KR100267742B1 - 녹색 형광단백질 유전자가 삽입된 재조합 베큘로바이러스를 이용한 형광누에 및 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 곤충 베큘로바이러스(AcNPV)의 다각체 단백질 유전자 프로모터의 조절하에 초록색 형광 단백질 유전자를 삽입한 재조합 바이러스(한국과학기술연구원 생명공학연구소 균주기탁번호 KCTC0418BP)를 제조하여, 이를 누에에 체강주사하면 재조합 바이러스의 소량 증식과 다각체 단백질 유전자 프로모터 조절에 의해 초록색 형광 단백질 유전자가 발현되는 유전자재조합 바이러스의 형광누에 및 제조방법 그리고 그 용도에 관한 발명이다. 형광누에는 누에품종에 따라서 그 발현정도가 다르며 특히 대장점이 발현율과 전이에서 효과적이었고, 자외선 조사시 온몸에서 초록색 형광을 발하였다. 또 형광누에의 초록색 형광 단백질 유전자는 숙주곤충의 게놈에 삽입되는 기작으로 차세대에 전이됨을 밝혔다. 따라서 본 발명의 형광누에 개발 기술은 신기능 및 유전공학적으로 개량된 형질전환 곤충 창출에 활용될 수 있다.

Description

녹색 형광 단백질유전자가 삽입된 재조합 베큘로바이러스를 이용한 형광누에 및 제조방법
본 발명은 곤충 베큘로바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus: AcNPV 이하 AcNPV이라 함)의 다각체 단백질 유전자 프로모터 조절하에 초록색 형광 단백질 유전자를 도입한 재조합 AcNPV(한국과학기술원 생명공학연구소 균주기탁번호 KCTC 0418BP)를 누에(Bombyx mori)에 주사하여 만든 초록색 형광누에 및 그 제조방법에 관한 것이다.
누에는 비단 (Silk)의류를 생산하는 곤충으로서 동서양을 막론하고 대량사육을 통해 사람들과 친숙하고 최근에는 교육이나 애완용으로도 이용되고 있다. 누에는 다른 곤충에 비해 충체가 크고, 대량 사육이 용이하며, 사람들에 알레르기를 유발하지 않고, 유전육종학적으로 잘 연구되어져 있다. 최근들어 누에를 이용하여 형질전환 곤충 개발 또는 베큘로바이러스 발현계에 의한 재조합 단백질의 대량생산에 관해 모리(Mori et al., Bio/Technology 13, 1005-1007, 1995), 슈다리(Choudary et al., Methods in Molecular Biology, Baculovirus Expression Protocols, ed Richardson, C. D., 243-264, Human Press, Totowa, N. J., 1995), 마에다(Maeda, Insect Cell Biotechnology, eds Maramorosch, K. & Mclntosch, A., 1-31, CRC Press, Boca Raton, Fl., 1994)등에 의해 깊이있게 연구되고 있다.
최근 찰플(Chalfle et al., Science, 263, 802-805, 1994) 등에 의해 살아있는 생물체에서 단밸질의 위치와 발현 검색을 위한 가시적 표식자로서 초록색 형광 단밸질이 개발되었으나 이는 단지 자외선이나 395-470 nm 청파장 조사에 의해 세포내 초록색 형광 단밸질의 검색이 가능하고, 기질이나 보조인자 등이 요구되지 않기 때문에 그 사용에 제한을 받지 않는다. 한편 곤충 베큘로바이러스는 그라나도스 (Granados & Federichi, The biology of baculoviruses, Vol. I, II, Boca raton, CRC Press) 등에 의해 숙주특이성을 갖고 있다는 것이 밝혀졌다.
최근 보고에 의하면 모리(Mori et al., Bio/Technology, 13, 1005-1007, 1995)등은 AcNPV가 누에 유층에서 소량 증식하며, 이를 이용하여 초파리의 열충격 단백질 유전자 프로모터 조절하에 반딧불에 발광유전자를 삽입하여 제작한 재조합 AcNPV를 누에에 주사하고 기질로서 루시페린(Luciferin)과 화학약품 주입에 의해서 죽은 누에에서도 발광을 확인하였다.
또한, 헝(Hung et al., J. Invertebr. Pathol., 69, 234-245, 1997) 등에 의하면 AcNPV의 다각체 단백질 유전자 프로모터 조절하에 반딧불이 발광유전자를 삽입하여 제작한 재조합 AcNPV를 누에 유충에 주사하였을 시 누에 유충 혈액에서 발광유전자가 소량 발현되었다고 보고하였다. 그러나 이상과 같은 보고들은 누에에서 외래유전자 발현을 확인하기 위해서는 결국 누에가 죽어야 하는 문제점이 있고, 아울러 그 확인 방법 역시 기질과 화학약품 등의 사용에 따른 번거러움이 있다. 즉 살아있는 상태에서 쉽게 확인이 되지 않기 때문에 그 이용과 응용이 상당히 제한된다.
본 발명은 곤충 베큘로바이러스 발현계를 이용하여 초록색 형광 단백질 유전자가 다각체 단백질 유전자 프로모터의 조절하에 포함된 재조합 AcNPV (균주 기탁번호 KCTC 0418BP, 이하 유전자재조합 바이러스라함)를 제조하고, 이를 숙주범위가 다른 누에에 주사함으로서 누에는 죽지 않으면서 그 재조합 바이러스가 소량 증식되어 다각체 단백질 유전자 프로모터의 조절에 의해 초록색 형광 단백질을 발현하는 것을 자외선 조사에 의해 쉽게 확인하였으며 그 유전자는 차세대로 전이됨을 밝혀냈다. 본 발명은 세계 최초로 살아있는 상태에서 외래유전자 도입과 발현을 확인할 수 있는 기술이기 때문에 초록색 형광 단백질 유전자를 이용하여 신기능 및 유전공학적으로 개량된 형질전환 곤충을 창제할 수 있고, 본 발명의 방법으로 개량한 형광누에는 자외선 조사시 아름다운 초록색 형광을 띈다. 이러한 형광누에 제조기술은 살아있는 누에에서 유용물질의 생산 뿐만 아니라 신기능 및 유전공학적으로 개량된 형질전환 곤충 및 동물의 창제를 가능하게 하는 새로운 모델을 제시한 것으로서, 본 발명의 기술을 토대로 하여 전지용, 애완용, 특수 목적용의 곤충이나 동물에 활용할 수 있다.
제1도는 다각체 단백질 유전자 프로모터 조절하에 초록색 형광 단백질 유전자를 포함하고 있는 재조합 베큘로바이러스의 제작 모식도이다.
제2도는 제1도의 재조합 베큘로바이러스에 의해 제작된 형광누에들이다.
제3도는 형광누에와 일반누에들의 체액 단백질 합성양상을 단백질 전기영동과 초록색 형광단백질 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 (Western blot) 분석한 결과이다.
제4도는 차세대 형광누에의 지방체 조직에서 발현된 초록색 형광 단백질을 형광현미경으로 일반누에의 지방체 조직과 비교한 것이다.
제5도는 차세대 형광누에 게놈에서 초록색 형광 단백질 유전자의 전이를 PCR(Polymerase chain reaction)로 분석한 결과이다.
본 발명은 숙주법위가 다른 재조합 AcNPV의 다각체 단백질 유전자 조절에 의한 초록색 형광 단백질 유전자를 누에 유충에서 발현시키기 위하여 유전자 프로모터 조절하에 재조합 AcNPV의 제조와 이를 누에 유층에 주사하여 초록색 형광누에 제조 그리고 누에 체내에서 다각체 단백질 유전자 프로모터 조절에 의한 초록색 형광 단백질의 발현과 살아있는 형광누에로부터 자외선 조사에 의한 용이한 식별 및 그 유전자의 차세대 전이와 차세대에서의 발현의 확인으로 구성된다. 본 발명은 다음의 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 이들 실시예가 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1]
(재조합 바이러스의 제조)
초록색 형광 단백질 유전자를 다각체 단백질 유전자 프로모터 조절하에 AcNPV의 재조합 바이러스를 제조하기 위해, 도1과 같이 베큘로바이러스 전이벡터 pBacPAK8 (Clontech 사 제품)의 제한효소 BamHl과 Pstl 위치에 pGFP (Clontech 사 제품)로부터 절단된 약 720 bp의 초록색 형광 단백질 유전자를 삽입하였다. 재조합전이벡터 (pAc-GFP) 500 ng과 Bsu361으로 절단한 BacPAK6 바이러스 DNA (Clontech 사 제품)를 혼합하고 리포펙틴 (Iipofection, Gibco 사 제품)을 동량 첨가하여 상온에서 15분 반응시켰다. 그리고 1.0 ×106개의 곤충세포주 (Sf9)를 포함하고 있는 35mm2세포 배양용 접시에 상기 혼합물을 접종하여 27℃에서 5시간 트렌스펙션 (Transfection)하고, 새 배양약으로 교체한 후 27℃에서 5일간 배양하였다.
재조합 바이러스 (Ac-GFP)의 선발은 플라크 검정법 (Summers & Smith, Texas Agriculture Experiment Station, Bulletin No. 1555, 1987)으로 행하였다. 선발한 재조합 바이러스는 Sf9 곤충세포주에서 증식시켰다.
재조합 베큘로바이러스의 모식도는 도1에 나타난 바와 같으며, 초록색 형광 단백질 유전자는 AcNPV의 다각체 단백질 유전자 프로모터 조절하에 삽입되었다.
[실시예 2]
(재조합 AcNPV의 의한 초록색 형광누에 제조)
초록색 형광누에 제조를 위하여, 재조합 바이러스는 초고속원심분리 (23,000rpm, 1시간, 4℃)에 의해 순수분리하여 멸균증류수에 용해하였다. 그 재조합 바이러스를 얼음에서 살짝 기절시킨 5령 1일째 누에에 1마리 당 약 2.5×104PFU씩 체강주사하였다. 누에 품종은 대성잠 (일본종과 중국종의 교잡종)과 호잠계통 등 약 20품종을 사용하였다. 주사 후 즉시 깨어 난 누에는 뽕잎으로 25℃에서 계속 사육하였다. 형광누에 제작 여부는 매일 일정한 시간에 자외 선을 조사함으로서 관찰하였으며 그 결과는 도2에 나타나 있다. 일반누에 (a)는 자외선을 조사하여도 초록색 형광을 띠지 않는 반면에 대성잠은 재조합바이러스 주사 후 4일이 경과하면서 가슴발에서 부터 초록색 형광을 띠기 시작하여 7일째 온몸체로부터 초록색 형광을 나타냈다 (b). 또는 호잠계통의 누에 품종은 체색무늬와 초록색 형광이 어우러져 아름다운 형광을 나타냈다 (c). 뽕나무가지 위에 있는 대성잠 형광누에에 자외선을 조사하였을 시 살아있는 상태에서 온몸으로부터 초록색 형광을 나타냈다 (d).
[실시예 3]
(형광누에와 보통누에의 혈액 단백질 합성 양상)
재조합 바이러스를 주사하여 제조된 형광누에와 일반누에의 체액 단백질 합성양상을 비교하기 위하여, 1일 간격으로 체액을 채취하여 단백질 전기영동 (Laemmli, Nature, 227 680-685, 1970)과 웨스턴 블랏 (western blot) 분석을 수행하였다. 시기별로 채취된 체액 1 ul에 2배량의 단백질 시료 용액 (0.0625M Tris-HCL, pH6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% β-mercaptoethanol, 0.001% bromophenol blue)을 혼합하였다. 그리고 100℃에서 5분간 가열한 후, 전기영동을 12.5% SDS-폴리아크릴아마이드 젤에서 수행하고, 코마시 브릴리언트 블루 (Coomassie brilliant blue)로 염색하였다.
또한 웨스턴 블랏 분석은 코마시 브릴리언트 블루로 염색하지 않은 겔의 단백질 시료를 나이트로셀룰로오스 막 (Nitrocellulose membrane)에 전이 시킨 후 초록색 형광 단백질에 대한 항체를 결합 시킴으로서 분석하였으며 그 결과는 도3에 나타냈다.
주사 후 7일째 채취된 일반누에 (레인 1)와 형광누에 (레인 2)의 혈액 단백질 합성 양상을 전기영동한 결과, 그 밴드 패턴으로는 차이를 구분할 수 없었다. 그러나 웨스턴 블랏 분석에서 일반누에 (레인 3)에서는 관찰되지 않았지만, 형광누에 (레인 4)의 경우 7일째 그 혈액에 존재하는 약 27 kDa의 초록색 형광 단백질 밴드를 뚜렷이 확인할 수 있었다. 이때 형광누에 체액에 존재하는 재조합 AcNPV 바이러스 증식율은 주사시에 비해 약 240배 증가하였다.
[실시예 4]
(형광누에의 차세대 전이)
형광누에의 차세대 전이는 차세대 5령 누에 유충을 자외선 조사로 확인하였으며, 이때 차세대 전이율은 비교적 낮은 10.9% 였다. 아울러 형광누에의 지방체 조직을 적출하여 형광현미경으로 관찰하였고 그 결과를 도4에 나타냈다. 형광누에의 경우 (도4의 a와 b)와 일반누에 (도4의 c와 d)의 경우를 비교하였을 시, 도4의 b에서 형광누에의 지방체에서는 초록색 형광을 띄는데 이는 초록색 형광 누에의 유전자가 차세대로 전이됨을 알 수 있다.
또한 차세대 형광누에에서 유전자 전이를 분석하기 위하여 게놈유전자를 추출하고 특이 프라이머를 이용하여 PCR (Polymerase chain reaction)에 의하여 분석하였다.
게놈유전자 추출은 적출한 지방체 조직에 프로테인에이즈 케이 (proteinase K)를 0.5 ㎎/㎖ (Sigma사 제품) 농도가 되도록 첨가하여 37℃에서 4시간 이상 처리였다. 그 후 동량의 페놀/클로로포름-이소아밀알콜 (phenol/chloroform-isoamylalcohol, 24:1)을 가하여 혼합하고 15,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상청액을 수집하였다. 여기에 2배량의 냉에탄올을 가하고 15,000 rpm으로 15분간 원심하여 DNA를 침전시키고, 70% 에탄올 세척으로 분리된 재조합 바이러스 DNA를 멸균증류수에 용해하여 PCR 분석에 사용하였다.
PCR 프라이머는 초록색 형광유전자의 존재를 분석하기 위하여 초록색 형광 유전자의 전이개시 부위의 5'-ATGAGTAAAGGAGAAGAA-3' 와 종결부위의 5'-TTTGTATAGTTCATCCAT-3'의 두 프라이머를 사용했으며, 또한 초록색 형광 유전자가 AcNPV의 다각체 단백질 유전자 프러모터 부위를 포함하고 있는지 여부를 확인하기 위하여 AcNPV 다각체 단백질 프로모터 부위의 5'-CTGATATCATGGAGATAA-3'와 역시 초록색 형광 단백질 유전자 종결부위의 5'-TTTGTATAGTTCATCCAT-3'의 두 프라이머를 사용하였다.
PCR 반응은 250 ng의 게놈 DNA, 2.5 U의 탁 디엔에이 폴리머라아제 (Taq DNA polymerase, Promega 사 제품), 200 nM 데옥시누클레오타이드 트리포스페이트 (deoxynucleotide triphosphate), 100 pM의 각 프라이머 및 3mM MgC12를 50 ul 양으로 만들어, PCR기 (Thermal Cycler, Perkin Elmer Cutus 제품)에서 증량하였다. 반응 온도와 시간은 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 35 싸이클 (Cycle) 동안 반응 시켰다. PCR 반응 후 산물은 냉에타놀에 침전하고 1.0% 아가로스 겔에서 분석하였다.
그 결과는 도5에 나타난 바와 같이, 3번 레인의 일반누에의 게놈에서는 PCR 산물이 검출되지 않은 반면 형광누에의 경우는 초록색 형광 단백질 유전자 (레인 1)와 아울러 AcNPV 다각체 단백질 유전자 프로모터 부위를 포함 (레인 2)하고 있음을 확인하였으며, 차세대 형광누에의 혈액속에 재조합 바이러스는 검출되지 않았다. 따라서 형광누에의 전이는 초록색 형광 단백질 유전자가 숙주곤충의 게놈에 삽입되는 기작으로 차세대 전이됨을 확인하였다.
본 발명은 살아있는 상태에서 외래유전자 도입과 발현을 확인할 수 있는 기술로서 초록색 형광 단백질 유전자를 이용하여 신기능 및 유전공학적으로 개량된 형질전환 곤충을 창제할 수 있고, 본 발명의 방법으로 개량한 형광누에는 자외선 조사시 아름다운 초록색 형광을 띄게 되는 형광누에 제조기술은 살아있는 누에에서 유용물질의 생산 뿐만 아니라 신기능 및 유전공학적으로 개량된 형질전환 곤충 및 동물의 창제를 가능하게 하는 새로운 모델을 제시하여 전시용, 애완용, 특수 목적용의 곤충이나 동물에 활용할 수 있다.

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