CN1666105A - 作为肿瘤的表型分析剂的肿瘤消解病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种使用能够选择性地在具有特定表型的肿瘤中复制的肿瘤消解病毒诊断具有特定表型的肿瘤的方法。例如，呼肠孤病毒不能在正常细胞中复制。不过，呼肠孤病毒能选择性地在具有激活的ras途径的细胞中复制，这会导致所述细胞死亡。因此，至少部分是由于ras途径活性升高而导致的成为肿瘤的细胞，可以通过它对呼肠孤病毒复制的易感性进行诊断。本发明还可以利用其他肿瘤消解病毒应用于其他肿瘤的诊断和/或治疗，如干扰素－敏感型肿瘤，p53－缺陷型肿瘤和Rb－缺陷型肿瘤。还提供了用于本文所披露的诊断或治疗的试剂盒。

Description

作为肿瘤的表型分析剂的肿瘤消解病毒
相关申请
本申请要求2002年6月28日提交的美国临时申请流水号60/392,031；以及2003年1月29日提交的流水号60/443,188的优先权。上述每一个在先申请所披露的内容的整体被收作本文参考。
发明领域
本发明涉及检测肿瘤的潜在病因的方法，特别是将呼肠孤病毒用于ras-激活的肿瘤的诊断。另外，具有不同选择性的其他肿瘤消解病毒也可用于特殊肿瘤类型的诊断。
参考文献
美国专利号6,136,307。
WO 94/18992，公开日为1994年9月1日。
Bischoff JR.等，″能够在p53-缺陷型人类肿瘤中选择性地复制的腺病毒突变体″，Science 274(5286)：373-376(1996)。
Bos，J，″人类癌症中的ras癌基因：综述″，Cancer Res.49：4682-4689(1989)。
Campbell，S.L.等，″Ras信号传导的增加的复杂性″，Oncogene17：1395-1413(1998)。
Chandron和Nibert，″通过烷基硫酸酯洗涤剂阻断对呼肠孤病毒衣壳蛋白mul和mulC的蛋白酶裂解，导致了新型的感染性亚毒粒颗粒″，J.of Virology 72(1)：467-75(1998)。
Chang等，J.Virol.69：6605-6608(1995)。
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在上面以及在本申请的其他地方引用的所有文献，专利和专利申请都以它们的整体形式以相同的程度收作本文参考，就如同每一份文献，专利申请或专利被专门地和单独指明被以它的整体形式收作本文参考一样。
发明背景
随着在肿瘤学和细胞生物学领域的最新发展，研究者业已能够开始专门针对癌症的潜在原因的药物开发，特别是如果所述原因是特殊基因产物的缺陷或突变。因此，如果临床医生具有确定每一个癌症患者的癌的原因的工具的话，就可以选择针对特定原因定制的具有优化效力的治疗方案。
Ras癌基因导致了大部分的肿瘤。Ras基因本身的激活突变出现在大约30％的所有人类肿瘤中(Bos，J.L.，1989)，主要出现在胰腺癌(90％)，散发性结直肠癌(50％)和肺癌(40％)，以及髓细胞白血病(30％)中。除了ras基因本身的突变之外，ras途径中在ras上游或下游的因子的激活同样与肿瘤相关。例如，HER2/Neu/ErbB2或表皮生长因子(EGF)受体的超量表达在乳腺癌中是常见的(25-30％)，而血小板衍生的生长因子(PDGF)受体或EGF受体的超量表达在神经胶质瘤和成胶质细胞瘤中是占优势的(40-50％)。已知EGF受体和PDGF受体在与它们相应的配体结合时都能激活ras，并且v-erbB编码缺乏细胞外结构域的组成型激活的受体。总之，在所述ras途径中的ras癌基因或上游因子的直接突变被认为出现在大约2/3的所有肿瘤中。
由于ras途径在肿瘤发生中发挥重要作用，需要能够确定肿瘤是否与ras途径的激活相关，以便可以开发专门定制的治疗方案。不过，在本发明之前，还没有诊断癌症与ras途径的关系的简单的和灵敏的方法。尽管在ras结构基因上的突变可以通过聚合酶链式反应(PCR)以高的灵敏度检测，在所述ras途径中存在很多其他因子，这些因子可能是造成高的ras活性的原因，如在ras基因旁侧序列上的突变会导致ras基因产物的异常的高表达水平，在ras途径中的ras的上游或下游的因子的结构基因上的突变，或能影响所述上游或下游因子的表达水平的调控突变。因此，用于ras基因的PCR不能精确地鉴定与ras途径相关的所有癌症。仍然需要诊断ras激活的肿瘤的简单而又精确的方法。
发明概述
本发明提供了使用呼肠孤病毒或其他类似的肿瘤消解病毒诊断具有特定表型的肿瘤，特别是通过ras途径的异常高的活性介导的肿瘤的方法。呼肠孤病毒不能在正常细胞中复制。不过，呼肠孤病毒能选择性地在具有激活的ras途径的细胞中复制，这会导致所述细胞的死亡。所述细胞中的ras途径可能由于ras结构基因的突变或在所述ras途径中的会导致该途径激活的任何其他因素的异常性。因此，至少部分由于ras途径活性升高而导致成为肿瘤的细胞可以通过它对呼肠孤病毒复制的易感性进行诊断。
因此，本发明的一方面提供了检测生物学样品中的ras激活的肿瘤细胞的方法，包括让所述样品与呼肠孤病毒接触，并且测定所述呼肠孤病毒在所述样品中复制的能力，其中，所述呼肠孤病毒复制的能力表明了ras激活的肿瘤细胞在所述样品中的存在。
所述生物学样品优选来自哺乳动物，特别是人类。任何能够在ras激活的细胞中复制的呼肠孤病毒都可用于本发明，例如，哺乳动物呼肠孤病毒或禽呼肠孤病毒。所述哺乳动物呼肠孤病毒优选是血清型3呼肠孤病毒，更优选是Dearing株呼肠孤病毒。
在优选实施方案中，所述生物学样品来自携带选自下组的肿瘤的动物：肺癌，前列腺癌，结直肠癌，甲状腺癌，肾癌，肾上腺癌，肝癌，胰腺癌，乳腺癌，造血细胞癌以及中枢和外周神经系统癌。
本发明的另一方面提供了诊断动物体内ras激活的肿瘤的方法，包括：
(a)从所述动物体内取出生物学样品，其中，所述样品包括细胞；
(b)在允许所述呼肠孤病毒在ras-激活的细胞中复制的条件下让所述样品与呼肠孤病毒接触；
(c)测定所述呼肠孤病毒在所述样品中复制的能力；和
(d)如果所述呼肠孤病毒能够在所述样品中复制，确定所述动物具有ras-激活的肿瘤。
所述动物优选是哺乳动物，特别是人类。任何能在ras-激活的细胞中复制的呼肠孤病毒都可用于本发明，例如，哺乳动物呼肠孤病毒或禽呼肠孤病毒。所述哺乳动物呼肠孤病毒优选是血清型3呼肠孤病毒，更优选是Dearing株呼肠孤病毒。
在优选实施方案中，所述生物学样品来自携带选自下组的肿瘤的动物：肺癌，前列腺癌，结直肠癌，甲状腺癌，肾癌，肾上腺癌，肝癌，胰腺癌，乳腺癌，造血细胞癌以及中枢和外周神经系统癌。
本发明的另一方面提供了诊断动物体内ras激活的肿瘤的方法，包括：
(a)确定所述动物体内的ras-激活的肿瘤，包括取出一组来自所述动物的细胞，在允许呼肠孤病毒在ras-激活的细胞中复制的条件下，让所述细胞与呼肠孤病毒接触，并且如果呼肠孤病毒能够在所述细胞中复制，确定所述细胞为包括ras-激活的肿瘤细胞；和
(b)给所述动物施用有效量的对ras-激活的肿瘤具有选择性的治疗剂。
对ras-激活的肿瘤具有选择性的治疗剂优选是肿瘤消解病毒。所述肿瘤消解病毒优选是呼肠孤病毒，在VA1区发生突变的腺病毒，在K3L和/或E3L区发生突变的痘苗病毒，在OV20.0L基因上发生突变的副痘病毒属orf病毒，在NS-1基因上发生突变的流感病毒，在γ134.5基因上发生突变的疱疹病毒，在γ134.5基因上发生突变的疱疹病毒，水泡性口炎病毒(VSV)，或新城病毒。
对ras-激活的肿瘤具有选择性的其他治疗剂包括，但不局限于，法呢基转移酶抑制剂(FTIs)和RAF激酶抑制剂。
在本发明的任何实施方案中，所述呼肠孤病毒都可以是重组呼肠孤病毒。重组呼肠孤病毒可以通过用呼肠孤病毒的不同的亚型共同感染哺乳动物细胞而制备。重组呼肠孤病毒可以是天然存在的或非天然存在的。重组呼肠孤病毒可来自呼肠孤病毒的两种或两种以上株，特别是选自下组的呼肠孤病毒的两种或两种以上株：Dearing株，Abney株，Jones株，和Lang株。重组呼肠孤病毒还可能由于来自不同血清型的呼肠孤病毒的重排而产生，如选自下组的血清型：血清型1呼肠孤病毒，血清型2呼肠孤病毒和血清型3呼肠孤病毒。重组呼肠孤病毒可以包括天然存在的变体外被蛋白编码序列或突变的外被蛋白编码序列。
除了呼肠孤病毒之外，多种其他肿瘤消解病毒也对ras-激活的肿瘤具有选择性，因此，能够以与呼肠孤病毒相同的方式将它们用于实施本发明。这些病毒包括，但不局限于，在VA1区发生突变的腺病毒，在K3L和/或E3L区发生突变的痘苗病毒，在OV20.0L基因上发生突变的副痘病毒属orf病毒，在NS-1基因上发生突变的流感病毒，或在γ134.5基因上发生突变的疱疹病毒。因此，例如，本发明的一方面提供了检测生物学样品中的ras-激活的肿瘤细胞的方法，包括让所述样品与能够在PKR-缺陷型细胞中选择性复制的肿瘤消解病毒接触，并且确定所述病毒在所述样品中复制的能力，其中，所述病毒复制的能力表明了ras-激活的肿瘤细胞在所述样品中的存在。优选的是，所述肿瘤消解病毒选自下组：在VA1区发生突变的腺病毒，在K3L和/或E3L区发生突变的痘苗病毒，在OV20.0L基因上发生突变的副痘病毒属orf病毒，在NS-1基因上发生突变的流感病毒，和在γ134.5基因上发生突变的疱疹病毒。
不过，能够选择性地感染特定肿瘤细胞的很多其他肿瘤消解病毒也可以与呼肠孤病毒相同的方式用于本发明。例如，可将水泡性口炎病毒(VSV)用于诊断干扰素-抗性肿瘤，将ONYX-015病毒用于诊断p53-缺陷型病毒，将Δ24病毒用于诊断Rb-缺陷型肿瘤。不过，可用于本发明的肿瘤消解病毒优选不是腺病毒，尤其不是ONYX-015病毒。
本发明还提供了治疗或缓解干扰素-抗性肿瘤，p53-缺陷型肿瘤，或Rb-缺陷型肿瘤的方法，包括首先让从肿瘤获得的生物学样品与选自下组的病毒接触：VSV，ONYX-015和Δ24，然后根据阳性诊断用合适的治疗剂治疗肿瘤。
本发明的另一方面提供了包括呼肠孤病毒的试剂盒和用于检测呼肠孤病毒复制的装置。所述检测装置可以是对呼肠孤病毒的核酸具有特异性的一对引物，并且可任选包括用于PCR的试剂。所述检测装置还可以是对呼肠孤病毒蛋白具有特异性的抗体，以及诸如二级抗体的辅助试剂。所述检测装置还可以是适合在显微镜下观察受感染细胞的形态学的载玻片和染料，或病毒培养基和可用于测定呼肠孤病毒滴度的细胞。类似的，本发明还提供包括能够在特定肿瘤细胞中复制的其他病毒的试剂盒，以及用于检测所述病毒复制的装置。所述病毒的例子包括，但不局限于，VSV，ONYX-015病毒，和Δ24病毒。
本发明的另一方面提供了包括至少两种病毒的试剂盒，所述病毒可用对于本发明的肿瘤进行表型分析。所述病毒优选对具有不同表型的肿瘤具有选择性。所述病毒优选选自下组：呼肠孤病毒，VSV，ONYX-015病毒，和Δ24病毒。
本发明的另一方面提供了包括可用于诊断具有特定表型的肿瘤的病毒的试剂盒，以及对所述肿瘤具有选择性的治疗剂。
另外，由于肿瘤消解病毒能选择性地在肿瘤细胞中复制，但不能在正常细胞中复制，本发明的另一方面提供了诊断肿瘤在哺乳动物体内存在的方法，该方法包括让来自所述哺乳动物的细胞样品与肿瘤消解病毒接触，其中，所述病毒在所述样品中复制的能力表明了肿瘤在所述哺乳动物体内的存在。
通过阅读本申请的整个说明书可以理解本发明的其他方面。
发明详述
本发明提供了利用肿瘤消解病毒诊断具有特定表型的肿瘤的方法。具体地讲，通过ras途径的异常高活性介导的肿瘤可以使用呼肠孤病毒诊断。呼肠孤病毒不能在正常细胞中复制。不过，呼肠孤病毒能选择性地在具有激活的ras途径的细胞中复制，这会导致所述细胞死亡。因此，可以通过它对呼肠孤病毒复制的易感性，诊断ras-激活的肿瘤。然后，所述诊断能以更高的效率促进所述肿瘤的治疗或缓解。
本发明还可应用于诊断和/或治疗或缓解其他肿瘤，如干扰素-抗性肿瘤，p53-缺陷型肿瘤和Rb-缺陷型肿瘤。还提供了可用于本文所披露的诊断或治疗的试剂盒。
在更详细地说明本发明之前，对本申请所使用的术语进行以下定义，除非另有说明。
定义
在本文中，“肿瘤细胞”又被称为“具有增殖失调的细胞”表示不具有正常的生长抑制特性的增殖的细胞。包括肿瘤细胞的新的生长是“肿瘤”或“瘤”。肿瘤是异常的组织生长，通常会形成独特的团块，它是通过比正常组织生长更快的细胞增殖生长的。肿瘤可能表现出结构组构和与正常组织的功能性协调的部分或全面缺乏。在本文中，肿瘤意在包括造血肿瘤以及实体瘤。
肿瘤可以是良性的(良性肿瘤)或恶性肿瘤(恶性肿瘤或癌症)。恶性肿瘤可大体上划分成三种主要类型。由上皮结构产生的恶性肿瘤被称为癌，源于诸如肌肉，软骨，脂肪或骨骼的结缔组织的恶性肿瘤被称为内瘤，而影响包括免疫系统的成分在内的造血结构(与血细胞的形成相关的结构)的恶性肿瘤被称为白血病和淋巴瘤。其他肿瘤包括但不局限于多发性神经纤维瘤。
″PKR缺陷型细胞″是其中的PKR不能像在正常细胞中那样激活的细胞。所述PKR缺陷可能是由于，例如，在PKR基因上的突变或降低的PKR蛋白水平或活性。例如，ras-激活的肿瘤细胞是PKR缺陷型，因为激活的ras途径阻断了PKR的磷酸化。对PKR蛋白或活性水平的测定为本领域所公知。
在本文中，″ras-激活的肿瘤细胞″或″ras-介导的肿瘤细胞″表示能够以异常高的速度增殖的细胞，这部分是由于ras途径的激活。所述ras途径可以通过ras基因结构突变，ras基因表达水平的升高，ras基因信使的稳定性升高，或会导致ras激活的任何突变或其他机制或ras途径中的ras下游或上游的因子而激活，从而提高ras途径活性。例如，EGF受体，PDGF受体或Sos的激活，导致了ras途径的激活。Ras介导的肿瘤包括，但不局限于Ras-介导的肿瘤细胞，它是由于ras途径的激活而以恶性方式增殖的细胞。
″ras-激活的肿瘤″是其中的ras途径被激活的肿瘤。
″干扰素-抗性肿瘤″或″具有干扰素抗性表型的肿瘤″是不能够用干扰素-α，β或γ治疗或缓解的肿瘤。
″p53-缺陷型肿瘤″或″具有p53-缺陷的表型的肿瘤″是其中的细胞肿瘤抑制剂p53水平低于正常细胞的肿瘤。
″Rb-缺陷型肿瘤″或″具有Rb-缺陷的表型的肿瘤″是其中的细胞肿瘤抑制剂Rb水平低于正常细胞的肿瘤。
″肿瘤消解病毒″是能选择性地杀伤肿瘤细胞的病毒。肿瘤细胞的杀伤可以通过在本领域建立的任何方法检测，如测定活细胞计数，细胞病理效应，肿瘤细胞的程序死亡，病毒蛋白在肿瘤细胞中的合成(例如，通过代谢标记，病毒蛋白的Western分析，或复制所必需的病毒基因的逆转录聚合酶链式反应)，或肿瘤尺寸的减少。
在本文中，″呼肠孤病毒″表示被归入呼肠孤病毒属的任何病毒。呼肠孤病毒的名称(呼吸道和肠道孤儿病毒)是表示所述病毒的说明性的只取首字母的缩写词，尽管与人类的任何已知的疾病状态不相关，可以从呼吸道和肠道中分离。术语“呼肠孤病毒”是被归入呼肠孤病毒属的所有病毒。
呼肠孤病毒包括三种血清型：1型(Lang或T1L株)，2型(Jones，T2J株)和3型(Dearing株或Abney，T3D株)。根据中和作用和血细胞凝集素-抑制测定可方便地识别这三种血清型(例如，参见Nibert等，1996)。
所述呼肠孤病毒可以是天然存在的或修饰过的。当呼肠孤病毒是从天然来源中分离的并且没有通过人类在实验室中进行有意的修饰时呼肠孤病毒是“天然存在的”。例如，呼肠孤病毒可来自“野外资源”，就是说，来自业已受到呼肠孤病毒感染的人类。
可以对呼肠孤病毒进行修饰，但仍然能够裂解性地感染具有活性ras途径的哺乳动物细胞。在给所述增殖细胞施用之前，可以对呼肠孤病毒进行化学或生物化学预处理(例如，用蛋白酶处理，如胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶)。用蛋白酶预处理除去了所述病毒的外被或衣壳，并且能够提高所述病毒的感染力。可以将呼肠孤病毒包在脂质体或胶束中(Chandron和Nibert，1998)，以便减弱或抑制来自业已产生了对呼肠孤病毒的免疫力的哺乳动物的免疫反应。例如，可以在存在胶束的条件下用胰凝乳蛋白酶处理毒粒，形成烷基硫酸酯洗涤剂的浓度，以便产生新的传感性亚毒粒颗粒。
所述呼肠孤病毒可以是重组呼肠孤病毒，它来自两种或两种以上遗传学上不同的呼肠孤病毒的基因组片段的重组/重排。所述重组呼肠孤病毒可来自两种或两种以上类型的具有不同的病理学表型的呼肠孤病毒，以便它包括不同的抗原性决定簇，因此减弱或抑制了以前接触过呼肠孤病毒亚型的哺乳动物的免疫反应。与原始呼肠孤病毒相比，重组呼肠孤病毒还可以具有不同的生物学活性(例如在肿瘤细胞中的复制活性和生物分布)。呼肠孤病毒基因组片段的重组/重排可以在至少两种遗传学上不同的呼肠孤病毒感染宿主生物之后自然发生。重组毒粒还可以在细胞培养物中制备，例如，通过用遗传学上不同的呼肠孤病毒共同感染许可宿主细胞(Nibert等1996)。
因此，本发明涉及通过两种或两种以上遗传学上不同的呼肠孤病毒的基因组片段的重排所产生的重组呼肠孤病毒的用途，包括，但不局限于人类呼肠孤病毒，如1型(例如，Lang株)，2型(例如，Jones株)，和3型(例如，Dearing株或Abney株)，非人哺乳动物呼肠孤病毒，或禽呼肠孤病毒。本发明还涉及通过两种或两种以上遗传学上不同的呼肠孤病毒的基因组片段的重排所产生的重组呼肠孤病毒的用途，其中，至少一种亲本病毒是通过遗传工程改造的，包括一个或多个化学合成的基因组片段，业已用化学或物理诱变剂处理过，或它本身就是重组事件的结果。本发明还涉及在存在化学诱变剂或物理诱变剂的条件下发生了重组的重组呼肠孤病毒的用途，所述化学诱变剂包括，但不局限于硫酸二甲酯和溴化乙锭，所述物理诱变剂包括，但不局限于紫外线和其他形式的辐射。
本发明还涉及在一个或多个基因组片段中包括缺失或重复的重组呼肠孤病毒，由于与宿主细胞基因组重组的结果，它包括额外的遗传学信息，或它包括合成基因。
对肿瘤进行″表型分析″表示按照它的表型对肿瘤分类。例如，肿瘤表型包括ras途径激活，干扰素-抗性，p53-缺陷和Rb-缺陷。所述表现型不是彼此排斥的，就是说一种肿瘤可能从表型上划分成一种以上类型。
″生物学样品″是从诸如动物的生物学对象体内采集的样品。
″有效量″是足以实现预期目的的量。例如，用于治疗或缓解疾病或医学状况的目的的呼肠孤病毒的有效量是足以导致疾病症状或医学状况减弱或完全消除的用量。特定治疗剂的有效量可以根据一些因素而改变。如所述试剂的性质，施用途径，接受所述治疗剂的动物的体形和肿瘤，以及施用的目的。每一个个体的有效量可以由本领域技术人员根据本领域业已建立的方法凭经验确定。
疾病或医学状况的″治疗或缓解″表示疾病症状或医学状况的减轻或完全消除。
如果一种试剂对特定的疾病或医学状况比对其他疾病或医学状况更有效，该治疗剂就对所述疾病或医学状态“具有选择性”。类似的，如果与其他肿瘤细胞相比，一种试剂能够以更高的效率杀死特定类型的肿瘤细胞，这种治疗剂就对所述特定类型的肿瘤细胞具有选择性。
方法
本发明可用于对肿瘤进行精确的表型分析，以便有利于针对特殊肿瘤定制的治疗方案的开发。在优选实施方案中，利用呼肠孤病毒感染从携带肿瘤的动物体内获得的生物学样品。由于呼肠孤病毒能选择性地感染ras-激活的肿瘤细胞，而不能感染正常细胞，或其中的ras途径没有激活的肿瘤细胞，本发明方法使得实施者能够精确地确定所述肿瘤是否与ras途径激活相关。如果诊断出ras激活，就可以用ras-特异性治疗方案对所述肿瘤进行治疗。如呼肠孤病毒治疗(美国专利号6,136,307)。
所述ras途径是一种复杂的信号传导途径，它会导致细胞增殖。Ras是该途径的中继站，它能接收来自上游因子的信号(例如，生长因子受体)，并且将所述信号传递给下游因子。
诸如表皮生长因子(EGF)受体，血小板衍生的生长因子(PDGF)受体以及EGF受体-相关的分子(例如Her-2/Neu/ErbB2)的很多生长因子受体都具有内在的酪氨酸激酶活性，该活性是通过配体诱导的受体二聚体化激活的。由此导致了酪氨酸残基上的所述受体的自体磷酸化，和含有Src-同源性2(SH2)结构域的蛋白的结合。两种这样的SH2是Grb2和SHC，它们间接地激活了与质膜相关的，小型GTP-结合蛋白Ras。Ras激活还可以反应于对七次跨膜结构域G-蛋白偶联的受体的配体而发生(例如，Gutkind，1998)。Ras和其他生长因子受体-调控的信号传导途径的激活，最终导致了细胞骨架和细胞增殖，分化，和转化所必需的基因表达的改变(由Campbell等进行了综述，1998)。
三种人ras基因(Ha-Ras，N-Ras，和Ki-Ras)编码4种蛋白(由于Ki-Ras mRNA的可变剪接)。在正常情况下，Ras蛋白在活性(GTP-结合)状态和失活(GDP-结合)状态下循环。Ras激活是通过结合的GDP交换成GTP而进行的，这一过程是通过一个家族的鸟嘌呤核苷酸交换因子促进的。Ras失活是通过结合的GTP水解成GDP实现的。该反应是通过GTPase激活蛋白(GAPs)促进的。在很多人类癌症中，Ras蛋白通过破坏其GTPase活性的突变而被致癌性激活，并因此下调Ras信号传导(参见Campbell等的综述，1998)。
存在多种候选ras效应物，它能够在信号传导和致癌转化中在ras下游起作用，包括小GTPase的Rho家族的成员，磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶c-Raf-1(由Campbell等进行了综述，1998)。Raf-介导的信号传导是表征最清楚的Ras效应物途径。激活的Ras将Raf募集到细胞膜上，在这里发生了Raf激活。激活的Raf是激酶级联系统-有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)级联系统的起始成分。Raf能对MEKI和MEK2(MAPK/ERK激酶)蛋白激活进行磷酸化和激活，随后又能使细胞外信号调控的激酶ERK1和ERK2(又被称为MAPK1和MAPK2)磷酸化和激活。与它们的下游目标不同，ERK1，2，MEK1，2蛋白是高度特异性的酶，它们唯一的已知的底物是ERK1，2蛋白。在激活时ERK1和ERK2能将多种靶蛋白，包括细胞核转录因子磷酸化(并因此对它们进行调控)，导致最终的细胞反应。
因此，多种事件可以导致ras途径的激活，例如，可以在三个ras结构基因中的任意一个上发生突变。结构突变还可以发生在ras上游的受体上，ras下游的信号传导物(如raf或mek1，2)，或所述最终效应物MAPK1和2。类似地，能导致任何蛋白在ras途径中的异常高水平的表达的调控突变，还可能导致产生有丝分裂的细胞反应。所述调控突变可能在ras途径成员的调控序列中的任何地方发生，或者甚至是在能控制ras途径成员的表达的因子的结构或调控部分发生。因此，检测ras途径中的任何特殊成员的异常性，不是确定ras途径是否被激活的有效方法。
可以测定MAPK，ras途径的最终效应物的活性，因为MAPK的组成性激活是ras途径激活的指标。不过，这样的生物化学途径需要大量的样品材料，以及诸如提取和/或部分纯化MAPK的烦琐的过程。
通过检测ras激活的表型而不是任何特殊基因或基因产物的异常，可以使用本发明，而无论是由于ras结构基因，ras基因的调控序列，或ras途径中的任何其他因子的突变。另外，本发明的方法比较简单，不必从所述样品中提取或纯化酶。
可以通过本领域的任何方法确定呼肠孤病毒感染样品中细胞的能力。例如，可以通过聚合酶链式反应测定呼肠孤病毒核酸复制，其中使用对呼肠孤病毒特异的引物；可以通过特异性抗体检测呼肠孤病毒蛋白合成；可以在显微镜下观察感染的细胞并且检测通过呼肠孤病毒诱导的细胞病理效应；以及可以从所述样品中收获复制的呼肠孤病毒，并且测定病毒效价，以便评估是否业已发生了病毒复制。确定呼肠孤病毒复制存在的其他方法为本领域普通技术人员所公知或者可以由这样的人员开发。
应当指出的是，肿瘤可能包括多种致癌的异常。具体地讲，业已报导了ras激活通常是通过乳腺癌中的p53超量表达促进的(Smith等，2000)。除了ras途径激活之外，还存在其他致癌的异常，不过，不会妨碍为ras-激活的肿瘤专门定制的治疗方案的能力。例如，即使细胞还包括异常高水平的p53，呼肠孤病毒仍然能选择性地杀伤ras-激活的肿瘤细胞。
另外，由于呼肠孤病毒能选择性地在ras-激活的肿瘤细胞复制，而不能在正常细胞中复制，本发明的另一方面提供了诊断肿瘤在哺乳动物体内的存在的方法，该方法包括在允许呼肠孤病毒在ras-激活的细胞中复制的条件下让来自所述哺乳动物的细胞样品与呼肠孤病毒接触，其中，所述呼肠孤病毒在所述样品中复制的能力表明了肿瘤在所述哺乳动物体内的存在。
与呼肠孤病毒类似，多种其他肿瘤消解病毒同样能选择性地在ras-激活的细胞中复制。考虑所述肿瘤消解病毒能够以与呼肠孤病毒相同的方式实施本发明。所述病毒通常是对双链RNA激活(PKR)敏感的突变体，而它们的野生型对应物对PKR是不敏感的。
正常情况下，当病毒进入细胞时，PKR被激活，并且阻断蛋白合成，而所述病毒不能在该细胞中复制。某些病毒业已形成了抑制PKR，并且促进病毒蛋白合成和病毒复制的系统。例如，腺病毒能生产大量的小RNA，VA1 RNA。VA1 RNA具有广泛的二级结构，并且与通常能激活PKR的双链RNA(dsRNA)竞争结合PKR。由于它需要最低长度的dsRNA激活PKR，VA1 RNA不能激活PKR。相反，通过它的较大的数量螯合PKR。结果是，没有阻断蛋白合成，并且腺病毒能够在所述细胞中复制。
Ras-激活的肿瘤细胞不能进行通过PKR抑制的蛋白合成，因为ras能使PKR失活。因此，所述细胞容易受病毒感染，即使所述病毒不具备PKR抑制系统。因此，如果腺病毒中的PKR抑制剂是突变的，以便不再能阻断PKR功能的话，由于PKR对蛋白合成的抑制，所得到的病毒不能感染正常的细胞，不过，它们能够在缺乏PKR活性的ras-激活的肿瘤细胞中复制。
因此，病毒是修饰过的或突变的，以便它不能抑制PKR功能，选择性地在ras-激活的肿瘤细胞复制，而正常细胞是具有抗性的。所述病毒优选是在VA1区发生突变的腺病毒，在K3L和/或E3L区发生突变的痘苗病毒，在OV20.0L基因上发生突变的副痘病毒属orf病毒，在NS-1基因上发生突变的流感病毒，或在γ134.5基因上发生突变的疱疹病毒。
所述病毒可以是按照病毒PKR抑制剂的已知结构-功能关系修饰过的或突变的。例如，由于E3蛋白的氨基末端区与PKR的羧基末端区结构域相互作用，该结构域的缺失或点突变能抑制抗PKR功能(Chang等，1992，1993，1995；Sharp等，1998；Romano等，1998)。痘苗病毒的K3L基因编码pK3，即PKR的假底物。在K3L中存在功能突变的丧失。在K3L蛋白上的与eIF-2上的79-83号残基同源的C-末端部分上出现的截短或点突变，破坏了PKR抑制活性(Kawagishi-Kobayashi等，1997)。
在本发明的另一种实施方案中，可以将水泡性口炎病毒(VSV)用于诊断干扰素-抗性肿瘤。干扰素是与细胞表面受体结合的循环因子，并最终在靶细胞中导致抗病毒反应和生长抑制和/或细胞程序死亡信号的诱导。尽管理论上讲，可以将干扰素用于抑制细胞的增殖，但是这种尝试并不是很成功，这是因为干扰素途径的成员的肿瘤特异性突变。
不过，通过破坏所述干扰素途径，以避免由干扰素产生的生长抑制作用，肿瘤细胞能够同时破坏它们的抗肿瘤反应。实际上，业已证实了VSV，那一种有外被的，反义RNA病毒能在存在干扰素的条件下，在多种人类肿瘤细胞系中快速复制并且杀死这些细胞，同时，正常的人类原代细胞培养物受到干扰素的明显保护。因此，可以将VSV用于诊断干扰素抗性，但仍然是VSV-敏感型的肿瘤。与呼肠孤病毒实施方案类似，基于VSV的诊断是对表现型的评估，并且不取决于干扰素抗性的机制。
在本发明的另一种实施方案中，可以将ONYX-015病毒用于诊断p53-缺陷型肿瘤。p53是一种有效的肿瘤抑制剂，它存在于所有细胞中，并且控制细胞生长。由于病毒复制取决于细胞增殖机制，它们会受到p53调控，并且不能过度复制。不过，某些腺病毒，SV40和人类乳头瘤病毒，包括能使p53失活的蛋白，从而允许它们自身复制(Nemunaitis 1999)。
对于腺病毒血清型5来说，该蛋白是由E1B区编码的55Kd的蛋白。如果编码该55kd蛋白的E1B区缺失，如在ONYX-015病毒中的情况(Bischoff等，1996；WO94/18992)，就不再存在55kd的p53抑制剂。结果，当ONYX-015进入正常细胞时，p53起到抑制细胞增殖和病毒复制的作用。因此，ONYX-015不能在正常细胞中复制。另一方面，在具有受到破坏的p53功能的肿瘤细胞中，ONYX-015能够复制，并最终导致所述细胞死亡。因此，可以将该病毒用于检测样品中的p53-缺陷型肿瘤细胞。本领域普通技术人员还可以使用建立的技术突变和破坏腺病毒5或其他病毒中的p53抑制剂的基因，并且将所得到的病毒用于本发明的方法中，用来诊断p53-缺陷型肿瘤。
类似地，可以将Δ24病毒用于诊断Rb-缺陷型肿瘤。Δ24病毒是在E1 A区具有24个碱基对缺失的突变型腺病毒(Fueyo等，2000)。该区负责与细胞肿瘤抑制剂Rb的结合并且抑制Rb功能，因此使得所述细胞增殖机制，以至病毒复制能够以不受控制的方式进行。Δ24在Rb结合区具有缺失，并且不能结合Rb。因此，在正常细胞中，突变型病毒的复制受到了Rb的抑制。不过，如果Rb是失活的，并且所述细胞成为肿瘤细胞，Δ24就不再受抑制。相反，突变型病毒能够有效复制并且裂解Rb-缺陷型细胞。因此，可以将Δ24病毒用于确定样品是否含有Rb-缺陷型肿瘤细胞。
对于ras-激活的肿瘤细胞来说，p53-缺陷型或Rb-缺陷型细胞可以是多种原因造成的。例如，p53或Rb的结构基因上的突变可能导致异常功能的基因产物或较差的翻译，发生在p53或Rb基因的调控序列上的突变，可能导致较低数量的转录，发生在p53或Rb基因的转录因子上的突变可能导致缺陷型p53或Rb生产，或出现在p53或Rb功能所必需的辅因子上的突变还可能导致p53或Rb-缺陷。由于本发明检测所述表型，而不是仅仅检测p53或Rb基因/蛋白的结构异常，它比诸如PCR的基于结构的方法更为有效。
一旦确定了肿瘤的表现型，就可以根据它的表现型对所述肿瘤进行治疗。例如，ras-激活的肿瘤可以通过呼肠孤病毒或ras途径的抑制剂治疗。因此，本发明还提供了治疗或缓解动物体内的ras-激活的肿瘤的方法，该方法包括鉴定所述动物体内的ras-激活的肿瘤，包括从所述动物体内除去一组细胞，在允许呼肠孤病毒在ras-激活的细胞中复制的条件下让所述细胞与呼肠孤病毒接触，如果呼肠孤病毒能够在所述细胞中复制，确定所述细胞为包括ras-激活的肿瘤细胞，并且给所述动物施用有效量的呼肠孤病毒。呼肠孤病毒疗法业已被公开，例如，参见美国专利号6,136,307。
另外，本发明还提供了治疗或缓解肿瘤的方法，该方法包括采集样品，鉴定具有VSV，Δ24或ONYX-015病毒的样品的表型，并且按照所述表型施用有效量的合适的治疗剂。所述治疗剂可以是病毒本身，或者，对于p53或Rb-缺陷来说，是p53或Rb功能的激活剂。应当指出的是，Δ24和ONYX-015仅仅是说明本发明用途的例子，本领域普通技术人员能够鉴定和开发可用于按照本发明所披露的方法诊断和治疗肿瘤的其他病毒。
对于呼肠孤病毒来说，其他肿瘤消解病毒免疫保护的或重排病毒的使用也属于本发明的范围。另外，除了在本发明中具体讨论的病毒之外，本领域普通技术人员可以按照本发明的说明和可以从本领域获得的知识用其他肿瘤消解病毒实施本发明。所述肿瘤消解病毒可以是以下病毒科的成员；肌尾病毒科，长尾病毒科，短尾病毒科，teciviridae，被盖病毒科，芽生病毒科，脂毛病毒科，fuselloviridae，痘病毒科，虹色病毒科，藻DNA病毒科，杆状病毒科，疱疹病毒科，腺病毒科，乳多空病毒科，多DNA病毒科，丝状病毒科，微小病毒科，双生病毒科，circoviridae，细小病毒科，嗜肝DNA病毒科，逆转录病毒科，cyctoviridae，呼肠孤病毒科，双RNA病毒科，副粘病毒科，棒状病毒科，线状病毒科，正粘病毒科，本杨病毒科，沙粒病毒科，轻小病毒科，小核糖核酸病毒科，sequiviridae，豇豆花叶病毒科，马铃薯Y病毒科，嵌杯状病毒科，星状病毒科，野田村病毒科，四病毒科，番茄丛矮病毒科，冠状病毒科，glaviviridae，外衣病毒科，或barnaviridae。
本发明可应用于任何动物，特别是哺乳动物。优选的哺乳动物包括狗，猫，绵羊，山羊，牛，马，猪，人和非人灵长类。最优选的哺乳动物是人。
试剂盒
本发明提供了可用于诊断和/或治疗肿瘤的试剂盒。本发明的一方面提供了包括呼肠孤病毒的试剂盒，以及用于检测呼肠孤病毒复制的装置。所述检测装置可以是对呼肠孤病毒的核酸特异的一对引物，并且可任选包括用于PCR的试剂。所述检测装置还可以是对呼肠孤病毒蛋白特异的抗体，并且可以任选包括诸如二级抗体的辅助试剂。所述检测装置还可以是适合在显微镜下观察受感染的细胞形态学的载玻片和染料，或可用于测定呼肠孤病毒滴度的病毒培养基和细胞。类似地，本发明还提供了包括能够在特殊肿瘤细胞中复制的其他病毒的试剂盒，以及用于检测所述病毒复制的装置。所述病毒的例子包括，但不局限于VSV，ONYX-015，和Δ24病毒。
本发明的另一方面提供了包括至少两种病毒的试剂盒，可将该试剂盒用于按照本发明的方法对肿瘤进行表型分类。所述病毒优选选自下组：呼肠孤病毒，VSV，ONYX-015病毒，和Δ24病毒。
提供下列的实施例是为了说明本发明，而不被认为以任何方式限定本发明的范围。
实施例
在下面的实施例中，以下缩略语具有以下含义。没有定义的缩略语具有它们的被普遍认可的含义。
℃＝摄氏度
hr＝小时
min＝分钟
μM＝微摩尔
mM＝毫摩尔
M＝摩尔
ml＝毫升
μl＝微升
mg＝毫克
μg＝微克
PAGE＝聚丙烯酰胺凝胶电泳
rpm＝每分钟转速
FBS＝胎牛血清
DTT＝二硫苏糖醇
SDS＝十二烷基硫酸钠
PBS＝磷酸缓冲的盐溶液
DMEM＝Dulbecco′s修饰的Eagle′s培养基
α-MEM＝α-修饰的Eagle′s培养基
β-ME＝β-巯基乙醇
MOI＝感染复数
PFU＝噬斑形成单位
EGF＝表皮生长因子
PDGF＝血小板衍生的生长因子
CPE＝细胞病理效应
VSV＝水泡性口炎病毒
PCR＝聚合酶链式反应
SH2＝src-同源性2
                               实施例1
具有呼肠孤病毒的肿瘤表型分析
当65岁的女性进行定期的乳房X-光照相时发现了肿块。在生物活组织检查期间从所述肿块上采集样品，并且表现为恶性肿瘤。为了确定所述肿瘤是否含有ras-激活的细胞，将所述样品放置在细胞培养基中，并且与呼肠孤病毒一起培养。
将血清型3呼肠孤病毒的Dearing株放置在按照Smith等的方法纯化的L-929细胞的悬浮培养液中繁殖(Smith等，1969)，所不同的是，从提取缓冲液中去掉了β-巯基乙醇(β-ME)。纯化的呼肠孤病毒的颗粒/PFU比例通常为100/1。在DMEM中将所述生物活组织样品切碎，在37℃下与呼肠孤病毒一起培养2小时，更换新的补充了20％FBS的DMEM，并且培养48小时。然后，收集该培养液的上清液，并且测定呼肠孤病毒滴度。结果表明呼肠孤病毒业已在所述样品中复制。因此，所述乳腺肿瘤包括ras-激活的肿瘤细胞。

Claims (33)

1.一种检测生物学样品中的ras-激活的肿瘤细胞的方法，包括让所述样品与呼肠孤病毒接触，并且测定所述呼肠孤病毒在所述样品中复制的能力，其中，所述呼肠孤病毒复制的能力表明了ras-激活的肿瘤细胞在所述样品中的存在。
2.如权利要求1的方法，其中，所述生物学样品来自哺乳动物。
3.如权利要求2的方法，其中，所述哺乳动物是人。
4.如权利要求1的方法，其中，所述呼肠孤病毒是哺乳动物呼肠孤病毒。
5.如权利要求4的方法，其中，所述哺乳动物呼肠孤病毒是血清型3呼肠孤病毒。
6.如权利要求5的方法，其中，所述血清型3呼肠孤病毒是Dearing株呼肠孤病毒。
7.如权利要求1的方法，其中，所述呼肠孤病毒是禽呼肠孤病毒。
8.如权利要求1的方法，其中，所述生物学样品来自携带选自下组的肿瘤的动物：肺癌，前列腺癌，结直肠癌，甲状腺癌，肾癌，肾上腺癌，肝癌，胰腺癌，乳腺癌，造血细胞癌以及中枢和外周神经系统癌。
9.一种诊断动物体内的ras-激活的肿瘤的方法，包括：
(a)提供来自所述动物的生物学样品，其中，所述样品包括细胞；
(b)在允许所述呼肠孤病毒在ras-激活的细胞中复制的条件下让所述样品与呼肠孤病毒接触；
(c)测定所述呼肠孤病毒在所述样品中复制的能力；和
(d)如果所述呼肠孤病毒能够在所述样品中复制，确定所述动物具有ras-激活的肿瘤。
10.如权利要求9的方法，其中，所述动物是人。
11.如权利要求9的方法，其中，所述呼肠孤病毒是哺乳动物呼肠孤病毒。
12.如权利要求11的方法，其中，所述哺乳动物呼肠孤病毒是血清型3呼肠孤病毒。
13.如权利要求12的方法，其中，所述血清型3呼肠孤病毒是Dearing株呼肠孤病毒。
14.如权利要求9的方法，其中，所述病毒是禽呼肠孤病毒。
15.如权利要求9的方法，其中，所述生物学样品来自选自下组的肿瘤：肺癌，前列腺癌，结直肠癌，甲状腺癌，肾癌，肾上腺癌，肝癌，胰腺癌，乳腺癌，造血细胞癌以及中枢和外周神经系统癌。
16.一种治疗或缓解动物体内的ras-激活的肿瘤的方法，包括：
(a)确定所述动物体内的ras-激活的肿瘤，包括提供一组来自所述动物的细胞，在允许呼肠孤病毒在ras-激活的细胞中复制的条件下，让所述细胞与呼肠孤病毒接触，并且如果呼肠孤病毒能够在所述细胞中复制，确定所述细胞为包括ras-激活的肿瘤细胞；和
(b)给所述动物施用有效量的对ras-激活的肿瘤具有选择性的治疗剂。
17.如权利要求16的方法，其中，所述治疗剂是选自下组的肿瘤消解病毒：呼肠孤病毒，在VA1区发生突变的腺病毒，在K3L和/或E3L区发生突变的痘苗病毒，在OV20.0L基因上发生突变的副痘病毒属orf病毒，在NS-1基因上发生突变的流感病毒，和在γ134.5基因上发生突变的疱疹病毒。
18.如权利要求16的方法，其中，所述动物是人。
19.如权利要求18的方法，其中，所述哺乳动物是人。
20.如权利要求16的方法，其中，所述呼肠孤病毒是哺乳动物呼肠孤病毒或禽呼肠孤病毒。
21.如权利要求16的方法，其中，所述呼肠孤病毒是Dearing株呼肠孤病毒。
22.如权利要求16的方法，其中，所述生物学样品所述生物学样品来自选自下组的肿瘤：肺癌，前列腺癌，结直肠癌，甲状腺癌，肾癌，肾上腺癌，肝癌，胰腺癌，乳腺癌，造血细胞癌以及中枢和外周神经系统癌。
23.一种诊断肿瘤在哺乳动物体内存在的方法，包括让来自所述哺乳动物的细胞样品与肿瘤消解病毒接触，其中，所述病毒在所述样品中复制的能力，表明了肿瘤在所述哺乳动物体内的存在。
24.如权利要求23的方法，其中，所述病毒选自下组的呼肠孤病毒：在VA1区发生突变的腺病毒，在K3L和/或E3L区发生突变的痘苗病毒，在OV20.0L基因上发生突变的副痘病毒属orf病毒，在NS-1基因上发生突变的流感病毒，在γ134.5基因上发生突变的疱疹病毒，水泡性口炎病毒，ONYX-015病毒，和Δ24病毒。
25.一种检测生物学样品中的具有特定表型的肿瘤细胞的方法，包括让所述样品与能够在具有所述特定表型的肿瘤细胞中选择性地复制的肿瘤消解病毒接触，并且确定所述病毒在所述样品中复制的能力，其中，所述病毒复制的能力表明了具有所述特定表型的肿瘤细胞在所述样品中的存在。
26.如权利要求25的方法，其中，所述特定表型选自下组：干扰素-抗性，p53-缺陷，Rb-缺陷，和PKR-缺陷。
27.如权利要求25的方法，其中，所述病毒选自下组：
(a)水泡性口炎病毒；
(b)ONYX-015病毒；
(c)Δ24病毒；和
(d)选自下组的病毒：在VA1区发生突变的腺病毒，在K3L和/或E3L区发生突变的痘苗病毒，在OV20.0L基因上发生突变的副痘病毒属orf病毒，在NS-1基因上发生突变的流感病毒，和在γ134.5基因上发生突变的疱疹病毒。
28.一种诊断动物体内的具有特定表型的肿瘤的方法，包括：
(a)提供来自所述动物的生物学样品，其中，所述样品包括细胞；
(b)让所述样品与能选择性地在具有所述特定表型的肿瘤细胞中复制的肿瘤消解病毒接触；
(c)确定所述病毒在所述样品中复制的能力；和
(d)如果所述病毒能够在所述样品中复制，确定所述动物为携带具有所述特定表型的肿瘤的动物。
29.如权利要求28的方法，其中，所述特定表型选自下组：干扰素-抗性，p53-缺陷，Rb-缺陷，和PKR-缺陷。
30.如权利要求28的方法，其中，所述病毒选自下组：
(i)水泡性口炎病毒；
(ii)ONYX-015病毒；
(iii)Δ24病毒；和
(iv)选自下组的病毒：在VA1区发生突变的腺病毒，在K3L和/或E3L区发生突变的痘苗病毒，在OV20.0L基因上发生突变的副痘病毒属orf病毒，在NS-1基因上发生突变的流感病毒，和在γ134.5基因上发生突变的疱疹病毒。
31.一种治疗或缓解动物体内的具有特定表型的肿瘤的方法，包括：
(a)确定所述动物体内的具有特定表型的肿瘤，包括提供来自所述动物的一组细胞，让所述细胞与能选择性地在所述具有所述特定表型的肿瘤细胞中复制的肿瘤消解病毒接触，并且如果所述病毒能够在所述细胞中复制，确定所述细胞为包括具有所述特定表型的肿瘤；
(b)给所述动物施用有效量的对具有所述特定表型的肿瘤细胞具有选择性的治疗剂。
32.如权利要求31的方法，其中，所述特定表型选自下组：干扰素-抗性，p53-缺陷，Rb-缺陷，和PKR-缺陷。
33.如权利要求31的方法，其中，所述病毒选自下组：
(i)水泡性口炎病毒；
(ii)ONYX-015病毒；
(iii)Δ24病毒；和
(iv)选自下组的病毒：在VA1区发生突变的腺病毒，在K3L和/或E3L区发生突变的痘苗病毒，在OV20.0L基因上发生突变的副痘病毒属orf病毒，在NS-1基因上发生突变的流感病毒，和在γ134.5基因上发生突变的疱疹病毒。
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