CN1112445C

CN1112445C - 植物基因表达的控制

Info

Publication number: CN1112445C
Application number: CN95194442A
Authority: CN
Inventors: 梅尔文·约翰·奥利弗; 杰里·埃德温·奎森伯里; 诺玛·李·格罗薇尔·特罗林德; 唐李·凯姆
Original assignee: Delta and Pine Land Co LLC; US Department of Agriculture USDA
Current assignee: Monsanto Co; US Department of Agriculture USDA
Priority date: 1994-08-01
Filing date: 1995-07-31
Publication date: 2003-06-25
Anticipated expiration: 2015-07-31
Also published as: TR199500933A2; BR9508471A; DK0775212T3; AU3205095A; ATE305976T1; DE69534503T2; CA2196410A1; JPH10503377A; EP0775212B1; EG23907A; DE69534503D1; WO1996004393A3; WO1996004393A2; ES2250974T3; US5925808A; AU696668B2; CN1161717A; CA2196410C; HK1003271A1; US5977441A

Abstract

本发明公开了一种制备遗传学修饰的植物的方法，包括：从被下述DNA序列转染的植物细胞再生完整的植株，所述的DNA序列包括与瞬时活化启动子相连接的其表达产生一个改变的植物表型的第一个基因，该基因和启动子通过旁侧具有特异切除序列的封阻序列分隔开，该DNA序列还包括编码特异于与阻抑型启动子的相连的特异切除序列的重阻酶的第二个基因，以及编码特异于该阻抑型启动子的阻遏物的第三个基因。还公开了制备遗传学修饰的杂交植物的方法，该方法是将第一种植物与第二种植物进行杂交，并从杂交种子生长杂交植物，所述的第一种植物是从用下述DNA序列转染的植物细胞再生得到，所述的DNA序列包括与瞬时活化启动子相连接的其表达产生一个改变的植物表型的第一个基因，该基因和启动子通过旁侧具有特异切除序列的封阻序列分隔开；所述的第二种植物是从用下述DNA序列转染的第二种植物细胞再生得到，所述的DNA序列包括编码特异于与萌发活化启动子的相连的特异切除序列的重阻酶的第二个基因。还公开了含有上述DNA序列的植物细胞、植物组织、植物种子以及完整植株。

Description

植物基因表达的控制

本发明涉及转基因植物并涉及一种制备带有可控制基因的转基因植物的方法。更具体地说，本发明涉及已被修饰的转基因植物，以便使所需的导入的基因的表达被限制于一个植物发育的特定时期，一种特定的植物组织，特定的环境条件，或者特定时间或位置，或者是这些情况的组合。

在一种或多种有机体中可操作的各种基因表达控制因子是已知的，例如，PCT申请WO90/08826(Bridges，et al)公开了一种对一种外源化学诱导物敏感的可诱导的基因启动子，称做“基因开关”。这个启动子可以与一个基因相连接并导入一种植物，该基因可以通过应用化学诱导物直接激活启动子而有选择地表达。

PCT申请WO94/03619(Bright et al)公开了由一个与阻遏物基因相连接的基因开关和一个与能够破坏植物发育的破坏蛋白相连接的可阻遏操纵子组成的基因盒。通过应用或抑制一种化学诱导物可以控制植物的生长。当诱导物存在时，阻遏物可被表达，附着于破坏基因的启动子被遏制，破坏蛋白不表达，附着于破坏基因的启动子被遏制，破坏蛋白不表达，从而允许植物正常生长。如果抑制化学诱导物，基因开关被关闭，阻抑型启动子没有被阻抑，所以破坏蛋白被表达并且植物发育受到破坏。据说这一系统通过依赖于连续应用化学诱导物进行连续生长和发育而控制植物不进入野生状态，并通过在种子发育的最后时期阻抑化学诱导物而缓和谷粒收获前发芽的问题。

Gatz和Quail(1988)和Gatz et al(1992)(Hoppe-Seyler，372：659-660(1991)，公开了一个由应用四环素所控制的植物活化阻遏物-操纵子系统。该系统由Tn10tet阻遏物基因和一个花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子组成，它修饰后含有二个tet操纵子并与氯霉素乙酰转移酶(cat)基因相连接(Gatz和Quail，1988)，或者它修饰后含有三个tet操纵子并连接到β-葡糖醛酸酶(gus)基因上(Gatz et al.，1992)。只要Tn10tet阻遏物基因是具活性的，修饰后的启动子就被阻遏物与tet操纵子的相互作用所遏止，并且cat或gus基因不表达。四环素的存在抑制了阻遏物的结合，使cat或gus基因表达。

发明概述

在一个实施方案中，本发明涉及制备一种含有其表达可通过应用外部刺激物而控制的基因的转基因植物。该系统采用一种外部刺激物对基因表达进行正调控，不需要连续应用外部刺激物维持基因表达。在第二个实施方案中，本发明也涉及制备转基因亲代植物，它们通过杂交产生能表达在任一亲本中均不表达的基因的子代。通过控制影响植物表型的基因的表达，可以使植物生长在使一种表型呈优势的一套条件或一种环境中，然后移植植物或种植它的种子到使另一表型呈优势的另一套条件或另一种环境中。这项技术在农业和园艺应用上有特殊用途。

根据本发明的一个实施方案，将一系列序列导入一种植物，所述序列包含有一个连接到结构基因上的瞬时激活启动子，该启动子和结构基因被一个两侧结合有特异切除序列的封阻序列所分开，还包含一个可操纵地连接到编码能够识别所述特异切除序列的位点特异性重组酶的基因的阻抑型启动子，和一个编码特异于所述阻抑型启动子的阻遏物的基因，所述阻遏物对外部刺激物敏感。没有应用外部刺激物时，结构基因不表达。应用刺激物时，阻遏物功能被抑制，重组酶被表达并导致在特异切除序列去除封阻序列，从而将结构基因和瞬时活化启动子直接连接。

在该实施方案的修改方案中，将编码重组酶的序列借助一个病毒载体单独地导入植物中。

在另一种可选用的实施方案中，没有使用阻遏物基因或阻抑型启动子。而是将重组酶基因连接到一个萌发特异性的启动子上并导入到不含其他序列的另一种植物中。含有瞬时活化启动子，封阻序列和结构基因的植物和含有重组酶基因的植物杂交，产生含有所有序列的子代。当第二个瞬时活化启动子变为活化时，重组酶在子代中将封阻序列去除，使结构基因在子代中表达，而结构基因在两个亲本中不表达。

在另一个实施方案中，重组酶基因简单地与一个诱导型启动子连接。把植物暴露于特异于诱导型启动子的诱导环境中可导致重组酶基因的表达和封阻序列的切除。

在所有这些实施方案中，当瞬时活化启动子在正常生长和发育过程中变成有活性时结构基因被表达，并只要瞬时活化启动子是有活性的，则结构基因将持续地表达，而不需要连续的外部刺激。这个系统对下述种子发育是特别有用的，即一个特定性状仅在该种子生长成的植物的第一代中需要，或者仅在随后的代中需要一个性状。

发明详述

本发明涉及一种制备转基因植物的方法，其中特定的植物性状的表达主要受外部控制。在一个实施方案中，所述控制是通过应用一种外部刺激物而获得；在另一个实施方案中所述控制是通过杂交获得，在又一个实施方案中控制是通过将一种重组酶或重组酶基因直接导入到一种植物而获得。本发明中的转基因植物是通过把一系列功能相关的DNA序列导入植物的基因组而制得的，所述DNA序列含有以下基本因子：一个在植物发育特定时期或在特定环境条件下有活性的植物活化启动子(“瞬时活化启动子”)，一种其表达导致植物表型改变的基因，该基因借助一个将瞬时活化启动子和该基因分隔开的封阻序列连接到瞬时活化启动子上；封阻序列旁侧的特异切除序列，其中特异切除序列由位点特异性重组酶识别，一个编码位点特异性重组酶的基因，一种连接到该重组酶基因的另外的阻抑型启动子，和一个编码特异于阻抑型启动子的阻遏物的另外的基因，阻遏物的行为对所应用的或外在的刺激敏感。这些因子可以以任何顺序排列，只要能获得下面描述的相互作用即可。在一个实施例中，优选地将它们按如下排列：含有瞬时活化启动子，第一个特异切除序列，封阻序列，第二个特异切除序列，其表达导致改变的植物表型的基因的第一个DNA序列；含有可操作地连接于重组酶基因的阻抑型启动子和任选的增强子的第二个DNA序列；含有编码特异于可阻遏启动子的阻遏物的基因的第三个DNA序列，它本身连接于植物中有功能的组成型启动子。第三个DNA序列可以方便地作为定位于第一个DNA序列的封阻序列，但也可以不改变系统功能而独立地存在。可将该实施例进行修饰，即将重组酶序列借助一个病毒载体单独地导入。在另一个的实施方案中，优势的排列如下所述：含有第一个DNA序列的第一个植物，该DNA序列包括瞬时活化启动子，第一个特异切除信号序列，封阻序列，第二个特异切除信号序列，和其表达导致一个改变的植物表型的基因；含有第二个DNA序列的第二个植物，所述DNA序列包含一个可操作地连接到重组酶基因上的组成型植物活化启动子(两个植物杂交产生的子代含有所有上述序列)。

当一种植物含有任何一个实施例的基本元件时，其表达导致一个改变的植物表型的基因是不活化的，因为其是通过封阻序列与它的启动子相分隔的。在第一个实施方案中缺乏外部刺激，阻遏物是活化的并阻遏控制重组酶表达的启动子；在另一个可选择实施方案中，重组酶不与第一个DNA序列存在于同一植物中。这样一种植物将不显示改变的表型并将产生使所繁殖的植物也不显示改变表型的种子。当将阻遏物敏感的刺激物应用于这一种子或这种植物时，阻遏物不再有功能，使位点特异性重组酶表达，或者，当通过杂交将该重组酶导入时，它在种子发芽过程中被表达，这两者都导致在特异性切除信号序列间的封阻序列被去除。由于封阻序列的去除，瞬时活化启动子变成直接连接于其表达导致一个改变的植物表型的基因上。从处理的或杂交的种子生长的植物或者一个处理的植物，将仍然不展示改变的表型，直到瞬时活化启动子在植物发育过程中变成活化的，在这之后它所连接的基因被表达，植物才显示出改变的表型。

如本说明书中使用的，瞬时活化启动子是在植物发育的一个特定时期或在特定环境条件下是活化的任何启动子，并且在其他时期基本失活。

植物活化启动子是在一个感兴趣的植物细胞中是活化的任何启动子，植物活化启动子可以是病毒，细菌，真菌，动物或植物来源的。

导致产生一个改变的植物表型的基因是其表达导致植物显示一种或多种使之区别于不表达该基因的同种类植物的性状的任何基因。这种改变的表型的例子包括不同的生长习性，改变的花或果实的颜色或质量，过早开花或晚开花，增加或减少产量，不育性，死亡率，感病性，改变的次生代谢物的产生，或者改变的作物特性如气味或外观。

如果基因和启动子是在DNA的相同链上，在相同取向上，并且相对的定位是使启动子指导基因的转录(也即顺式)，则该基因和启动子就被认为是可操作地连接。启动子和基因之间存在插入DNA序列不排除可操作的关系。

封阻序列是阻止启动子指导靶基因表达的任何长度的DNA序列。

特异切除序列是一个由位点特异性重组酶所识别的DNA序列。

重组酶是识别一个特异切除序列或一套特异切除序列并导致特异切除序列间的DNA的去除或者改变特异切除序列间的DNA的一种酶。

阻遏物元件是一种作用为阻止另一个可表达基因的表达的基因产物。阻遏物元件可以包括蛋白质，RNA或DNA。

阻抑型启动子是一种被阻遏物元件所影响的启动子，以便使连接于阻抑型启动子的基因的转录被阻止。

在一个优选的实施例中，本发明涉及一种转基因植物或种子，所述种子在用外部刺激物处理后产生的植物所产生的种子不能萌发(但其它方面不改变)。如果瞬时活化启动子是只在胚胎发生晚期有活性，那么它所连接的基因将只在种子发育或成熟的最后阶段被表达。如果连接于该启动子上的基因是一个致死基因，它将使得该植物产生的种子不能萌发。在最初转化的植物细胞中，这一致死基因是不表达的，这不仅是由于该启动子本质上是不活化的，而且也因为存在一个把致死基因与它的启动子分开的封阻序列。同时在这些细胞的基因组内还包括连接到一个阻抑型启动子上的重组酶基因，和编码阻遏物的基因，该阻遏物呈组成型地表达并阻遏重组酶的表达。这些植物细胞可以再生为一个完整的植株并能够产生种子，成熟的种子接触一种刺激物，如一种化学试剂，便抑制了阻遏物的功能。由于阻遏物被抑制，驱动重组酶基因的启动子去阻遏并且重组酶基因被表达。所得到的重组酶识别侧接于封阻序列的特异切除序列，并导致封阻序列的去除，晚期胚胎发生启动子和致死基因就直接相连了。然而，由于启动子在植物生命循环的这个时期不是活化的，致死基因不表达。将这一种子种植，并生长产生一个所期望的植物的作物，由于作物成熟并产生第二代种子，晚期胚胎发生启动子变成活化的，致死基因在第二代种子成熟时被表达，从而使种子不能萌发。以这样的方式，可以避免偶然的重播种，作物逃脱到耕作面积以外的区域或者贮存种子萌发。

在另一个优选实施方案中，本发明涉及一对转基因植物，它们杂交能产生显示亲本中没有的表型的子代。在该优选实施方案中，只在晚期胚胎发生活化的瞬时活化启动子可以借助一个被特异切除序列在两端结合的封阻序列连接到致死基因上。将这些遗传序列导入到植物细胞，产生一个转基因亲本植物。将重组酶基因连接到一个萌发特异性启动子并导入另外的植物细胞产生第二个转基因亲本植物。如果第一个和第二个转基因亲本植物杂交，子代将既含有被阻遏的致死基因也含有重组酶基因。在种子萌发时重组酶被表达并导致封阻序列的去除，正如第一个实施例，从而直接将致死基因和瞬时活化启动子相连。正象在第一个实施例中，这个启动子在第二代种子成熟过程中变得有活性，导致种子不能萌发。理想的情况是，第一个亲本以一个雄性不育基因作为封阻序列，并包括一个除莠剂抗性基因。以这样的方式，避免了第一个转基因亲本植物的自花传粉。通过应用除莠剂可消除自花传粉的第二个转基因亲本植物，在杂交子代中，雄性不育基因由重组酶去除，导致产生能够自花传粉的杂交子代。

在另一个实施例中，将重组酶基因连接到一个可诱导的启动子上。这样的启动子的例子包括铜，可控制的基因表达系统(Mett et.al.，1993)和甾类化合物诱导的基因系统(Schena et al.，1991)。把转基因植物与特异于诱导型启动子的诱导物相接触导致重组酶基因的表达和封阻序列的切除。当瞬时活化启动子变得有活性时导致一种改变的植物表型的基因被表达。

可以利用任何合适的瞬时活化启动子，选择一个合适的启动子必须考虑植物类型和寻求控制的表型性状。优选地，瞬时活化启动子不是一个“渗漏型”启动子，意思是它基本上只在一个规定好的植物生长阶段或特殊的环境条件下有活性，并在所有其他时期基本没活性。这一性质阻止了系统的未成熟“触发”。已有大量已公开的瞬时活化启动子的例子，它们可用于本系统。选择一个合适的启动子原则上考虑的是植物生命时期在此时期希望有改变的表型表达。如果期望在第一代后有该表型表达，优选的是在种子产生期间是活化的启动子，因为它在第一代植物生长的营养期将不活化。如果期望在第一代本身的某些时候有改变的表型表达，一个在较早期是活化的启动子是合适的。对本领域内熟练技术人员来说显而易见的是，在那些应用阻抑型启动子系统的实施例中，对植物应用外部刺触来激发系统的时间应该早于对于预期显示改变的表型的植物的世代，所选择的瞬时活化启动子是活化的时期。如果期望在第一代之后出现改变的表型，则一个在胚胎发生晚期活化的启动子，如LEA启动子，Hughes和Galau，1989和1991，Galau，et al.1991，1992和1993是理想的，因为该启动子仅在第一代植物完成一个营养生长季节之后，在种子中形成胚胎时活化(胚胎发生最终是在大多数其它果实和种子结构形成之后的种子形成的最后时期)。

连接到植物发育启动子上一个或多个基因可以是其表达导致产生一个所期望的可检测的表型的任何基因。该表型可以是在一种情况下一种植物所期望的任何一种性状，而在另一情况下不希望出现的性状，如雄性不育，干旱抗性，昆虫抗性，早或晚种子萌发或早或晚开花。通常一种植物可以拥有在某些条件下或以某些方式是有利的但是对植物有一定代价的性状。例如，具昆虫抗性的性状可能涉及以植物的一定的代谢消耗产生次生植物代谢物或结构。这在存在害虫的环境是有利的，而在不存在害虫时基本上是一个不必要的负担。另一个例子是一年生瓜果作物的种子的生产，如西瓜。显然，至少一代植物产生种子是必要的，所以一个种子公司可以生产种子，销售给种植者，但是从那样的种子生长的无籽瓜果作物是商业上需要的。还有另一个例子是在谷类作物中使种子容易而快速萌发的性状，以最小的努力尽可能快地长成一种作物是有利的，但是如果它导致所收获的谷物在谷物包里萌发却是非常令人不满意的。还有一个例子是在一个地方或季节是合乎需要的植物(象一种冬季饲料)，但是在另一地方被当作杂草。如果第二代种子不能萌发，那么就可防止收获后的萌发，防止植物通过自然的种子散布“逃脱”进入不期望的位置，或者防止偶然的再播种。较有利的是这最后两个例子可以利用致死基因(即一个其表达在一定程度上干扰植物生长或发育的基因)，以使第二代种子不萌发，或者最后的例子中可以采用任何导入能降低植物活力象易感病性，早开花，低种子生产或无籽的性状的基因。核糖体抑制蛋白(“RIP”)基因是一种优选的致死基因，皂草素6 RIP(GenBank IDSOSAPG，Accession NO.X15655)是特别优选的。RIP直接干扰植物细胞中所有蛋白质的表达，而对其他有机体没有毒性。RIP在胚细胞中的表达将完全阻止种子的萌发。

封阻序列可以是任何阻止连接到瞬时活化启动子上的基因的表达的序列，例如终止信号，但在那些利用阻抑型启动子的实施例中优选的是编码阻遏物的序列。以这样的方式，当封阻序列被切除，阻遏物基因就被消除，从而进一步使后期抑制该系统的机会降到最小。在杂交实施例中，优选的是，封阻序列是一个产生雄性不育性的基因(如连接到一个花药特异性启动子上的致死基因)。以这样的方式，杂交便容易进行，但是封阻序列被重组酶去除时，杂交子代将能自花授粉。

在那些利用阻抑型启动子系统的实施例中，编码阻遏物的基因对外部刺激敏感，或编码本身对一种外部刺激敏感的阻遏物元件，以便阻遏物功能可以受外部刺激所控制。这种刺激物优选的是通常不与植物接触的刺激物，例如一种特定的化学物质，温度休克，或渗透休克。以这样的方式，简单地利用刺激物将封阻重组酶的阻遏，当然会存在阻遏物被偶然封阻的低可能性。如果阻遏物对一种化学刺激物敏感，那么这种化学物质较好的是对作物和非害虫动物非毒性的。一种优选的系统是Tn10tet阻遏物系统，它对四环素敏感，见Gatz和Quail(1988)；Gatz，et al(1992)。在这个系统中，利用一种含有一个或多个，优选三个tet操纵子的经修饰的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子；Tn10 tet阻遏物基因产生一个结合于tet操纵子的阻遏物蛋白并阻止了该启动子所连接的基因的表达。四环素的存在抑制了Tn10tet阻遏物结合到tet操纵子上，使连接的基因自由表达。由于刺激物四环素不是一种植物正常接触的物质，所以这个系统是优选的，这样它的运用是可以控制的。同时，由于四环素对植物或动物无有害影响，它的存在将不妨碍植物的正常生长发育，并且处理后在种子或植物中的残留量将不会显著地影响环境。其他阻抑型启动子系统的例子由Lanzer和Bujard(1988)和Ptashne等人所描述。

重组酶/切除序列系统可以是任何在植物基因组中有选择地去除DNA的系统。切除序列优选地在植物中是唯一的，从而不会发生植物基因组中不期望发生的切割。这样的系统的几个例子由Sauer，U.S.专利4,959,317和Sadowski(1993)所讨论。一种优选的系统是细菌噬菌体CRE/LOX系统，其中CRE蛋白的作用为在LOX位点进行DNA位点特异重组。其他系统包括解离酶(Hall 1993)，FLP(Pan.et al：1993)，SSV1编码的整合酶(Muskhekishvili，et al.1993)，和玉米Ac/Ds转座子系统(Shen和Hohn，1992)。

用于靶植物实际转化的方法对本发明不是关键。植物的转化优选的是永久的，例如：通过在植物基因组中整合导入的序列，以使导入的序列通过连续的植物繁殖而传递。有许多本领域内技术人员所熟知的植物转化技术，并且新技术接连变得已知了，任何适合于靶植物的技术都可以用于本发明。例如：可以以各种形式导入序列，如一条DNA链，在质粒中或在人工染色体中。序列导入到靶植物细胞可以通过许多技术完成，例如磷酸钙DNA共沉淀，电穿孔，显微注射，土壤杆菌感染，脂质体或微射弹转化。本领域内普通技术人员熟知的技术可以参考文献得到详情，并不需要过分的实验。

可用许多方法将重组酶基因导入到转基因植物中。该基因可以和所有其它基本序列一起导入，如在上述的第一个优选的实施例中。阻抑型启动子/重组酶构建体还可以直接借助一个病毒载体导入含有该系统的其它序列组分的转基因植物。将所有必需序列导入一个单一植物的其他方法是上述的第二个优选的实施例，包括含有瞬时活化启动子/结构基因序列和封阻序列的第一个转基因植物，和包含连接到一个萌发特异性植物活化启动子上的重组酶基因的第二个转基因植物，两种植物用常规方法杂交产生含有所有必需序列的杂交子代。

也可将重组酶以与一种化合物例如生物素的共轭物的形式直接导入到一种转基因植物中，该共轭物被转送到细胞中，见Horn，et al.(1990)。

用于将转化细胞再生成整个植株的方法对本发明不是关键的，并且可以使用任何对靶植物合适的方法。文献中描述了许多用于再生特定植物类型的技术(如，通过体细胞胚胎发生，Umbeck，et al.1987)，更多的技术正在变成已知的，本领域内普通技术人员熟知的技术可以参考文献获得详情并选择合适的技术而不需要过分的实验。

本发明可以用来制备各种转基因植物。该方法特别适用于由种子种成的一年生作物植物。这些植物包括，但不限于，纤维作物如棉花和亚麻；双子叶种子作物如大豆，向日葵和花生，一年生观赏花植物；单子叶谷类作物如玉米，小麦和高粱；叶子类作物如烟草；蔬菜类作物如莴苣，胡萝卜，花茎甘蓝，卷心菜和花椰菜；和蔬果料作物如西红柿，小西葫芦，西瓜，甜瓜和南瓜。

下面的例子用于阐明，但不限制所要求的发明。

实施例1

致死(RIP)编码序列的选择

目前存在有两类生物技术上相关的编码蛋白质的基因，当它们在植物细胞中表达时导致细胞死亡。这些类别是1：核酸酶；例如芽孢杆菌RNA酶(Barnase)和核糖核酸酶A和2：催化致死蛋白；例如：白喉毒素和核糖体抑制蛋白(RIP)。如果基因是在组织或细胞特异性转录启动子的控制下，则可将来自于任何一类的蛋白质(或者任何细胞毒素蛋白质，或由这样一种蛋白质酶促产生的产物)成功地用于特异性细胞类型的遗传脱离(ablation)。为了检测烟草中的各种保护系统的效能，编码任何已知的致死基因的序列是合适的。由于这些蛋白质可以影响种子，致死基因表达的靶组织的最终质量，在商品棉花中只有某些选择的致死基因可以利用。核糖体抑制蛋白(该蛋白质应该是在脏器中敏感于蛋白酶抑制的)和核酸酶很可能是在棉花种子中表达的候选物。如果种子不是作物商业价值的一个因素(例如：饲料作物，观赏作物或为花工业培养的植物)任何致死基因应该都可接受。在我们的实施例中我们已经选择核糖体抑制蛋白(RIP)皂草素和芽孢杆菌RNA酶(来自于解淀粉芽孢杆菌)作为在种子发育后期表达的细胞致死蛋白。

RIP编码序列(CDS)在其5’末端(前RIP蛋白的N-末端)含有一个75个碱基对长的转运信号序列。成熟的RIP的编码序列起源于一个如Barthelemy等人(1993)所描述的从Saponaria officinalis子cDNA文库中分离得到的cDNA克隆，信号序列来源于一个完整的RIP基因，皂草素6(GenBank ID SOSAP6，入藏号X15655)的序列。将编码信号序列的核苷酸与编码成熟编码区连接的构建体作为一个EcoRI片段克隆到通用克隆载体pBluescriptIIKS+(Stratagene)。该构建体被命名为Del3。修饰这个序列来构建含有起始于ATG密码子但是去除编码信号序列的核苷酸的成熟的RIP编码区的第二个质粒。这个构建体命名为Del1。Del3编码带有信号序列的RIP，其表达时导致蛋白质从细胞中分泌出来，但不导致细胞死亡，所以用作系统的一个可检测的对照。Del1编码一个当其表达时保留在细胞质中并因此是细胞毒素的RIP。

为了制备用于特异性启动子融合构建体的RIP构建体(Del1和Del3)，将一个NcoI位点导入在两个RIP序列的每一个5引导末端的5′ATG序列中。这通过利用PCR诱变获得。带有在RIP序列中产生NcoI位点的突变并跨越pBluescript IIKS+质粒的多克隆位点部分的引物的3′-GAAGTAGTGATCGGTACCAGTGTAGTT-5′(用于Del1)和3′-GTAGTGATCGGTACCTCTATATACAACATCG-5′(用于Del3)与针对RIP序列下游的pBluescript序列的引物一起使用。将通过PCR产生的突变的RIP序列，Del1NcoDel3Nco分别单独地直接克隆到载体pCRII(InVitrogen)得到源载体，pDel1Nco和pDel3Nco。完整的RIP序列可以从这些构建体中分离，作为RIP盒亚克隆到启动子构建体。

实施例2

Lea(晚期胚胎发生高丰度)启动子的分离和诱变

用于此实施例中的Lea启动子来自于两种Lea基因，Lea4A和Lea14。这些启动子的选择取决于他们的表达特征，如Hughes和Galat，1989和1991，Galau et al 1991，1992和1993所报道的，在胚胎发生过程中和在成熟的植物组织中，在棉花品种Coker20l中的转录物积累水平的时间，和已公开基因序列的可用性.(GenBank)。两个基因在种子发育后期被表达并在成熟组织中似乎不脱落酸受控于植物激素脱落酸(ABA)。每个基因的启动子序列是通过利用跨越Lea蛋白质编码区的5′末端到每个启动子的转译起始位点上游大约2000碱基处的序列的嵌套引物，经PCR从Coker 201基因组DNA产生而来的。对于Lea 4A，外部引物是在位置-2043(碱基1＝ATG的A)，5′-CCCCTCCTATGACCAAGTTACC-3′和+279，5′-CCCTTCAGTTCCTAGTTGTTGC-3′，内部引物是在位置-2018，5′-GCTCCAAACGAGTTGACTTTGAC-3′和+258，5-ACTTTGTGCCTCCCTTTTCATC-3′。对于Lea14，外部引物是在位置-2113，5′CTAACTCCTCTTCTCAGGCAAATG-3′和+342，5′-TTGTGTCGCTGTCTTTCAATG-3′，并且内部引物是在位置-1846，5′TCAGCTCGTCTGCTTCATACCAAC-3′和+172，5′-CAAATGGGGATGGAATGGCTGTAG-3′。在两种情况下，初级扩增反应利用外部引物来完成，并从这个反应的产物中，利用内部引物对从次级反应中分离得到最后的启动子片段。将Lea4A诱变的最后产物克隆到pCRII，将Lea14产物克隆到pBluescript IIKS+，以产生Lea启动子源质粒pCLea4p和pKSLea14p。

为了克隆的目的(也即将启动子连接到RIP序列，以便将来自Lea启动子片段的5′-未转译前导序列直接连接到RIP编码序列的ATG)，利用诱变引物PCR使lea启动子片段突变以便在5′前导序列的末端产生NcoI位点。利用上游内部引物和新诱变的引物，通过PCR合成lea启动子片段并克隆到pCRII以便产生突变的Lea启动子源质粒pCmLea4p和pCmLea14p。与相应的上游内部引物一起应用的诱变引物对于Lea4A为5′-CTCTGACGCCATGGTTCTTCTTGC-3′，对于Lea14为5′-CCAACAACTGCGCCATGGCGTACAAAGTC-3′。

实施例3

利用Lea启动子和RIP构建致死基因

3.1 编码区

将含有每个突变Lea启动子片段和每个RIP编码区结构的嵌合部分基因组装并置于贮用载体pBluescript，然后克隆进入一个植物转化中间载体。对Lea4-Del1和Del3联合体，从pCmLea4p中分离得到SalI/NcoI片段形式的Lea4启动子片段并连接到用同样两种酶切割的pDel 1Nco和pDel3Nco。这产生了Lea4嵌合基因源质粒pCmLea4Del 1和pCmLea4Del3。为了克隆，SalI片段形式的Lea4-Del1和Del3盒是可去除的。Del1和Del3裂缝(rip)序列可通过用NcoI和XbaI限制酶消化从pDel1Nco和pDel3Nco中分离得到并连接到用同样两种酶切割的突变的Lea14 pBluescript结构中。这产生了Lea14嵌合部分基因源质粒pKSmLea14Del1和pKSmLea14Del3。

为了产生完整的LeaRip基因，将含有一个多聚腺苷酸化位点和一个转录终止序列(3′终止子)的3′非翻译区加到RIP编码序列的3′末端。对于所有构建体这可通过将一个含有来自基因7的3′终止区序列盒(根瘤土壤细菌章鱼碱T-左区)和一个庆大霉素抗性基因(以使植物转化能够利用各种各样的土壤细菌菌株和双载体系统)装配来完成。gene7Term/庆大霉素盒可通过将一个来自含有基因7序列的pAP2034(Velten和Schell，1985)的EcoRI-SalI片段亚克隆到pBluescriptKS+来产生pg7KS质粒来构建。将来自pTC182(Charles和Nester，1993)的庆大霉素抗性盒的PstI片段插入基因73′-终止区序列下游的PstI位点来产生质粒pg7KSGm。

3.2 将嵌合基因导入一个植物转化中间载体和根瘤土壤杆菌

对于Lea4启动子RIP构建物，在Lea4启动子/RIP编码区已经以一个EcoRI片段形式克隆到中间载体(双性)pBin19之后，在SmaI-XbaI位点的RIP编码序列紧接着的下游导入SalI：填充的XbaI片段形式的gene7Term/庆大霉素盒。这个过程产生了质粒pBLea4Del1g7Gm和pBLea4Del3g7Gm。

对于Lea14启动子RIP构建物，在pKSmLea14Del1和pKSmLea14Del3的RIP编码序列紧接下游的EcoRV和XbaI位点导入SalI：填充XbaI片段形式基因7Term/庆大霉素盒。从这些构建体中，将完整的基因构建体加庆大霉素抗性标记以一个SalI-XbaI片段形式切下并克隆到中间载体(二性)pBin19多克隆位点的SalI和XbaI位点。这个过程产生了质粒pBLea14Del1g7Gm和pBLea14Del3g7Gm。

正如Walker Peach和Velten(1994)所述的，通过直接转化，将这些构建体个别地导入二种根瘤土壤杆菌菌株，EHA101(Hood et al，(1986)和GV3850(Van Haute et al.1983)。然后通过土壤细菌转染，通过一个标准的叶片转化过程将这些构建体导入烟草Nicotiana benthemiana(Horsch et al.1985)。并通过一个下胚轴转化过程导入棉花并借助体细胞胚胎发生过程再生(Umbeck et al(1987)。

选择那些成功地生长到成熟，开花和产生种子的植物作为以正确方式表达Lea RIP基因的植物。然而带有Lea RIP嵌合基因的种子不能萌发。这些植物将用于完全保护系统中验证RIP的效率和Lea启动子的发育控制。如果启动子证明有渗漏并引起在成熟之前或种子成熟早期植物或植物组织的成熟前死亡，那么启动子可以被诱变或减少为在种子成熟的正确时间严格表达的一个序列。

3.3 非渗漏基因构建体的选择

非渗漏Lea启动子是通过在RIP编码区附着之前即通过用只含有Lea启动子的质粒pCmLea4p或pCmLea14p进行Lea4或Lea14启动子的诱变来获得的。诱变是以几种方法中的一种获得的；通过随机的方法通过利用多义引物集合的PCR方法(如由Zhao et al 1993所描述)，或者是通过利用与诱变引物一起使用的内切酶抗性的α-thio链进行位点特异性诱变的方法(Olsen et al.1993)。正如Botstein et al 1985所述，还可将Lea启动子亚克隆到一个M13基础的载体，以便生产单链DNA，以该DNA作为底物，利用二亚硫酸钠进行随机化学诱变。

诱变之后，Lea启动子的群体被分离并被亚克隆到一个pBin19中间转化载体，从而产生一个突变Lea启动子RIP/g7Term嵌合基因构建体的群体，按照Peach和Velten(1994)所描述的方法；采用直接转化将它们导入合适的根瘤土壤杆菌(EHA101)菌株，得到的细菌培养物用作为接种物，用于转化烟草。利用RIP作为可筛选的遗传标记简化了从突变群体导找一个非渗漏的Lea启动子的过程，其中如果一个转基因植物能够再生到成熟并从自身受精产生75％不能发育的种子那么它一定带有一个Lea启动子的非渗漏译本。通过将植物生长过程中从用作样品的叶子中分离得到的DNA进行PCR(利用已经获得的Lea引物)来回收突变启动子，然后将这样一个突变启动子用于构建用于烟草和棉花的完全系统。

实施例4

由35S启动子驱动的tet阻遏物基因的构建

来自Tn10的四环素阻遏物基因的编码序列可通过将含有附加体F′，lacqZ△M15，proAB，Tn10(tetr)的一个E.coli细胞系中分离得到的总DNA进行PCR扩增分离得到。合成一组嵌套的PCR引物，即两个外部和两个内部引物，以达到分离。5′内部引物含有一个导致产生唯一的限制位点(BglII)的突变，有利于将阻遏物片段克隆到一个合适的载体。所用的外部引物是1)5′外部引物5′-GCAAGCAATACGCCAAAGTG-3′，来自于-234到-214(+1在ATG)位置，2)3′外部引物5′-GTCAACAGCAATGGATCACTGAA-3′，来自于位置+859到+882(终止密码子是在+621)。所用的内部引物是1)5′突变内部引物(含有一个在-2的BglII位点)5′-CAAAATTAGGAAGATCTGATGTCTAGATTAG-5′，来自位置-19到+13，和2)3′内部突变引物5′-AGTGAACGCCGTTTCCATTTAGG-3′，来自位置+731到+754。在利用内部引物组的第二次循环之后获得的PCR片段被克隆进入pCRII来制备四环素阻遏物CDS源质粒pCtetR。

为了产生一个被CaMV35S启动子驱动的完整的嵌合四环素阻遏物基因，将四环素阻遏物CDS以一个BglII(在-2)-EcoRI(在+682)片段形式从pCtetR中移出并克隆在质料pGG的BglII-EcoRI之间(Sutton et al，1992)。从而将四环素阻遏物CDS置于一个短的35S启动子AMV5′前导融合体和一个NOS3′终止序列之间来制备一个全长嵌合的四环素阻遏物基因。将得到的源质粒命名为pGGtetRl。为了重新构建完整长度的35S启动子，一个EcoRV到Sal I片段(含有35S启动子的116bp，AMV前导区，四环素阻遏物和NOS3′终止信号)被移到pMM23(Qin et al，1994)来制备pMM23tetR2。

将完整35S-AMV5′-tetR CDS-NOS3′Term基因以一个BamHI(NOS3′Term3′末端)-HindIII(35S启动子的5′末端)片段形式从pMM3tetR2中切下并在多克隆位点的BamHI和HindIII位点克隆到中间载体(二性的)pBin19来产生pBintet1。将这个构建物导入根癌土壤细菌的二个菌株EHA101和GV3850(如上所述)。为了在植物研究中评价在我们的构建体中四环素阻遏物的活性和四环素阻遏35S启动子的效率，利用一个标准叶片转化过程(Horsch et al，1985)通过土壤细菌转染将这些构建体导入烟草种类Nicotiana benthemiana。这通过下面的过程来实现，tet操纵基因修饰的35S启动子被用于代替在植物功能GUS质粒pBI221(Clonetech实验室Inc.)中的野生型35S启动子。将得到的Op35S→GUS→NOS3′基因按照Nunberg和Thomas(1993)描述的方法电击到转基因烟草细胞系中表达tetR基因(内标是一个野生型35S→Lux构建体)。活性的四环素阻遏将减少或消除电击后的原生质体中的GUS活性(相对于Lux)

实施例5

在四环素去阻遏35S启动子控制下的CRE基因的构建

如Gatz et al.(1992)描述，将在同一位点含有三个tet操纵基因序列的一个35S启动子构建为一个在5′末端含有一个EcoRV位点和在3′末端为互补于XbaI5’突出端的3’突出端的双链连接体形式。通过以一个步骤融合的方式将下面两个寡聚核苷酸退火而构建该连接体：

(按5′-3′描述)1：ATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCC-

CACTCTATCAGTGATAGAGTGTATATAAGACTCTATCAGTGATAGAGTGAACTC-

TATCAGTGATAGAGTTAACGGTACCT and 2：CTAGAGGTACCGTTAACTCTA-

TCACTGATAGAGTTCACTCTATCACTGATAGAGTCTTATATACACTCTATCACT-

GATAGAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGAT

将来自pMM23的完整35S启动子以HindIII到XbaI片段形式亚克隆到HindIII和XbaI所切割的pBluescriptKS质粒来产生pBSK35S。将35S启动子/3tet操纵基因连接体克隆进入这个质粒的未修饰的35启动子内的EcoRV和XbaI位点之间从而产生pBSK35S3O。含有这三个tet操纵基因位点的整个35S启动子以HindIII到XbaI片段的形式从这个质粒中分离并亚克隆回到pMM23来产生pMM23tet3O，这个质粒因而含有了一个由35Stet操纵基因启动子和NOS3′终止区序列所侧接的CRE编码序列。

完整的四环素可阻遏CRE嵌合基因以HindIII到SalI片段形式从pMM23tet3O中分离并克隆到中间载体(二性)pBin19的多克隆位点中的SalI和HindIII位点来产生pBin35S3OCRE。将这个构建体导入两种根癌土壤细菌的菌株EHA101和GV3850(如上所述)。然后将这个构建体通过一个标准叶片转化过程，(Horsch et al.，1985)，借助于土壤细菌感染导入烟草种类Nicotiana benthemiana。来自这个构建体的CRE蛋白的表达以三种方式进行检测；以CRE抗体免疫学测定CRE蛋白在转化体中的水平；按照Sauer 1993所描述生化方法利用一个体外测定检测CRE活性，或者第三，将一个表达可筛选酶活性的试验质粒通过电击穿方法(Nunberg和Thomas 1993)直接地进入原生质体内(来自CRE被表达的任何植物，即对于后来的构建体)。作为一个例子我们将一个LOX-tetR-LOX盒导入35S启动子和GUSCDS之间的pBI221的BamHI位点(Clonetech实验室Inc.)并筛选使tet R的NOS3′和pBI221的35S启动子成一线的取向。CRE活性将移去P35S和GUS之间的LOX-tetr-LOX块，激活GUS转录并因而产生可检测的GUS活性。那些以高水平表达活性CRE蛋白质的烟草植物可用于进行杂交来建立烟草中的完整的可切割-可阻遏的保护系统。

这个构建体也可以如Umbeck et al1987描述的方法通过下胚轴/土壤细菌转化过程导入棉花和通过体细胞胚胎发生进行再生，这将产生作为CRE供体的棉花植物以在棉花中建立完整的可切割可阻遏的保护系统。同样如所描述的测定烟草方法测定棉花的CRE表达。

实施例6

将被阻遏的致死基因导入烟草和棉花6.1将LOXL封阻序列加到Lea启动子和RIP致死基因构建体

LOX位点仅可以一个方向用于这种类型的构建体，因为在一种方向他们的导入将两个ATG密码子导入嵌合基因中的5′非转译前导序列，该嵌合基因暴露于CRE蛋白之后将不被切割。在一个5′-非翻译前导序列中的这样的ATG密码子将抑制转录mRNA的转译，因而减少所期望的产物，在这个例子中是RIP，的水平。另外，由于期望把封阻序列放在几个不同启动子-CDS构建体的5′非转译前导序列中，令人满意的是将它克隆进入在所有构建体的CDS的起始处的普通NcoI位点。这会导致在封阻序列克隆和切除之后，将另一个ATG序列也导入这个区域，所以一个导入的LOX连接体的5′末端的NcoI序列必须是在切割和除去之后额外的ATG不被导入该序列的序列。因而合成了下面的NcoI连接体以制备一个通过一系列不对称限制性位点从RIP编码序列分离而来的Lea启动子，以便以一个指定的取向导入LOX位点和封阻序列，并消除一个额外ATG序列导入的问题。连接体序列是：上链5′-CATGTCTTCGAATTCGCCAC-3′，下链5′-CATGGTGGCGAATTCGAAGA-3′。在寡聚核苷酸退火之后，该连接体有5′和3′末端的NcoI特异性突出端，在中央的一个EcoRI位点和一个BbsI位点(补偿切割)，该位点将除去过量的NcoI位点，在导入的LOX位点的CRE指导的切割过程中产生了过量NcoI位点。

全长的Lea启动子/可切割填充片段(LOX-35S-tetR-g7-LOX)/RIP-Nos3′构建体的构建由于其大小和在Lea启动子中的不同位点变得更复杂化。下面的例子描述了Lea4和Lea14启动子系统的构建，但是，同样的方法可以用于所有可能的能用于完全系统中的Lea或其它启动子。6.1.1 Lea14-LOXL-Nos3′-tetR-35S-LOXR-RIP-g7构建体的组装

通过PstI消化从pKSmLea14Del1g7Gm中去除庆大霉素抗性盒、片段纯化和随后的连接，获得了一个起始质粒pKSmLea14Del1g7。然后将此质粒用NcoI进行切割(在预先置于Lea14启动子和Del1 CDS之间的单一NcoI位点切割)并在一个上述的含有过量NcoI连接体的连接反应中用作载体源来产生pKSmLea14NcoIadDel1g7。NcoI连接体的成功导入通过EcoRI消化进行检测并采用序列分析证明。这个质粒用BbsI和BamHI消化以移去Del1/g7区并产生一个载体-Lea14启动子BbsI/BamHI片段，该片段经凝胶纯化后为LOXL(5′切除序列)连接体的一个靶。

通过将两条合成的寡聚核苷酸：上链：5′-CGCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATG-3′，下链：5′-GATCCATAACTTCGTTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3′退火构建用于融合Lea14启动子的一个LOXL连接体。这个连接体退火后产生一个BbsI特异性5′突出端和一个BamHI3′特异性突出端。将LOXL(Lea14)连接体连接到载体-Lea14启动子BbsI/BamHI片段以产生源质粒pKSmLea14LOXL。

用NcoI和HindIII消化起始质粒pKSmLea14Del1g7以去除Lea14启动子并产生一个Del1/g7NcoI/HindIII片段，该片段经凝胶纯化为LOXR(3′切除序列)连接体的靶。

通过将两条合成的寡聚核苷酸：上链；5′-AGCTTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCAC-3′，下链；5′-CATGGTGGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATA-3′退火而构建用于融合到Del 1 CDS上的LOXR连接体。一旦退火这个连接体即产生一个HindIII特异性5′突出端和一个NcoI3′特异性突出端。将LOXR连接体连接到Del1/g7 NcoI/HindIII片段以产生源质粒pKSLOXRDel1g7。

通过来源于前面提到的源质粒的凝胶纯化片段的三片段连接将最后的构建体，Leal4-LOXL-Nos3′-tetR-35S-LOXR-RIP-g7组装在pBluescriptIIKS+载体上。三个片段如下；1.一个来自于含有全长35S-AMV5′tetRCDS-Nos3′Term基因的pMM23tetR2的BamHI/HindIII片段；2.一个来自含有完整的LOXR-Del1-g7序列的pKSLOXRDel1g7的HindIII/SacI片段；3.一个来自含有完整Bluescript IIKS+载体和Lea14启动子-LOXL序列的pKSmLea14LOXL的BamHI/.SacI片段。连接反应产生源质粒pKSmLea14LOXLNos3′tetR35SLOXRDel1g7。

全长的Lea14LOXLNos3′tetR35SLOXRDel1g7构建体以SmaI/SalI片段形式从p pKSmLea14LOXLNos3′tetR35SLOXRDel1g7中切下，并克隆进入中间载体(二元的)pBin19的多克隆区的SmaI和SalI位点以产生pBmLea14LOXLNos3′tetR35 SLOXRDel1g7，将此构建体导入根瘤土壤细菌的GV3850菌株。然后通过一个标准叶片转化过程(Horsch et al.1985)通过土壤细菌转染将这个构建体导入烟草种类Nicotiana benthemiana。对于棉花转化，优选使用土壤细菌菌株EHA101，然而由于此土壤细菌菌株携带了一个卡那霉素抗生素标记，所以使用卡那霉素的筛选含有带有它自己的卡那霉素抗性基因的pBmLea14LOXLNos3′tetR35SLOXRDel1g7转化的EHA101变得复杂，因为确实不含质粒的土壤细菌细胞也能在抗生素处理中存活。为了筛选仅含有pBmLa14LOXLNos3′tet35SLOXRDel1g7的土壤细菌细胞，将一个庆大霉素抗性基因(Gm)盒导入这个质粒，方便地是作为一个PstI片段导入。因而含有pBmLea14LOXLNos3′tetR35SLOXRDel1g7Gm的转化的土壤细菌细胞是通过庆大霉素处理而进行筛选。6.1.2 Lea4-LOXL-Nos3′-tetR-35S-LOXR-RIP-g7构建体的组装

通过将一个EcoRI片段形式的来自pCmLea4的突变的Lea4启动子亚克隆进入pBluescript IIKS+，获得一个起始质粒pKSmLea4。将这个质粒然后用NcoI(切割位于预先置于Lea14启动子和Del 1 CDS之间的单一NcoI位点)切割，并用作含有一个上述的过量的NcoI连接体的一个连接反应中的载体源，产生pKSmLea4NcoIad。NcoI连接体的成功的导入可通过EcoRI消化测试并可以采用序列分析证明。从这个质粒中以EcoRI片段形式切下突变的Lea4启动子/NcoI连接体序列，并克隆进入pUC18的EcoRI位点(以在突变Lea4启动子的5′末端导入一个BamHI位点)以产生源质粒pUC18mLea4Ncoad。将这个质粒用BbsI和BamHI消化产生载体-Lea4启动子BbsI/BamHI片段，所述片段经凝胶纯化作为LOXL连接体的靶。

通过将两条合成的低聚核苷酸，上链；5′-AACCATAACTTCGATATAGCATACATTATACGAAGTTATG-3′，下链；5′-GATCCATAACTTCGTTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3′退火，构建一个用于融合到Lea4启动子的LOXL连接体，一旦退火该连接体即产生一个BbsI特异的5′突出端和一个BanHI特异3′突出端。将此LOXL(Lea4)连接体连接到载体-Lea4启动子BbsI/BamHi片段来产生源质粒pUC18mLea4LOXL。

最后的构建体，Lea4-LOXL-Nos3′-tetR-35S-LOXR-RIP-g7通过将来源于前面提到的源质粒的凝胶纯化片段的三片段连接而组装在pUC18载体上。三个片段如下；1.一个来自含有全长的35S-AMV5′-tetR CDS-Nos3′Term基因的pMM23tetR2的BamHI/HindIII片段；2.一个来自含有完整的LOXR-Del1-g7序列的pKSLOXRDel1g7的HindIII/PstI片段；和3.一个来自含有完整的pUC18载体和Lea4启动子-LOXL序列的pUC18mLea4LOXL的BamHI/PstI片段。这个连接反应产生源质粒pUC18mLea4LOXLNos3′tetR35SLOXRDel1g7。

全长的Lea4LOXLNos3′tetR35SLOXRDel1g7构建体以SmaI/SalI片段形式从pPKSmLea4LOXLNos3’tetR35SLOXRDel1g7中移去并克隆进入中间载体(二元的)pBin19的多克隆区的SmaI和SalI位点来产生pBmLea4LOXLNos3′tetR35SLOXRDel1g7。将这个构建体导入根癌土壤细菌的GV3850菌株。通过一个标准叶片转化过程(Horschetal.，1985)，通过土壤细菌转染将构建体导入烟草种类Nicotiana bentbemiara。同样，对于棉花转化，如果用到EHA101，那么为了转化的土壤细菌的选择方便，将一个庆大霉素抗性基因盒插入pBmLea4LOXLNos3′tetR35SLOXRDel1g7。

实施例7

带有功能系统的整个植株的产生

将含有活性表达四环素阻遏物的Lea4启动子-LOX-35StetRCDS-Nos3′末端-NcoI位点-RIP CDS-g7Term-Gm构建体并证实含有所有构建体成分的转基因烟草植物与受含有三个tet操纵基因序列的35S启动子控制表达CRE蛋白质的植物杂交。含有完整系统也即，含有Lea4启动子-LOX-35Stet R CDS-Nos3′末端-NcoI位点-RIP CDS-g7Term-Gm和35StetO-CRE的子代将生长至成熟。含有这些构建体的子代的筛选根据他们对卡那霉素和庆大霉素的抗性，四环素阻遏物的表达，他们的CRE的不表达但存在35S3TetO-CRE嵌合基因和通过带有合适引物的PCR而证明系统所有其它组份来进行。含有完整系统的转基因棉花植物将以和烟草同样的方法或者通过含有带有pBin35S3OCRE的Lea4启动子-LOX-35StetR CDS-Nos3′末端-NcoI位点-RIP CDS-g7Term-Gm构建体植物的再转化而再生。

实施例8

通过四环素切除激活来产生活性的Lea启动子RIP嵌合基因

通过利用四环素通过以几种方法中的一种进行外源处理，通过与四环素形成复合物释放四环素阻遏物来激活35S3tetO-CRE嵌合基因。首先转基因烟草或棉花的种子可以在一个四环素的水溶液中吸胀，顶端分生组织和/或总芽可以喷洒一种四环素的水溶液，或者四环素可以通过根系统直接地导入。在所有的情况下激活所需的四环素的浓度是低的，恒定应用0.01到2mg/l，证明在烟草中对四环素阻遏物阻遏的启动子的诱导是有效的(Roderetal1994，Gatzetal 1991，1992，和1Gatz和Quail，1998)。这一抗生素的水平具有的优点是对这样处理的植物所生长的环境的影响是可忽视的。在上述所讨论的例子中，目的是通过在含有四环素的溶液中棉花和烟草种子的吸胀来诱导该系统。在两种情况中需选择四环素浓度来达到效率最大但可能的抗生素的环境积累最小。已证明最大量可以为5mg/l(这是在漂浮烟草叶片上显示有效激活系统的浓度)。由于我们只把种子暴露于抗生素短时间来完成吸胀，在这之后将清除种子表面残留的四环素(进一步减少对种植的生长环境的可能的污染)，所以需要较高的浓度。

吸胀四环素的靶细胞是增殖的顶端分生组织细胞的L2层。通过在这些细胞中驱动CRE表达的35S3tetO启动子的去阻遏诱导该系统将保证所有未来种系的细胞将含有可表达的Lea-RIP嵌合基因，因而使来自不能萌发的处理种子的植物得到所有成熟种子。我们在棉花中已经证明种子吸胀和四环素是类似的大小和复杂性的溶于5％DMSO溶液中的活性染料Terta Zolium红，确实成功地渗透进入发育胚的所有细胞并真正地贯穿种子的所有组织。我们目前正在利用吸胀一种四环素溶液测试表达四环素阻遏物蛋白并含有一个35S3tetO启动子控制下的细菌β-葡糖醛酸酶CDS(GUS)的转基因烟草植物的GUS表达模式。这将确定诱导萌发胚的顶端分生组织的L2层中的CRE嵌合基因的去阻遏所必需的条件。

实施例9

产生一种遗传系统，通过该系统由通过病毒载体系统(或其它手段)导入的位点特异性重组酶切除封阻系列(填充序列)而激活发育控制的致死基因

在上述特定的实施例中所描述的遗传系统不需要通过一个外部信号的位点特异性重组酶的诱导，而是将它在合适时间导入转基因植物的靶细胞。这可以以几种方式达到，通过如Zhou et al 1983所述的在棉花种子中那样，直接导入一个可表达DNA系统；如Horn et al；199所述的大豆细胞中那样，将位点特异性重组酶附着于生物素分子上，或者利用下面所述的病毒载体系统。在完整植株水平上或者对我们建议的方案中所需要的批量处理的种子，还没有证明前面两种例子是蛋白质或基因导入的可靠方法。可以利用后一个例子，病毒载体。下面描述了一个用于可以被烟草花叶病毒(TMV)感染的植物的系统但并不排除使用可以感染其它植物种类的其它病毒载体。这个方案的基本元素对于用于位点特异重组酶的释放的任何病毒载体系统均是相同的。

在本实施例中使用相同于内源的诱导系统中的基因排列，其中Lea启动子(或任何其它启动子)是由一个可切除的封阻序列与所期望的编码序列，在这里是一个RIP CDS分隔开。在本实施例中封阻序列是35S启动子-TMV外壳蛋白CDS-Nos3′Term嵌合基因，因此全长构建体具有下述结构：Lea4启动子-LOX-35S启动子-TMV外壳蛋白CDS-Nos3’Term-LOX-NcoI位点-RIP CDS-g7Term。通过许多植物转化技术中的任何一种将其插入基因组以产生仅生产病毒外壳蛋白的转基因植物。病毒外壳蛋白这种表达将没有可见的表型也不影响植物的生产能力。

CRE蛋白质是作为携带于包装到病毒外壳蛋白质中的重组病毒基因组中的表达基因而被输送到植物种子细胞中(顶端分生组织的L2层以保证发育植物的所有结构均可以表达CRE)。在这个例子中这可以以下面的方式来完成。将TMV野生株(也即一个在靶植物中不引起症状的)的RNA基因组的cDNA拷贝中的外壳蛋白编码序列去除并用CRE CDS替代。在病毒基因组的3′部分的外壳蛋白附着位点必须留在位置上。将该工程cCDNA克隆进入pBluescript并且在体外利用T7或T3聚合酶合成全长突变的TMV RNA。然后将全长的RNA在体外用外壳蛋白包装并用于感染一个正表达TMV外壳蛋白的转基因植物，也即，含有活化的35S外壳蛋白-Nos3′嵌合基因或等同物的转基因植物。在体外没有包装的全长RNA的感染将产生类似但效率较低的结果，为了批量接种含有掺入的Lea4启动子-LOX-35S启动子-TMV外壳蛋白CDS-Nos3′-Term-LOX-NcoI位点-RIP CDS-g7Term构建体的种子，将突变TMV(含有CRE蛋白质CDS)扩增到足够水平这一步骤是必需的。一旦在源植物中进行扩增，即将突变病毒分离并采用真空辅助吸收方法用于接种靶种子。一旦病毒进入种子中，在种子表面的病毒可以被除去和失活。在萌发基础上，发育的秧苗将被感染，并由于细胞正表达TMV外壳蛋白，突变的病毒应该传播到整个发育的植物。在感染期间，CRE CDS将作为病毒mRNA释放、翻译，并合成CRE蛋白。然后CRE从Lea4启动子-LOX-35S启动子-TMV外壳蛋白CDS-Nos3′Term-LOX-NcoI位点-RIP CDS-g7Term序列中移去封阻序列，因而使RIP编码序列处于Lea启动子控制下。在种子成熟过程中RIP将在这种植物中被表达使它不能产生子代。只要初级分生组织的L2层被感染了并且在它们中产生了CRE蛋白质，发育植物其余部分将具有其中Lea-RIP基因是活化的细胞，特别是所有将来发育的胚芽细胞。

由于封阻序列是35S-外壳蛋白-Nos3′嵌合基因或等同物，这些植物将显示外壳蛋白产生能力的急剧丧失，而这种丧失则抑制突变病毒增殖。这具有减少靶植物用作突变病毒的有效储藏库的的能力的优点，并减少能量从光合作用向病毒复制和增殖的转移，从而使系统对植物生产能力的可能的影响降到最小。这个系统另一个有感染力的特征是在植物组织中突变病毒不能复制和移动，除非细胞中存在TMV外壳蛋白。所以非转基因植物(和不含表达TMV外壳蛋白基因的转基因植物)不能被这种病毒感染。因而这种突变病毒在环境中的传播可被忽略。

实施例10

对实施例7的转化植物生产不能生长发育的种子的评价

转基因系统的有效性的评价是在对Lea4启动子-LOX-35Stet阻遏物CDS-Nos 3′末端-NcoI位点-RIP CDS-g7Term-Gm和35Stet OCRE构建体是纯合的或者是真正的再生的完整植株中进行的。进行两种类型评价。对转基因植物的正常生长和在没有用四环素处理时系统的非功能能力进行一系列评价。第二类评价测试了当将四环素用于种子时功能系统的有效性。

在第一系列重复的试验中，在一个重复的设计中，在温室和田间环境中将未处理的转基因植物的种子种植在非转基因亲本植物的种子旁边。主要的目的是评价转基因和非转基因植物的表型的相似性。一种所需要的转基因植物(没有用四环素处理)具有与非转基因亲本植物基本相同的表型。

对如发芽能力，活力，生长习性，成熟性，产物产量和产物质量这样的性状进行评价。对于所测试任一性状转基因植物与非转基因亲本植物的显著的负偏差表明下列情况之一或其结合：在所期望的基因活性中的机能障碍或者在植物染色体上的构建体插入位点的正效应。通过制备和评估来源于涉及Lea4启动子-LOX-35Stet阻遏物CDS-Nos3′末端-NcoI位点-RIPCDS-87Term-GM和35S3teto-CRE构建体的几种插入事件的植物提出了后一问题。

第二类测试包含通过用四环素处理转基因种子，在CRE激活基础上对所期望基因型的有效性进行估价。这系列测试涉及在种子吸胀四环素之后的转基因植物与非处理，非转基因亲本植物比较。转基因植物预期的效果包括正常生长和发育，正常成熟和正常产物产量和质量。从该植物产生的种子不能生长发育也是预期到的。

不仅在受控的环境条件下，而且在各种各样的田间环境下的评价也是预期的。具有特殊兴趣的是对任何可能引起早熟或不期望的35S3teto-CRE基因的激活的特异环境条件的鉴定。评价包括生长在各种环境条件下的非处理转基因植物的种子子代的萌发。另外，封阻序列切除后L E A启动子的后胚胎发生后期的激活或者“渗漏”之前作评价。任何‘渗漏’导致除植物产生的种子胚以外的植物或植物组成部分的死亡。

一旦这些估价指出了系统的完全的功能能力，转基因植物就通过回交方式导入一个种类内的各种基因型。再对回交的基因型的功能能力以及经济潜力进行评估。

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Claims

1、一种制备遗传学修饰的植物的方法，包括

将第一个DNA序列、第二个DNA序列和第三个DNA序列导入一种植物细胞，所述的第一个DNA序列含有其表达导致产生改变的植物表型的第一个基因和一个瞬时活化启动子，第一个基因和瞬时活化启动子可操作地相互连接，但由一个旁侧具有特异切除序列的封阻序列分开，封阻序列的存在阻止第一个基因的表达，所述的第二个DNA序列含有编码一种重组酶的第二个基因和一个可操作地以功能关系连接到第二个基因上的阻抑型启动子，所述的重组酶特异于第一个DNA序列的封阻序列旁侧的特异切除序列，所述的第三个DNA序列含有编码特异于第二个DNA序列的阻抑型启动子的阻遏物的第三个基因，第三个序列与一植物活化启动子相连接；

从所述的植物细胞再生一个完整植株。

2、根据权利要求1的方法，其中所述的封阻序列包含第三个DNA序列。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其中瞬时活化启动子选自包含在晚期胚胎发生，在种子发育，在花发育，在叶发育，在根发育，在维管组织发育，在花粉发育，在伤害后，在热或冷胁迫时，在水胁迫时，或在暴露于重金属过程中或之后活化的启动子的一组，

第一个基因选自包含致死基因，杀虫基因，抑真菌基因，杀真菌基因，杀细菌基因，抗病毒基因，干旱抗性基因，蛋白质产物基因或改变次生代谢的基因的一组，

特异切除信号序列选自包含LOX序列和被flippase，解离酶，FLP，SSV1编码的整合酶或者转座酶所识别的序列的一组，

第二个基因编码选自于包含CRE，flippase，解离酶，FLP，SSV1编码的整合酶和转座酶的一组的特异性重组酶，

第三个基因编码选自于包括Tn10tet阻遏物和Lac操纵基因一阻遏物系统的一组的阻遏物，

阻抑型启动子选自包括修饰为含有一或多个tet操纵子的35S启动子，修饰的遍在蛋白启动子，修饰的MAS启动子和修饰的NOS启动子的一组。

4、根据权利要求3所述的方法，其中瞬时活化启动子是LEA启动子。

5、根据权利要求3所述的方法，其中第一个基因编码核糖体抑制蛋白(RIP)。

6、根据权利要求3所述的方法，其中特异切除信号序列是LOX序列并且第二个基因编码CRE。

7、根据权利要求3所述的方法，其中第三个基因编码Tn10tet阻遏物。

8、根据权利要求3所述的方法，其中阻抑型启动子是修饰为含有三个tet操纵子的35S启动子。

9、根据权利要求2所述的方法，其中植物是棉花，瞬时活化启动子是LEA启动子，特异切除信号序列是LOX序列，第一个基因编码核糖体抑制蛋白(RIP)，阻抑型启动子是修饰为含有三个tet操纵子的35S启动子，第二个基因编码CRE，第三个DNA序列是Tn10tet阻遏物基因。

10、产生不能萌发的种子的方法，包括

将第一个DNA序列、第二个DNA序列和第三个DNA序列导入一种植物细胞，所述的第一个DNA序列含有致死基因和一个在晚期胚胎发生中活化的启动子，致死基因和在晚期胚胎发生启动子功能性相互连接，但由一个旁侧具有特异切除信号序列的封阻序列分开，封阻序列的存在阻止致死基因的表达，所述的第二个DNA序列含有编码一种重组酶的基因和一个以功能关系连接到特异性重组酶基因上的阻抑型启动子，所述的重组酶特异于第一个DNA序列的封阻序列旁侧的特异切除信号序列，所述的第三个DNA序列含有编码特异于第二个DNA序列的阻抑型启动子的阻遏物的基因；

从所述的植物细胞再生完整植株；

使再生的完整植株产生第一代种子；

将第一代种子与阻抑阻遏物功能的一种刺激物接触，以使阻遏物元件不再抑制特异性重组酶基因的表达，从而允许特异性重组酶表达并在特异切除信号序列切除第一个DNA序列的封阻序列，导致晚期胚胎发生启动子与致死基因的直接功能性连接；

萌发第一代种子以产生表达晚期胚胎发生启动子/致死基因序列的第一代植物；

使所述植物产生第二代种子，其中在胚胎发生过程中晚期胚胎发生启动子活化，使致死基因在第二代种子中表达，从而使第二代种子不能萌发。

11、根据权利要求10所述的方法，其中封阻序列包含第三个DNA序列。

12、根据权利要求10或11所述的方法，其中种子是棉花种子；

晚期胚胎发生启动子选自包括LEA启动子和在晚期胚胎发生期活化但不是LEA的启动子的一组，

致死基因选自于包括核糖体抑制蛋白(RIP)和芽孢杆菌RNA酶的一组，

特异切除信号序列选自于包括LOX序列和可以被flippase，解离酶，FLP，SSV1编码的整合酶或转座酶识别的序列的一组，

特异性重组酶选自于包括CRE，flippase，解离酶，FLP，SSV1编码的整合酶和转座酶的一组，

阻遏物基因编码选自于包括Tn10tet阻遏物和Lac操纵基因一阻遏物系统的一组中的阻遏物，并且

阻抑型启动子选自于包括修饰为含有一或多个的tet操纵子的35S启动子和修饰为含有Lac操纵基因序列的启动子的一组。

13、根据权利要求12所述的方法，其中晚期胚胎发生启动子是LEA启动子。

14、根据权利要求12所述的方法，其中致死基因编码核糖体抑制蛋白(RIP)。

15、根据权利要求12所述的方法，其中特异切除信号序列是LOX序列，并且特异性重组酶基因编码CRE。

16、根据权利要求12所述的方法，其中阻遏物基因编码Tn10tet阻遏物。

17、根据权利要求12所述的方法，其中阻抑型启动子是一个修饰为含有三个tet操纵子的35S启动子。

18、根据权利要求11所述的方法，其中种子是棉花种子，晚期胚胎发生启动子是LEA启动子，特异切除信号序列是LOX序列，封阻序列是第三个DNA序列，致死基因编码核糖体抑制蛋白(RIP)，阻抑型启动子是一个修饰成含有二个tet操纵子的35S启动子，特异性重组酶基因编码CRE，第三个DNA序列是Tn10tet阻遏物基因。

19、含有外源DNA的一种植物细胞，所述的DNA包括

含有其表达导致改变的植物表型的第一个基因和一个瞬时活化启动子的第一个DNA序列，第一个基因和瞬时活化启动子有相互的功能关系，但是被一个旁侧具有特异切除信号序列的封阻序列所分开，从而封阻序列的存在阻止第一个基因的表达，

含有编码特异于第一个DNA序列的封阻序列旁侧的特异切除信号序列的重组酶的第二个基因和一个以功能关系连接于第二个基因的阻抑型启动子的第二个DNA序列，和

含有编码特异于第二个DNA序列的阻抑型启动子的阻遏物元件的第三个基因的第三个DNA序列，该第三个序列与植物活化启动子相连接。

20、根据权利要求19的植物细胞，其中封阻序列含有第三个DNA序列。

21、根据权利要求19或20所述的植物细胞，其中

植物细胞是棉花细胞，

瞬时活化启动子选自包含在晚期胚胎发生，在种子发育，在花发育，在叶发育，在根发育，在维管组织发育，在花粉发育，在伤害后，在热或冷胁迫时，在水胁迫时，或在暴露于重金属过程中或之后活化的启动子的一组，

特异切除序列选自包含LOX序列和被flippase，解离酶，FLP，SSV1编码的整合酶或者转座酶所识别的序列的一组，

第三个基因编码选自于包括Tn10tet阻遏物和Lac操纵基因-阻遏物系统的一组的阻遏物，

22、根据权利要求21所述的植物细胞，其中瞬时活化启动子是LEA启动子。

23、根据权利要求21的植物细胞，其中第一个基因编码核糖体抑制蛋白(RIP)。

24、根据权利要求21的植物细胞，特异切除信号序列是LOX序列并且第二个基因编码CRE。

25、根据权利要求21所述的植物细胞，第三个基因编码Tn10tet阻遏物。

26、根据权利要求21所述的植物细胞，其中阻抑型启动子是一个修饰成含有三个tet操纵子的35S启动子。

27、根据权利要求20所述的植物细胞，其中瞬时活化启动子是LEA启动子，特异切除信号序列是LOX序列，封阻序列是第三个DNA序列，第一个基因编码核糖体抑制蛋白(RIP)，阻抑型启动子是一个修饰成含有三个tet操纵子的35S启动子，第二个基因编码CRE，第三个DNA序列是Tn10tet阻遏物基因。

28、产生不能生长发育的种子的方法，包括

向一种植物细胞或细胞培养物中导入含有致死基因和一个在晚期胚胎发生期活化的启动子的第一个DNA序列，致死基因和晚期胚胎发生启动子具有相互的功能关系，但是被一个旁侧具有特异切除信号序列的封阻序列分开，从而封阻序列的存在阻止致死基因的表达，还导入第二个DNA序列，其含有编码特异于第一个DNA序列的封阻序列旁侧的特异切除信号序列的重组酶的基因序列，和一个以功能关系连接于特异性重组酶基因的诱导型启动子；

从所述的植物细胞或细胞培养物再生完整植株；

使再生的完整植株产生第一代种子；

将第一代种子与诱导第二个DNA序列的诱导型启动子的一种刺激物接触，以诱导特异性重组酶基因的表达，从而在特异切除信号序列切除第一个DNA序列的封阻序列，导致晚期胚胎发生启动子与第一个基因的直接功能性连接；

萌发第一代种子以产生组成型表达晚期胚胎发生启动子/第一个基因序列的植物；

29、生产一种表达在亲本中不被表达的性状的杂交植物的方法，包含

向第一种植物细胞或细胞培养物中导入含有其表达导致一个改变的植物表型的第一个基因和一个瞬时活化启动子的第一个DNA序列，第一个基因和瞬时活化启动子可操作地相互连接，但是由一个旁侧具有特异切除信号序列的封阻序列分开，从而封阻序列的存在阻止第一个基因的表达；

向第二种植物细胞或细胞培养物中导入第二个DNA序列，所述DNA序列含有编码特异于第一个DNA序列的封阻序列旁侧的特异切除信号序列的重组酶的第二个基因，和一个在种子萌发过程中活化但在其他时期基本上不活化的启动子，该启动子可操作地以功能关系连接于第二个基因；

再生第一和第二种细胞或细胞培养物使之成为第一和第二种植物；

杂交第一和第二种植物产生含有第一和第二个DNA序列的杂交种子；

使杂交种子生长成为杂交植物。

30、根据权利要求29的方法，其中封阻序列是引起雄性不育的序列。

31、根据权利要求30所述的方法，其中

引起雄性不育的序列选自于包括可操作地连接于一种花药特异性启动子的致死基因和可操作地连接于一种花粉特异性启动子的致死基因的一组。

32、根据权利要求31的方法，其中瞬时活化启动子是LEA启动子。

33、根据权利要求31的方法，其中第一个基因编码核糖体抑制蛋白(RIP)。

34、根据权利要求31所述的方法，其中特异切除信号序列是LOX序列并且第二个基因编码CRE。

35、根据权利要求31的方法，其中引起雄性不育的序列是连接到花药特异性启动子的RIP基因。

36、根据权利要求31的方法，其中植物是棉花植物，瞬时活化启动子是LEA启动子，特异切除信号序列是LOX序列，第一个基因编码RIP，第二个基因编码CRE，引起雄性不育的序列是连接到花药特异性启动子的RIP基因。

37、产生不能萌发的种子的方法，包括

向第一种植物细胞或细胞培养物中导入含有致死基因和一个在胚胎发生晚期活化的启动子的第一个DNA序列，致死基因和晚期胚胎发生启动子可操作地相互连接，但是由一个旁侧具有特异切除序列的封阻序列分开，从而封阻序列的存在阻止致死基因的表达；

向第二种植物细胞或细胞培养物中导入第二个DNA序列，所述DNA序列含有编码特异于第一个DNA序列的封阻序列旁侧的特异切除序列的重组酶的基因，和一个在种子萌发过程中活化的启动子，该启动子可操作地以功能关系连接于重组酶基因；

使杂交种子萌发产生表达重组酶的杂交植物；

使杂交植物产生第二代杂交种子，其中在胚胎发生过程中，晚期胚胎发生启动子活化，使致死基因在第二代杂交种子中表达，从而使第二代杂交种子不能萌发。

38、根据权利要求37的方法，其中封阻序列是引起雄性不育的序列。

39、根据权利要求38的方法，其中

重组酶基因编码选自于包含CRE，flippase，解离酶，FLP，SSV1编码的整合酶和转座酶的一组的特异性重组酶，

40、根据权利要求39的方法，其中瞬时活化启动子是LEA启动子。

41、根据权利要求39的方法，其中致死基因编码核糖体抑制蛋白(RIP)。

42、根据权利要求39的方法，其中特异切除信号序列是LOX序列并且第二个基因编码CRE。

43、根据权利要求39的方法，引起雄性不育的序列是连接到花药特异性启动子的RIP基因。

44、根据权利要求39的方法，其中植物是棉花植物，瞬时活化启动子是LEA启动子，特异切除信号序列是LOX序列，致死基因编码RIP，重组酶基因编码CRE，引起雄性不育的序列是连接于花药特异性启动子的RIP基因。

45、制备一种遗传学修饰的植物的方法，包括

向一种植物细胞中导入第一个DNA序列和任选的第二个DNA序列，所述的第一个DNA序列包括其表达导致改变的植物表型的第一个基因和一个瞬时活化启动子，第一个基因和瞬时活化启动子可操作地相互连接，但是被一个旁侧具有特异切除信号序列的封阻序列分开，从而封阻序列的存在阻止第一个基因的表达，所述的第二个DNA序列包括编码特异于第三个DNA序列的阻抑型启动子的阻遏物的第二个基因，编码阻遏物的基因与植物活化启动子相连接，

向一种植物病毒中导入第三个DNA序列，所述的DNA序列包括编码特异于第一个DNA序列的封阻序列旁侧的特异切除信号序列的重组酶的第三个基因，和一个以功能关系连接于第三个基因的启动子，该启动子任选地是阻抑型启动子；

从该植物细胞再生一个完整植株；

用植物病毒感染植物，从而使第一，第二，第三个DNA序列都存在于植物中。