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GEBIET DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft Verfahren für
den Nachweis der einem Tumor zugrunde liegenden Ursachen, insbesondere
die Verwendung eines Reovirus in der Diagnostik von ras-aktivierten
Tumoren. Zusätzlich
können
auch andere onkolytische Viren mit unterschiedlichen Selektivitäten in der
Diagnostik von bestimmten Tumortypen verwendet werden.
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LITERATURNACHWEIS
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U.S. Patent Nr. 6,136,307.
- WO 94/18992 , veröffentlicht
1. September 1994 Bischoff JR. et al., "An Adenovirus Mutant that Replicates
Selectively in p53-Deficient
Human Tumor", Science
274(5286):373-376 (1996).
- Bos, J, "ras
oncogenes in human cancer: a review", Cancer Res. 49:4682-4689 (1989).
- Campbell, S.L. et al., "Increasing
complexity of Ras signaling",
Oncogene 17: 1395-1413 (1998).
- Chandron und Nibert, "Protease
cleavage of reovirus capsid Protein mu 1 and mu 1C is blocked by
alkyl sulfate detergents, yielding a new type of infectious subvirion
particle", J. of
Virology 72(1):467-75 (1998).
- Chang et al., J. Virol. 69:6605-6608 (1995).
- Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:4825-4829 (1992).
- Chang et al., Virol. 194:537-547 (1993).
- Fueyo, J., et al., "A
Mutant Oncolytic Adenovirus Targeting the Rb Pathway Produces Anti-Glioma
Effect in Vivo",
Oncogene 19(1):2-12 (2000).
- Gutkind, J.S., "The
pathways connecting G protein-coupled receptors to the nucleus through
divergent mitogen-activated Protein kinase cascades", J Biol Chem. 273:1839-1842
(1998).
- Kawagishi-Kobayashi, M. et al., Mol. Cell. Biol. 17:4146-4158
(1997).
- Nemunaitis, J., "Oncolytic
viruses", J. Invest.
New Drugs 17:375-386 (1999).
- Nibert, M.L., Schiff, L.A., and Fields, B.N., "Reoviruses and their
replication", Seiten
1557-96 in Virology (Fields et al., 3te Ausgabe), Lippencott-Raven Press,
1996.
- Romano et al., Mol. Cell. Bio. 18(12):7304-7316 (1998).
- Sharp et al., Virology 250:302-315 (1998).
- Smith, R.E., et al., "Polypeptide
components of virions, top component and cores of reovirus type
3", Virology, 39:791-800
(1969).
- Smith, C.A. et al., "Correlations
among p53, Her-2/neu, and ras overexpression and aneuploidy by multiparameter
flow cytometry in human breast cancer: evidence for a common phenotypic
evolutionary pattern in infiltrating ductal carcinomas", Clin Cancer Res.
6(1):112-26 (2000).
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Durch
die neuesten Entwicklungen auf dem Gebiet der Onkologie und Zellbiologie,
haben Forscher die Möglichkeit
bekommen, Programme für
die Arzneimittelentwicklung einzusetzen, die spezifisch die dem
Krebs zugrunde liegenden Ursachen zum Ziel haben, insbesondere wenn
die Ursache im Fehlen von oder in einer Mutation von spezifischen
Genprodukten liegt. Wenn Ärzten
das Handwerkzeug zur Bestimmung der Ursache von Krebs für jeden
Krebspatienten zur Verfügung
steht, kann daher ein Behandlungsplan ausgesucht werden, der auf
die spezifische Ursache zugeschnitten ist und eine optimierte Wirksamkeit
aufweist.
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Das
ras-Onkogen ist für
eine große
Zahl von Tumoren verantwortlich. Aktivierende Mutationen des ras-Gens
selbst kommen in etwa 30% aller menschlicher Tumore vor (Bos. J.L.,
1989), in erster Linie bei Bauchspeicheldrüsenkrebs (90%), sporadischem
Kolorektalkrebs (50%) und Lungenkrebs (40%) sowie bei myeloischer
Leukämie
(30%). Zusätzlich
zu den Mutationen des ras-Gens selbst steht auch die Aktivierung
von Faktoren stromaufwärts oder
stromabwärts
von ras im ras-Signalweg mit Tumoren in Zusammenhang. Zum Beispiel
ist bei Brustkrebs die Überexpression
von HER2/Neu/ErbB2 oder des epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)-Rezeptors
häufig
(25–30%),
und in Gliomen und Glioblastomen ist die Überexpression des Blutplättchen-Wachstumsfaktor
(PDGF)-Rezeptors oder EGF-Rezeptors vorherrschend (40–50%). Sowohl der
EGF-Rezeptor als auch der PDGF-Rezeptor sind dafür bekannt, nach dem Binden
ihrer entsprechenden Liganden, ras zu aktivieren, und v-erbB codiert einen
konstitutiv aktivierten Rezeptor, dem die extrazelluläre Domäne fehlt.
Alles in allem wird angenommen, dass eine direkte Mutation des ras-Onkogens oder
eines stromaufwärts
im ras-Signalweg befindlichen Elements in annäherungsweise zwei Drittel aller
Tumore vorkommt.
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Angesichts
der maßgeblichen
Rolle des ras-Signalwegs in der Tumorgenese ist es wünschenswert,
in der Lage zu sein zu bestimmen, ob ein Tumor mit der Aktivierung
des ras-Signalwegs in Zusammenhang steht, so dass ein speziell zugeschnittener
Behandlungsplan entwickelt werden kann. Vor der vorliegenden Erfindung
gab es jedoch kein einfaches und sensitives Verfahren, um den Zusammenhang
zwischen einem Krebs und dem ras-Signalweg zu diagnostizieren. Während Mutationen
im ras-Strukturgen mit einer hoch sensitiven Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
nachgewiesen werden können,
gibt es viele andere Faktoren im ras-Signalweg, die als Ursache
für eine
hohe ras-Aktivität
in Frage kommen wie beispielsweise Mutationen in den ras-Gen-flankierenden
Sequenzen, die zu einem anormal hohen Expressionsspiegel des ras-Genprodukts
führen,
Mutationen in den Strukturgenen eines Faktors stromaufwärts oder
stromabwärts
von ras im ras-Signalweg
oder regulatorische Mutationen, die die Expressionsspiegel dieser
stromaufwärts
oder stromabwärts
gelegenen Faktoren beeinflussen. Daher identifiziert eine PCR für das ras-Gen
nicht genau alle Krebse, die in Zusammenhang mit der Aktivierung
des ras-Signalwegs stehen. Der Bedarf an einem einfachen und genauen
Verfahren zur Diagnose ras-aktivierter Tumore blieb bestehen.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Diagnose von Neoplasmen,
die bestimmte Phänotypen
aufweisen, insbesondere Neoplasmen, die durch anormal hohe Aktivität des ras-Signalwegs vermittelt
werden, durch die Verwendung von zwei oder mehr Reoviren oder anderen ähnlichen
onkolytischen Viren. Das Reovirus repliziert nicht in normalen Zellen.
Allerdings repliziert es selektiv in Zellen mit einem aktivierten
ras-Signalweg, was zum Tod dieser Zellen führt. Der ras-Signalweg in diesen
Zellen kann aufgrund von Mutationen des ras-Strukturgens oder Anomalien
eines anderen Faktors des ras-Signalwegs, die zur Aktivierung des
Signalwegs führen,
aktiviert sein. Daher kann eine Zelle, die aufgrund von zumindest
teilweise erhöhten
Aktivitäten des
ras-Signalwegs neoplastisch wird, durch ihre Empfänglichkeit
gegenüber
der Reovirusreplikation diagnostiziert werden.
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Demgemäß liefert
ein Teil der beanspruchten Erfindung eine Verfahren zum Nachweis
von ras-aktivierten neoplastischen Zellen in einer biologischen Probe
und umfasst: das Inkontaktbringen einer Probe mit einem Reovirus
und das Bestimmen der Fähigkeit
des Reovirus in der Probe zu replizieren, wobei die Fähigkeit
des Reovirus zur Replikation auf die Anwesenheit von ras-aktivierten
neoplastischen Zellen in der Probe hinweist.
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Die
biologische Probe ist vorzugsweise von einem Säuger, besonders von einem Menschen.
Jedes Reovirus, das in der Lage ist, in ras-aktivierten Zellen zu
replizieren, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
zum Beispiel ein Säuger-Reovirus
oder ein Vogel-Reovirus. Das Säuger-Reovirus
ist vorzugsweise ein Serotyp-3-Reovirus und stärker bevorzugt ein Dearing-Stamm-Reovirus.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die biologische Probe von einem Tier, das ein Neoplasma trägt, ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Lungenkrebs, Prostatakrebs, Kolorektalkrebs, Schilddrüsenkrebs,
Nierenkrebs, Nebennierenkrebs, Leberkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs,
Brustkrebs, hämatopoetischer
Krebs und Krebs des zentralen und periphären Nervensystems.
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert ein Verfahren
gemäß Anspruch
1.
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Das
Tier ist vorzugsweise ein Säuger,
insbesondere ein Mensch. Jedes Reovirus, das in der Lage ist in
ras-aktivierten Zellen zu replizieren, kann in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, zum Beispiel ein Säuger-Reovirus oder ein Vogel-Reovirus.
Das Säuger-Reovirus
ist vorzugsweise ein Serotyp-3-Reovirus und stärker bevorzugt ein Dearing-Stamm-Reovirus.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die biologische Probe aus einem Tier, das ein Neoplasma trägt, ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Lungenkrebs, Prostatakrebs, Kolorektalkrebs, Schilddrüsenkrebs,
Nierenkrebs, Nebennierenkrebs, Leberkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs,
Brustkrebs, hämatopoetischer
Krebs und Krebs des zentralen und periphären Nervensystems. Das onkolytische
Virus ist vorzugsweise ein Reovirus, ein Adenovirus, das in der
VA1-Region mutiert ist, ein Vaccinia-Virus, das in der K3L- und/oder
E3L-Region mutiert ist, ein Parapoxvirus-Orf-Virus, das im OV20.0L-Gen
mutiert ist, ein Influenzavirus, das im NS-1-Gen mutiert ist, ein
Herpesvirus, das im γ134.5-Gen mutiert ist, ein Vesicular-Stomatitis-Virus
(VSV) oder ein Newcastle-Virus. Zu anderen therapeutischen Wirkstoffen,
die hinsichtlich ras-aktivierter Neoplasmen selektiv sind, gehören, ohne
darauf beschränkt
zu sein, Farnesyltransferaseinhibitoren (FTIs) und RAF-Kinaseinhibitoren.
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In
jeder erfindungsgemäßer Ausführungsform
kann das Reovirus ein rekombinantes Reovirus sein. Das rekombinante
Reovirus kann durch Co-Infektion von Säugerzellen mit verschiedenen
Subtypen des Reovirus hergestellt werden. Das rekombinante Reovirus
kann natürlich
vorkommend oder nicht natürlich
vorkommend sein. Das rekombinante Reovirus kann aus zwei oder mehr
Reovirus-Stämmen
sein, insbesondere zwei oder mehr Reovirus-Stämmen, ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus den Stämmen
Dearing, Abney, Jones und Lang. Das rekombinante Reovirus kann auch
das Ergebnis einer Neukombination von Reoviren unterschiedlicher
Serotypen sein wie beispielsweise aus der Gruppe bestehend aus Serotyp-1-Reovirus,
Serotyp-2-Reovirus und Serotyp-3-Reovirus. Das rekombinante Reovirus
kann natürlich
vorkommende Hüllproteinvarianten-codierende
Sequenzen oder mutierte Hüllprotein-codierende
Sequenzen enthalten.
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Zusätzlich zu
Reovirus sind auch eine Reihe von anderen onkolytischen Viren selektiv
für ras-aktivierte
Neoplasmen und können
daher in der Anwendung der Erfindung in der gleichen Art und Weise
wie ein Reovirus verwendet werden. Zu diesen Viren gehören, ohne
darauf beschränkt
zu sein, Adenoviren, die in der VA1-Region mutiert sind, Vaccinia-Viren, die
in der K3L- und/oder E3L-Region mutiert sind, Parapoxvirus-Orf-Viren,
die im OV20.0L-Gen mutiert sind, Influenzaviren, die im NS-1-Gen
mutiert sind oder Herpesviren, die im γ134.5-Gen
mutiert sind. Daher liefert zum Beispiel ein Aspekt der vorliegenden
Erfindung ein Verfahren zum Nachweis ras-aktivierter, neoplastischer
Zellen in einer biologischen Probe und umfasst: das Inkontaktbringen
einer Probe mit einem onkolytischen Virus, das selektiv in PKR-defizienten Zellen
repliziert, und das Bestimmen der Fähigkeit des Virus, in der Probe
zu replizieren, dabei weist die Fähigkeit des Virus zu replizieren auf
die Anwesenheit von ras-aktivierten, neoplastischen Zellen in der
Probe hin. Vorzugsweise wird das onkolytische Virus aus der Gruppe
bestehend aus Adenoviren, die in der VA1-Region mutiert sind, Vaccinia-Viren,
die in der K3L- und/oder E3L-Region mutiert sind, Parapoxvirus-Orf-Viren,
die im OV20.0L-Gen mutiert sind, Influenzaviren, die im NS-1-Gen
mutiert sind, und Herpesviren, die im γ134.5-Gen
mutiert sind, ausgewählt.
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Außerdem sind
auch viele andere onkolytische Viren, die in der Lage sind, selektiv
bestimmte Tumorzellen zu infizieren, in der gleichen Weise wie das
Reovirus für
die vorliegende Erfindung nützlich. Zum
Beispiel kann das Vesicular-Stomatitis-Virus (VSV) verwendet werden, um Interferon-resistente Tumore
zu diagnostizieren, das ONYX-015-Virus kann verwendet werden, um
ein p53-defizientes Virus zu diagnostizieren und das Delta24-Virus
kann verwendet werden, um Rb-defiziente Tumore zu diagnostizieren.
Allerdings ist das erfindungsgemäß nützliche
onkolytische Virus vorzugsweise kein Adenovirus, insbesondere kein
ONYX-015-Virus.
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Noch
ein anderer Aspekt könnte
ein Kit sein, der ein Reovirus und ein Mittel zum Nachweis der Replikation
des Reovirus umfasst. Das Nachweismittel kann ein Paar von Primern
sein, die spezifisch für die
Nucleinsäure
des Reovirus sind, und kann gegebenenfalls Reagenzien für die PCR
enthalten. Das Nachweismittel kann auch ein Antikörper sein,
der spezifisch für
ein Reovirusprotein ist, sowie beigefügte Reagenzien wie beispielsweise
sekundäre
Antikörper.
Bei dem Nachweismittel kann es sich des weiteren um Objektträger und
Farbstoffe handeln, die geeignet sind, die Morphologie der infizierten
Zellen unter dem Mikroskop zu beobachten, oder ein Virus-Kulturmedium
und Zellen, die verwendet werden können, um den Titer des Reovirus
zu bestimmen. In ähnlicher
Weise liefert die vorliegende Erfindung Kits, die ein anderes Virus
enthalten, das in der Lage ist, in bestimmten Tumorzellen zu replizieren,
sowie Mittel, um die Replikation des Virus nachzuweisen. Beispiele
dieser Viren sind, ohne darauf beschränkt zu sein, VSV, ONYX-015-Virus
und Delta24-Virus.
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Ein
anderer Aspekt könnte
ein Kit sein, der mindestens zwei Viren umfasst, die verwendet werden
können,
um Tumore erfindungsgemäß zu phänotypisieren.
Die Viren sind vorzugsweise selektiv für Neoplasmen mit verschiedenen
Phänotypen.
Vorzugsweise werden die Viren aus einer Gruppe bestehend aus Reovirus,
VSV, dem ONYX-015-Virus und dem Delta24-Viurs ausgewählt.
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Noch
ein anderer Aspekt könnte
ein Kit sein, der ein Virus umfasst, das für die Diagnose eines Neoplasmas
eines bestimmten Phänotyps
nützlich
ist.
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Da
onkolytische Viren selektiv in neoplastischen Zellen, aber nicht
in normalen Zellen replizieren, könnte ein weiterer Aspekt ein
Verfahren sein, um die Anwesenheit eines Neoplasmas in einem Säuger zu
diagnostizieren, und umfassen: das Inkontaktbringen einer Probe
von Zellen von diesem Säuger
mit einem onkolytischen Virus, wobei die Fähigkeit dieses Virus in dieser
Probe zu replizieren auf die Anwesenheit eines Neoplasmas in diesem
Säuger hinweist.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Diagnose von Neoplasmen,
die einen bestimmten Phänotyp
aufweisen, unter Verwendung von zwei oder mehr onkolytischen Viren.
Insbesondere können
Tumore, die durch eine abnorm hohe Aktivität des ras-Signalwegs vermittelt
werden, unter Verwendung von Reoviren diagnostiziert werden. Reoviren
replizieren nicht in normalen Zellen. Allerdings replizieren Reoviren
selektiv in Zellen mit einem aktivierten ras-Signalweg, was zum
Tod dieser Zellen führt.
Daher kann ein ras-aktivierter Tumor durch seine Empfänglichkeit
gegenüber
der Reovirusreplikation diagnostiziert werden. Die Diagnose wird
dann die Behandlung oder Besserung des Tumors durch größerer Wirksamkeit
vereinfachen.
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Diese
Erfindung kann ferner angewendet werden, um andere Tumore wie beispielsweise
Interferon-resistente Tumore, p53-defiziente Tumore und Rb-defiziente Tumore
zu diagnostizieren.
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Vor
der ausführlicheren
Beschreibung der Erfindung werden die in dieser Anmeldung verwendeten
Begriffe wie folgt definiert, sofern nicht anders angegeben.
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DEFINITIONEN
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„Neoplastische
Zellen" wie hierin
verwendet, auch bekannt als „Zellen
mit proliferativer Störung", bezeichnen Zellen,
die ohne die normalen Wachstumshemmungseigenschaften proliferieren.
Ein neues Wachstum, neoplastische Zellen umfassend, ist ein „Neoplasma" oder „Tumor". Ein Neoplasma ist
ein anormales Gewebewachstum, gewöhnlich eine abgegrenzte Masse
erzeugend, die durch zelluläre
Proliferation schneller wächst
als normales Gewebe. Neoplasmen können den teilweisen oder vollständigen Verlust
einer strukturellen Organisation und einer funktionellen Koordination
mit normalem Gewebe zeigen. Für
ein hierin verwendetes Neoplasma ist vorgesehen, dass es hämatopoetische
Neoplasmen genauso wie feste Neoplasmen umfasst.
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Ein
Neoplasma kann gutartig sein (gutartiger Tumor) oder bösartig (bösartiger
Tumor oder Krebs). Bösartige
Tumore können
allgemein in drei Haupttypen eingeteilt werden. Bösartige
Neoplasmen, die aus epithelialen Strukturen hervorgehen, werden Karzinome
genannt, bösartige
Neoplasmen, die ihren Ursprung in Bindegeweben wie Muskel, Knorpel, Fett
oder Knochen haben, werden Sarkome genannt und bösartige Tumore, die hämatopoetische
Strukturen (Strukturen, die die Bildung von Blutzellen betreffen)
befallen einschließlich
Komponenten des Immunsystems, werden Leukämien und Lymphome genannt.
Zu anderen Neoplasmen gehört,
ohne darauf beschränkt
zu sein, die Neurofibromatose.
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Eine „PKR-defiziente
Zelle" ist eine
Zelle, in der PKR nicht wie in normalen Zellen aktiviert ist. Solch
ein PKR-Mangel kann zum Beispiel aufgrund einer Mutation im PKR-Gen
oder einem verminderten Spiegel des PKR-Proteins oder der PKR-Aktivität bestehen.
Zum Beispiel sind ras-aktivierte neoplastische Zellen PKR-defizient, da der
aktivierte ras-Signalweg die Phosphorylierung von PKR blockiert. Tests
für den
PKR-Proteinspiegel oder die PKR-Aktivität sind auf dem Fachgebiet bekannt.
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„Ras aktivierte
neoplastische Zellen" oder „ras-vermittelte
neoplastische Zellen" wie
hierin verwendet, beziehen sich auf Zellen, die wegen einer zumindest
teilweisen Aktivierung des ras-Signalwegs in einer anormal hohen
Rate proliferieren.
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Der
ras-Signalweg kann aktiviert werden durch eine ras-Strukturgenmutation,
erhöhte
Spiegel der ras-Genexpression, erhöhte Stabilität der Messenger
des ras-Gens oder
jede Mutation oder andere Mechanismen, die zur Aktivierung von ras
oder einem Faktor oder Faktoren stromabwärts oder stromaufwärts von
ras im ras-Signalweg
führen,
wobei die Aktivität
des ras-Signalwegs erhöht
wird. Zum Beispiel führt
die Aktivierung des EGF-Rezeptors, des PDGF-Rezeptors oder Sos zur
Aktivierung des ras-Signalwegs. Zu den ras-vermittelten neoplastischen
Zellen gehören,
ohne darauf beschränkt
zu sein, ras-vermittelte Krebszellen, die wegen der Aktivierung
des ras-Signalwegs in einer bösartigen
Weise proliferieren.
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Ein „ras-aktivierter
Tumor" ist ein Tumor
in dem der ras-Signalweg aktiviert ist.
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Ein „Interferon-resistenter
Tumor" oder „ein Tumor,
der den Phänotyp
einer Interferon-Resistenz aufweist", ist ein Tumor, der nicht mit Interferon-alpha,
-beta oder -gamma behandelt oder gebessert werden kann.
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Ein „p53-defizienter
Tumor" oder „ein Tumor, der
den Phänotyp
eines p53-Mangels
aufweist" ist ein
Tumor, in dem der Spiegel des zellulären Tumorsupressors p53 geringer
ist als der in einer normalen Zelle.
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Ein „Rb-defizienter
Tumor" oder „ein Tumor, der
den Phänotyp
eines Rb-Mangels
aufweist" ist ein Tumor,
in dem der Spiegel des zellulären
Tumorsupressors Rb geringer ist als der in einer normalen Zelle.
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Ein „onkolytisches
Virus" ist ein Virus,
das selektiv neoplastische Zellen tötet. Das Töten der neoplastischen Zellen
kann durch jedes auf dem Fachgebiet etablierte Verfahren nachgewiesen
werden, wie beispielsweise Bestimmung der Lebendzellzahl, cytopathischer
Effekt, Apoptose neoplastischer Zellen, Synthese von viralen Proteinen
in den neoplastischen Zellen (z. B. durch metabolische Markierung, Western-Analyse
viraler Proteine oder Umkehrtranskriptions-Polymerase-Kettenreaktion von
viralen Genen, die nötig
sind für
die Replikation) oder die Reduktion der Tumorgröße.
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„Reovirus" wie hierin verwendet
bezieht sich auf jedes Virus, das der Gattung Reovirus angehört. Der
Name Reovirus (Respiratory-enteric-orphan-Virus) ist ein beschreibendes
Akronym, das nahe legt, dass diese Viren, obwohl sie mit keinem
bekannten menschlichen Krankheitszustand in Zusammenhang stehen,
sowohl aus den Atemwegen als auch dem Darmtrakt isoliert werden
können.
Der Begriff „Reovirus" bezieht sich auf
alle Viren der Gattung Reovirus.
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Das
menschliche Reovirus umfasst drei Serotypen: Typ 1 (Stamm Lang oder
T1L), Typ 2 (Stamm Jones, T2J) und Typ 3 (Stamm Dearing oder Stamm
Abney, T3D). Die drei Serotypen sind leicht auf der Basis von Neutralisations-
und Hämagglutinininhibitions-Tests
zu identifizieren (siehe zum Beispiel Nibert et al., 1996).
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Das
Reovirus kann natürlich
vorkommen oder modifiziert sein. Das Reovirus ist „natürlich vorkommend", wenn es aus einer
natürlichen
Quelle isoliert werden kann und nicht vorsätzlich von Menschen im Labor
modifiziert worden ist. Zum Beispiel kann das Reovirus von einer „Feldquelle" sein, die von einem
Menschen stammt, der mit dem Reovirus infiziert worden ist.
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Das
Reovirus kann modifiziert sein, aber trotzdem in der Lage sein,
eine Säugerzelle,
die einen aktiven ras-Signalweg aufweist, lytisch zu infizieren.
Das Reovirus kann vor der Verabreichung an die proliferierenden
Zellen chemisch oder biochemisch aufbereitet werden (z. B. durch
Behandlung mit einer Protease wie beispielweise Chymotrypsin oder
Trypsin). Eine Vorbehandlung mit einer Protease entfernt die äußere Hülle oder
das Kapsid eines Virus und kann die Infektiosität des Virus erhöhen. Das
Reovirus kann von einem Liposom oder einer Micelle umhüllt sein
(Chandron und Nibert, 1998), um eine Immunantwort eines Säugers, der
eine Immunität
gegenüber
dem Reovirus entwickelt hat, abzumildern oder zu unterdrücken. Zum
Beispiel kann das Virion mit Chymotrypsin in Anwesenheit von Micellen-erzeugenden
Konzentrationen eines Alkylsulfat-Detergens behandelt werden, um
ein neues infektiöses subvirales
Partikel hervorzubringen.
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Das
Reovirus kann ein rekombinantes Reovirus sein, das aus der Rekombination/Neukombination
genomischer Segmente aus zwei oder mehr genetisch verschiedenen
Reoviren hervorgegangen ist. Das rekombinante Reovirus kann aus
zwei oder mehr Typen von Reoviren mit unterschiedlichen pathogenen
Phänotypen
bestehen, so dass es unterschiedliche Antigendeterminanten enthält und dabei eine
Immunantwort eines Säugers,
der zuvor einem der Reovirus-Subtypen
ausgesetzt war, abmildert oder unterdrückt. Rekombinante Reoviren
können auch
im Vergleich zum ursprünglichen
Virus unterschiedliche biologische Aktivitäten (z. B. Replikationsaktivität in neoplastischen
Zellen und Bioverteilung) aufweisen. Die Rekombination/Neukombination
von reoviralen genomischen Segmenten kann auf natürliche Wiese
nach der Infektion eines Wirtsorganismus mit mindestens zwei genetisch
verschiedenen Reoviren stattfinden. Rekombinante Virionen können auch
in Zellkultur hergestellt werden, zum Beispiel durch Co-Infektion von permissiven
Wirtszellen mit genetisch verschiedenen Reoviren (Nibert et al.
1996).
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Demgemäß zieht
die Erfindung die Verwendung von rekombinanten Reoviren in Erwägung, die aus
der Neukombination von Genomsegmenten zweier oder mehrerer genetisch
verschiedener Reoviren hervorgehen, zu denen, ohne darauf beschränkt zu sein,
das menschliche Reovirus wie Typ 1 (z. B. Stamm Lang), Typ 2 (z.
B. Stamm Jones) und Typ 3 (z. B. Stamm Dearing oder Stamm Abney), nicht-menschliche Säuger-Reoviren
oder Vogel-Reoviren gehören.
Des weiteren wird erfindungsgemäß die Verwendung
von rekombinanten Reoviren in Betracht gezogen, die aus der Neukombination
von Genomsegmenten zweier oder mehrerer genetisch verschiedener
Reoviren hervorgehen. Dabei ist mindestens ein parentales Virus
genetisch verändert
und enthält
ein oder mehr chemisch synthetisierte Genomsegmente, ist mit chemischen
oder physikalischen Mutagenen behandelt worden oder ist selbst das
Ergebnis eines Rekombinationsereignisses. Des weiteren wird erfindungsgemäß in Erwägung gezogen,
ein rekombinanten Virus zu verwenden, das eine Rekombination erfahren
hat, und zwar in Anwesenheit chemischer Mutagene, einschließlich, ohne darauf
beschränkt
zu sein, Dimethylsulfat und Ethidiumbromid, oder physikalischer
Mutagene, einschließlich,
ohne darauf beschränkt
zu sein, ultraviolettes Licht oder andere Formen der Strahlung.
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Die
Erfindung zieht des weiteren rekombinante Reoviren in Betracht,
die Deletionen oder Duplikationen in einem oder mehreren der Genomsegmente
enthalten, die in Folge einer Rekombination mit einem Wirtszellgenom
zusätzliche
genetische Information enthalten oder die synthetische Gene enthalten.
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Einen
Tumor zu „phänotypisieren" bedeutet einen Tumor
gemäß seinem
Phänotyp
einzuordnen. Zum Beispiel gehören
zu den Tumorphänotypen
die Aktivierung des ras-Signalwegs, Interferon-Resistenz, p53-Mangel
und Rb-Mangel. Die Phänotypen schließen sich
nicht gegenseitig aus, ein Tumor kann nämlich in mehr als einer Kategorie
phänotypisiert werden.
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Eine „biologische
Probe" ist eine
Probe, die von einem biologischen Testindividuum wie beispielsweise
einem Tier gesammelt wurde.
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VERFAHREN
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Die
vorliegende Erfindung ist nützlich
bei der genauen Phänotypisierung
von Tumoren und vereinfacht dabei die Entwicklung eines Behandlungsplans, der
auf einen spezifischen Tumor zugeschnitten ist. In einem ersten
Teil der beanspruchten Erfindung wird ein Reovirus verwendet, um
eine biologische Probe, die von einem Tumor-tragenden Tier entnommen
wurde, zu infizieren. Da Reoviren selektiv ras-aktivierte neoplastische Zellen infizieren,
aber nicht normale Zellen oder Tumorzellen in denen der ras-Signalweg
nicht aktiviert ist, versetzt das vorliegende Verfahren den Anwender
in die Lage genau zu bestimmen, ob der Tumor mit der Aktivierung
des ras-Signalwegs in Zusammenhang seht. Wenn als ras-aktiviert
diagnostiziert, kann der Tumor mit ras-spezifischen Behandlungsplänen wie
beispielsweise einer Reovirus-Therapie (
U.S. Patent Nr. 6,136,307 ) behandelt
werden.
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Der
ras-Signalweg ist ein komplexer Signalübertragungsweg, der zur zellulären Proliferation führt. Ras
ist ein zentrales Relais in diesem Weg, es erhält Signale von stromaufwärts gelegenen
Elementen (z. B. Wachstumsfaktorrezeptoren) und überträgt sie auf stromabwärts gelegenen
Elemente.
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Viele
Wachstumsfaktorenrezeptoren wie der epidermale Wachstumsfaktor (EGF)-Rezeptor,
der Blutplättchen-Wachstumsfaktor
(PDGF)-Rezeptor genauso wie EGF-Rezeptor-verwandte Moleküle (z. B.
Her-2/Neu/ErbB2) besitzen eine intrinsische Tyrosinkinaseaktivität, die durch
die Liganden-induzierte Rezeptordimerisierung aktiviert wird. Dies
hat die Autophosphorylierung des Rezeptors an Tyrosinresten und
das Binden von Proteinen, die Src-Homologie 2 (SH2)-Domänen enthalten,
zur Folge. Zwei solche SH2-Proteine sind Grb2 und SHC, die indirekt
das Plasmamembran-gebundene kleine GTP-bindende Protein Ras aktivieren.
Eine Ras-Aktivierung
findet auch als Antwort auf eine Ligandenbindung an Sieben-Transmembrandomänen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
statt (z. B. Gutkind, 1998). Die Aktivierung von Ras und anderen
Wachstumsfaktorrezeptor-regulierten Signalübertragungswegen führt letztlich
zu Veränderungen
im Cytoskelett und der Genexpression, die nötig sind für die zelluläre Proliferation, Differenzierung
und Transformation (im Überblick veröffentlicht
in Campbell et al., 1998).
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Die
drei menschlichen Ras-Gene (Ha-Ras, N-Ras und Ki-Ras) codieren 4
Proteine (aufgrund alternativen Spleißens der Ki-Ras-mRNA). Unter
normalen Umständen
pendeln Ras-Proteine zwischen einem aktiven (GTP-gebundenem) und einem
inaktiven (GDP-gebundenem) Zustand hin und her. Die Ras-Aktivierung
erfolgt durch den Austausch von gebundenem GDP durch GTP, was durch
eine Familie von Guaninnucleotid-Austauschfaktoren erleichtert wird.
Die Ras-Inaktivierung
erfolgt durch die Hydrolyse von gebundenem GTP zu GDP. Diese Reaktion wird
durch GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) erleichtert. In vielen
menschlichen Krebsen werden Ras-Proteine onkogenisch aktiviert durch
Mutationen, die ihre GTPase-Aktivität zerstören und dadurch die Ras-Signalgebung
deregulieren (im Überblick veröffentlicht
in Campbell et al., 1998).
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Es
gibt viele Kandidaten für
Ras-Effektoren, die stromabwärts
von Ras der Signalübertragung und
der onkogenen Transformation dienen können, einschließlich Mitglieder
der Rho-Familie kleiner GTPasen, Phosphatidylinosit-3-Kinase (PI3K)
und die Serin/Threonin-Proteinkinase c-Raf-1 (im Überblick veröffentlicht
in Campbell et al., 1998). Die Raf-vermittelte Signalgebung ist
der best-charakterisierte Ras-Effektorweg.
Aktiviertes Ras leitet Raf an die Membran, wo die Raf-Aktivierung
stattfindet. Aktiviertes Raf ist die Startkomponente einer Kinasekaskade,
die Mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK)-Kaskade. Raf phosphoryliert
und aktiviert die MEKI und MEK2 (MAPK/ERK-Kinase)-Proteinkinasen,
die wiederum phosphorylieren und aktivieren die extrazelluläre Signal-regulierten
Kinasen ERK1 und ERK2 (auch bekannt als MAPK1 und MAPK2). Im Gegensatz
zu ihren Zielen stromabwärts,
ERK1/2, sind die MEK1/2-Proteine hoch spezifische Enzyme, deren einzig
bekannte Substrate die ERK1/2-Proteine sind. Nach der Aktivierung
phosphorylieren (und damit regulieren) ERK1 und ERK2 eine Reihe
von Zielproteinen, einschließlich
nukleäre
Transkriptionsfaktoren, was letztendlichen zur zellulären Antwort
führt.
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Demgemäß können eine
Reihe von Ereignissen zur Aktivierung des ras-Signalwegs führen. Zum Beispiel kann in
jedem der drei ras-Strukturgene eine Mutation auftreten. Strukturelle
Mutationen können auch
in den stromaufwärts
von ras befindlichen Rezeptoren, den Signalüberträgern stromabwärts von ras
(wie raf oder mek1/2) oder den Endeffektoren MAPK1 und 2 stattfinden.
Auf ähnliche
Weise können auch
regulatorische Mutationen, die zu anormal hohen Expressionsspiegeln
irgendeines Proteins im ras-Signalweg führen, mitogene zelluläre Antworten verursachen.
Solch regulatorischen Mutation können überall in
der regulatorischen Sequenz eines Mitgliedes des ras-Signalwegs
auftreten oder sogar in der strukturellen oder regulatorischen Region
eines Faktors, der die Expression eines Mitglieds des ras-Signalwegs
kontrolliert. Folglich ist der Nachweis einer Abweichung irgendeines
spezifischen Mitgliedes des ras-Signalwegs kein wirksamer Weg, um
zu bestimmen, ob der ras-Signalweg aktiviert ist.
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Es
ist möglich,
die Aktivität
von MAPK, dem Endeffektor des ras-Signalwegs, zu messen, da die konstitutive
Aktivierung von MAPK für
die ras-Signalweg-Aktivierung
bezeichnend ist. Allerdings erfordert solch ein biochemischer Ansatz
eine erhebliche Menge an Probenmaterial sowie mühsame Verfahren wie beispielsweise
die Extraktion und/oder teilweise Reinigung von MAPK.
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Durch
das Nachweisen des ras-aktivierten Phänotyps, eher als durch die
Abweichung irgendeines spezifischen Gens oder Genproduktes, ist
die vorliegende Erfindung nützlich,
egal ob die ras-Signalweg-Aktivierung auf der Mutation des ras-Strukturgens, der
regulatorischen Sequenzen des ras-Gens oder irgendeines anderen
Faktors im ras-Signalweg beruht. Des weiteren ist das vorliegende
Verfahren relativ einfach ohne dass es notwendig ist, ein Enzym
aus der Probe zu extrahieren oder aufzureinigen.
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Die
Fähigkeit
des Reovirus Zellen in einer Probe zu infizieren kann durch ein
beliebiges Verfahren auf dem Fachgebiet bestimmt werden. Zum Beispiel
kann die Nucleinsäurereplikation
durch eine Polymerase-Kettenreaktion mit Primern, die spezifisch sind
für das
verwendete Reovirus, gemessen werden; die Reovirusproteinsynthese
kann durch spezifische Antikörper
nachgewiesen werden; infizierte Zellen können unter einem Mikroskop
beobachtet und Anzeichen von cytopatischen Effekten, die das Reovirus
hervorruft, nachgewiesen werden und replizierte Reoviren können aus
der Probe geerntet werden und der Virustiter bestimmt werden, um
zu prüfen,
ob eine Virusreplikation stattgefunden hat. Andere Verfahren zur
Bestimmung des Vorhandenseins einer Reovirusreplikation sind bekannt
oder können vom
Fachmann entwickelt werden.
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Es
sollte angemerkt werden, dass ein Tumor viele onkogene Anomalien
enthalten kann. Insbesondere ist berichtet worden, dass beim Brustkrebs
der ras-Aktivierung
häufig
die Überexpression
von p53 vorangeht (Smith et al., 2000). Die Anwesenheit anderer
onkogener Anomalien zusätzlich
zur ras-Signalweg-Aktivierung behindert indes nicht die Eignung eines
speziellen Therapieplans, der für
ras-aktivierte Tumore
zugeschnittenen wurde. Zum Beispiel kann Reovirus noch selektiv ras-aktivierte
neoplastische Zellen töten,
auch wenn die Zellen ebenfalls abnorm hohe Spiegel von p53 enthalten.
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Da
das Reovirus selektiv in ras-aktivierten neoplastischen Zellen repliziert,
aber nicht in normalen Zellen, liefert ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt
ferner ein Verfahren zur Diagnose der Anwesenheit eines Neoplasmas
in einem Säuger
und umfasst: das Inkontaktbringen einer Probe von Zellen aus diesem
Säuger
mit einem Reovirus unter Bedingungen, die dem Reovirus erlauben
in ras-aktivierten Zellen zu replizieren, wobei die Fähigkeit
dieses Reovirus in dieser Probe zu replizieren die Anwesenheit eines Neoplasmas
in diesem Säuger
anzeigt.
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Ähnlich zu
Reovirus replizieren auch eine Reihe anderer onkolytischer Viren
in ras-aktivierten Zellen. Es ist in Erwägung zu ziehen, dass diese
onkolytischen Viren eingesetzt werden können, um die vorliegende Erfindung
in der gleichen Art und Weise wie mit Reoviren durchzuführen. Diese
Viren sind normalerweise Mutanten, die sensitiv gegenüber der doppelsträngigen-RNA-Kinase
(PKR) sind, wohingegen ihre Wildtypentsprechungen nicht sensitiv
gegenüber
PKR sind.
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Wenn
ein Virus in eine Zelle eindringt, wird PKR normalerweise aktiviert
und blockiert die Proteinsynthese, und das Virus kann in dieser
Zelle nicht replizieren. Einige Viren haben ein System entwickelt,
um PKR zu hemmen und erleichtern die virale Proteinsynthese sowie
die virale Replikation. Zum Beispiel stellt Adenovirus eine große Menge
einer kleinen RNA, VA1-RNA, her. VA1-RNA weist ausgeprägte Sekundärstrukturen
auf und bindet, in Konkurrenz mit der doppelsträngigen RNA (dsRNA), die normalerweise
PKR aktiviert, an PKR. Da eine minimale Länge einer dsRNA erforderlich
ist, um PKR zu aktivieren, aktiviert VA1-RNA PKR nicht. Stattdessen trennt
sie PKR durch den Vorteil ihrer große Menge ab. Folglich wird
die Proteinsynthese nicht blockiert und Adenovirus kann in der Zelle
replizieren.
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Ras-aktivierte
neoplastische Zellen sind der Hemmung der Proteinsynthese durch
PKR nicht unterworfen, da ras PKR inaktiviert. Daher sind diese Zellen
gegenüber
einer viralen Infektion empfänglich, auch
wenn das Virus kein PKR-hemmendes
System aufweist. Wenn die PKR-Inhibitoren in Adenovirus mutiert
sind, so dass sie die PKR-Funktion nicht mehr blockieren, infiziert
demgemäß das so
entstandene Virus keine normalen Zellen, aufgrund der Hemmung der
Proteinsynthese durch PKR, aber es repliziert in ras-aktivierten
neoplastischen Zellen, denen PKR-Aktivitäten fehlen.
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Demgemäß repliziert
ein Virus, das derart modifiziert oder mutiert ist, dass es die
PKR-Funktion nicht hemmt, selektiv in ras-aktivierten neoplastischen
Zellen während
normale Zellen resistent sind. Vorzugsweise ist das Virus ein Adenovirus,
das in der VA1-Region mutiert ist, ein Vaccinia-Virus, das in der K3L-
und/oder E3L-Region
mutiert ist, ein Parapoxvirus-Orf-Virus, das im OV20.0L-Gen mutiert
ist, ein Influenzavirus, das im NS-1-Gen mutiert ist, oder ein Herpesvirus,
das im γ134.5-Gen mutiert ist.
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Die
Viren können
gemäß den bekannten Struktur/Funktion-Beziehungen
der viralen PKR-Inhibitoren modifiziert oder mutiert sein. Da zum
Beispiel die aminoterminale Region des E3-Proteins mit der Domäne der carboxyterminalen
Region von PKR interagiert, verhindert die Deletion oder Punktmutation dieser
Domäne
eine Anti-PKR-Funktion (Chang et al., 1992, 1993, 1995; Sharp et
al., 1998; Romano et al., 1998.) Das K3L-Gen von Vaccinia-Virus
codiert pK3, ein Pseudosubstrat der PKR. Es gibt eine „Verlust-der-Funktion"-Mutation innerhalb
von K3L. Kürzungen
oder Punktmutationen innerhalb des C-terminalen Teils des K3L-Proteins, das homolog
zu den Resten 79 bis 83 von eIF-2 ist, heben die PKR-inhibitorische Aktivität auf (Kawagishi-Kobayashi
et al., 1997).
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In
einem zweiten Teil der beanspruchten Erfindung kann das Vesicular-Stomatitis-Virus
(VSV) verwendet werden, um interferon-resistente Tumore zu diagnostizieren.
Interferone sind zirkulierende Faktoren, die an Zelloberflächenrezeptoren
binden, und letztendlich sowohl zu einer antiviralen Antwort als
auch einer Induktion von wachstumshemmenden und/oder apoptotischen
Signalen in den Zielzellen führen.
Obwohl Interferone theoretisch zur Hemmung der Proliferation von
Tumorzellen verwendet werden können,
ist dieser Ansatz, aufgrund Tumor-spezifischer Mutation von Mitgliedern
des Interferon-Signalwegs, nicht sehr erfolgreich gewesen.
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Allerdings
können
Tumorzellen, um die von Interferon angestrebte Wachstumshemmung
zu verhindern, den Interferon-Signalweg unterbrechen und dadurch
gleichzeitig ihre antivirale Antwort beeinträchtigen. In der Tat ist gezeigt
worden, dass VSV, ein umhülltes
Negativstrang-RNA-Virus, schnell in einer Vielzahl menschlicher
Tumorzelllinien in Anwesenheit von Interferon repliziert und diese
tötet,
wohingegen normale menschliche Primärzellkulturen offenbar durch
Interferon geschützt
waren. Daher kann VSV verwendet werden, um Interferon-resistente jedoch
VSV-sensitive Tumore zu diagnostizieren. Wie die Ausführungsform
mit dem Reovirus, ist die VSV-basierte Diagnose eine Beurteilung
des Phänotyps
und hängt
nicht von dem Mechanismus der Interferon-Resistenz ab.
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In
einem alternativen zweiten oder dritten Teil der beanspruchten Erfindung
kann das ONYX-015-Virus verwendet werden, um p53-defiziente Tumore
zu diagnostizieren. P53 ist ein potenter Tumorsupressor, der in
jeder Zelle vorkommt und das Zellwachstum kontrolliert. Da Viren
auf die zelluläre Proliferationsmaschinerie
angewiesen sind, um zu replizieren, sind sie der p53-Regulation unterworfen und
können
nicht überreplizieren.
Bestimmte Adenoviren, SV40 und das menschliche Papillomavirus enthalten
jedoch Proteine, die p53 inaktivieren, und dadurch ihre eigene Replikation
erlauben (Nemunaitis 1999).
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Für Adenovirus
Serotyp 5 ist dieses Protein ein 55 kd-Protein, codiert von der
E1B-Region. Wenn die E1B-Region, die dieses 55 kd-Protein codiert, entfernt
wird wie im ONYX-015-Virus (Bischoff et al., 1996;
WO 94/18992 ), ist der 55 kd-p53-Inhibitor nicht länger vorhanden.
Wenn ONYX-015 in eine normale Zelle eindringt, besteht infolgedessen
die Wirkung von p53 darin, die Zellproliferation sowie die Virusreplikation
zu unterdrücken.
Daher repliziert ONYX-015 in normalen Zellen nicht. Auf der anderen
Seite kann ONYX-015 in neoplastischen Zellen, die eine zerstörte p53-Funktion
aufweisen, replizieren und schließlich das Sterben der Zelle
verursachen. Demgemäß kann dieses
Virus verwendet werden, um p53-defiziente neoplastische Zellen in
einer Probe nachzuweisen. Ein Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet kann
auch das p53-Inhibitorgen in Adenovirus 5 oder anderen Viren unter
Verwendung etablierter Verfahren mutieren und zerstören. Die
so entstandenen Viren sind in dem vorliegenden Verfahren nützlich,
um p53-defiziente Tumore zu diagnostizieren.
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Auf ähnliche
Weise kann in jedem anderen Teil der beanspruchten Erfindung das
Delta24-Virus verwendet werden, um Rb-defiziente Tumore zu diagnostizieren.
Das Delta24-Virus ist ein mutiertes Adenovirus, das eine 24 Rasenpaar-Deletion
in der E1A-Region trägt
(Fueyo et al., 2000). Diese Region ist für das Binden an den zellulären Tumorsupressor Rb
und die Hemmung der Rb-Funktion verantwortlich, wodurch der zellulären Proliferationsmaschinerie
und somit der Virusreplikation erlaubt wird, in unkontrollierter
Art und Weise abzulaufen. Delta24 weist eine Deletion in der Rb-Bindungsregion
auf und bindet nicht an Rb. Daher wird in normalen Zellen die Replikation
des mutierten Virus durch Rb gehemmt. Wenn Rb allerdings inaktiviert
ist und die Zelle neoplastisch wird, wird Delta24 nicht länger gehemmt. Stattdessen
repliziert das mutierte Virus wirksam und lysiert die Rb-defiziente
Zelle. Demgemäß kann das Delta
24-Virus verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Probe Rb-defiziente
Tumorzellen enthält.
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Wie
es auch in ras-aktivierten Tumorzellen der Fall ist, können p53-defiziente
und Rb-defiziente Zellen aus einer Vielzahl verschiedener Ursachen entstehen.
Zum Beispiel kann eine Mutation in dem Strukturgen von p53 oder
Rb zu einem schlecht funktionierenden Genprodukt oder zu einer schlechten Translation
führen;
eine Mutation in der regulatorischen Sequenz des p53- oder Rb-Gens
kann eine geringere Transkriptionsmenge verursachen; eine Mutation
in einem Transkriptionsfaktor für
das p53- oder Rb-Gen kann zu einer unzureichenden p53- oder Rb-Produktion
führen
oder eine Mutation in einem Co-Faktor, der für die p53- oder Rb-Funktion nötig ist, kann auch die Ursache
eines p53- oder Rb-Mangels sein. Da die vorliegende Erfindung eher den
Phänotyp
nachweist, als lediglich eine strukturelle Abweichung des p53- oder
Rb-Gens/Proteins, ist sie leistungsfähiger als Struktur-basierte
Verfahren wie beispielsweise die PCR.
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Sobald
der Phänotyp
eines Tumors bestimmt ist, kann der Tumor entsprechend seinem Phänotyp behandelt
werden. Zum Beispiel kann ein ras-aktivierter Tumor durch ein Reovirus
oder Inhibitoren des Ras-Signalwegs behandelt werden. Reovirus-Therapie
ist z. B. im
US-Patent Nr. 6.136.307 offenbart.
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Es
sollte erwähnt
werden, dass Delta24 und ONYX-015 lediglich Beispiele darstellen,
um die Anwendung der Erfindung zu erläutern, während ein Durchschnittsfachmann
auf dem Gebiet in der Lage sein wird, andere Viren zu identifizieren
oder zu entwickeln, die für
die erfindungsgemäße Diagnose
und Behandlung von Tumoren nützlich
sind.
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Wie
bei Reovirus umfasst die vorliegenden Erfindung auch die Verwendung
von Viren, die vor dem Immunsystem geschützt sind, und neukombinierte
Viren anderer onkolytischer Viren. Zusätzlich zu den Viren, die in
der vorliegenden Anmeldung besonders erläutert werden, kann ein Durchschnittsfachmann
auf dem Gebiet die vorliegende Erfindung des weiteren unter Verwendung
zusätzlicher
onkolytischer Viren, gemäß der hierin
gegebenen Beschreibung und dem verfügbaren Fachwissen ausführen. Das
onkolytische Virus kann ein Mitglied der Familie der Myoviridae,
Siphoviridae, Podoviridae, Teciviridae, Cortiocoviridae, Plasmaviridae,
Lipothrixviridae, Fuselloviridae, Poxviridae, Iridoviridae, Phycodnaviridae,
Baculoviridae, Herpesviridae, Adenoviridae, Papovaviridae, Polydnaviridae,
Inoviridae, Microviridae, Geminiviridae, Circoviridae, Parvoviridae,
Hepadnaviridae, Retroviridae, Cyctoviridae, Reoviridae, Birnaviridae,
Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae,
Arenaviridae, Leviviridae, Picornaviridae, Sequiviridae, Comoviridae, Potyviridae,
Caliciviridae, Astroviridae, Nodaviridae, Tetraviridae, Tombusviridae,
Coronaviridae, Glaviviridae, Togaviridae oder Barnaviridae sein.
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Die
vorliegende Erfindung kann bei jedem Tier, insbesondere Säugern, angewendet
werden. Zu den bevorzugten Säugern
gehören
Hunde, Katzen, Schafe Ziegen, Rinder, Pferde, Schweine, Menschen und
nicht-menschliche Primaten. Am meisten bevorzugt ist der Säuger ein
Mensch.
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KITS
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Ein
weiterer Aspekt könnten
Kits sein, die nützlich
sind für
die Diagnose von Tumoren. Ein Aspekt könnte ein Kit sein, der ein
Reovirus und ein Mittel für
den Nachweis der Replikation des Reovirus enthält. Das Nachweismittel kann
ein Paar von Primern sein, die spezifisch sind für die Nucleinsäure des
Reovirus, und kann gegebenenfalls Reagenzien für eine PCR enthalten. Das Nachweismittel
kann auch ein Antikörper,
spezifisch für
ein Reovirusprotein, sein und kann gegebenenfalls Begleitreagenzien wie
beispielsweise sekundäre
Antikörper
enthalten. Bei dem Nachweismittel kann es sich des weiteren um Objektträger und
Farbstoffe handeln, die geeignet sind die Morphologie der infizierten
Zellen unter dem Mikroskop zu betrachten, oder Virus-Kulturmedien
und Zellen, die verwendet werden können, um den Titer des Reovirus
zu bestimmen. Gleichermaßen
könnten
Kits, die ein anderes Virus enthalten, das in der Lage ist, in spezifischen
Tumorzellen zu replizieren, sowie Mittel für den Nachweis der Virusreplikation
verwendet werden. Beispiele dieser Viren umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein,
VSV, das ONYX-015- und Delta24-Virus.
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Vorzugsweise
könnte
ein Kit verwendet werden, der mindestens zwei Viren umfasst, die
verwendet werden können,
um erfindungsgemäß Tumore
zu phänotypisieren.
Vorzugsweise werden die Viren aus einer Gruppe bestehend aus Reovirus,
VSV, das ONYX-015-Virus und das Delta-Virus ausgewählt.
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Die
folgenden Beispiele werden gegeben, um diese Erfindung zu veranschaulichen
und sind in keiner Weise dahingehend ausgelegt, den Schutzbereich
der vorliegenden Erfindung zu beschränken.
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BEISPIELE
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In
den nachstehenden Beispielen haben die folgenden Abkürzungen
die folgenden Bedeutungen. Nicht definierte Abkürzungen haben ihre allgemein übliche Bedeutung.
- °C
- = Grad Celsius
- hr
- = Stunde
- min
- = Minute
- μM
- = Mikromolar
- mM
- = Millimolar
- M
- = Molar
- ml
- = Milliliter
- μl
- = Mikroliter
- mg
- = Milligramm
- μg
- = Mikrogramm
- PAGE
- = Polyacrylamidgelelektrophorese
- rpm
- = Umdrehung pro Minute
- FBS
- = Fötales Kälberserum
- DTT
- = Dithiothreit
- SDS
- = Natriumdodecylsulfat
- PBS
- = Phosphat-gepufferte
Salzlösung
- DMEM
- = Dubelccos modifiziertes
Eagle's-Medium
- α-MEM
- = α-modifiziertes Eagle's-Medium
- β-ME
- = β-Mercaptoethanol
- MOI
- = Infektionsmultiplizität
- PFU
- = Plaque-formende
Einheit
- EGF
- = Epidermaler Wachstumsfaktor
- PDGF
- = Blutplättchen-Wachstumsfaktor (PDGF)
- CPE
- = Cytopathischer Effekt
- VSV
- = Vesicular-Stomatitis-Virus
- PCR
- = Polymerase-Kettenreaktion
- SH2
- = Src-Homologie 2
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BEISPIEL 1
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Phänotypisierung eines Tumors
mit einem Reovirus
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Bei
einer 65 jährigen
Frau wird bei der Erstellung ihres regelmäßigen Mammogramms ein Knoten gefunden.
Eine Probe des Knotens wird während
einer Biopsie entnommen und scheint ein bösartiger Tumor zu sein. Um
zu bestimmen, ob der Tumor ras-aktivierte Zellen enthält, wird
die Probe in eine Zellkultur gebracht und mit dem Reovirus inkubiert.
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Der
Dearing-Stamm des Reovirus-Serotyps 3 wird in Suspensionskulturen
von L-929-Zellen vermehrt, die gemäß Smith aufgereinigt wurden
(Smith et al., 1969), mit der Ausnahme, dass β-Mercaptoethanol (β-ME) im Extraktionspuffer
weggelassen wurde. Das Partikel/PFU-Verhältnis für aufgereinigtes Reovirus beträgt normalerweise
100/1. Die Biopsieprobe wird in DMEM zerkleinert, mit dem Reovirus
für die
Dauer von 2 Stunden bei 37°C
inkubiert, in frisches DMEM plus 20% FBS gewechselt und für die Dauer
von 48 Stunden kultiviert. Danach wird der Überstand der Kultur gesammelt
und der Reovirustiter bestimmt. Das Ergebnis zeigt, dass das Reovirus in
der Probe repliziert hat. Daher enthält der Brusttumor ras-aktivierte
Tumorzellen.