现的荧光素酶上来。术语荧光素酶也指萤火虫，细菌，鱼，乌贼和其他能够生物发光的生物体中发现的氧化酶。

“荧光素”是指其他化合物，其中一些衍生自寡肽，易受到荧光素酶的氧化。在下述具体的实施方案中，腔肠素是优选的荧光素，然而，本领域技术人员会意识到，任何在植物细胞内可成功生产的荧光素都适用于本发明。除了水母外，不同的荧光素发现在水母，细菌，鱼，乌贼和其他生物体，并且所有在此引作参考。

“绿色荧光蛋白”或“GFP”是指吸收由coelenterate荧光素酶发射的蓝光，并且借助荧光发射绿光。福斯特能量转移效应据认为可使蓝光高度有效地转化成绿光。通常GFP非共价地结合到荧光素酶/荧光素复合物。改变生物发光的波长的目的尚未知晓。本发明公开的前腔肠素多肽具有与GFP一样的序列，除了在其氨基酸序列中有单个改变以外。

“选择序列”是指众多可放置在载体中以使成功转染的细胞区别于没有被转染的细胞的任何多核苷酸序列。这样一种选择序列的例子为编码启动子的多核苷酸序列，并且是一种赋予卡那霉素抗性的多核苷酸序列。本领域技术人员会意识到，有多种编码抗生素抗性的序列，它们常用于选择转染的细胞。本领域技术人员还会意识到，除了那些编码抗生素抗性的序列以外，还有其他选择序列。

“不育操纵子”是指一种或多种添加到转染载体导致植物或其他生物体不能够繁殖的基因。本领域技术人员会意识到，成功的不育操纵子已由Monsanto公司开发，并正以其ROUNDUP READY^TM大豆使用。本领域技术人员还会意识到，这仅仅是许多在植物或其他生物体内诱导不育的方法中的一种。这种方法描述在U.S.专利Nos.5,723,765，6,297,426和6,228,643中，所有专利引作参考。

本发明涉及使用两种或多种核苷酸序列以构建植物细胞内的生物发光机制。所得植物将发光至少部分给定时段。优选的是让植物在晚上发光或至少数小时发光。

本发明可施用给任何类型的植物。在景观植物和室内植物中，本发明是尤其理想的。树木，灌木，花草是本发明所用的理想植物。这些植物通常发现在居家庭园的景观中，其中增加的安全性和令人愉快的外观是高度理想的。单子叶植物，诸如草和棕榈，以及双子叶植物，诸如树和大多数花，可用于本发明中。下述的当今植物转化技术为遗传修饰任何类型的植物提供了手段。

荧光素酶为本领域所知已有一段时间。它们的多核苷酸和氨基酸序列，染色体座位，晶体结构以及活性位点已得以阐述。水母荧光素酶通常以腔肠素作为底物，在其活性位点处具有酪氨酸肽。以腔肠素为其底物的水母荧光素酶家族包括发光蛋白质，奥贝林(obelin)和海肾(renilla)荧光素酶。这些荧光素酶称作coelenterate荧光素酶，都适用于本发明。在氧和钙存在下，它们能够氧化腔肠素。这使得它们尤其适于使用前腔肠素编码序列。

一旦选择了合适的荧光素酶/荧光素生物发光机制，则利用适当的核苷酸序列转化或“转染”真核生物细胞。本领域技术人员会意识到，有众多方法用于转染植物细胞。最常见转染植物细胞的方法是利用来自根瘤农杆菌(Agro-bacterium tumefaciens)的“TI”质粒。TI质粒含有T-DNA区段，TI质粒将其转移到已转染植物细胞的染色体中。野生型农杆菌的T-DNA可被长达25Kb的多核苷酸替换。在本发明中，可插入荧光素酶基因，荧光素基因，启动子，以及任选的选择序列和任选的附加控制序列，包括靶向序列，来代替T-DNA。然后，农杆菌转染将产生植物细胞，其中这些多核苷酸序列已被整合到其基因组。通过使植物细胞接触于合适量的激素和营养物，完全成熟的植物可自单个细胞中发育出来。

根瘤农杆菌TI质粒仅转染双子叶植物细胞，限制了其应用，然而，利用相似的TI质粒，已发现发根农杆菌(Agro-bacteriumrhizogenes)可成功转染单子叶植物细胞。本领域技术人员会意识到，为了成功转染植物细胞，不同类型的植物细胞要求不同类型的质粒和细菌。

其他转化植物细胞的方法也是存在的。例如，生物弹(biolistics)已用于转化植物细胞。在此方法中，金属微颗粒包被有所需的重组DNA。所述重组DNA可能是上述相同的多核苷酸。接着，DNA包被的微颗粒利用火药，氦气或其他本领域技术人员公知的方法加速至一速度，以致它们可渗透植物细胞。生物弹的优点之一在于，它可用于任何植物细胞上。

微注射是另一转化植物的方法。该方法包括使用显微针渗透和直接注射DNA至植物细胞核。

另一适于所有类型植物细胞的转化方法是电穿孔。电穿孔包括使用强大的电脉冲使植物细胞休克。其立刻破坏植物细胞膜导致其中形成孔。然后，周围溶液中的重组多核苷酸由这些孔进入植物细胞。

另一转化植物细胞的方法是将它们接触聚乙烯醇(PEG)。植物细胞叶绿体接触PEG使得它们立刻可渗透。象电穿孔一样，该方法也使周围溶液中的DNA方便地渗透到细胞中。

本领域技术人员会意识到，还有其他转化植物细胞的方法，包括使用硅化纤维(silicone fibers)。哪种转化方法最适用，将取决于多种本领域技术人员公知的因素。这些因素包括但不限于，在转化植物细胞的类型，在用荧光素酶和荧光素基因的类型，待插入重组DNA分子的大小，可用的设备以及方法的相对耗费。

细菌人工染色体“BAC”可与长达350Kb的重组多核苷酸片段一起用于转化植物细胞。此外，已发现发根农杆菌的TI质粒可成功转染单子叶植物细胞。二元载体，如同pBIN 20载体，为含有TI质粒和毗连序列的质粒，让它们也转染植物细胞。

在转化和长成成熟植物的植物细胞中，由重组DNA编码的生物发光机制将依据所用的启动子加以表达，从而导致植物生物发光。

在本发明一个具体的实施方案中，参照附图1，重组TI质粒10用于转染植物细胞。质粒10包括毒力编码区12，插入区52和非编码区50。非编码区50不编码任何肽，并且没有控制序列。复制(replacation)起点区48含有可被DNA聚合酶识别的序列，并且是质粒开始复制的点。

毒力区12为相对大的含有多核苷酸序列的操纵子，所述多核苷酸序列编码导致根瘤农杆菌侵入植物细胞的蛋白。这些序列包括virA14，virB 16，virG 18，virC 20，virD 22，virE 24，virF 26和virH 28。由这些基因编码的蛋白和酶检测已受伤植物释放的化学物质。其后，它们连接并侵入植物细胞。它们是TI质粒为了成功转染植物细胞所必须的组分。插入区52含有全部待插入植物基因组的编码和控制序列。左边32和右边30分别由25个碱基对多核苷酸序列组成，所述序列负责把插入区52插入到植物基因组中。限制区54各自包括一系列限制性位点。本领域技术人员对限制性位点十分熟悉。它们是很短的序列，为核酸内切酶所识别，并且利于把多核苷酸序列剪接到T-DNA区。本领域技术人员会意识到，对TI质粒农杆菌有许多公知的修饰。至少有几十种版本的TI质粒，而限制区54上存在的真正限制性位点将根据使用哪种修饰的TI质粒，通常，使用哪种限制性位点以向其中剪接所需的插入区DNA，而得以确定。质粒没有区别。一般而言，理想的是使用插入区重组DNA的5’和3’端上的不同限制性位点。这可防止质粒自身连接而不是同插入区连接。还有可能在5和3端使用相同的限制性酶。

序列36编码荧光素酶基因。其受到启动子序列34的调节。在该具体的实施方案中，靶向序列46位于荧光素酶基因序列36的5’端。靶向序列46编码添加到荧光素酶N’端的其他肽序列。该靶向序列导致胞内机构把荧光素酶导向至细胞的特定细胞器官或区域。靶向序列可导向蛋白至多种细胞器官，包括但不限于，高尔基体，线粒体，叶绿体，溶酶体，过氧化物酶体，核小体，或其他细胞器官。包括靶向序列46是任选的，因为荧光素酶/荧光素反应会发生在胞液中，但是，将酶及其底物靶向到特定的细胞器官由于许多原因可能是有利的。多种不同的细胞器官具有最适的pH，更高浓度的O₂，ATP和/或钙。同样，将所有荧光素酶和荧光素导向至细胞器官会导致相对浓度更高的酶，从而加速反应。其结果缩短了消耗荧光素所需的时间，但是也增加了生物发光植物的亮度。

启动子区34可以是多种本领域公知的任何启动子序列。在此具体的实施方案中，使用a/b光活性复合物的Cab2启动子区。当夜幕降临时，Cab2启动子下调下游序列。这表明荧光素酶序列将在黄昏前后终止表达。下调外源序列使得植物使用其能量以及其他天然功能用的氨基酸和核糖体。有可能使用其他从不关闭的启动子，即组成型启动子。还有可能使用在晚间上调而在日间下调的启动子。本领域公知有众多涉及生物钟的启动子区，根据它们所接触到的日光量而调节表达。由于这些植物的生物发光只在黑暗中可见，因此优选的是生物发光由它们所接触到的光量进行调节。然而，这不是必须的，可使用任何需要的启动子。

多种植物启动子是公知的，并且可用于促进生物发光机构在植物内多种位置中的表达。在开花植物中，诱导花自身生物发光可能是理想的。或者，在结果植物中，仅诱导果实生物发光可能是理想的。生物发光所需的位置，所需的持续时间以及植物物种将确定所用的启动子。

荧光素编码区40相似地受到启动子区38的调节。优选的是，启动子序列34和启动子序列38是部分相同序列，但这不是必要的。在此具体的实施方案中，荧光素酶利用腔肠素，而编码区40编码前腔肠素肽，例如授权给Ward等的’668专利中所述的肽，所述专利引作参考。一旦基因转录并被翻译成多肽，前腔肠素多肽自发地与自身反应，导致由两个酪氨酸和一个苯丙氨酸组成的环三肽形成腔肠素。腔肠素的半衰期相对较短，即大约1个半小时到两个小时，因此，理想的是，对启动子38使用不同于启动子序列34的启动子序列。该启动子区38包括Cab2或其他在晚间关闭的生物钟启动子。照此，该具体实施方案的生物发光仅在黄昏后持续数小时。更理想的是利用黄昏时开启的启动子。还优选使用不依赖于生物钟的启动子。

在这具体的实施方案中，荧光素基因40编码前腔肠素。本领域技术人员会意识到，为了形成胞内荧光素，其他荧光素要求代谢途径以及一种基因以上的操纵子。本领域技术人员会意识到，本发明可包括其他更多的复合操纵子代替单个多肽。正如本领域还已知和在此所述，使用其他的荧光素需要使用替代的荧光素酶基因36。

该具体的实施方案也包括编码卡那霉素抗性的选择序列42。本领域技术人员会意识到，这仅是若干可能的选择序列中的一种。其他遍在抗生素抗性选择序列包括那些给链霉素和潮霉素赋予抗性的选择序列。本领域技术人员还会意识到，选择序列本身是不必要的，因为生物发光本身可用作选择标记。如果需要，使用抗生素抗性或其他选择标记也是可能的。

某些启动子区要求附加基因以帮助调节。在插入区52中有可能包括这些基因。在这具体的实施方案中，使用Cab2启动子区，而其他控制序列是非必需的。本领域技术人员会意识到，使用Cab2表明，该质粒对于转化拟南芥(arabidopsis)以及其他植物是适当的。采用何种启动子将取决于在转化植物的类型以及生物发光所需的定时。

图2示出了利用图1所示的质粒形成生物发光植物的方法。将质粒10插入到根瘤农杆菌，并且与叶片62一起置于接种溶液64中。叶片62撕成部分72，其中叶子已受伤。一旦叶片62被接种，将其转移至含有生长培养基76的培养 66中。生长培养基76具有的营养足以使转染的细胞保持存活。沿着受伤的部分72，叶片62现在具有转染细胞74的区域。将熟化溶液68反复添加到培养皿66中。熟化溶液68包括使转染细胞发育成成熟植物的营养物和激素。在这具体的实施方案中，转染细胞遗留在叶片62上，从而产生单个转基因植物70。本领域技术人员会意识到，各个转染细胞可自动被分离和长成成熟植物。本领域技术人员会意识到，该图表是简化的过程，以及含有许多步骤并且需要若干周或数月的时间才能发育成幼株。在转基因树和大型灌木的情形下，在开发出成熟转基因生物发光植物之前，需要几年时间。

理想的是，这些转基因生物发光植物是不育的。如果植物不能繁殖，那些反对基因修饰生物体的人们可能更能接受它们。本领域技术人员会意识到，用于使遗传修饰的生物体不育的方法已被开发出来了。这些方法描述在U.S.专利Nos.5,723,765，6,297,426和6,228,643，参照同上。胚胎学领域技术人员会意识到，有若干启动子序列受到生物体年龄的调节。当植物第一次发芽时，有些启动子开启，而有些启动子关闭。随着植物老化，这些启动子中有些将最终关闭，而有些启动子则开启。含有待插入到植入基因组中的基因的重组对核苷酸包括受早期发育启动子序列活化的操纵子。这将导致如图1中示为操纵子44的操纵子诱导生成杀死秧苗的毒素，从而阻止植物产生后代。

在这具体的实施方案中，毒素基因序列44编码抑制胞内机构的核糖体抑制蛋白(RIP)。启动子58具有众多本领域技术人员公知的任何启动子序列，这些序列在萌芽时具有活性，但在其后不久就失活。序列58和44是任选的。

不是所有的荧光素代谢途径都已得以阐述。然而，本领域技术人员会认识到，完成此项工作有多种方法。一个优选的方法是利用基因组文库。例如，特定物种的整个基因组可被切成若干较短的DNA链。染色体与一种或多种限制性酶混合，导致染色体被切成多条DNA链。然后，限制性酶通过变性或其他本领域公知的方法钝化。接着，DNA链插入到质粒，噬菌粒，粘粒或BAC。本领域技术人员会认识到，该方法常用于形成多种物种的基因组文库。单个植物细胞可以培养皿，液体培养基或其他本领域公知的手段进行培养。利用TI质粒或如上所述的其他方法对它们进行转化。通过转化插入编码荧光素酶蛋白的DNA。使用控制序列，诸如上述卡那霉素抗性，是选择性生长仅被转化的植物细胞的常见方法。成功转化的植物细胞能够表达荧光素酶。Cab2启动子，温度敏感启动子，或其他手段可用于调节荧光素酶基因的翻译和转录。利用由上述方法创建的基因组文库，这些其中具有编码的荧光素酶基因的植物细胞可被第二次转化。本领域技术人员显而易见的是，用于初始转化植物细胞的荧光素酶必须来自DNA文库衍生的同一物种。生物发光领域的技术人员懂得，多种物种的荧光素酶一般与其他物种的荧光素不相容。

位于质粒，噬菌粒，粘粒或BAC内的控制序列用于制备文库，优选区别于初始转化中所用的控制序列。例如，如果初始质粒具有卡那霉素抗性，则优选的是，第二种转化用多核苷酸序列编码针对另一抗生素，诸如庆大霉素的抗性。然后，转化的植物细胞可生长在既含有卡那霉素又含有庆大霉素的培养基中，以致仅对含有两个质粒的植物细胞加以选择。这导致对其中已掺入荧光素酶基因和部分基因组文库的植物进行选择。本领域技术人员会意识到，编码荧光素代谢途径的操纵子有可能存在于至少一种双转化的植物细胞中。植物细胞生长在为荧光素基因和基因组文库基因提供表达的条件下。任何代谢荧光素的植物细胞将生物发光。这些植物细胞可长成会生物发光的成熟植物。

此外，理想的是分离生物发光的植物细胞，并且鉴定对荧光素代谢负责的多核苷酸序列。一旦分离出荧光素代谢操纵子，可将其掺入到同样的质粒，噬菌粒，粘粒或BAC中作为原始荧光素酶基因。这个新转化多核苷酸可用于转化植物细胞，由此通过单次转化途径提供生物发光植物细胞。所述细胞可长成生物发光的成熟植物。

上述方法可用于阐述许多物种的荧光素酶/荧光素基因。

为了利于生物发光，对植物细胞进行附加修饰的一个例子是把勒克斯操纵子加入植物中。通常，勒克斯操纵子据信在植物细胞中是无效的。这部分是由于缺乏可用的黄素单核苷酸，所述黄素单核苷酸不与黄素蛋白结合，在胞液内是游离的，并且以其还原态存在。FMNH₂为勒克斯生物发光反应所需的底物。为了确保有足够的FMNH₂存在于胞液中，可采取两个步骤。第一步，将FMN还原酶基因掺入转化多核苷酸中。其可通过相同或不同于调节荧光素酶和/或荧光素基因所用的启动子加以调节。一般而言，理想的是，还原酶蛋白的表达量足以提供足量的FMNH₂来促进生物发光反应。本领域技术人员会意识到，还原酶蛋白的过表达可能会破坏胞内化学。

另一调节胞内FMNH₂的量的方法是在转化多核苷酸内包括编码对FMNH₂代谢所必需的蛋白的操纵子。为了在胞液中提供足量的游离FMNH₂，可使用适当的启动子序列。该操纵子可以或不可以包括FMN还原酶基因。

另一在胞液中提供游离FMNH₂的方法是在转化多核苷酸中包括控制序列，所述控制序列在植物细胞内上调天然FMNH₂代谢途径。这个上调控制序列自身可受到启动子区的调节，所述启动子区控制天然FMNH₂代谢操纵子的上调程度。

尽管本发明参照附图已经加以描述，但是应该理解，在本发明的实质和范围内，除了在此所示或暗示的之外，还可进行其他和进一步的修饰。

Claims

1.一种制备转基因生物发光植物的方法，其包括：

用至少一种编码荧光素酶的基因和荧光素的基因的载体转染至少一种植物细胞，所述荧光素与编码的荧光素酶相容；

将所述至少一种植物细胞生长成成熟植物；以及

提供调节所述编码荧光素酶的基因和所述编码荧光素的基因的表达的手段。

2.权利要求1的方法，其中所述编码荧光素酶的基因为编码发光蛋白的基因。

3.权利要求1的方法，其中所述编码荧光素酶的基因为编码奥贝林的基因。

4.权利要求1的方法，其中所述编码荧光素酶的基因为编码海肾荧光素酶的基因。

5.权利要求1的方法，其中所述编码荧光素的基因编码腔肠素前体。

6.权利要求1的方法，其中所述载体进一步包括不育操纵子，并且不能繁殖。

7.权利要求6的方法，其中所述不育操纵子编码至少一种毒素基因序列，在所述毒素基因序列的上游具有启动子序列，所述启动子序列在萌芽时被活化，但在成熟植物中不被活化。

8.权利要求7的方法，其中所述毒素为核糖体抑制剂蛋白。

9.权利要求1的方法，其中所述调节所述编码荧光素酶的基因和所述编码荧光素的基因的表达的手段为rubisco 5’启动子区。

10.权利要求1的方法，其中所述编码荧光素酶的基因进一步包括靶向序列，以致表达的多肽被导向至特定的细胞器官。

11.权利要求10的方法，其中所述特定细胞器官选自高尔基体，线粒体，叶绿体，溶酶体，过氧化物酶体和核小体。

12.权利要求1的方法，其中所述调节所述编码荧光素酶的基因和所述编码荧光素的基因的表达的手段为rubisco 5’启动子区。

13.一种通过权利要求1的方法形成的转基因植物，其中所述荧光素酶编码基因编码发光蛋白，而所述荧光素编码基因编码前腔肠素蛋白，以及其中所述荧光素酶编码基因和所述荧光素编码基因受rubisco小单元5’启动子区的调节。

14.权利要求1的方法，其中所述调节所述编码荧光素酶的基因和所述编码荧光素的基因的表达的手段为Cab2启动子区。

15.一种转基因生物发光植物，包括：

至少一种植物细胞；

重组DNA区段，其掺入所述至少一种植物细胞的基因组中；

其中所述重组DNA包括至少一种编码荧光素酶的基因和至少一种编码至少一种能够形成胞内荧光素的蛋白的基因；以及

至少一种位于所述编码荧光素酶的基因上游的5’启动子序列，以及至少一种位于所述至少一种编码至少一种能够形成胞内荧光素的蛋白的基因上游的5’启动子序列。

16.权利要求15的植物，其中所述编码荧光素酶的基因编码发光蛋白。

17.权利要求15的植物，其中所述编码荧光素酶的基因编码奥贝林。

18.权利要求15的植物，其中所述编码荧光素酶的基因编码海肾荧光素酶。

19.权利要求15的植物，其中所述编码荧光素的基因编码腔肠素前体。

20.权利要求15的植物，其中所述重组DNA区段进一步包括不育操纵子，并且不能够繁殖。

21.权利要求20的植物，其中所述不育操纵子包括编码毒素的基因，所述毒素的基因具有在萌芽时被活化但在成熟植物中被钝化的5’启动子序列。

22.权利要求15的植物，其中所述至少一种位于所述编码荧光素酶的基因上游的5’启动子序列以及所述至少一种位于所述至少一种编码至少一种能够形成胞内荧光素的蛋白的基因上游的5’启动子序列选自Cab2启动子区和rubisco启动子区。

23.一种制备生物发光植物的方法，包括：

用具有编码荧光素酶基因的转化多核苷酸转化植物细胞；

用来自基因组文库的转化多核苷酸第二次转化植物细胞；

选择能够生物发光的植物细胞；以及

使生物发光植物细胞长成成熟植物。

24.一种制备生物发光植物的方法，包括：

在植物细胞的胞液中提供游离还原型黄素单核苷酸；

用其中掺有勒克斯操纵子的转化多核苷酸转化植物细胞；以及

使植物细胞长成成熟植物。