PT1890151E - Vírus oncolíticos como agentes de fenotipagem para neoplasmas - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO "VÍRUS ONCOLÍTICOS COMO AGENTES DE FENOTIPAGEM PARA NEOPLASMAS"
Esta invenção refere-se a estojos-conjunto de componentes (kits) para detectar a causa subjacente de tumores, particularmente a utilização de reovirus no diagnóstico de tumores activados por ras. Além disso, outros virus oncoliticos com diferentes selectividades podem ser também utilizados no diagnóstico de tipos particulares de tumores.
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Patente U.S. N° 6136307.
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Com os recentes desenvolvimentos no campo da oncologia e da biologia celular, os investigadores têm sido capazes de iniciar programas de desenvolvimento de fármacos que se dirigem especificamente à causa subjacente do cancro, particularmente se a causa for a deficiência ou a mutação de produtos génicos específicos. Deste modo, se os clínicos tiverem as ferramentas para determinar a causa do cancro para cada doente canceroso, pode ser escolhido um regime de tratamento que é feito à medida para a causa específica com eficácia optimizada. C.J.A. Ring descreve a utilização de vírus citolíticos para tratar cancro. O oncogene ras é responsável por um grande número de tumores. Mutações activadoras do próprio gene ras ocorrem em cerca de 30% de todos os tumores humanos (Bos, J.L., 1989), principalmente em carcinomas pancreáticos (90%), colorrectais esporádicos (50%) e pulmonares (40%), assim como leucemia mielóide (30%) . Além de mutações do próprio gene ras, a activação dos factores a montante ou a jusante de ras na via ras 3 está também associada com tumores. Por exemplo, a sobreexpressão de HER2/Neu/ErbB2 ou do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGF) é comum no cancro da mama (25-30%) e a sobreexpressão do receptor do factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGF) ou do receptor do EGF é prevalente em gliomas e glioblastomas (40-50%) . O receptor do EGF e o receptor do PDGF são ambos conhecidos por activarem ras após ligação ao seu respectivo ligando, e v-erbB codifica um receptor activado constitutivamente que carece do dominio extracelular. Em conjunto, crê-se que a mutação directa do oncogene ras ou de um elemento a montante na via ras ocorre em aproximadamente dois terços de todos os tumores.
Dado o papel significativo da via ras na tumorigénese, é desejável ser capaz de determinar se um tumor está associado com a activação da via ras de modo que possa ser desenvolvido um regime de tratamento feito especificamente à medida. Antes da presente invenção, contudo, não existia um método simples e sensível de diagnóstico da associação de um cancro com a via ras. Enquanto as mutações no gene estrutural de ras podem ser detectadas com uma elevada sensibilidade por reacção em cadeia da polimerase (PCR), existem muitos outros factores na via ras que podem ser a causa da elevada actividade de ras, tais como mutações nas sequências flanqueadoras do gene ras que conduzem ao nível de expressão excepcionalmente elevado do produto do gene ras, mutações nos genes estruturais de um factor a montante ou a jusante de ras na via ras ou mutações reguladoras que afectam os níveis de expressão destes factores a montante ou a jusante. Deste modo, a PCR para o gene ras não identifica precisamente todos os cancros associados com a activação da via ras. A necessidade permanece para um método simples e preciso de diagnóstico de tumores activados por ras. 4
SUMARIO DA INVENÇÃO A invenção na sua forma mais abrangente é definida pela reivindicação 1:
Um estojo-conjunto de componentes (kit) para diagnóstico de um neoplasma pelo fenótipo compreendendo, pelo menos, dois virus oncoliticos, em que cada virus oncolitico replica selectivamente em células neoplásicas tendo um fenótipo seleccionado do grupo consistindo em activação da via ras, resistência a interferão, deficiência de p53 e deficiência de Rb e, em que cada dos virus oncoliticos replica selectivamente em células neoplásicas que têm um fenótipo diferente seleccionado do grupo consistindo em activação da via ras, resistência a interferão, deficiência de p53 e deficiência de Rb.
As formas de realização preferidas são definidas nas reivindicações dependentes 2-15.
Descrição detalhada da invenção A presente invenção proporciona um estojo-conjunto de componentes (kit) para diagnóstico de neoplasmas que têm fenótipos particulares, particularmente, neoplasmas mediados por actividade excepcionalmente elevada da via ras, por utilização de reovirus ou outros virus oncoliticos semelhantes. 0 reovirus não replica em células normais. Contudo, os reovirus replicam selectivamente em células com uma via ras activada, o que conduz à morte dessas células. A via ras nestas células pode ser activada devido a mutações do gene estrutural de ras ou anomalias de qualquer outro factor na via ras que conduz à 5 activação da via. Deste modo, uma célula que se torne neoplásica devido a, pelo menos em parte, actividades elevadas da via ras pode ser diagnosticada pela sua susceptibilidade à replicação de reovirus.
Consequentemente, a presente invenção proporciona um kit para diagnóstico de um neoplasma pelo fenótipo compreendendo, pelo menos, dois virus oncoliticos, em que cada virus oncolitico replica selectivamente em células neoplásicas que têm um fenótipo seleccionado do grupo consistindo em activação da via ras, resistência a interferão, deficiência de p53 e deficiência de Rb e, em que cada dos virus oncoliticos replica selectivamente em células neoplásicas que têm um fenótipo diferente, em que os virus oncoliticos são seleccionados do grupo consistindo em reovirus, virus da estomatite vesicular (VSV), ONYX-015, Delta24, adenovirus mutados na região VAI, virus vacinia mutados na região K3L e/ou E3L, virus orf parapoxvirus mutados no gene OV20.0L, virus da gripe mutados no gene NS-1 e virus herpes mutados no gene γχ34.5.
Qualquer reovirus capaz de replicação em células activadas por ras pode ser utilizado na presente invenção, por exemplo, um reovirus de mamífero ou um reovirus aviário. 0 reovirus de mamífero é, de um modo preferido, um reovirus do serotipo 3 e, de um modo mais preferido, um reovirus da estirpe Dearing. 0 neoplasma pode ser seleccionado do grupo consistindo em cancro do pulmão, cancro da próstata, cancro colorrectal, cancro da tiróide, cancro renal, cancro das supra-renais, cancro hepático, cancro pancreático, cancro da mama, cancro hematopoiético e cancro do sistema nervoso central e periférico. 6 É ainda divulgado um método de diagnóstico de um neoplasma activado por ras num animal, compreendendo: (a) remover uma amostra biológica do animal, em que a amostra compreende células; (b) colocar em contacto a amostra com um reovirus sob condições que permitem que o reovirus replique em células activadas por ras; (c) determinar a capacidade do reovirus para replicar na amostra; e (d) identificar o animal como tendo um neoplasma activado por ras, se o reovirus puder replicar na amostra. 0 animal é, de um modo preferido, um mamífero, particularmente um humano. Pode ser utilizado qualquer reovirus capaz de replicação em células activadas por ras, por exemplo, um reovirus de mamífero ou um reovirus aviário. 0 reovirus de mamífero é, de um modo preferido, um reovirus do serotipo 3 e, de um modo mais preferido, um reovirus da estirpe Dearing.
De um modo preferido, a amostra biológica é de um animal que tem um neoplasma seleccionado do grupo consistindo em cancro do pulmão, cancro da próstata, cancro colorrectal, cancro da tiróide, cancro renal, cancro das supra-renais, cancro hepático, cancro pancreático, cancro da mama, cancro hematopoiético e cancro do sistema nervoso central e periférico.
Em qualquer forma de realização da presente invenção, o reovirus pode ser um reovirus recombinante. 0 reovirus recombinante pode ser produzido por co-infecção de células de mamífero com diferentes subtipos de reovirus. 0 reovirus recombinante pode ser de ocorrência natural ou não natural. 0 reovirus recombinante pode ser de duas ou mais estirpes de reovirus, particularmente duas ou mais estirpes de reovirus 7 seleccionadas do grupo consistindo em estirpe Dearing, estirpe Abney, estirpe Jones e estirpe Lang. 0 reovirus recombinante pode também resultar da reordenação de reovirus de diferentes serotipos, tal como seleccionados do grupo consistindo em reovirus do serotipo 1, reovirus do serotipo 2 e reovirus do serotipo 3. 0 reovirus recombinante pode compreender seguências codificantes da proteína do revestimento variantes de ocorrência natural ou seguências codificantes da proteína do revestimento mutadas.
Além do reovirus, uma variedade de outros vírus oncolíticos são também selectivos para neoplasmas activados por ras e, deste modo, estes podem ser utilizados para praticar a presente invenção do mesmo modo que o reovirus. Estes vírus incluem, sem estarem limitados a, adenovírus mutados na região VAI, vírus vacínia mutados na região K3L e/ou E3L, vírus orf parapoxvírus mutados no gene OV20.0L, vírus da gripe mutados no gene NS-1 ou vírus herpes mutados no gene γχ34.5. É ainda descrito um método de detecção de células neoplásicas activadas por ras numa amostra biológica, compreendendo colocar em contacto a amostra com um vírus oncolítico que replica selectivamente, em células deficientes em PKR e determinar a capacidade do vírus para replicar na amostra, em que a capacidade do vírus para replicar indica a presença de células neoplásicas activadas por ras na amostra. De um modo preferido, o vírus oncolítico é seleccionado do grupo consistindo em adenovírus mutados na região VAI, vírus vacínia mutados na região K3L e/ou E3L, vírus orf parapoxvírus mutados no gene OV20.0L, vírus da gripe mutados no gene NS-1 e vírus herpes mutados no gene γχ34.5.
Além disso, muitos outros vírus oncolíticos que são capazes de infectar selectivamente células tumorais particulares são também úteis na presente invenção do mesmo modo que o reovirus. 8
Por exemplo, pode ser utilizado o vírus da estomatite vesicular (VSV) para diagnosticar tumores resistentes a interferão, pode ser utilizado o vírus ONIX-015 para diagnosticar vírus deficientes em p53 e pode ser utilizado o vírus Delta24 para diagnosticar tumores deficientes em Rb. Contudo, o vírus oncolítico útil na presente invenção é, de um modo preferido, não um adenovírus, particularmente não o vírus ONIX-015.
Um aspecto da presente invenção proporciona um kit compreendendo um reovírus e meios para detectar a replicação de reovírus. Os meios de detecção são um par de iniciadores específicos para o ácido nucleico do reovírus e pode opcionalmente incluir reagentes para PCR. Os meios de detecção podem também ser um anticorpo específico para uma proteína de reovírus, assim como reagentes acompanhantes, tal como anticorpos secundários. Os meios de detecção podem ser ainda lâminas e corantes adequados para observar a morfologia de células infectadas ao microscópio ou meios de cultura de vírus e células que são utilizados para determinar o título do reovírus. De modo semelhante, a presente invenção também proporciona kits compreendendo outro vírus oncolítico capaz de replicação em células tumorais específicas, assim como meios para detectar a replicação do vírus. Os exemplos destes vírus incluem, sem estarem limitados a, VSV, vírus ONIX-015 e vírus Delta24.
Outro aspecto desta invenção proporciona um kit compreendendo, pelo menos, dois vírus oncolíticos que podem ser utilizados para a fenotipagem de tumores de acordo com a presente invenção. Os vírus são, de um modo preferido, selectivos para neoplasmas com diferentes fenótipos. De um modo preferido, os virus são seleccionados do grupo consistindo em reovírus, VSV, vírus ONIX-015 e vírus Delta24. 9
Ainda outro aspecto desta divulgação proporciona um kit compreendendo um virus útil para o diagnóstico de um neoplasma de um fenótipo particular, assim como um agente terapêutico selectivo para o neoplasma.
Além disso, uma vez gue os virus oncoliticos replicam selectivamente em células neoplásicas mas não em células normais, outro aspecto da presente divulgação proporciona um método para diagnóstico da presença de um neoplasma num mamífero, compreendendo colocar em contacto uma amostra de células do referido mamífero com um vírus oncolítico, em gue a capacidade do referido vírus para replicar na referida amostra indica a presença de um neoplasma no referido mamífero. A presente invenção proporciona um kit para diagnóstico de neoplasmas que têm fenótipos particulares por utilização de, pelo menos, dois vírus oncoliticos. Em particular, os tumores mediados por actividade excepcionalmente elevada da via ras podem ser diagnosticados utilizando reovírus. 0 reovírus não replica em células normais. Contudo, o reovírus replica selectivamente em células com uma via ras activada, o que conduz à morte dessas células. Deste modo, um tumor activado por ras pode ser diagnosticado pela sua susceptibilidade à replicação de reovírus. 0 diagnóstico poderá depois facilitar o tratamento ou a melhoria do tumor com maior eficiência.
Esta invenção pode ser ainda aplicada para diagnosticar outros tumores, tais como tumores resistentes a interferão, tumores deficientes em p53 e tumores deficientes em Rb através da utilização de kits úteis no diagnóstico ou tratamento aqui divulgados. 10
Antes de se descrever a invenção com mais detalhe, os termos utilizados neste pedido são definidos como se segue, salvo indicação em contrário.
Definições
Como aqui utilizado, "células neoplásicas", também conhecidas como "células com um distúrbio proliferativo", referem-se a células que proliferam sem as propriedades normais de inibição de crescimento. Um novo crescimento compreendendo células neoplásicas é um "neoplasma" ou "tumor". Um neoplasma é um crescimento anómalo de tecido, formando, geralmente, uma massa distinta que cresce por proliferação celular mais rapidamente do que o crescimento normal de tecido. Os neoplasmas podem apresentar uma falta parcial ou total de organização estrutural e coordenação funcional com o tecido normal. Como aqui utilizado, um neoplasma pretende abranger neoplasmas hematopoiéticos assim como neoplasmas sólidos.
Um neoplasma pode ser benigno (tumor benigno) ou maligno (tumor maligno ou cancro). Os tumores malignos podem ser genericamente classificados em três tipos principais. Os neoplasmas malignos originários de estruturas epiteliais são denominados carcinomas, os neoplasmas malignos originários de tecidos conjuntivos, tais como músculo, cartilagem, gordura ou osso, são denominados sarcomas e os tumores malignos que afectam estruturas hematopoiéticas (estruturas que se relacionam com a formação de células sanguíneas), incluindo componentes do sistema imune, são denominados leucemias e linfomas. Outros neoplasmas incluem, mas não estão limitados a, neurofibromatose.
Uma "célula deficiente em PKR" é uma célula em que PKR não está activada como em células normais. Tal deficiência de PKR 11 pode ser devida a, por exemplo, uma mutação no gene PKR ou um nível reduzido da proteína ou da actividade de PKR. Por exemplo, as células neoplásicas activadas por ras são deficientes em PKR porque a via ras activada bloqueia a fosforilação de PKR. Os ensaios para níveis proteicos ou de actividade de PKR são conhecidos na técnica.
Como aqui utilizado, "células neoplásicas activadas por ras" ou "células neoplásicas mediadas por ras" referem-se a células que proliferam a uma taxa anormalmente elevada devido, pelo menos em parte, a activação da via ras. A via ras pode ser activada por meio de mutação estrutural do gene ras, nível elevado de expressão do gene ras, estabilidade elevada do mensageiro do gene ras ou qualquer mutação ou outro mecanismo que conduz a activação de ras ou um factor ou factores a jusante ou a montante de ras na via ras, aumentando assim a actividade da via ras. Por exemplo, a activação do receptor do EGF, receptor do PDGF ou Sos resulta na activação da via ras. As células neoplásicas mediadas por ras incluem, mas não estão limitadas a, células cancerosas mediadas por ras que são células que proliferam de um modo maligno devido à activação da via ras.
Um "tumor activado por ras" é um tumor em que a via ras está activada.
Um "tumor resistente a interferão" ou "um tumor que tem o fenótipo de resistência a interferão" é um tumor que não pode ser tratado ou melhorado com interferão-alfa, beta ou gama.
Um "tumor deficiente em p53" ou "um tumor que tem o fenótipo de deficiência de p53" é um tumor em que o nível do supressor celular tumoral p53 é inferior àquele em células normais. 12
Um "tumor deficiente em Rb" ou "um tumor que tem o fenótipo de deficiência de Rb" é um tumor em que o nivel do supressor celular tumoral Rb é inferior àquele em células normais.
Um "vírus oncolítico" é um vírus que mata selectivamente células neoplásicas. A morte das células neoplásicas pode ser detectada através de qualquer método estabelecido na técnica, tal como determinar a contagem de células viáveis, efeito citopático, apoptose das células neoplásicas, síntese de proteínas virais nas células neoplásicas (e. g., por marcação metabólica, análise de Western de proteínas virais ou por reacção em cadeia da polimerase com transcrição reversa de genes virais necessários para replicação) ou redução no tamanho de um tumor.
Como aqui utilizado, "reovírus" refere-se a qualquer vírus classificado no género reovírus. 0 nome reovírus (Vírus respiratório e entérico órfão) é um acrónimo descritivo que sugere que estes vírus, embora não associado com qualquer estado de doença conhecido em humanos, podem ser isolados a partir de tractos respiratórios e entéricos. 0 termo "reovírus" refere-se a todos os vírus classificados no género reovírus. 0 reovírus humano consiste em três serotipos: tipo 1 (estirpe Lang ou TIL) , tipo 2 (estirpe Jones, T2J) e tipo 3 (estirpe Dearing ou estirpe Abney, T3D) . Os três serotipos são facilmente identificáveis com base em ensaios de neutralização e inibição da hemaglutinina (ver, por exemplo, Nibert et al., 1996). 0 reovírus pode ser de ocorrência natural ou modificada. 0 reovírus é de "ocorrência natural" quando pode ser isolado a partir de uma fonte na natureza e não foi intencionalmente 13 modificado por humanos no laboratório. Por exemplo, o reovirus pode ser de uma "fonte de campo", isto é, de um humano que foi infectado com o reovirus. 0 reovirus pode ser modificado mas ainda capaz de infectar liticamente uma célula de mamifero que tem uma via de ras activa. 0 reovirus pode ser pré-tratado quimica ou bioquimicamente (e. g., por tratamento com uma protease, tal como quimiotripsina ou tripsina) antes da administração às células proliferativas. 0 pré-tratamento com uma protease remove o revestimento externo ou cápside do virus e pode aumentar a infectividade do virus. 0 reovirus pode ser revestido num lipossoma ou micela (Chandron e Nibert, 1998) para reduzir ou prevenir uma resposta imune de um mamifero que desenvolveu imunidade ao reovirus. Por exemplo, o virião pode ser tratado com quimiotripsina na presença de concentrações formadoras de micela de detergentes de alquilsulfato para produzir uma nova partícula infecciosa de subvirião. 0 reovirus pode ser um reovirus recombinante que resulta de recombinação/reordenação de segmentos genómicos de dois ou mais reovirus geneticamente distintos. 0 reovirus recombinante pode ser de dois ou mais tipos de reovirus com fenótipos patogénicos diferentes de modo que contenha determinantes antigénicos diferentes, reduzindo ou prevenindo assim, uma resposta imune por um mamifero exposto previamente a um subtipo de reovirus. Os reovirus recombinantes podem também apresentar actividades biológicas diferentes (e. g., actividades de replicação em células neoplásicas e biodistribuição) comparativamente aos reovirus originais. A recombinação/reordenação de segmentos genómicos de reovirus pode ocorrer na natureza após infecção de um organismo hospedeiro com, pelo menos, dois reovirus geneticamente distintos. Os viriões recombinantes podem também 14 ser produzidos em cultura de células, por exemplo, por co-infecção de células hospedeiras permissivas com reovirus geneticamente distintos (Nibert et al. 1996).
Consequentemente, a invenção contempla a utilização de reovirus recombinantes que resultam da reordenação de segmentos genómicos de dois ou mais reovirus geneticamente distintos, incluindo mas não limitados a, reovirus humano, tais como tipo 1 (e. g., estirpe Lang) , tipo 2 (e. g., estirpe Jones) e tipo 3 (e. g., estirpe Dearing ou estirpe Abney), reovirus de mamíferos não humanos ou reovirus aviários. A invenção contempla ainda a utilização de reovirus recombinantes que resultam da reordenação de segmentos genómicos de dois ou mais reovirus geneticamente distintos em que, pelo menos, um vírus parental é manipulado geneticamente, compreende um ou mais segmentos genómicos sintetizados quimicamente, foi tratado com mutagénios químicos ou físicos ou é ele próprio o resultado de um evento de recombinação. A invenção contempla ainda a utilização de reovirus recombinante que sofreu recombinação na presença de mutagénios químicos, incluindo mas não limitados a, dimetilsulfato e brometo de etídio, ou mutagénios físicos, incluindo mas não limitados a, luz ultravioleta e outras formas de radiação. A invenção contempla, ainda, reovirus recombinantes que compreendem deleções ou duplicações em um ou mais segmentos genómicos que compreendem informação genética adicional como resultado de recombinação com um genoma de célula hospedeiro ou que compreendem genes sintéticos. A "fenotipagem" de um tumor significa classificar um tumor de acordo com o seu fenótipo. Por exemplo, os fenótipos tumorais incluem activação da via ras, resistência a interferão, 15 deficiência a p53 e deficiência a Rb. Os fenótipos não são mutuamente exclusivos, nomeadamente, um tumor pode ser fenotipado em mais do que uma classe.
Uma "amostra biológica" é uma amostra recolhida a partir de um indivíduo biológico, tal como um animal. 0 kit da presente invenção é útil na fenotipagem precisa de tumores, facilitando assim o desenvolvimento de um regime de tratamento que é feito à medida de um tumor específico. Podem ser utilizados reovírus para infectar uma amostra biológica recolhida de um animal contendo tumor. Uma vez que os reovírus infectam selectivamente células neoplásicas activadas por ras mas não células normais ou células tumorais em que a via ras não está activada, o método permite ao médico assistente determinar precisamente se o tumor está associado com a activação da via ras. Se for diagnosticado como sendo activado por ras, o tumor pode ser depois tratado com regimes de tratamento específicos de ras, tal como terapia de reovírus (Patente U.S. N° 6136307). A via ras é uma via de transdução de sinal complexa que conduz a proliferação celular. Ras está numa posição central nesta via, recebendo sinais de elementos a montante (e. g., receptores de factores de crescimento) e transmitindo-os a elementos a jusante.
Muitos receptores de factores de crescimento, tais como o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGF), receptor do factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), assim como moléculas relacionadas com o receptor do EGF (e. g. Her-2/Neu/ErbB2), possuem uma actividade intrínseca de tirosina cinase que é activada por dimerização do receptor induzida por ligando. Isto resulta em autofosforilação do receptor nos 16
resíduos de tirosina e na ligação de proteínas contendo domínios Src-homologia 2 (SH2) . Duas dessas proteínas SH2 são Grb2 e SHC que activam indirectamente a pequena proteína de ligação a GTP associada à membrana plasmática Ras. A activação de Ras ocorre também em resposta à ligação do ligando a receptores acoplados a proteína G de sete domínios transmembranares (e. g. Gutkind, 1998) . A activação de Ras e de outras vias de sinalização reguladas por receptor de factor de crescimento conduz, em última análise, a variações no citoesqueleto e expressão génica que são necessárias para proliferação, diferenciação e transformação celulares (revisto em Campbell et al., 1998).
Os três genes ras humanos (Ha-Ras, N-Ras e Ki-Ras) codificam 4 proteínas (devido a excisão-união alternativa do ARNm de
Ki-Ras). Sob circunstâncias normais, as proteínas Ras permutam entre um estado activo (ligado a GTP) e um estado inactivo (ligado a GDP) . A activação de Ras ocorre por troca de GDP ligado para GTP que é facilitada por uma família de factores de troca de nucleótidos de guanina. A inactivação de Ras ocorre por hidrólise de GTP ligado para GDP. Esta reacção é facilitada por proteínas activadoras de GTPase (GAP). Em muitos cancros humanos, as proteínas Ras tornam-se oncogenicamente activadas por mutações que destroem a sua actividade de GTPase e, assim, regulam negativamente a sinalização de ras (revisto em Campbell et al., 1998).
Existem múltiplos candidatos a efectores de Ras que podem actuar a jusante de Ras na transdução de sinal e transformação oncogénica, incluindo membros da família Rho de pequenas GTPases, fosfatidilinositol-3 cinase (PI3K) e serina/treonina proteína cinase c-Raf-1 (revisto em Campbell et al., 1998). A sinalização mediada por Raf é a via efectora de Ras mais bem caracterizada. A Ras activada recruta Raf para a membrana onde 17 ocorre a activação de Raf. A Raf activada é o componente inicial de uma cascata de cinase, a cascata da Proteina Cinase Activada por Mitogénio (MAPK). A Raf fosforila e activa as proteínas cinases MEK1 e MEK2 (MAPK/ERK cinase) que, por sua vez, fosforilam e activam as Cinases Reguladas por Sinal Extracelular ERK1 e ERK2 (também conhecidas como MAPK1 e MAPK2). Ao contrário dos seus alvos a jusante, ERK1,2, as proteínas MEK1,2 são enzimas altamente especificas cujos os únicos substratos conhecidos são as proteínas ERK1,2. Após activação, ERK1 e ERK2 fosforilam (e regulam assim) uma variedade de proteínas alvo, incluindo factores de transcrição nucleares, conduzindo à resposta celular final.
Consequentemente, numerosos eventos podem conduzir à activação da via ras. Por exemplo, uma mutação pode ocorrer em qualquer dos três genes estruturais de ras. As mutações estruturais podem também ocorrer nos receptores a montante de ras, nos transdutores de sinal a jusante de ras (tais como raf ou mekl,2) ou nos efectores finais MAPK1 e 2. De modo semelhante, as mutações reguladoras que conduzem a níveis anormalmente elevados de expressão de qualquer proteína na via ras podem também causar respostas celulares mitogénicas. Tais mutações reguladoras podem ocorrer em qualquer posição nas sequências reguladoras de um membro da via ras ou mesmo na região estrutural ou reguladora de um factor que controla a expressão de um membro da via ras. Consequentemente, a detecção da aberração de qualquer membro específico na via ras não é uma forma eficiente para determinar se a via ras está activada. É possível medir a actividade de MAPK, o efector final da via ras, uma vez que a activação constitutiva de MAPK é indicadora de activação da via ras. Contudo, uma tal abordagem bioquímica requer uma quantidade substancial de material de 18 amostra, assim como processos fastidiosos, tais como extracção e/ou purificação parcial de MAPK.
Através da detecção do fenótipo activado de ras, em vez da aberração de qualquer gene ou produto génico especifico, a presente invenção é útil quer a activação da via ras seja devida a mutação do gene estrutural de ras, de sequências reguladoras do gene ras ou de qualquer outro factor na via ras. A capacidade do reovírus para infectar células numa amostra pode ser determinada por qualquer método na técnica. Por exemplo, a replicação do ácido nucleico do reovirus pode ser medida por reacção em cadeia da polimerase com iniciadores específicos para o reovirus utilizado; a sintese proteica do reovirus pode ser detectada por anticorpos específicos; as células infectadas podem ser observadas ao microscópio e a evidência de efeitos citopáticos induzidos por reovirus detectada; e os reovirus replicados podem ser recolhidos a partir da amostra e o titulo do virus determinado, para avaliar se ocorreu replicação virai. Outros métodos de determinação da presença da replicação de reovirus são conhecidos ou podem ser desenvolvidos por técnicos com conhecimento geral na matéria.
Deve ser assinalado que um tumor pode conter múltiplas anomalias oncogénicas. Em particular, foi descrito que a activação de ras é frequentemente precedida por sobreexpressão de p53 em cancro da mama (Smith et al., 2000) . A presença de outras anomalias oncogénicas além da activação da via ras, contudo, não impede a capacidade de um regime de terapia feito especificamente à medida para tumores activados por ras. Por exemplo, o reovirus pode ainda matar selectivamente células neoplásicas activadas por ras mesmo se as células contiverem também niveis excepcionalmente elevados de p53. 19
Além disso, uma vez que o reovírus replica selectivamente em células neoplásicas activadas por ras, mas não em células normais, um outro aspecto da presente invenção proporciona um método para diagnóstico da presença de um neoplasma num mamifero, compreendendo colocar em contacto uma amostra de células do referido mamifero com um reovirus sob condições que permitem ao reovirus replicar em células activadas por ras, em que a capacidade do referido reovirus para replicar na referida amostra indica a presença de um neoplasma no referido mamifero.
Semelhante ao reovirus, muitos outros virus oncoliticos também replicam, selectivamente, em células activadas por ras. Está contemplado que estes virus oncoliticos podem ser empregues para praticar a presente invenção do mesmo modo que os reovirus. Estes virus são tipicamente mutantes que são sensíveis à cinase de ARN de dupla cadeia (PKR), enquanto os seus correspondentes de tipo selvagem não são sensíveis a PKR.
Normalmente, quando um virus entra numa célula, a PKR é activada e bloqueia a síntese proteica e o vírus não pode replicar nesta célula. Alguns vírus desenvolveram um sistema para inibir a PKR e facilitar a síntese proteica virai, assim como a replicação virai. Por exemplo, o adenovírus sintetiza uma grande quantidade de um ARN pequeno, ARN VAI. 0 ARN VAI tem extensas estruturas secundárias e liga-se a PKR em competição com o ARN de dupla cadeia (dsARN) que activa normalmente a PKR. Uma vez que requer um comprimento minimo de dsARN para activar a PKR, o ARN VAI não activa a PKR. Alternativamente, este sequestra PKR em virtude da sua grande quantidade. Consequentemente, a síntese proteica não é bloqueada e o adenovírus pode replicar na célula. 20
As células neoplásicas activadas por ras não são submetidas a inibição da síntese proteica por PKR, porque a ras inactiva a PKR. Estas células são, deste modo, susceptíveis a infecção virai mesmo se o vírus não tiver um sistema inibidor da PKR. Consequentemente, se os inibidores de PKR no adenovírus forem mutados de modo a não bloquearem mais a função de PKR, o vírus resultante não infectam as células normais devido a inibição da síntese proteica por PKR, mas replicam em células neoplásicas activadas por ras que carecem de actividades de PKR.
Consequentemente, um vírus que seja modificado ou mutado de modo que não iniba a função de PKR, replica selectivamente em células neoplásicas activadas por ras quando as células normais forem resistentes. De um modo preferido, o vírus é um adenovírus mutado na região VAI, um vírus vacínia mutado na região K3L e/ou E3L, um vírus orf parapoxvírus mutado no gene OV20.0L, um vírus da gripe mutado no gene NS-1 ou um vírus herpes mutado no gene Yi34.5.
Os vírus podem ser modificados ou mutados de acordo com a relação estrutura-função conhecida dos inibidores virais de PKR. Por exemplo, uma vez que a região amino terminal da proteína E3 interage com o domínio da região carboxi-terminal de PKR, a deleção ou mutação pontual deste domínio previne a função anti-PKR (Chang et al., 1992, 1993, 1995; Sharp et ai., 1998; Romano et al., 1998). 0 gene K3L do virus vacínia codifica pK3, um pseudosubstrato de PKR. Existe uma mutação de perda-de-função em K3L. Truncamentos ou mutações pontuais na porção C-terminal de proteína K3L que é homóloga aos resíduos 7 9 a 83 em eIF-2 elimina a actividade inibidora de PKR (Kawagishi-Kobayashi et al., 1997) . 21
Noutra forma de realização da presente invenção, o vírus da estomatite vesicular (VSV) pode ser utilizado para diagnosticar tumores resistentes a interferão. Os interferões são factores circulantes que se ligam aos receptores de superfície celular e conduzem, em última análise, a uma resposta antiviral e a uma indução de inibição do crescimento e/ou de sinais apoptóticos nas células alvo. Embora os interferões possam ser teoricamente utilizados para inibir a proliferação de células tumorais, esta tentativa não foi muito bem sucedida por causa de mutações específicas de tumor de membros da via do interferão.
Contudo, por interrupção da via do interferão para evitar a inibição do crescimento exercida pelo interferão, as células tumorais podem simultaneamente comprometer a sua resposta antiviral. De facto, foi demonstrado que o VSV, um vírus de ARN de sentido negativo com envelope, replicou rapidamente e matou uma variedade de linhas de células tumorais humanas na presença de interferão, enquanto que culturas de células primárias humanas normais foram aparentemente protegidas por interferão. 0 VSV pode ser assim utilizado para diagnosticar tumores resistentes a interferão mas sensíveis a VSV. Tal como a forma de realização de reovírus, o diagnóstico baseado em VSV é uma avaliação do fenótipo e não depende do mecanismo de resistência ao interferão.
Noutra forma de realização da presente invenção, o vírus ONIX-015 pode ser utilizado para diagnosticar tumores deficientes em p53. 0 p53 é um potente supressor tumoral que está presente em todas as células e controla o crescimento celular. Uma vez que os vírus contam com a maquinaria de proliferação celular para replicar, estão sujeitos a regulação pelo p53 e não podem sobrerreplicar. Determinados adenovírus, SV40 e o vírus do papiloma humano, contudo, incluem proteínas 22 que inactivam p53, permitindo assim a sua própria replicação (Nemunaitis 1999).
Para o serotipo 5 do adenovirus, esta proteína é uma proteína de 55 Kd codificada pela região E1B. Se a região E1B que codifica esta proteína de 55 kd for suprimida, como no vírus ONIX-015 (Bischoff et al, 1996; documento WO 94/18992), o inibidor p53 da 55 kd não está mais presente. Como resultado, quando ONIX-015 entra numa célula normal, o p53 funciona de modo a suprimir a proliferação celular, assim como a replicação virai. Deste modo, ONIX-015 não se replica em células normais. Por outro lado, em células neoplásicas com a função de p53 interrompida, o ONIX-015 pode replicar e eventualmente causar morte da célula. Consequentemente, este vírus pode ser utilizado para detectar células neoplásicas numa amostra deficiente em p53. Um técnico com conhecimento geral na matéria pode também mutar e interromper o gene do inibidor p53 em adenovirus 5 ou outros vírus utilizando técnicas estabelecidas e os vírus resultantes são úteis na presente invenção para diagnosticar tumores deficientes em p53.
De modo semelhante, o vírus Delta24 pode ser utilizado para diagnosticar tumores deficientes em Rb. 0 vírus Delta24 é um adenovirus mutante que contém uma deleção de 24 pares de bases na região EIA (Fueyo et al., 2000). Esta região é responsável pela ligação ao supressor tumoral celular Rb e inibição da função de Rb, permitindo assim a maquinaria proliferativa celular, e assim, a replicação virai, prosseguir de um modo não controlado. Delta24 tem uma deleção na região de ligação a Rb e não se liga a Rb. Deste modo, a replicação do vírus mutante é inibida por Rb numa célula normal. Contudo, se o rb for inactivado e a célula se tornar neoplásica, o Delta24 não é mais inibido. Alternativamente, o vírus mutante replica 23 eficientemente e lisa a célula deficiente em Rb. Desta forma, o virus Delta24 pode ser utilizado para determinar se uma amostra contém células tumorais deficientes em Rb.
Como no caso de células tumorais activadas por ras, as células deficientes em p53 ou deficientes em Rb podem ser o resultado de uma variedade de razões. Por exemplo, uma mutação no gene estrutural de p53 ou Rb pode conduzir a um produto génico que funciona mal ou a fraca tradução, uma mutação na sequência reguladora do gene de p53 ou Rb pode provocar uma redução na quantidade de transcrição, uma mutação num factor de transcrição para o gene de p53 ou Rb pode resultar na produção deficiente de p53 ou Rb ou uma mutação num cofactor necessário para a função de p53 ou Rb pode também ser a razão para deficiência de p53 ou Rb. Uma vez que a presente invenção detecta o fenótipo, em vez de apenas aberração estrutural do gene/preoteina de p53 ou Rb, é mais poderosa do que métodos baseados em estrutura, tal como PCR.
Uma vez determinado o fenótipo de um tumor, o tumor pode ser tratado de acordo com o seu fenótipo. Por exemplo, um tumor activado por ras pode ser tratado por reovirus ou inibidores da via ras.
Deve ser assinalado que Delta24 e ONIX-015 são meramente exemplos para elucidar a aplicação da presente invenção, enquanto um técnico com conhecimento geral na matéria será capaz de identificar ou desenvolver outros virus úteis no diagnóstico e tratamento de tumores de acordo com a presente divulgação.
Como com reovirus, a utilização de virus imunoprotegidos ou reordenados de outros virus oncoliticos está também abrangida na presente invenção. Além disso, adicionalmente aos virus 24 especificamente discutidos no presente pedido, um técnico com conhecimento geral na matéria pode praticar a presente invenção utilizando virus oncoliticos adicionais de acordo com a divulgação aqui apresentada e conhecimento disponível no campo técnico. 0 vírus oncolítico pode ser um membro na família de myoviridae, siphoviridae, podoviridae, teciviridae, corticoviridae, plasmaviridae, lipothrixviridae, fuselloviridae, poxviridae, iridoviridae, phycodnaviridae, herpesviridae, adenoviridae, papovaviridae, inoviridae, microviridae, geminiviridae, hepadnaviridae, retroviridae, birnaviridae, paramyxoviridae, orthomyxoviridae, bunyaviridae, picornaviridae, caliciviridae, tombusviridae, parvoviridae, reoviridae, filoviridae, leviviridae, potyviridae, tetraviridae, sequiviridae, astroviridae, coronaviridae, baculoviridae, polydnaviridae, circoviridae, cyctoviridae, rhabdoviridae, arenaviridae, comoviridae, nodaviridae, glaviviridae, togaviridae ou barnaviridae. A presente invenção pode ser aplicada a qualquer animal, particularmente mamíferos. Os mamíferos preferidos incluem cães, gatos, carneiros, cabras, bovinos, cavalos, porcos, humanos e primatas não humanos. De um modo muito preferido, o mamífero é humano.
Estojos-conjunto de componentes (kits) A presente invenção proporciona kits úteis para o diagnóstico de tumores. Um aspecto da presente invenção proporciona um kit compreendendo um reovírus e meios para detectar a replicação do reovírus. Os meios de detecção podem ser um par de iniciadores específicos para o ácido nucleico do reovírus e pode opcionalmente incluir reagentes para PCR. Os 25 meios de detecção podem também ser um anticorpo especifico para uma proteína de reovírus e pode, opcionalmente, ainda conter um anticorpo secundário. Os meios de detecção podem ser ainda lâminas e corantes adequados para observar a morfologia de células infectadas ao microscópio ou meios de cultura de vírus e células que podem ser utilizados para determinar o título do reovírus. De modo semelhante, a presente invenção também proporciona kits compreendendo outros vírus oncolíticos capazes de replicação em células específicas de tumor, assim como meios para detectar a replicação do vírus. Os exemplos destes vírus incluem, sem estarem limitados a, VSV, vírus ONIX-015 e Delta24.
Outro aspecto desta invenção proporciona um kit compreendendo, pelo menos, dois vírus oncolíticos que podem ser utilizados na fenotipagem de tumores de acordo com a presente invenção. De um modo preferido, os vírus são seleccionados do grupo consistindo em reovírus, VSV, o vírus ONIX-015 e o vírus Delta24.
Os seguintes exemplos são apresentados para ilustrar esta invenção e não são para serem interpretados, de modo algum, como limitantes do âmbito da presente invenção.
EXEMPLOS
Nos exemplos abaixo, as seguintes abreviaturas têm os seguintes significados. As abreviaturas não definidas têm os seus significados geralmente aceites. °C = grau Célsio h = horas min = minuto 26 μΜ mM Μ mL yL mg yg PAGE ^ rpm FBS = DTT = SDS = PBS = DMEM : a-MEM B-Me = MOI = PFU = EGF = PDGF : CPE = VSV = PCR = SH2 = micromolar milimolar molar mililitro microlitro miligrama micrograma electroforese em gel de poliacrilamida rotações por minuto soro fetal de bovino ditiotrietol dodecilsulfato de sódio soro fisiológico tamponado com fosfato meio de Eagle modificado por Dulbecco : meio de Eagle α-modifiçado β-mercaptoetanol multiplicidade de infecção unidades formadoras de placas factor de crescimento epidérmico factor de crescimento derivado das plaquetas efeito citopático virus da estomatite vesicular reacção em cadeia da polimerase src-homologia 2 EXEMPLO 1
Fenotipagem de um tumor com reovírus É encontrado um nódulo numa mulher de 65 anos quando realiza o seu mamograma regular. É recolhida uma amostra do nódulo durante a biopsia e parece ser um tumor maligno. De modo a 27 determinar se o tumor contém células activadas por ras, a amostra é colocada em cultura de células e incubada com reovirus. A estirpe Dearing do serotipo 3 de reovirus é propagada em culturas em suspensão de células L-929 purificadas de acordo com Smith (Smith et al., 1969), com a excepção de β-mercaptoetanol (β-Me) ser omitido do tampão de extracção. A razão particula/PFU para o reovirus purificado é tipicamente 100/1. A amostra da biopsia é misturada em DMEM, incubada com reovirus durante 2 horas a 37 °C, mudado para DMEM fresco mais 20% de FBS e cultivada durante 48 horas. Posteriormente, o sobrenadante da cultura é recolhido e o titulo de reovirus é determinado. O resultado indica que o reovirus replicou na amostra. Deste modo, o tumor da mama contém células tumorais activadas por ras.
Lisboa, 17 de Maio de 2012. 28
Claims (15)
- REIVINDICAÇÕES 1. Estojo-conjunto de componentes (kit) para diagnóstico de um neoplasma pelo fenótipo compreendendo, pelo menos, dois virus oncoliticos, em que cada virus oncolitico replica selectivamente em células neoplásicas que têm um fenótipo seleccionado do grupo consistindo em activação da via ras, resistência a interferão, deficiência de p53 e deficiência de Rb e em que cada dos virus oncoliticos replica selectivamente em células neoplásicas tendo um fenótipo diferente seleccionado do grupo consistindo em activação da via ras, resistência a interferão, deficiência de p53 e deficiência de Rb.
- 2. Estojo-conjunto de componentes (kit) da reivindicação 1, em que os virus oncoliticos são seleccionados do grupo consistindo em reovirus, virus da estomatite vesicular (VSV), ONIX-015, Delta24, adenovirus mutados na região VAI, virus vacinia mutados na região K3L e/ou E3L, virus orf parapoxvirus mutados no gene OV20.0L, virus da gripe mutados no gene NS-1 e virus herpes mutados no gene γι34.5.
- 3. Estojo-conjunto de componentes (kit) da reivindicação 1, em que os virus oncoliticos são seleccionados do grupo consistindo em reovirus, VSV, ONIX-015 e Delta24.
- 4. Estojo-conjunto de componentes (kit) da reivindicação 2, em que o reovirus é um reovirus de mamífero.
- 5. Estojo-conjunto de componentes (kit) da reivindicação 4, em que o reovirus de mamífero é um reovirus do serotipo 3. 1
- 6. Estojo-conjunto de componentes (kit) da reivindicação 5, em que o reovirus do serotipo 3 é um reovirus da estirpe Dearing.
- 7. Estojo-conjunto de componentes (kit) da reivindicação 2, em que o reovirus é um reovirus aviário.
- 8. Estojo-conjunto de componente (kit) da reivindicação 1, compreendendo ainda meios para detectar a replicação dos virus.
- 9. Estojo-conjunto de componentes (kit) da reivindicação 8, em que os meios de detecção são um par de iniciadores específicos para o ácido nucleico do virus.
- 10. Estojo-conjunto de componentes (kit)da reivindicação 9, compreendendo ainda reagentes para PCR.
- 11. Estojo-conjunto de componentes (kit) da reivindicação 8, em que o meio de detecção é um anticorpo especifico para uma proteína do vírus.
- 12. Estojo-conjunto de componentes (kit) da reivindicação 11, compreendendo ainda um anticorpo secundário.
- 13. Estojo-conjunto de componentes (kit) da reivindicação 8, compreendendo ainda lâminas adequadas para observar a morfologia de células infectadas ao microscópio. 2
- 14. Estojo-conjunto de componentes (kit) da reivindicação 8, compreendendo ainda corantes adequados para observar a morfologia de células infectadas ao microscópio.
- 15. Estojo-conjunto de componentes (kit) da reivindicação 8, compreendendo ainda meios de cultura de virus e células que são utilizados para determinar o titulo do virus. Lisboa, 17 de Maio de 2012. 1
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