CN1296526A

CN1296526A - 生产耐受或抗除草剂的植物的方法

Info

Publication number: CN1296526A
Application number: CN 99804930
Authority: CN
Inventors: C·A·施普顿; I·B·布赖安
Original assignee: Zeneca Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1998-04-09
Filing date: 1999-04-07
Publication date: 2001-05-23
Also published as: WO1999053081A1; GB9807818D0; CA2321965A1; JP2002511274A; BR9909501A; EP1078084A1; AU3429899A

Abstract

一种生产抗或耐受可体外抑制4－羟苯基丙酮酸双加氧酶(4HPPD)的除草剂的植物的方法,该方法包括下列步骤:(i)用一种包括编码八氢番茄红素去饱和酶的区的多核苷酸来转化植物材料;(ii)将由此转化的材料再生成形态正常的植物。在一个优选的实施方案中,由所述多核苷酸包含的区是SEQ ID No.1所描述的序列或是与在55℃—60℃的温度下和含有0.1%SDS的强度为0.3的柠檬酸缓冲盐水中培养、随后在相同温度下用含有0.1%SDS的强度为0.3的柠檬酸缓冲盐水冲洗时仍然与SEQ ID No.1所描述的序列杂交的一种序列互补的序列。

Description

生产耐受或抗除草剂的植物的方法

本发明涉及一种生产耐受或抗除草剂的植物的方法，尤其涉及与非转基因的类似植物比较时表现出基本上抗或基本上耐受除草剂的转基因植物的生产。

当给基本上“耐受”除草剂的植物施用除草剂时，它们可产生一种与由类似进行的非耐受性类似植物产生的剂量/反应曲线相比时向右偏移的剂量/反应曲线。这类剂量/反应曲线具有绘制在x轴上的“剂量”和绘制在y轴上的“杀死百分比”、“除草作用”等。耐受性植物需要的除草剂多于非耐受性类似植物以便产生特定的除草作用。当以一般由农用化学品协会使用的浓度和比例给植物施用除草剂以杀死土壤中的杂草时，基本上“抗”除草剂的植物很少(如果有的话)表现出坏死、裂解、萎黄病或其它病变。抗除草剂的植物也耐受除草剂。将术语“抗”和“耐受”在本申请的上下文中解释为“耐受和/或抗”。

特别与本发明相关的除草剂是那些能够在体外抑制4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD或4HPPD)的酶类的物质。这类除草剂已经被公开：诸如在法国专利申请9506800和95 13570中特别描述的异噁唑类，且特别是isoxaflutole(一种选择性的玉米除草剂)；二酮腈类诸如那些在欧洲专利申请0496 630、0496 631中所述的物质、特别是2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO₂CH₃-4-CF₃-苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO₂CH₃-4-2,3Cl₂苯基)丙烷-1,3-二酮；在欧洲专利申请0 625 505和0625 508中所述的三酮类、特别是磺草酮、mesotrione(BSI-申请的)、pyrazolynate和苄草唑。能够提供耐受这些除草剂的公知基因是那些编码HPPD酶类的基因。

本发明提供了生产抗或耐受体外抑制4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(4HPPD)的除草剂的植物的方法，该方法包括下列步骤：

(ⅰ)用一种包括编码八氢番茄红素去饱和酶(PDS)的区的多核苷酸来转化植物材料；

(ⅱ)将由此转化的材料再生成形态正常的植物。

由所述多核苷酸包含的区可以具有SEQ ID No.1所描述的序列或可以是与在55℃-60℃的温度下和含有0.1％SDS的强度为0.3的柠檬酸缓冲盐水中培养、随后在相同温度下用含有0.1％SDS的强度为0.3的柠檬酸缓冲盐水冲洗时仍然与SEQ ID No.1所描述的序列杂交的一种序列互补的序列。优选八氢番茄红素去饱和酶来源于细菌，如SEQ ID No.1所述，并来源于噬夏孢欧文氏杆菌和/或特别是不需质体醌9作为辅因子的一种细菌。然而，该去饱和酶可以来源于植物，诸如特别是单子叶植物或双子叶植物、特别是拟南芥属或伞形科植物，例如胡萝卜。它可以是天然的或可能是突变的，同时基本上保持对HPPD抑制剂诸如异噁唑类除草剂诸如Balance^TM除草剂或三酮类的耐除草剂的特性。由上述方法生产的除草剂抗性植物可以通过其对体外抑制4HPPD的除草剂的抗性来选择。然而，可以进一步优选的情况是编码八氢番茄红素去饱和酶的多核苷酸进一步包括有利于选择再生转化体(transformats)的选择标记基因。合适的选择标记基因包括诸如卡那霉素、潮霉素和庆大霉素这样的抗生素抗性基因；诸如含草甘膦除草剂这样的另外的除草剂抗性基因；诸如eutypine这样的毒素抗性基因。其它的选择形式也是可使用的，诸如以激素为基础的选择系统诸如Hiroyrasu Ebinuma等在1997 PNAS第94卷2117-2121页中所述的Multi Auto Transformantion(MAT)系统；使用公知绿色荧光蛋白质、β-葡糖醛酸糖苷酶(glucoronidase)、甘露糖异构酶、木糖异构酶和2-DOG的目视选择系统。

可以(或已经可以)进一步用下列多核苷酸对所述的植物材料进行转化：包括编码能够产生具有抗或耐受除草剂、昆虫、脱水和/或真菌、细菌或病毒感染的蛋白质的区的多核苷酸；能够编码可产生改进质量的性状诸如提高的产量、改变的淀粉质量和/或提高的营养含量的蛋白质的多核苷酸。

多核苷酸内的蛋白质编码序列两侧是植物可操作的启动子和终止子。这类启动子和终止子本身与本发明没有密切关系，对于本领域技术人员来说是众所周知的，且包括例如CaMV35S、FMV35S、NOS、OCS和E9(来源于RUBISCO的小亚基)启动子和终止子或α-微管蛋白基因的启动子和终止子(EP-A 652，286)。优选的情况是，以有利于诸如(例如)包括至少一种诸如EP-A-507,698中所述的组蛋白启动子的编码序列超表达的启动子调节序列为基础。

根据本发明，同样能够使用与启动子调节序列相关的位于启动子和编码序列之间的其它调节序列，诸如转录或翻译增强子，诸如(例如)国际专利申请(引入本文作为参考的PCT公开号WO87/07644)中所述的烟草蚀刻病毒(TEV)翻译激活剂；或转运肽类(单或双)且在这种情况中它可能由中间体序列分离、即它在转录方向上包括编码可编码质粒定位酶的植物基因转运肽的序列、编码质粒定位酶的N-末端成熟部分植物基因的部分序列、然后是编码可编码质粒定位酶的植物基因的第二种转运肽的序列，它由可编码质粒定位酶的植物基因的N-末端成熟部分的部分序列形成，诸如EP-A-508,909中所述。

可以已经或可以随后-进一步用下列多核苷酸对所述的植物材料进行转化：包括可编码能够产生具有抗或耐受除草剂、昆虫、脱水和/或真菌、细菌或病毒感染的蛋白质的区的多核苷酸；能够编码可产生改进质量的性状诸如提高的产率、改变的淀粉质量和/或提高的营养含量的蛋白质的多核苷酸。

能够产生除草剂抗性的蛋白质选自下列物质组成的组：草甘膦氧化-还原酶(GOX)、5-烯醇-丙酮基-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)、膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)、羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、细胞色素P450、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、乙酰乳酸合酶(ALS)、原卟啉原氧化酶(PROTOX)、二氢蝶酸合酶、多胺转运蛋白、超氧物歧化酶(SOD)、溴草腈腈水解酶、获自真养产碱杆菌的tfdA基因的产物、和所述蛋白质的已知诱变的其它修饰的变体。

如上所述，可以转化所述植物材料的多核苷酸可以包括5’蛋白质编码区，该区编码：(ⅰ)能够将该区翻译产物定向至质粒诸如叶绿体、线粒体、其它细胞器或植物细胞壁的肽；和/或(ⅱ)非翻译翻译增强序列。

一旦将所述的多核苷酸引入植物材料就可以使所述的多核苷酸密码子最佳化、或将其改变以至少促进转录。由此将用于转化所述材料的所述多核苷酸进行修饰即可以除去mRNA不稳定性编码基元和/或不规则剪接区；或可以使用植物优选的密码子，以便在植物中由此修饰的多核苷酸的表达产生基本上类似的蛋白质，该蛋白质具有基本上与通过表达编码未修饰多核苷酸区的蛋白质是内源性的生物体中未修饰的多核苷酸而获得的活性/功能类似的活性/功能，条件是如果-就除草剂抗性授予区而言-由此修饰的多核苷酸包括植物优选的密码子，那么编码所述修饰的多核苷酸内区的蛋白质与编码所述植物内内源性包含的区和基本上编码相同蛋白质的类似的蛋白质之间的同一性程度低于约70％。

转化技术是众所周知的，且包括粒子介导的生物分解(biolistic)转化、土壤杆菌属介导的转化、原生质体转化(任意在有聚乙二醇存在的情况下)；在含有所述多核苷酸或载体的培养基中对植物组织、细胞或原生质体进行超声处理；将所述多核苷酸或载体显微插入全能植物材料(任意使用公知的碳化硅“针状单晶”技术)、电穿孔等。

本发明进一步提供了从上一段落最后部分中所述的材料再生的形态正常的可育(或雄性不育)的完整植物和这类植物的子代、这类植物和子代的种子以及这类植物和子代的部分。经转化的本发明植物包括小谷类、含油种子作物、纤维植物、果实、蔬菜、栽培作物和树。特别优选的这类植物包括大豆、棉花、烟草、甜菜、油菜、canola、亚麻、向日葵、马铃薯、番茄、苜蓿、莴苣、玉米、小麦、高粱、黑麦、香蕉、大麦、燕麦、草坪草、牧草、甘蔗、豌豆、蚕豆、稻、松、杨、苹果、葡萄、柑桔和坚果类植物。

本发明的转化植物对某些除草剂具有耐受性或抗性，所述的除草剂诸如在法国专利申请9506800和95 13570中特别描述的异噁唑类，且特别是4-[4-CF₃-2-(甲磺酰基)苯甲酰基]-5-环丙基异噁唑、且尤其是isoxaflutole(一种选择性的玉米除草剂)；二酮腈类诸如那些在EP-A-496,630和EP-A-496,631中所述的物质、特别是2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO₂CH₃-4-CF₃-苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO₂CH₃-4-2,3Cl₂-苯基)丙烷-1,3-二酮；以及在EP-A-625,505和EP-A-625,508中所述的三酮类、特别是磺草酮、mesotrione(BSI-申请的)、pyrazolynate和苄草唑。

本发明进一步包括从本发明方法中得到的形态正常的可育(或雄性不育)的完整植物、这类植物的子代、这类植物和子代的种子以及这类植物和子代的部分。

本发明进一步提供了包括编码八氢番茄红素去饱和酶的区的多核苷酸在生产抗或耐受可体外抑制酶4-HPPD的除草剂的植物材料中的用途。

本发明进一步提供了一种在大田中选择性控制杂草的方法，所述的大田中包括杂草和农作物植物，该方法包括给所述大田施用体外能够抑制酶4-HPPD的除草剂的步骤，其特征在于已经用包括编码八氢番茄红素去饱和酶的序列的多核苷酸编码区对所述植物进行了转化并表达了包括编码八氢番茄红素去饱和酶的序列的多核苷酸编码区。

特别优选的情况是八氢番茄红素去饱和酶编码序列是SEQ ID No.1所描述的序列或是与在55℃-60℃的温度下和含有0.1％SDS的强度为0.3的柠檬酸缓冲盐水中温孵、随后在相同温度下用含有0.1％SDS的强度为0.3的柠檬酸缓冲盐水冲洗时仍然与SEQ ID No.1所描述的序列杂交的一种序列互补的序列。所述的除草剂可以选自下列物质组成的组：mesotrione(BSI-申请的)、pyrazolynate和苄草唑、Balance^TM、磺草酮等。在给所述大田施用除草剂之前或之后可以用一种杀虫剂处理所述的大田，所述的杀虫剂选自下列物质组成的组：杀真菌剂、杀昆虫剂和杀线虫剂。

现在通过下列非限定性实施例、附图和序列表来描述本发明，其中：

SEQ ID No.1是分离自噬夏孢欧文氏杆菌(Erwinia aredovora)的八氢番茄红素去饱和酶(脱氢酶)基因的序列。本领域技术人员会认识到可以将任何八氢番茄红素去饱和酶用于生产对上述除草剂具有抗性/耐受性的植物。

SEQ ID No.2是由SEQ ID No.1编码的蛋白质。

SEQ ID No.3是编码豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基转运肽的多核苷酸序列。

SEQ ID No.4是由SEQ ID No.3编码的氨基酸序列。

图1是携带噬夏孢欧文氏杆菌crtⅠ基因的质粒pYPEIT4的结构，所述的基因带有豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基的转运肽序列(描述为TP)。

实施例

耐受能够在体外抑制酶4-HPPD的除草剂的植物的生产

从噬夏孢欧文氏杆菌(一种非绿色致植物腐烂的细菌)中克隆PDS基因(crtⅠ)，并使用含有CaMV35S启动子和叶绿体转运肽(pYPEIT4)的质粒将其在转基因烟草和番茄中进行超表达(Misawa等，1993)。获得超表达crtⅠ基因的纯合番茄品系，和含有相同构建体的烟草植物。

携带tp-crtⅠ基因的质粒pYPEIT4的构建

使用标准方法实施重组DNA技术。以204 bp的HindⅢ-Sphl片段形式从质粒pSNIF83(Schreier等，1985)中分离编码豌豆的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶)小亚基前体中的转运肽(TP)的DNA序列，其Spg1位点含有tp加工位点。用BamHⅠ和HindⅢ消化携带噬夏孢欧文氏杆菌完整八氢番茄红素去饱和酶基因(crtⅠ)的质粒pCRT-1(Fraser等(1992)《生物化学杂志》(J.Bio.Chem.)267 19891-19895)，并分离携带截短的crtⅠ基因的1.57 kb的HindⅢ-Sphl TP片段。将上述204 bp的HindIII-SphlTP片段与携带从含有crtⅠ起始密码子的SPhl位点的粘端至BamHⅠ位点的粘端的读框的76 bp的合成片段连接，并与1.57 kb的BamHⅠ-HindⅢ片段连接。分离携带tp-crtⅠ嵌合基因的所需1.84 kb的HindⅢ片段，用克列诺酶补平，并连入从二元载体bB/121(商购自Clontech laboratories)中除去β-葡糖醛酸糖苷酶基因的10.9kb片段的Saml-Sacl位点。由此生成所需的质粒pYPEIT4，正如附图1中所示。在转运肽和完整CrtⅠ的起始密码子下划线。这种携带tp-crtⅠ基因的HindⅢ片段被二元载体pB1121中的CaMV35S启动子和NOS终止子包围，以便在转基因烟草和番茄植物的组织中产生充分的表达。作为对照，构建携带完整crtⅠ基因而没有被的CaMV35S启动子和NOS终止子包围的tp的质粒pBICAR4。通过公知技术将质粒pYPEIT4引入烟草和番茄材料，然后再通过公知技术将所述材料再生成完整植物。

用crtⅠ基因转化的番茄植物对mesotrione和isoxaflutole的耐受性

将来源于‘野生型’(即未转化的)番茄植物cv.Ailsa Craig的纯合种子和用来自噬夏孢欧文氏杆菌的crtⅠ基因转化的植物(参见上文)播种在3英寸罐内以泥炭为主的堆肥中，并转入温室。在3叶期，用mesotrione或isoxaflutole(Balance^TMHerbicide)进行出苗后重复处理4次之前到之后，使植物在20/16度的日/夜温度下和16小时的光照期中生长约4周。将化合物悬浮在水中并通过轨道喷雾器按每公顷200升的喷洒体积，以每公顷1-500克活性组分(ga.i./ha)的比例施用，正如表1中所示。

使所述植物进一步生长25天，然后与未处理的‘对照’植物相比，对除草剂的破坏情况进行目视评估。所观察到的典型植物毒性症状是严重的退绿症/漂白和叶坏死以及新的生长。将来自该试验的结果列在表1中，其中‘％破坏/植物毒性’评分代表来自4次重复处理中每一次的目视评估结果的平均值。

表1

正如可以观察到的，用表达来自噬夏孢欧文氏杆菌的细菌PDS的crtⅠ基因转化的植物表现出高于野生型未转化番茄的对mesotrione和isoxaflutole的耐受性。例如，11g a.i./ha的mesotrione可对野生型番茄产生50％的植物毒性，而在转化的植物中仅观察到9％的损伤。类似地，野生型植物受到500g a.i./ha isoxaflutole的破坏程度明显高于那些含有crtⅠ基因的植物。

本领域技术人员会认识到本发明并不限于上述技术内容。例如，可以用编码PDS酶的基因转化非番茄和烟草的植物，无论所述基因是来源于细菌还是其它来源。

序列表<110>ZENECA LIMITED<120>生产耐受或抗除草剂的植物的方法<130>PPD50336WO<140><141><150>9807818.1<151>1998-04-09<160>4<170>Patentln2.0版<210>1<211>1493<212>DNA<213>噬夏孢欧文氏杆菌<220><221>CDS<222>115)..(1493)<400>1taaagagcga ctac atg aaa cca act acg gta att ggt gca ggc ttc ggt 50

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110 115 120ctg gac tat tca cgc gcg gtg ttt aaa gaa ggc tat cta aag ctc ggt 434Leu Asp Tyr Ser Arg Ala Val Phe Lys Glu Gly Tyr Leu Lys Leu Gly125 130 135 140act gtc cct ttt tta tcg ttc aga gac atg ctt cgc gcc gca cct caa 482Thr Val Pro Pha Leu Ser Phe Arg Asp Met Leu Arg Ala Ala Pro Gln

145 150 155ctg gcg aaa ctg cag gca tgg aga agc gtt tac agt aag gtt gcc agt 530Leu Ala Lys Leu Gln Ala Trp Arg Ser Val Tyr Ser Lys Val Ala Ser

160 165 170tac atc gaa gat gaa cat ctg cgc cag gcg ttt tct ttc cac tcg ctg 578Tyr Ile Glu Asp Glu His Leu Arg Gln Ala Phe Ser Phe His Ser Leu

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190 195 200cac gcg ctg gag cgt gag tgg ggc gtc tgg ttt ccg cgt ggc ggc acc 674His Ala Leu Glu Arg Glu Trp Gly Val Trp Phe Pro Arg Gly Gly Thr205 210 215 220ggc gca tta gtt cag ggg atg ata aag ctg ttt cag gat ctg ggt ggc 722Gly Ala Leu Val Gln Gly Met Ile Lys Leu Phe Gln Asp Leu Gly Gly

225 230 235gaa gtc gtg tta aac gcc aga gtc agc cat atg gaa acg aca gga aac 770Glu Val Val Leu Asn Ala Arg Val Ser His Met Glu Thr Thr Gly Asn

240 245 250aag att gaa gcc gtg cat tta gag gac ggt cgc agg ttc ctg acg caa 818Lys Ile Glu Ala Val His Leu Glu Asp Gly Arg Arg Phe Leu Thr Gln

255 260 265gcc gtc gcg tca aat gca gat gtg gtt cat acc tat cgc gac ctg tta 866Ala Val Ala Ser Asn Ala Asp Val Val His Thr Tyr Arg Asp Leu Leu

270 275 280agc cag cac cct gcc gcg gtt aag cag tcc aac aaa ctg cag act aag 914Ser Gln His Pro Ala Ala Val Lys Gln Ser Asn Lys Leu Gln Thr Lys285 290 295 300cgc atg agt aac tct ctg ttt gtg ctc tat ttt ggt ttg aat cac cat 962Arg Met Ser Asn Ser Leu Phe Val Leu Tyr Phe Gly Leu Asn His His

305 310 315cat gat cag ctc gcg cat cac acg gtt tgt ttc ggc ccg cgt tac cgc 1010His Asp Gln Leu Ala His His Thr Val Cys Phe Gly Pro Arg Tyr Arg

320 325 330gag ctg att gac gaa att ttt aat cat gat ggc crc gca gag gac ttc 1058Glu Leu Ile Asp Glu Ile Phe Asn His Asp Gly Leu Ala Glu Asp Phe

335 340 345tca ctt tat ctg cac gcg ccc tgt gtc acg gat tcg tca ctg gcg cct 1106Ser Leu Tyr Leu His Ala Pro Cys Val Thr Asp Ser Ser Leu Ala Pro

350 355 360gaa ggt tgc ggc agt tac tat gtg ttg gcg ccg gtg ccg cat tta ggc 1154Glu Gly Cys Gly Ser Tyr Tyr Val Leu Ala Pro Val Pro His Leu Gly365 370 375 380acc gcg aac ctc gac tgg acg gtt gag ggg cca aaa cta cgc gac cgt 1202Thr Ala Asn Leu Asp Trp Thr Val Glu Gly Pro Lys Leu Arg Asp Arg

385 390 395att ttt gcg tac crt gag cag cat tac atg cct ggc tta cgg agt cag 1250Ile Phe Ala Tyr Leu Glu Gln His Tyr Met Pro Gly Leu Arg Ser Gln

400 405 410ctg gtc acg cac cgg atg ttt acg ccg ttt gat ttt cgc gac cag ctt 1298Leu Val Thr His Arg Met Phe Thr Pro Phe Asp Phe Arg Asp Gln Leu

415 420 425aat gcc tat cat ggc tca gcc ttt tct gtg gag ccc gtt ctt acc cag 1346Asn Ala Tyr His Gly Ser Ala Phe Ser Val Glu Pro Val Leu Thr Gln

430 435 440agc gcc tgg ttt cgg ccg cat aac cgc gat aaa acc att act aat ctc 1394Ser Ala Trp Phe Arg Pro His Asn Arg Asp Lys Thr Ile Thr Asn Leu445 450 455 460tac ctg gtc ggc gca ggc acg cat ccc ggc gca ggc att cct ggc gtc 1442Tyr Leu Val Gly Ala Gly Thr His Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Val

465 470 475atc ggc tcg gca aaa gcg aca gca ggt ttg atg ctg gag gat ctg att 1490Ile Gly Ser Ala Lys Ala Thr Ala Gly Leu Met Leu Glu Asp Leu Ile

480 485 490tga 1493<210>2<211>492<212>PRT<213>噬夏孢欧文氏杆菌<400>2Met Lys Pro Thr Thr Val Ile Gly Ala Gly Phe Gly Gly Leu Ala Leu1 5 10 15Ala Ile Arg Leu Gln Ala Ala Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Glu Gln

20 25 30

Arg Asp Lys Pro Gly Gly Arg Ala Tyr Val Tyr Glu Asp Gln Gly Phe

35 40 45Thr Phe Asp Ala Gly Pro Thr Val Ile Thr Asp Pro Ser Ala Ile Glu

50 55 60Glu Leu Phe Ala Leu Ala Gly Lys Gln Leu Lys Glu Tyr Val Glu Leu65 70 75 80Leu Pro Val Thr Pro Phe Tyr Arg Leu Cys Trp Glu Ser Gly Lys Val

85 90 95Phe Asn Tyr Asp Asn Asp Gln Thr Arg Leu Glu Ala Gln Ile Gln Gln

100 105 110Phe Asn Pro Arg Asp Val Glu Gly Tyr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Ser

115 120 125Arg Ala Val Phe Lys Glu Gly Tyr Leu Lys Leu Gly Thr Val Pro Phe

130 135 140Leu Ser Phe Arg Asp Met Leu Arg Ala Ala Pro Gln Leu Ala Lys Leu145 150 155 160Gln Ala Trp Arg Ser Val Tyr Ser Lys Val Ala ser Tyr Ile Glu Asp

165 170 175Glu His Leu Arg Gln Ala Phe Ser Phe His Ser Leu Leu Val Gly Gly

180 185 190Asn Pro Phe Ala Thr Ser Ser Ile Tyr Thr Leu Ile His Ala Leu Glu

195 200 205Arg Glu Trp Gly Val Trp Phe Pro Arg Gly Gly Thr Gly Ala Leu Val

210 215 220Gln Gly Met Ile Lys Leu Phe Gln Asp Leu Gly Gly Glu Val Val Leu225 230 235 240Asn Ala Arg Val Ser His Met Glu Thr Thr Gly Asn Lys Ile Glu Ala

245 250 255Val His Leu Glu Asp Gly Arg Arg Phe Leu Thr Gln Ala Val Ala Ser

260 265 270Asn Ala Asp Val Val His Thr Tyr Arg Asp Leu Leu Ser Gln His Pro

275 280 285Ala Ala Val Lys Gln Ser Asn Lys Leu Gln Thr Lys Arg Met Ser Asn

290 295 300Ser Leu Phe Val Leu Tyr Phe Gly Leu Aan His His His Asp Gln Leu305 310 315 320Ala His His Thr Val Cys Phe Gly Pro Arg Tyr Arg Glu Leu Ile Asp

325 330 335Glu Ile Phe Asn His Asp Gly Leu Ala Glu Asp Phe Ser Leu Tyr Leu

340 345 350His Ala Pro Cys Val Thr Asp Ser Ser Leu Ala Pro Glu Gly Cys Gly

355 360 365Ser Tyr Tyr Val Leu Ala Pro Val Pro His Leu Gly Thr Ala Asn Leu

370 375 380Asp Trp Thr Val Glu Gly Pro Lys Leu Arg Asp Arg Ile Phe Ala Tyr385 390 395 400Leu Glu Gln His Tyr Met Pro Gly Leu Arg Ser Gln Leu Val Thr His

405 410 415Arg Met Phe Thr Pro Phe Asp Phe Arg Asp Gln Leu Asn Ala Tyr His

420 425 430Gly Ser Ala Phe Ser Val Glu Pro Val Leu Thr Gln Ser Ala Trp Phe

435 440 445Arg Pro His Asn Arg Asp Lys Thr Ile Thr Asn Leu Tyr Leu Val Gly

450 455 460Ala Gly Thr Mis Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Val Ile Gly Ser Ala465 470 475 480Lys Ala Thr Ala Gly Leu Met Leu Glu Asp Leu Ile

485 490<2l0>3<211>204<212>DNA<213>豌豆<220><221>CDS<222>(1)..(204)<400>3atg gct tct atg ata tcc tct tcg gct gtg aca aca gtc agc cgt gcc 48Met Ala Ser Met Ile Ser Ser Ser Ala Val Thr Thr Val Ser Arg Ala1 5 10 15tct agg ggg caa tcc gcc gca gtg gct cca ttc ggc ggc ctc aaa tcc 96ser Arg Gly Gln Ser Ala Ala Val Ala Pro Phe Gly Gly Leu Lys Ser

20 25 30atg act gga ttc cca gtg aag aag gtc aac act gac att act tcc att 144Met Thr Gly Phe Pro Val Lys Lys Val Asn Thr Asp Ile Thr Ser Ile

35 40 45aca agc aat ggt gga aga gta aag tgc atg aaa cca act acg gta att 192Thr Ser Asn Gly Gly Arg Val Lys Cys Met Lys Pro Thr Thr Val Ile

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35 40 45Thr Ser Asn Gly Gly Arg Val Lys Cys Met Lys Pro Thr Thr Val Ile

50 55 60Gly Ala Gly Phe65

Claims

1．一种生产抗或耐受可体外抑制4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(4HPPD)的除草剂的植物的方法，该方法包括下列步骤：

(ⅱ)将由此转化的材料再生成形态正常的植物，并从可抗或耐受体外抑制4HPPD的除草剂的那些再生植物群体中进行选择。

2．一种根据权利要求1所述的方法，其中由所述多核苷酸包含的区是SEQ ID No.1所描述的序列或是与在55℃-60℃的温度下和含有0.1％SDS的强度为0.3X的柠檬酸缓冲盐水中温孵、随后在相同温度下用含有0.1％SDS的强度为0.3X的柠檬酸缓冲盐水冲洗时仍然与SEQ ID No.1所描述的序列杂交的一种序列互补的序列。

3．一种根据权利要求1所述的方法，其中所述的八氢番茄红素去饱和酶来源于植物。

4．一种根据权利要求1所述的方法，其中所述的八氢番茄红素去饱和酶来源于细菌。

5．一种根据权利要求4所述的方法，其中所述的八氢番茄红素去饱和酶是从噬夏孢欧文氏杆菌中分离的。

6．一种根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中所述的多核苷酸进一步包括一种选择标记基因。

7．一种根据权利要求6所述的方法，其中所述的选择标记基因选自下列物质组成的组：赋予抗生素抗性的标记基因、赋予除草剂抗性的标记基因、赋予毒素抗性的标记基因、营养标记、视觉标记和在基于激素的选择系统中所用的标记基因。

8．一种根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中已经或进一步用下列多核苷酸将所述的植物物质进行了转化：包括编码能够产生具有抗或耐受除草剂、昆虫、脱水和/或真菌、细菌或病毒感染的蛋白质的区的多核苷酸；能够编码可产生改进质量的性状诸如提高的产量、改变的淀粉质量和/或提高的营养含量的蛋白质的多核苷酸。

9．一种根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中所述多核苷酸内所述蛋白质的编码序列两侧是植物可操作启动子和终止子。

10．一种根据权利要求8或9中之一所述的方法，其中所述的能够产生除草剂抗性的蛋白质选自下列物质组成的组：草甘膦氧化-还原酶(GOX)、5-烯醇-丙酮基-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)、膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)、羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、细胞色素P450、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、乙酰乳酸合酶(ALS)、原卟啉原氧化酶(PROTOX)、二氢蝶酸合酶、多胺转运蛋白、超氧物歧化酶(SOD)、溴草腈腈水解酶、获自真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)的tfdA基因的产物、法尼基焦磷酸合酶和所述蛋白质的已知诱变的或其它修饰的变体。

11．一种根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中所述多核苷酸的蛋白质编码序列包括5’区，该区可编码：(ⅰ)能够将该区翻译产物定向至质粒诸如叶绿体、线粒体、其它细胞器或植物细胞壁的肽；和/或(ⅱ)非翻译的翻译增强序列。

12．一种根据权利要求1-11中任意一项所述的方法，其中对用于转化所述材料的所述多核苷酸进行修饰，因而除去mRNA不稳定性编码基元和/或不规则剪接区；或使用植物优选的密码子以便由此修饰的多核苷酸在植物中的表达产生基本上类似的蛋白质，该蛋白质具有基本上与通过表达编码未修饰多核苷酸区的蛋白质是内源性的生物体中未修饰的多核苷酸而获得的活性/功能类似的活性/功能，条件是如果-就除草剂抗性授予区而言-由此修饰的多核苷酸包括植物优选的密码子，那么编码所述修饰的多核苷酸内区的蛋白质与编码所述植物内内源性包含的区和基本上编码相同蛋白质的类似的蛋白质之间的同一性程度低于约70％。

13．一种根据权利要求1-12中任意一项所述的方法，其中抑制4-HPPD的除草剂选自下列物质组成的组：isoxaflutole；二酮腈类诸如2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO₂CH₃-4-CF₃-苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO₂CH₃-4-2,3Cl₂苯基)丙烷-1,3-二酮；三酮类诸如磺草酮和mesotrione(BSI-申请的)、pyrazolynate和苄草唑。

14．一种根据权利要求1-13中任意一项所述的方法，其中将所述的除草剂在发芽后施用。

15．一种获自权利要求1-14中任意一项方法的形态正常的可育(或雄性不育)的完整植物、这类植物的子代、这类植物和子代的种子以及这类植物和子代的部分。

16．一种根据权利要求15的植物，它选自香蕉、棉花、玉米、番茄、藤本植物组成的组。

17．包括编码八氢番茄红素去饱和酶的区的多核苷酸在生产抗或耐受体外抑制酶4-HPPD的除草剂的植物材料的用途。

18．一种选择性控制大田中杂草的方法，所述的大田中包括杂草和农作物植物，该方法包括给所述大田施用体外能够抑制酶4-HPPD的除草剂的步骤，其特征在于已经用包括可编码八氢番茄红素去饱和酶的序列的多核苷酸编码区将所述植物进行了转化并表达了包括可编码八氢番茄红素去饱和酶的序列的多核苷酸编码区。

19．一种根据权利要求18所述的方法，其中所述的多核苷酸是在权利要求2-12中任意一项所述的多核苷酸。

20．一种根据权利要求18或19中之一所述的方法，其中所述的除草剂选自下列物质组成的组：isoxaflutole；二酮腈类诸如2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO₂CH₃-4-CF₃-苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO₂CH₃-4-2,3Cl₂苯基)丙烷-1,3-二酮；三酮类诸如磺草酮、和mesotrione(BSI-申请的)、pyrazolynate和苄草唑。

21．一种根据权利要求18-20中任意一项所述的方法，其中在给所述大田施用除草剂之前或之后，用一种杀虫剂处理所述的大田，所述的杀虫剂选自下列物质组成的组：杀真菌剂、杀昆虫剂和杀线虫剂。