DE1598807A1 - Verfahren und Mittel zur Fruehdiagnose der Phenylketonurie,der Ahornsirupkrankheit und der Hypervalinaemie - Google Patents

Description

(Xrüner: M 70 261 IXb/42 1)

E. Μ» r ο It 13. Juli ΙββΟ Aktiengesellschaft

Darmstadt

Verfahren und Mittel zur Frühdiagnose der P»ienylketonurie, der Ahornsirupkrackheit und der Hypervalinamle

Dl· Fruhdlagaone dor Phenylketomirie, dar Ahornsirupkrankheit (Leuoinose) anti der Hypcrvallnämle let von ganz besonderer Bedeutung, ireil diese Stoffwechselentglelsutigen bekanntlich schon in den ersten Lebenswoohen zu irreversiblen Schäden führen. Di» wirkllohe Frühdiagnose, insbesondere der Phenylketonurie, ist umso wlohtiger_f als ein effektiver Behandlungterfolg nur durch eine geeignete Diät in den allerersten Lebensmonaten oder -woohen erzielbar ist. Die relative Häufigkeit dieser Krankheiten und ihre soziale Bedeutung unterstreichen nooh die Wichtigkeit einer wirkliohen Früherfassung.

Bei der Phenylketonurie handelt es sich üb einen Enaysklefekt, bei dem Ils intermediären Eiweiß/itoffwecheel das Phenylalanin nicht zu Tyrosin oxydiert werden kann. Phenylalanin selbst wird nicht von Körper synthetisiert, sondern alt den Eiweißstoffen der Nahrung, vor allen der Uiloh, aufgenommen. Durch die Störung konat es zu einer Anhäufung des Phenylalanine la Blut, wodurch der weitere Aminosäuretransport gestört wird und eine Sohadigimg des Gehirns eintritt. Bereits wenige Tage nach der Geburt steigt der Pheny\a:Lanlngehalt la Blut auf dtn 1- bis 5fachen Noraalwert später bis bub 30fachen Wert en- Durch möglichst frühaeitige Verabreichung einer phenylalaninarmen Kost verläuft die geistige Entwicklung de» Kindes normal, während sonst irreversible Gehirnsohädon auftreten,

Neue Unterlagen (am 7«ι Ab*. 2 Nr. ι satz 3 des Αηο·ηι*髧··. ν. 009882/042S

BAD ORIGINAL

Bisher stehen drei Tests zur Diagnose der Phenylketonurle lur Verfugung: Die Ferrlohloridprobe, der Agardiffusion*test naoh Guthrle und die fluorlmetrlsohe Bestimmung naoh MoUaman-Ooblns. Die Ferriohloridprobe beruht auf einer Farbreaktion der duroh oxydative Desaainlerung von Phenylalanin gebildeten Phenylbrenztraubensaure in Harn. Pneny!brenztraubensäure wird Jedooh erst bei Serumphenylalanln~Konzentratlonen zwlsohen 10 and 20 Mg / 100 al (Normalwerte 1 bis 2 ng/iOO ml) ausgeschieden, Die Probe gibt daher erst in der 3, bis 6, Lebenswoohe ein pathologisches Resultat und ist deshalb für Entbindungsheime, wo die Säuglinge am ehesten dieser Kontrolle zu unterwerfen sind, nioht geeignet. Auoh nimmt später bei Hinnahe· bestimmter Medikamente die Spezifität des Testes ab. Deshalb ist die Messung des Phenylalanin anstiege la Blut als diagnostisches Kriterium vorzuziehen. Dieser Anstieg erreioht sohon wenige Tage naoh der Geburt eiudeutlg erhöhte Werte. Der erhöhte Anstieg kann duroh d"r* Agardlffusiocstest oder fluorlsietrlsoh in einen Tropfen Blut der Neugeborenen naohgewiesen werden. Der Agardlffuslonstest beruht auf des Prinzip, daß das Wachstum von Baolllus subtilis in eine» AganediuB duroh Zusatz von Thlenylalanln geheasit wird und daß diese Inhibition duroh Zusatz von Phenylalanin, Phenylbrenztraubensture, Phenyl»!lohsäure oder Prolin wieder aufgehoben wird. Diese Untersuchungen können jedooh nur in zentralen Laboratorien durchgeführt werden deaen die auf Spezialfilterpapier gesamelten Blutproben zugesandt werden Das gleiche gilt für die fluorlaetrisohe Methode naoh MoCaoan-Robins, die zwar sohon zu einem automatischen Verfahren ausgearbeitet wurde (Autoanalyzer)c .wegen der kostnplellgen erforderlichen Apparatur jedoch noch keinen Eingang in dio Praxis finden konnte

Die HypervalInKmIe 1st eine Krankheit, die auf dem Fehlen von Valin-Transoalnaee beruht. Bisher sind keine Schnell tests zur · Auffladung dieser Störung beschrieben worden>

009882/0425 bad original

Auoh dlt Ahornelrupkrankhelt (Leuoinoee) gehtirt zu den prlaären! Hyperaainoaoidurlen. Sie tritt iaat aueeohllefilloh bei SMα*linien In den ereten Lebenetagen auf und beruht auf dea Fehlen ron Verzwelgtketten-Aalnoeäuren-Deoarboxylaeen, wodurch ee zur Anreloherung vor alles von Leuoin, Ieoleuoln und Valin la Blut koaat Bin .Schnellteet iur Diagnoee dieeer Krankheit let bleher nloht bekannt geworden.

Ee wurde nun gefunden, dal aan In eines einsigen Sohne11teet eowohl die Phenvlketonurle ale auoh die Ahornelrupkrankhelt und die Hypervalinäai· erfaeeen kann. Mit dufteret geringen Serua-, Flaeaa- oder Blutaengen laeeen eich dleee 3 Krankheiten alt hoher Spezlfltät in kürxeeter Zeit ohne beeonderen Aufwand erfaeeen.

Dae neue Verfahren beetent darin, dal aan KVrperilueelgkelten wie Serua, Plaeaa oder Blut einer DUnneohlohtohroaatographle unterwirft, die dabei nach der Entwicklung erhaltenen Zonen τοη Valln/Phenylalanln und Leucln/leoleucln entweder durch Färbung alt eines Re&genz, dae beide AalnoeKurepaare etwa gleich etark anfärbt oder durch einen la Sorptlonealttel enthaltenen FluoreezeaalndlkMor erkennbar aacht und die Inteneltaten der Färbung bzw, der Fluoreeaens der beiden Zonen alteinander vergleicht. Beurteilt wird lediglich d&f Yerhältnle der Parblnteneitäten bzw, der αrad der Fluoreeaeozaufhellung oder -löeohung der beiden Anlnoeburepaare untereinander. Ia Noraaleerua, "Plaena oder -bim let die Färbung btw, die Aufhellung oder Ltteohung der Fluoreeaena dee Leucin/leoleucin-^Streifene etwa· •tärker oder gleichstark wie dl« dee Valin/Phenylalanln-Streifens Berolts eine Erhülmng dee Fheuvlelanini oder dee Valine auf weniger ale die doppelte Meng« der Moraalwerte let eindeutig zu erkennenc Fällt dieser Schnelltest po»itiv aus und weint daalt auf eine mögliche Phenylketonurle oder Hypervallnaale₍ eo auß natürlich * rie bieher auoh ■- vor Beglon einer Therapie eine genauere (tonalteboetiaaung dieeer Aainoeäuren erfolgen ι. B. papier-, dünneohic)ht-_r gae- oder eäuleachroaatographleoh oder fluorlaetriech, Sind bei etwa gleiohou Auftra^enengen la Vergleich tu noraalea Serua, Plaeaa oder Blut beide Konen der AalnoeJture«

BAD OBlGINW- 0 0 9 S 8 2/ 0 42 S

•...-JAS Sei

paare deutlich stärker gefärbt oder zeigen deutlich verstärkte Fluoresz&nzaufhellung oder -löschung, so besteht der Verdaoht auf Ahorosirupkrankheito Auoh In diesen Fall siUesen na tür 11 oh zur genauen Diagnose die einzelnen Aminosäuren noch quantitativ bestlsnt werden. Ein Vergleich zu den Inteneitäten der be» treffenden Amliiotäuren aus Normalblut wird iaaer leicht möglich sein, well diener Test Insbesondere IUr Reihenuntersuchungen geeignet ist und naoh den bisherigen Erfahrungen für Phenyl» ketonurle nur otra 1 Kind unter 10 QOO von diesen Krankheiten befallen wird, Es ist deshalb »it an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit anzunehmen, dafi bei der gleichzeitigen Durch* führung mehrerer Untersuchungen auoh die Färbungen der Normalwerte erhalten werden.

HÄufig 1st es günstig, eur genaueren Bestimmung der in Frage kommenden Zonen Leucin, Isoleucin, Valin und/oder Phenylalanin (lsi Qemlach oder einzeln) in den Normalmengen als Vergleich mitlaufen zu lassenο Die Lage der betreffenden Aeinoeäuren läßt sloh dann naoh der Entwicklung elnfaoher feststellen und etwaige Fehler in der technischen Durchführung bei der Entwicklung des Chronato^roasb werden sofort offenbar, Für geübtes Personal 1st jedoch wegon der Färbung kein Vergleichestandard erforderlich, da die Unterschiede zum Normalserum_; -blut oder -plasma eklatant sind Ee int auoh nioht erforderlich; daA did Vergleiohssubstanzen genau in den "Normalmengen" aufgetragen werden, zumal in der Fachliteratur nooh gar keine Einigkeit darüber herrscht, tr«lohe gsnouon Mengen als "normal¹¹ anzusehen sind,

Fach des Anfärben oder bei der Kontrolle unt*r UV-Licht erkennt nan im DUanechicktohrofcutogranm zwei unmittelbar nebeneinander* liegende aber deutlich voneinander getrennte Bänder* wobei die obere Zone »ua Louoin/lsoleuoia und die untere Zone aus Valin/ Phenylalanin b«steht Im Serum, Pia*«a oder Blut liegen beide Zonen in der gleichen Höhe wie die Vsrgleich»substanz(en).

009882/0425

BAD

Ale Sorptionsmittel für dl« durchzuführend· Ttilnntnhi nhtnnromsto graph!· kdnnen all· dl· verwendet werden, dl· mir Auftrennung ^TOtt Aminosäuren geeignet sind. Hierher gehören ■. B. Kl···Igel·, Aluminlumoxydo, Kieselgur·, Magnesiumsilikate, Calolumphosphate, Natriumpolyphosphate (Maddrellsohe* SaIe), Polyamide, Polycarbonate »Cellulose, Celluloseacetat·, Gellulos«~Ioneneuetauscher, z. B₃ KatIonenaustauscher wie Carboxycellulose, Carboxy«·thy1· oellulose (CM-Cellulose), phoephorylierte Cellulo·· (P-Cellulose), SulfofifchyloelluJ.ote (Sl-Celluloie) oder auoh Anlonenauetauioher wie Diäthylamiuottthyloellulo·· (DEAK-CeIluloee), Polyttthylenialncellulose (PBI-Celluloee), Ouanldoätbylo«llulo»o (OE»Cellulo··), Trmthylaialaoätliyloellulo·· (TEAE-Celluloee), Aainoäthyloellulo·· (AE-CeIIuIOOe)₁, p-Aalnoboaxyloellulo·· (PAB-C«llulo··) und ECTBOLA-CaIIuIoBe₀ Darüborhlnaufl können aber auoh lonenauetauiohharze, die »loh iur Auftrennung von Aminosäuren «lgn«n, als Sorptionsmittel verwendet werden (Amlno-Aold*>Analyz«r«Reelne). Alle diese Sorptionsmittel kOnn«n auoh, sofern das aus besonderen QrUnden ervlinsoht ist, in an sioh bekannter Welse hydrophil oder llpophll imprägniert werden. Hierfür kommen z. B. Pufferlösungen> mehrwertige Alkohole oder Paraffine in Betracht. Besondere Vorteile besltst Cellulose, insbesondere mikrokristalline Cellulose. Ss sind bereits mehrere Sorten solcher mikrokristallinen Cellulose^ für ohromatographlsohe Zweoke im Bändel. Selbstverständlich kdnnen auoh Gemische der genannten Sorptionsmittel verwendet werden*

Den Sorptionsmittel können auoh Pluoresienslndlkatorea zugesetzt sein, falls die Zonen der beiden Aminosäurepaare durch Yer~ änderung woo. FJuoreeienzereohclnungen kenntlich gemacht werden eolleno Ai beston 1st es, an das betreffende Sorptionsmittel chemisch igobundone oder «ubst&ntiv darauf aufgezogene flucroszierende organische ForbetclCe zu v«nrendeu_t dia nit don in Frage ko;nnenden Aiiinosäurea entweder in langwelligem UV durch Aufhellung oder in kurzwelliges UV (furch Löschung oder Verminderung der FluoreesBens sichtbare liffekte ergeben. Damit kann

BAD ORIGINAL

0098 8 2/0425

verhindert *er*en defl die Jn41katoron duroh da« Flltlalttel ausgewaschen werdon, Ia dtr Literatur sind zeiilreiohe hierfür In Fragt komtnd· Pluore*stenzindlkatoren beschrieben worden. Besonder· gnt flml la allgemeinen sulfoniKur«grupptnhaltlg· Indikatoren

Das oder dl· Sorptionsmittel wtrdtn in bekannter Wtl·· auf Unterlagen aufgetragen₀ getrooknet und gegebenenfall· aktiviert. Die Sohlohtdioken eatupreohen den für DUcneohlohtohroaatographlen Ubliohen unti liegen etwa zwischen 50 und 500 ^, ftlr Ctlluloet vtr» sugewelse bei etwa 100 μ. Xlnt bevorzugte Unterlagt für dlt Sorptioneaittel iut Glas, Jedooh können auoh andere Träger wie Kunststoffe in Folien odtr Bändern, Metallplatten oder -folie?» oder auofa geeignete Papltre rtrwtndtt wtrdtn. Bttonders vortf haft lädt «loh dao ntut Tsrfahren nach dtr Erfindung alt vorgefertigten abriebfesten Sohiohten auf dUnntn Olaeplatttn durchführen. r.ur Erzielung dtr gewünschten Haftfestigkeit und Abrieb» festigkeit dtr Sohiohten können natürlich dtn Sorptionsmittel gegebenenfalls auoh Zusätze btlgtgtbtn wtrdtn, dlt dlt Haft» festigkeit auf der Unterlage und/tdtr dlt Abrlebfestigkelt dtr ßohioht erhöhen, tiolohn Eusatcstoffe sind bereits in grofltr Anzahl bdsohrttbtn worüen. Out geeignet sind *_e B. Mufttrtt ftinttillgts .SiO_a- aus Aluiaogtltn gtwonntnt Aluetfnluaoxydt und - hydrojqrde _# Carboxymethylcellulose, Gipt, MontaorlUow.lt, oarboxylgruppeniialtige Ylnylpolyatrt «owl· Poljraorylesiide und Polyatthsorylaaildt» webM so lohe Substanzen natUrlloh auoh in Qtalsohtn lugoettist wtrden küimen,

Als Fiießmittol Kur DurohfüJuimg d«r ehroaatographiflohen Auftrennung MoEnan alle UbIlohelnftise fUr Auinosfturetrennungen verwendeten Flieänittel in Betracht FUr Gtllulost^Sohlohtin tlnd κ, Bc besonders gut geeignet: A<*thaaol/9*&a*r, Sutanol/listeelg/ Nasser; kothanolAatttr/Pyx-ldin; ProrAnol/Aeconiaklüsung; Ohiorofoxis/iitthanol/Aarnnlaklüsung,, IUr Kiene Igels tlnd z< B, jeelgnet: Propanol/Ifasiir; Propanol/»woniaklttsung; Plk«iayl/Vate»r Pyridin/wasoer. Weiter geeignet« Fllrfleilttul bzw. Fli-J«aittel S/tttat cind in dtr L/.tor»tür tahlrtlc^ btschrltben worden«

009882/04 25

BAD

Gegebenenfall* kann durch mint«eh·· Ausprobieren feetgeatellt werden, ob ilob ein FlleBalttel baw» Flleßalttel-Sretea für aae vorliegende Verfahren eignet, d. h. ob dealt eine Trennung der beiden hiev lntereealeretK . Aai&oaaurepaare erreioht werden kann. Sofern nan fu* SorptioniHlttel alkrokrietalllne Cellaloee verwendet, lateen eioh beeondore gttnitlge Ergebnleee Bit Aethanol alt eines Waeaergehalt unter 30 %_t rorsugewelee alt eines etwa 80 ^lgen Aethanol erzielen, da alt dleeea Flleft-Blttel eiae BiuoiBkoagulation In den Startlinien erreicht werden kann. Eine »olohe Koagulation let Jedooh nloht unbedingt erforderlich, de die Eiweißstoffe wegen ihre· höheren Molekular» gewloht· «owieeo langeaaer wandern und deshalb den Teat nloht • türen können,.

Die QrOAe der au verwendenden Platten hangt davon ab, wieviel Testa Jewell· gleichzeitig durchgeführt werden aollen. Geht aan davon aua, daJ? noraalerrelae aindeatena 2 Dnteraaohungen gluicli« seltlg auf einor Platte durchgeführt werden, aollte die Mindeste länge der Platte aindeatena etwa 5 ob, voraugawelae etwa IO ca, betragen. Die Kühe aollto vortugsweiae etwa bei 5 oa liegen. Natürlich kttunen bei Roihenuntemucbungen la gruferen MaBatab auch längere Platten eingeaetat werden. Beeondera einfach IaJIt ■loh daa neue Verfahren durchführen, wenn vorgefertigte Ölaeylatten entepreoheader irOfte verwendet werden, auf denen la einer abriebfeeten Schiebt von alkrokrietalliner Cellulote berelta eln<i n4er aehrere Vergleiohsaubetanaen Aufgetragen aind. Wenn dann ζ B, die Startlinien noch genau aarkiert alnd, kauti ohne Schwierigkelten eofort eine kleine Menge der zu unter« suehonden FiUcslgkeit aufg«»tragt» werden, ahnt daß das Einhaltet^ eiuey genauen Mfnge erfordernoh lat_t und die Entwicklung dee Chroectogrö*»9 kann »iohm^ueich

Sofern aan die beiden ionen, die die A-nlnoi»äurepaare fBta#)ten_t duroi» Anfärben kenntlloa aacht, i«t ea wichtig, ein ßeagon» au verwonden daa eine etwa gielohetarke AsfHrbuog der bilden

seetattat» Beeoadore gate Färbungen werdaa Bit

:■.., ' ■„ '"Wf^

neutrales oder aohwachaanrea_: voraugwweiee taaigaaor|p_e

00 9882/0425
BADORiGlNAL '3'

Mlnhrdrln-Reagene erhalten. Natür1loh können aber auch ander·, für Aminosäuren gebräuchliche Farbreagenalen verwendet «erden, ι. 1. Ieatin-Reagens, rolln-Reagens oder Pauly's Dla*o-R«ag«ns (Natriuiieulianilat + Katrlumnitrlt). Ein· Uebereicht über Sa-■asmtensetzunf und Amrendanf solcher Reagensien findet floh s. B in G. Patski_t OünnsohlohtohroBatographl· In der Amlnosäur·- und Peptldohenle, Walter de Oruyter A Co., Berlin 1966«

If hat üoh aln sweokBäBlg enrleaen, die tu untersuchenden Flüssigkeiten nicht punktförmig, sondern in Startlinien auitutregenα Aue der präparatlven Sohlchtohromsktgraphls let bereit« bekannt, dafl die Trennung von Bändern beater gelingt all die •Inselner Substanspunkt*. Besondere gut· Sxgebnleee werden bei des neuen Test nach der Erfindung erzielt, wenn dl« Startlinien jeder Seruaprobe eine Utnge von etwa 0,5 bit 5 ca, vorsugvweli« etwa 2 oa_t beiitsen* 01· Startlinie liegt vorsugewelee etwa 15 ■« oberhalb de· unteren Plattenrand··. Sin· g«g«b«n«nfall· al· Yerglelcheeubetani altlaufende Aainoslhir· kann allerdings auch ebenrogut punktfUraig aufgetragen werden=

die DUnnfohlohtohroaatographl· in 2 Stufen durchgeführt, •o ergeben flcii besondere günstige Effekt·, Man UUt dab ti tu» eret in der treten Stuf· das Fliefteitttl biw. das rileisiltttl« SvstsB in bekannter ¥·1β· elnvlrktn. Sobald das flieieltttl ble su einer bestiaeten, sweokBilBlg vorher festgnlegten Llnl· oberhalb der Startlinie (a. B. 3 ca oberhalb der Startlinie) hinaus» gelaufun ist, wird die Platts aus der Entwlcklungskaaw«r her« cusgenosaien und getrocknet, Ansoltllefend wird dann eine swelte Dunn»ohlohtohronai,3graphle Bit den gleichen cdtr eines anderen FlieOsiittöl durohctfuhrtc Naohdea die «weite Entwicklung abgesohloseen lit, wird das OUnnschlchtobroaatograssi in UbHoher Weise behAndelt und gegtbonenfalle angeftirbt«, Kaoh des TrooJrnen wirdeη » nofern angefürbt wurde - von den Aminosäuren herrührend·; violett gof&rbt« Streifen auf der Sorptlonsilttelsohloht erkenn« bar. Öle·· können natürlich sowohl visuell als auch fotometrisch In an sioh bekannter Welee aungtwerttt werdenο Soll dl« Aus-

009882/04,25

BAD ORiGiNAL

vertun* aufgrund der Veränderung dtr Fluorescein gesohohen, ·ο wird dl· tntwiokelte Platt· entweder te langwellig·» (366 im) oder Im kurzwelligen (204 na) UV botraohtet. Dl· Auswertung kann visuell oder alt Hilfe ein·· Spektralfotoaeters Mit Fluortszonz-Auswertung, da« «in Zu·*t«gerät für DC-Platten enthält „ erfolgen. Bei einer positiven Reaktion zeigt einer oder »•igen bold· streifen gegenüber den Verglolohswerten eine deut-Hohe Aufhellung b«w₀ Verminderung oder Aueldeohang der Fluoreexcns?

Häufig lnssen tioh besondere gUnstlge Iffekte erslelen, wenn man naoh der einten Stufe dieser Chromatographie dl· la dor Btartlinle verbliebenen liweiflatoffe und dl· stark polaren Aminosäuren (κ· Bo Lysin und Ornithin) τοη der übrigen Schicht abtrannt, iuis kann s. B. daduroh gesehenen, dai aan dl· Platt· bis zur Höhe der ureprüngllohen Startlinie in da« Flleaalttel eintauohen lttlt oder daß amn die Sorptlonsaittelschioht duroh Einritsen kiirx oberhalb der Startlinie unterbricht. Man kann aber auoh die da« Sorptionsalttel tragende Unterlage, vorzugsweise eine Glasplatte, so gestalten, dafl sie an dieser Stelle elngeritat iet und dann naoh der ersten Stuf« der Chromatographie dieser Teil dor Unterlag· alt der entsprechenden Sorptionealttel-Bohloht alt Lelohtlgkeit abgebrochen und verworfen werden kann₀ Dienen Folien als Unterlage, kann der nioht mohr erwünsohte Teil auoh elnfaoh abc«a«hnitt«n wordea· Iat ti· Sorptionaalttelsobloht nur duroh Abkratsen eines echaalen itrelfene oberhalb dar Start« linie unterbrochen worden, muB natUrlioh fur dl« «weite Stufe der Chromatographie der Fliesaittelspitgel in der lntwioklungskasaior entsprechend höher elngeeteilt worden.

Ii« sei Jedooh betont; daß dl· Durchführung dtr Chromatographie in zwei Stufen fakultativ ist_o Si weröen auoh genügend genaue Ir» gebnlsse orreicht, wenn mau die Färbungen bsv. dio Veränderungen d^r Fluoresaeni dor nur naoh olnea Durohlauf dee FlleAmittele erhaltenen »ander bourteilt. Die Aasbildung dor Baader selbst und dio Abgreneun« dor einaeinen Amlttoaäurepaare gegeaeloaader wird jedoeh stets bei avelaallgoa Bntwlokoln deutliobor.

Q09882/0425

DIt naoh (Un vorliegenden Verfahren durchgeführt· Chromatographie • teilt ein» neuartige Methode zur BntelweiOung τοη Sen» bsv. PI«iaa oder Blut bei gleichzeitiger extraktion und Anftreaaumg der betreffenden Aminosäuren dar. Will »an nonet Aminosäuren in biologleohen Plueeigkelten bestimmen, eo müssen sunäohst die stUrenden Begleltntoffe, also Insbeeondere Salze und Eiweißstoffe, entfernt werden. Dabei treten bei allen bekannten Fällungsroaktlonen alt Aoeten, Pikrinsäure oder Trlohloressigsäure Verluste an Aminosäuren auf. Außerdem let der Arbeitsaufwand duroh VerdUnuen der Probe, Filtrieren oder Zentrifugieren und erneute· Konzentrieren groß, Die freien Aminosäuren laeeen •lob eelbat überhaupt nloht extrahieren, sondern nur in Form von ätherlBsllohen Derivaten. Das Terfahren, Serum, Plasma oder Blut unmittelbar auf der Sohioht xu enteiwelßen, gleichzeitig die gewUneohten freien Aminosäuren quantitativ su extrahieret und gegebenenfalls duroh Abtrennen der Startlinie Ale stBrenuin Eiweißstoffe und stärker solaren Aminosäuren vtfllig zu entfernen, 1st bisher neon nloht b«sohrleben worden und von ganz besonderen Torteil.

Zur Untersuchung alt Hilfe des neuen Verfahren· wird zweokaäOlg Serum, Plasma oder alt Antikoagulantlen versetztes Blut herangesogen. Kermalerwels· reloheu zur Durchführung der Chromatographie i bis 3 ^i dieser Flüssigkeiten

Der aeue Test besitzt den erheblioaen Vorteil, daß keine der einzelnen Aminosäuren bestimmt zu werden brauoht, sondern daß nach der ohromatographieohen Auftrennung lediglloh die Färbung nebeneinander liegender Aminouä«rep«ffjre verglichen werden auß₃ Man kommt somit ohne einen fremden Standard aus und besieht sloh ledlglioh auf einen eigenen inneren Standards Da· ist für einen Suohtest vor. otna 1:10 000 vertretbai* und sogar erstrebenswert. Bin weiterer nohr erheblloher Vorteil liegt darin, daß keine genauen Mengen an Serum, Plaiuaa oder Blut aufgetragen werden müssen. Man kann Je aaoh den vorhandenen Flüssigksltssiengen Innerhalb weiter Orenien variieren. Auoh die auf eine« elnaigeα DUnnsohlohtohrooatograsn gleiohzeitli; su untersuoasaden Flüssigkelten brauchen aioht in genau gleichen Mengen elngeeetxt mn

009882/04 2 5 ₆A0

Die Bestimmungen nach den neuen Verfahren der vorliegenden Erfindung lassen sloh in Jedem lllnlklabor innerhalb ron etwa 30 Minuten durchführen, wob*»i der Aufwand an Geräten und Kosten minimal ist, Us kür on praktlsan beliebig viole oder wenige Untersuchungen glelohseitig ausgeführt werden. Die Speslfität 1st mindestens ebensogroO wie die den bekannten Agardlffuelonstests oder der bekannten fluorlmetrlachen Methode. Darüberhlnaus werden erstmalig duroh dieses neue Verfahren gleichseitig 3 verschiedene Störungen erfafit, was bei der großen Anzahl der notwendigen Untersuchungen von besonderer Bedeutung 1st, denn mtigllohst sollte Jedes Neugeborene einem Test unterworfen werden,

ErstAunlicherwelse ist in jedem Normalserum das Verhältnis der beiden AminosHurepaare suelnaader recht konstant, während der Qesamtgehalt an diesen Aminosäuren eum Teil stark variieren kann. Mach der vorliegenden Erfindung kann man jede Veränderung dee Mengenverhältnisses der beiden Amlnosaurepaare mit Leichtigkeit erfassen, wobei die Veränderung dieses Mengenverhältnisses für die Beurteilung im allgemeinen wesentlich wiohtiger ist als die nach den bekannten Methoden bestimmbaren Mengen, Der neue Test erlaubt t.lso auoh da brauchbare Aussagen, wo mit den anderen Methoden Fehlaussagen gemacht werden können, well der Oesamtgehalt an den einzelnes Aminosäuren aus Irgendeinem Qrunde anonrl 1st, wählend das Verhältnis der beiden Amlnoeäurenpaare Leuoin/leoleuoln und Valin/Phenylalaain durchaus Innerhalb der Normalwerte liegt und somit keine Krankheit vorliegt.

Das Verfahren naoh der vorliegenden Erfindung 1st nicht nur für Kolhenuntereuohunfen in Kliniken für Neugeborene von grtflter Bedeutung, sondern auch fur Untersuchungen an psvohleoh kranken Erwaoheer.enc Die Jrunde für ale psrohisohe Erkrankung lassen sloh daml,t einwandfrei dlagnoetlslercn. Darüborhlnaue erscheint auoh eine Untersuchung der heterorygo ten Anlagenträger von Wichtigkeit, damit mo* glichst schon boi den Eltern eine entapreohende Erbanlage festgestellt werden und bei deren Kindern reohtseltig geeignete Verkehrungea getroffen werden

BAD ORIGINAL 0 0 9 8 8 2 /0 '%■! 5

·· 12 -

Beispiel 1

Zur Untersuchung yon 2 Proben wir* ein etwa l mi dicker Olasstreifen ron 10 oa Länge und 5 oa Höh·, derait einer etwa 100 μ •tarken Sohloht einer DC-Celluloee (Avloel©) belegt 1st, verwendet. 1,5 oa vo« unteren Rand «atftrat befinden eich in eines Al)ItMId von j« 1 οι drei markiert· Startlinien ron Jt 2 oa Länge, wobei auf dtr alttiereη tin Phenylalanlnvtrgltloh ron etwa o,i jog aufgetragen let. Dae Ola« ltt 18 aa oberhalb dt· unteren landeα (aleo 3 aa oberhalb der Startllnltn) rorgerltsto

Mit tinea Kapillarröhrchen ron ttwa ι w* Inneren Durohaesser trägt aan durch Au··trtlohen auf die beiden Übrigen Startllnltn ttwa 2 ^aI swtitr rtrtohltdtntr Serenproben ron Säuglingen auf. Nach dea Antrooknen an dtr Luft (ttwa 1 Minute) ·teilt aan den Teetetrtlfen etnkreoht In eine paeeende Trennkaaaer, die etwa 0,5 ob hooh alt etwa 80 %lgea Aethanol gefüllt let, und eohllefit alt eines loee aufliegenden Deokel ab. Sobald da· FlleSalttel •1· lu einer aarklerten Linie O₁B ob roa oberen Rand entfernt geetlegen let (etwa 10 Minuten)_k entnlaat aan den Teetetreifen, trooknet Ihn an der Luft und bricht dann den rorgeritzten Streifen ab, )i· reetllohe DC»Platte wird erneut in die Trennkaaaer gestellt und wieder bia etwa zur gleichen Höhe entwlokelt (etwa 5 lilnuten)c Nach dea Trooknen taucht aan die Platte In eine neutrale oder eselgsäurehaltlge Nlnhrdrin»Le«ung oder besprüht al· daalt, treoknet an der Luft und erwärat einige Minuten auf etwa 60°« Die violett-gefärbten Streifen der Aalno-•äurepaare liegen dloht untereinander. Der untere Streifen (etwa 7 ιοί roa oberen Rand entfernt) enthält Valin + Phenylalanin, der obere (etwa 4 aa roa oberen Rand entfernt) Leucin + Isoleuoln. Ia hler vorliegenden Noraalfall sind die violetten FHrbungeu der beiden Streifen annähernd gleich.

Beispiel 2

5 Proben Cltrat~Blut (je 2 pl) ron Irwaohsenen werden analog Beispiel l auf J sa dicken Glasplatten von 20 oa Länge und 5 ob ■Vhe untersucht. Ale Vergleich wird auf der alttieren Startlinie vine Mleohung von Leucin; Iaoleuoln, Valin und Phenylalanin etwa

009882/0425

BAD ORiGiNAL

la Mengenverhältnis de· tforaalseruas aufgetragen (*Τ·γμ1··χίμι (für trwaohsene): Leuoin 2,1; Ieoleuoin 2,1; Valin 3,4; Phenyl« alanin 8,7 ag/lOO al).

Neon der ersten Stufe der Chromatographie wird dl· Platt« alt Hilf· «In·· Ventilator· In etwa 5 Sekunden getrocknet und dann erneut oba· Abtrennung der Startlinien in dl· Trennkaater aurtiokgestellt und ein «weite· Hai etwa 10 Minuten lang alt d«a gleichen FlleAalttel ohroaatographierto Nach der Ubliohen Behandlung worden dl· violetten streifen der Aninosaurepaare θ mi (Valin ·*■ Phenylalanin) b«w„ 5 m» (Leucin + leoleuoin) ve« oberen Rand entfernt sichtbar, fine der 5 Proben aeigte eine 10- bi· 20faoh stärkere Farbinteneitilt de· unteren Streifen· (Valin + Phenylalanin)· Bin· darüberhinau· erfolgte weitere üntereuohung ergab keine Erhöhung im Gehalt an Valin, was auf ein· Hypervaitnttmie gedeutet hatte, wohl aber an Phenylalanin, das In einer Menge ron 43 mg/1QO el gefunden wurde. Dieser Wert liegt 16HaI höher al· der entsprechende Normalwert (2,7 ag/lOO el\ •o dai hier eine echte Phenylketonurle vorlage Dieeer Berund konnte durch andere Teat· und weitere Untersuchungen bestätigt werdenc

Beispiel a

Analog Beispiel ι werden aui 5 Platten 10 Sorumproben von Säuglingen chrooatographisoh aufgetrennt. Als Vergleiohssubetana wird eine etwa den Horaalwerten von Säuglingen entsprechende Vergleichsaischung der A in Frag· koiseenden AainosÄuren (Leuoin Z₁ i; IsoHuoin 2,3; Valin 4,ft; Phenylalanin 1,3 mg/100 Ml) In einer länge van 2 ca aufgetragen» Öle Flatten werden gleichseitig In «Inir Trennkaseier entwickelt, in der sie alt elnea Abs Und von etwa Je t &» hintereinander angeordnet «lud» Haoh Absobluß der zveiten Stufe der Chroavtographie werden die beiden Aalnosaurepaaie in «ilnea Aiilttaind von 5 bxw« β um ram oberen Rand gefunden Die Interim a«r beiden ^trhstrelfen wird alt Hilfe «ine· Spektralfβfca»«ter* "it einem Zujatsgerftt fur DC-Fletten bestlantr Da die Seren von gesunden Säuglingen etajsmeu, ergaben •loh kein· Untereohi*de in der Par©lntea*ltit der Seron noch la Vtrgleicii zu den

" ö0 9882/0425
BAD ORlGtNAL

leUplel 4,

Analog Beispiel l werden 2 Proben von Säuglinge·ereη aufgetragen, wobei dl· ein· Prob· eines Normalierun enttprloht und da« svelte £erna auvcr alt auftauchen Mengen der Aaino»*uren rereetst Ht, naallob alt 1ΘΟ γ/i Ml Leucin» 210 γ/i al Ieoleaoln and 440 γ/i al Valin, Dliee Zueatce entefreoben dea lOiaotaen der in noraalea Senat vorhandenen Menge. Die wenigen bieher beobachteten und aufgewerteten B(UIe von Ahornalrupkrankhelt liegen alndeeten« la Leuoin* und Iioleuoingehalt nooh weeentlloh hUher.

Mach der /^fdrbung zeigt eioh bei der vorbehandelten Seraafrobe In beiden Zonen, vorwi send aber In der oberen, eine deutlich erhöhte Farblntenfität Ib Tergleioh zua Noraalsorua_e

Btifpiel 5

<Ie 2 μΐ von 4 Proben Citratblut von Srwaohtenen und einer Prob·, die zuvor alt 270 y/lO al PhenyXalanln vereetzt wurde_r werden analog Bei.epiel 2 dttnneohlohtohrnaatographl»ob untereuoht. Noch der Anfartrang zeigt dl· vorbehandelt· Prob·, dl· nur den doppelten Gehalt an Phenylalanin la Vergleich zum Noraalwort besitzt, In der unteren Zone eine deutlich erhöht· Farbioteniltat gegenüber den andenm Proben.

009882/0^25

BAD ORIGINAL

Claims (1)

1. ~ 15 -

   Patentansprüche

   Verfaliren zur rrUhdiagnoee der Phenylketonurlt', der Ahorn· elrupkrankhelt und der Qvpervallnaale, daduroh gekennzeichnet, da£ Boa Körper flüssigkeiten wie Serua, Plasaa eier Blut einer DUnnsohiohtohroeatographle unterwirft, die erhaltenen Ionen von Valln/Phenylalanin und Leuoln/Ieoleuoln entweder durch FKrbung Bit onea Reagenz_v da« beide Aalnoetturepaire etwa gleichstark safärbt, oder duroh einen Ib Sorptionemitte1 enthaltenen Pluoreezenalndikator erkennbar aaoht und dlv Intensität *n der färbung bzwο der Pluoreszena der beiden fcvnen alte1aander law. alt eines Standard vergleicht.

   Verfahren neth Anepruoh l, daduroh gekennzeichnet, dal a.vi YaIIn₁ Pheny alanin, Leucin und/oder leoleuoln In etwa de. NoraaXwertf< entepreohenden Mengen einzeln oder la Qealeoh altiaufen

   Veriahrwη naoh Anspruch 2, daduroh gekennxelohnet_t dal die vier 'JlnosKuren in einer Konzentration von je etwa Ο,ΟΓνγ In 4?r Startlinie der ftorptlonealtteleohloht ale V#rgl*loh· rorhanden e nd.

   4_a erfahren naoh den Aniprtohen 1 ble 3, daduroh gekennzeichnet_ε dafi Ban tor Anfarbung der AalnoaUurepaare ein neutrale· oder •ohvachf ftures Miithrdrin-aeigenz verwendet«

   Verfahren naoh den AneprUcheL 1 ble 4, daduroh gekennzeichnet. da£ BKn ale Scrptlonealttel aikrokrietalline Cellulose verwende 1.

   G V«vfaiu-ea nach den Ansprüchen 1 ble 5, dadurch gekennaelohnet d&Brnan tia Sorptionealtt«l eine einen Fluoreszenzindikator enthaltende alkrokrietalllne Cellulose verwendet.

   Neue Unter'a^on ■·.·-*· ·· _: ■:- · *-._-- -_ein_de,.._PBSS.,._v.₄,_9J

   0 098 82/04 2 5.
   BAD ORIGINAL

   7. Ytrfahren Mob dt» AasprUohtn 1 Μ· β, dadurch gtktattstlobmtt, dal «Mi dlt KörFtrfltUtigktit Ir Btartllnitn to· ttwa 0,5 bit 5, Torsugfvtitt ttwa 2 oa, LKag· auf trügt.

   ·· Ytrfahrt» aaoh dem Aaftfrüoatn l bis 7, dadaroh f«k«nas«loha«t_f dal μ« dl· Istwlokltmt d·· Chnmmtogwmu Xu 2 Stuf·» durchführt.

   9,IfIUtI nr Durchführung dtt Ytrfahront nach dtn Amifrüohtn

   1 bit S₁ btftthtad aaa «lntr für ohroaatographltoht torftion·- eobiolsttn gttlgntttn Unterlag· und tintr ttwa 50 bi· 500, Torauf;·«·!·· etwa 100 B ttarktn abrltbfttttn Sorftlontaltttlfohioht, dadurch gtk«miBtlohott_r daS al· SorytlonsBltttl tin· ■lkroL-rlttallln· Ctllulott rtrwtndtt wird, dl· gtgtbtntnfall· ■lt tinte chtalfob gtbandtatn tdtr «übttantIr aufgttogtntn organltoht* fluorttiUrtadtn Parbtttff rtrtthtn 1st, und da· dl· T*ttplattt auf dtr Startlinlt Ib «lntr IAngt tob ttwa

   2 oa ein Otalfoh tob jo etna 0,05 γ Letioln, Χ·ο1·ηο1η, TaIlB and fhtnylalanln tnthÄlt.

   ^009882/0425 BADOB.O.N.L