CN1582334A - 电位滴定dna微阵列、其制造方法及核酸解析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及低使用费、低价格、而且能够高精度测定的DNA微阵列、其制造方法及核酸解析方法。使核酸探针(3)在电场效应晶体管的栅绝缘物表面固定化，在栅绝缘物表面和目标基因进行杂交，利用电场效应检测此时产生的表面电荷密度的变化。

Description

电位滴定DNA微阵列、其制造方法及核酸解析方法
技术领域
本发明是关于基因诊断、DNA序列解析或者基因多型解析等生物技术领域，特别是基因检查领域的技术，更详细地说，是关于能够高精度、并列地解析数个不同的核酸的电位滴定DNA微阵列，其制造方法及核酸解析方法。
背景技术
以人类基因组计划为代表的各种生物的基因组碱基序列解析计划正迅速进展，蓄积着庞大的碱基序列信息。已正在决定人类基因组的全碱基序列。今后通过弄清生物中的基因的机能，推测在各种疾病的诊断、医药品的开发、农作物的品种改良等广泛领域与基因相关技术的开发会飞跃地发展。除了碱基序列信息以外还有基因的发现和机能信息成为这些新领域发展的基础。作为大规模地进行基因的机能及发现解析、向基因检查发展的技术，Affymetrix公司、Nanogen公司等正在开发DNA芯片或者DNA微阵列(以下，将两者统称为DNA微阵列)。但是，现状的DNA微阵列大多以荧光检测为基本原理，因此需要激光器或复杂的光学系统，从而使系统大型化，高价。
另外，现在正在开发的所有DNA微阵列，原则上只使用一次就废弃。即使能够洗净重复使用，限度最多使用2次至3次。因此，在使用许多试样的解析或检样的数目多的基因诊断等领域，使用费成为大问题。特别，在医疗领域，从控制医疗费的观点来看，高额的检查广泛普及是困难的。另一方面，在医疗领域，即基因诊断的领域，要求高精度、定量性。因此要求满足成本低和高精度化两者的技术。
作为解决这些问题的方法，报道了一些与氧化·还原标识组合的电流检测方式的DNA微列。Clinical Micro Sensors公司正在开发，在金属电极上使称做分子丝的分子的一端固定化，在另一端结合核酸探针，以基于和目标基因的杂交的氧化·还原标识和金属电极的电子授受为作为电流变化进行检测，来检测目标基因的方式(NatureBiotechnology，vol.16，(1998)p27，p.40)。该方式不需要高价的激光器或复杂的光学系统，因此能够构筑简单、小型的系统。但是，由于以金属电极上的氧化·还原反应作为检测的基本原理，因此，如果在试样中存在氧化物质或者还原物质(例如抗坏血酸)，基于氧化或者还原流出电流，构成基因检测的妨碍，使检测精度劣化。另外，伴随电流计测，在金属电极上进行电极反应。由于电极反应是不可逆、非平衡反应，因此发生电极的腐蚀、气体的生成等，而损害电流测定的稳定性，特别在反复测定的场合，检测精度劣化。
因此本发明的目的在于提供低使用费、低价格系统、而且可以高精度测定的DNA微阵列及其制造方法，以及使用该DNA微阵列的核酸解析方法。
发明内容
本发明是使核酸探针在绝缘物表面固定化、在绝缘物表面和目标基因进行杂交，检测此时产生的电荷密度变化的DNA微阵列。优先选择的是使核酸探针在电场效应晶体管的栅绝缘物表面固定化、在栅绝缘物表面和目标基因进行杂交，利用电场效应来检测此时产生的电荷密度变化的方式的DNA微阵列。为了使表面电荷密度的变化大，除了核酸自身保持的电荷以外，还进行嵌入剂的导入或在核酸中标识和离子等电荷粒子形成复合体的分子等，实现了以大的信号/杂音比能够检测表面电位变化的电位滴定DNA微阵列。使用本发明的DNA微阵列的基因解析方法，不需要高价的激光器或复杂的光学检测系统，并且与电流检测(电流滴定)方式不同，是使核酸探针在绝缘物基板上固定化，检测平衡状态下的表面电位，因此由基板的腐蚀或气体的产生、氧化/还原物质的妨碍等引起的信号值的不稳定性不会成为问题，稳定性优良的高精度的基因检测成为可能。
即，本发明的电位滴定DNA微阵列，其特征在于，具备使单链核酸探针或者分支核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的数个绝缘栅电场效应晶体管和参照电极。
另外，本发明的电位滴定DNA微阵列，其特征在于，具备形成有数个绝缘栅电场效应晶体管的基板，在基板的表面，使各个不同种类的单链核酸探针或者分支核酸探针直接或者通过载体在各绝缘栅电场效应晶体管的沟道部的栅绝缘物上固定化。
再者，本发明的电位滴定DNA微阵列，其特征在于，具备使具有和应该检测的核酸的一部分互补的碱基序列的核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的第1绝缘栅电场效应晶体管、使和应该检测的核酸哪个部分都不互补的碱基序列的核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的第2绝缘栅电场效应晶体管、以及将第1绝缘栅电场效应晶体管和第2绝缘栅电场效应晶体管的输出进行比较检测的电路。
本发明的核酸解析方法，其特征在于，具有：(a)在具有使各个不同种类的单链核酸探针或者分支核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的数个绝缘栅电场效应晶体管的基板上，导入含有至少一种核酸的试样溶液，与单链核酸探针或者分支核酸探针进行杂交的步骤，(b)在基板上导入洗涤液，从上述基板除去未反应的核酸的步骤，(c)在基板上导入嵌入剂溶液，与成为双链的核酸发生反应的步骤，(d)在基板上导入洗涤液，从基板上除去未反应的嵌入剂的步骤，(e)在基板上导入缓冲液，测定绝缘栅电场效应晶体管的输出值的步骤。
除上述步骤(a)至步骤(e)以外，还具有：(f)加热基板使单链核酸探针或者分支核酸探针和已杂交的核酸离解的步骤，(g)在基板上导入洗涤液，从单链核酸探针或者分支核酸探针除去离解的核酸和嵌入剂的步骤，随后，如果反复上述步骤(a)至步骤(e)，就能够连续进行数个测定。
本发明的核酸解析方法，其特征在于，还具备：(a)在具有使各个不同种类的单链核酸探针或者分支核酸探针直接或者通过载体在绝缘物表面固定化的数个绝缘栅电场效应晶体管的基板上，导入含有以能获取电荷粒子的分子标识的核酸片段的试样溶液，与单链核酸探针或者分支核酸探针进行杂交的步骤，(b)在基板上导入洗涤液，从上述基板除去未反应的核酸片段的步骤，(c)在基板上导入含有和标识分子形成复合体的离子的溶液，与成为双链的核酸中被标识的分子发生反应，形成离子和标识分子的复合体的步骤，(d)测定绝缘栅电场效应晶体管的输出值的步骤。
能获取电荷粒子的分子，可以是和1价或者2价的阳离子或者阴离子选择性地形成复合体的分子，例如，缬氨霉素、无活菌素/单活菌素、双冠醚、杯芳烃衍生物、非环状聚醚衍生物、季铵盐、紫菜碱、或者这些分子的衍生物。
此时，在各个不同种类的核酸片段上标识能获取电荷粒子的数种分子，通过在基板上导入对应于各分子的电荷粒子(离子)，能够同时或者依次地测定数种基因或者基因多型。
除上述步骤(a)至步骤(d)以外，还具有(e)加热基板使单链核酸探针或者分支核酸探针和已杂交的核酸片段离解的步骤，(g)在基板上导入洗涤液，从单链核酸探针或者分支核酸探针除去已离解的核酸片段的步骤，随后，如果反复上述步骤(a)至步骤(d)，能够连续地进行数个测定。
本发明的电位滴定DNA微阵列的制造方法，其特征在于，具有：在绝缘物基板的第1表面形成硅膜的步骤，使该硅膜图案化、分离成数个硅膜形成区域的步骤，在各硅膜形成区域形成成为各个电场效应晶体管的源极·漏极区域、加热元件、温度传感器的数个pn结的步骤，以源极·漏极区域之间作为沟道、从源极·漏极区域形成信号配线的步骤，在绝缘物基板的和形成有硅膜的面相反侧的第2表面上，使核酸探针直接或者通过载体在对应于电场效应晶体管的沟道部分固定化的步骤。
本发明的电位滴定DNA微阵列的制造方法，其特征在于，还具有：在绝缘物基板的表面形成硅膜的步骤，使该硅膜图案化、分离成数个硅膜形成区域的步骤，在各硅膜形成区域形成成为各个电场效应晶体管的源极·漏极区域、加热元件、温度传感器的数个pn结的步骤，以源极·漏极区域之间作为沟道、从源极·漏极区域形成信号配线的步骤，在形成有信号配线的面上形成绝缘膜的步骤，在绝缘膜的表面上，使核酸探针直接或者通过载体在对应于电场效应晶体管的沟道部分固定化的步骤。
附图说明
图1是说明本发明的基因检测用电场效应晶体管的一例的剖面模拟图；
图2是表示使用本发明的基因检测用电场效应晶体管的测定系统的构成例的图；
图3是组合本发明的DNA微阵列和嵌入剂的测定系统的说明图；
图4是组合本发明的DNA微阵列和标识分子的测定系统的说明图；
图5是说明本发明的薄膜栅型基因检测用FET(电场效应晶体管)芯片(DNA微阵列)的制作过程的图；
图6是表示本发明的DNA微阵列的一例的平面图；
图7是FET、加热元件、温度传感器的配置例的说明图；
图8是从里面观察本发明的DNA微阵列的斜视图；
图9是表示本发明的带散热片DNA微阵列的平面图；
图10是从里面观察本发明的带散热片DNA微阵列的斜视图；
图11是表示本发明的薄膜栅型基因检测用FET芯片的一例的剖面图；
图12是表示本发明的薄膜栅型基因检测用FET芯片的其他例的剖面图；
图13是使用本发明的薄膜栅型基因检测用FET芯片的测定系统的说明图；
图14是装备了本发明的薄膜栅型基因检测用FET芯片的液流单元的说明图；
图15是图14中所示的液流单元的分解图；
图16是利用本发明的基因检测用FET的测定规程的说明图。
具体实施方式
为了更详细地说明本发明，按照附图来说明本发明。在以下的图中，对相同的机能部分加上相同的符号进行说明。
实施例1
图1是说明本发明的基因检测用电场效应晶体管的一例的剖面模拟图。
是使核酸探针在绝缘栅电场效应晶体管1的栅绝缘物2的表面固定化的结构。核酸探针使用寡核苷酸或者cDNA或者在中途支化的DNA的片段，通常由小于或等于300个碱基构成，在合适的反应条件下，能够和应该测定的目标基因杂交，在寡核苷酸的情况下，希望是小于或等于80个碱基长的核酸片段。栅绝缘物，单独或者组合使用二氧化硅(SiO2)、氮化硅(SiN)、氧化铝(Al2O3)、五氧化二钽(Ta2O5)等材料，通常，为了保持晶体管良好地工作，在二氧化硅(SiO2)上形成叠层氮化硅(SiN)、氧化铝(Al2O3)、五氧化二钽(Ta2O5)的二层结构。
为了使核酸探针在上述绝缘物表面固定化，用氨基(NH2基)、硫羟基(SH基)、生物素等进行化学修饰。在使用用氨基进行化学修饰的核酸探针的场合，用氨丙基乙氧基硅烷、聚赖氨酸等对绝缘物的表面进行化学修饰，在绝缘物表面导入氨基，使与戊二醛或苯撑、二异氰酸酯(PDC)发生反应，使用氨基进行化学修饰的核酸探针在绝缘物表面固定化。在使利用硫羟基进行化学修饰的核酸探针在绝缘物表面固定化的场合，在绝缘物上形成金薄膜，利用硫羟基和金的亲和性使核酸探针固定化。另外，在使利用生物素进行化学修饰的核酸探针固定化的场合，在绝缘物表面导入链霉抗生物素蛋白，利用生物素和链霉抗生物素蛋白的亲和性，使核酸探针在栅绝缘物表面固定化。在进行实际的固定化时，仅在FET的沟道上的栅绝缘物表面滴下或者点滴含有核酸探针的溶液，使核酸探针仅在沟道部的栅绝缘物上固定化。
另一方面，也可以在FET的栅绝缘物表面形成固定化载体，使核酸探针间接地在该固定化载体的表面或者内部固定化。作为固定化载体的材料，可以使用琼脂糖、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)等，用氨基或链霉抗生物素蛋白进行化学修饰，如上所述，可以分别利用与戊二醛或PDC、或者抗生物素蛋白的亲和性，使核酸探针在固定化载体上固定化。像这样，通过固定化载体也可以间接地在FET的栅绝缘物上形成核酸探针。
在试样中存在含有应测定的目标基因的数个基因，在上述基因检测用FET的栅绝缘物上，如果具有和目标基因互补的碱基序列的核酸探针被固定化，在合适的反应条件下目标基因和核酸探针就进行杂交，目标基因和核酸探针形成复合体。在反应中使用的缓冲液的pH合适的条件下，核酸负带电。因此，由于由杂交引起的复合体形成，在FET的栅绝缘物附近电荷密度发生变化，栅绝缘物的表面电位也发生变化。该变化和FET的栅电压变化成为同等的作用，使沟道的导电率发生变化。因此，流过源极4和漏极5之间的漏极电流发生变化，能够检测出复合体的形成，即目标基因的存在。
实施例2
图2是表示使用图1所示的基因检测用电场效应晶体管(基因晶体管(Genetic FET))的基因检查系统的构成例的图。
该基因检查系统，除了图1所示的基因检测用FET1以外，使用参照FET6，进行基因检测用FET和参照FET的差动测定。具有和试样中的目标基因互补的碱基序列的核酸探针3在基因检测用FET1的栅绝缘物表面固定化。另一方面，具有和目标基因互补的碱基序列不同的碱基序列的核酸探针7在参照FET6的栅绝缘物表面固定化。
通过进行这样的差动测定，由FET的电特性的差异引起的周围的温度或光的变化所产生的输出值的变化得到补偿，或者抵消由试样中的电荷粒子在栅绝缘物上发生非特异地吸附而引起的输出值的变化，能够精度良好地只检测由目标基因和核酸探针的杂交引起的输出变化。希望基因检测用FET和参照FET的电特性一致，因此希望使用在相同基板集成化的一对FET。
为了稳定地测定基因检测用FET和参照FET的表面电位，设置成为电位测定所基准的参照电极8。参照电极，通常使用在规定组成·浓度的内部溶液中浸渍银/氯化银电极或者光敏电极的电极，使用在盐桥或者由多孔性材料产生的液体接界部内部溶液和试样溶液发生接触构成的电极。基因检测用FET1和参照FET6利用驱动电路9计测各个表面电位，2个表面电位的输出通过差动测定电路10输入信号处理电路11中。在将数个基因检测用FET集成化，同时计测数个基因的场合，可以共同使用参照FET，进行不同的基因检测用FET和共同的参照FET的差动测定。
实施例3
图3是组合本发明的DNA微阵列和嵌入剂的测定系统的说明图。在图示例子的DNA微阵列的情况下，3个Genetic FET12～14集成化，第1的FET12作为检测第1目标基因的基因检测用FET使用，第2的FET13作为检测第2基因的基因检测用FET使用，第3的FET14作为参照FET使用。分别使具有和第1、第2基因互补的碱基序列的核酸探针在第1、第2的FET的栅绝缘物上固定化。使具有和第1和第2的基因的互补碱基序列不同的碱基序列的核酸探针在参照FET的绝缘物表面固定化。
图3表示，在上述集成化DNA微阵列中导入仅含有第1基因的试样溶液，和目标基因进行杂交后，使嵌入剂发挥作用时的状态。第1基因，仅和第1的FET12的核酸探针进行杂交，而形成双链。嵌入剂15仅和双链的核酸发生反应而结合，不和单链的核酸结合。嵌入剂15具有电荷，因此仅第1基因检测用FET12的表面电荷密度发生变化，FET的输出信号也发生变化，第2基因检测用FET13和参照FET14的表面电荷密度不发生变化，因而输出信号不变化。因此，通过进行第1基因检测用FET12和参照FET14的差动测定以及第2基因检测用FET13和参照FET14的差动测定，仅前者的输出信号发生变化，检测出第1目标基因。或者，通过进行第1基因检测用FET12和参照FET14的输出比的测定以及第2基因检测用FET13和参照FET14的输出比的测定，前者的输出比发生变化，检测出第1目标基因。像这样，通过比较数个FET的输出，就能够检测出目标基因。作为嵌入剂可以使用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓、双苯甲亚胺33258(Hoechst 33258)等。
关于具体例子在下面加以说明。对于乙醇脱氢酶相关基因来说，已知存在单碱基多型(SNPs)，通过插入该单碱基多型部位来合成具有前后8碱基的17碱基长的第1和第2核酸探针。在下面示出该碱基序列。
第1核酸探针：5′-CATACACTAAAGTGAAA-3′
第2核酸探针：5′-CATACACTGAAGTGAAA-3′
从5′末端至第9的部位是SNP部位，第1核酸探针，该部位的碱基成为A，第2核酸探针成为G。使该第1和第2核酸探针分别在第1和第2的FET的栅上固定化。使具有和第2核酸探针不同序列的核酸探针，例如全部由A构成的17碱基长的核酸探针在参照用FET的栅上固定化。也可以使核酸探针不在参照用FET的栅上固定化。用氨基修饰上述核酸探针的5′末端。另一方面，对于本实施例的FET的栅绝缘膜来说，使用氮化硅，用γ-氨丙基三乙氧基硅烷进行化学修饰，在氮化硅表面导入氨基。使核酸探针的氨基和氮化硅的氨基例如与像戊二醛这样的双官能性试剂发生反应，通过形成由希弗碱产生的键，使核酸探针在氮化硅表面固定化。
试样，从血液中的白血球提取人类基因组，使包含上述SNP部位的100碱基长的领域增幅后，导入第1、第2基因检测用FET和参照FET中，在45℃进行8小时杂交。杂交后，用缓冲液洗净，除去未反应的试样，作为嵌入剂导入溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓。测定，首先在第1、第2基因检测用FET和参照FET中导入缓冲液，测定各个FET的输出电压、第1基因检测用FET和参照FET的差动输出、以及第2基因检测用FET和参照FET的差动输出，此后，导入试样，进行杂交、洗净后，导入嵌入剂，测定各个FET的输出电压、第1基因检测用FET和参照FET的差动输出、以及第2基因检测用FET和参照FET的差动输出。测定试样和嵌入剂导入前后的输出电压的变化。
具有对应第1核酸探针的碱基序列的试样(Narmal)，第1基因检测用FET和参照用FET的差动输出是5.0mV。而第2基因检测用FET和参照用FET的差动输出是0.5mV，得到有意义的差。虽然希望同时进行这一连串的差动输出测定，但如果是同一检查时间内也可以顺序地进行。具有对应第2核酸探针的碱基序列的试样(Mutant)，第1基因检测用FET和参照用FET的差动输出是0.3mV。而第2基因检测用FET和参照用FET的差动输出是4.0mV，也得到有意义的差。每一半具有对应第1和第2核酸探针的碱基序列的试样(Hetero)，第1基因检测用FET和参照用FET的差动输出是2.3mV，第2基因检测用FET和参照用FET的差动输出是2.0mV，得到大致1对1的比。从以上可知，通过本发明的SNP解析，能够识别Normal/Normal的同源，Mutant/Mutant的同源、Normal/Mutant的异源的3种试样。在使用嵌入剂的情况下，没有必要使标识化合物化学结合在试样DNA上进行识别。
如图2所示，在不使用嵌入剂，只检查目标DNA本来具有的电荷的场合，在Normal/Normal或者Mutant/Mutant的同源试样的测定中，基因检测用FET和参照用FET的差动输出是2.2mV的大值。因此，由于使用嵌入剂，能够谋求约2倍的高灵敏度化。
实施例4
图4是组合本发明的DNA微阵列和标识分子的测定系统的说明图。在图示例子的DNA微阵列的情况下，3个Genetic FET12～14集成化，第1的FET12作为检测第1目标基因的基因检测用FET使用，第2的FET13作为检测第2基因的基因检测用FET使用，第3的FET14作为参照FET使用。分别使具有和第1、第2基因互补的碱基序列的核酸探针在第1、第2的FET的栅绝缘物上固定化。使具有和第1和第2的基因的互补碱基序列不同的碱基序列的核酸探针在参照FET的绝缘物表面固定化。
图4表示，在上述集成化DNA微阵列中导入含有第1基因的试样溶液，和目标基因进行杂交时的状态。第1基因仅和第1的FET的核酸探针杂交，而形成双链。在第1基因上形成带电的分子或者离子和复合体的分子16被标识，通过上述的特异杂交，栅绝缘物表面的电荷密度发生变化。第2基因检测用FET和参照FET的表面电荷密度不变化，因而输出信号不变化。因此，通过进行第1基因检测用FET和参照FET的差动测定以及第2基因检测用FET和参照FET的差动测定，仅前者的输出信号发生变化，检测出第1目标基因。
作为形成离子和复合体的分子(配体)，使用缬氨霉素、无活菌素/单活菌素、双冠醚、杯芳烃衍生物、非环状聚醚衍生物、季铵盐等。例如在用双12冠4(Bis(12-crown-4))标识目标基因的场合，双12冠4选择性地和钠离子形成复合体，因此在和栅绝缘物上的核酸探针杂交后，如果在DNA微阵列上导入含有钠离子的缓冲液，双12冠4和钠离子就选择性地形成复合体，栅绝缘物表面的电荷密度局部地发生变化。用FET检测这种变化。
作为本实施例的具体应用，以下就进行SNP解析的例子加以说明。使用实施例3中所示的乙醇脱氢酶相关基因，使第1核酸探针(Normal)：5′-CATACACTAAAGTGAAA-3′、第2核酸探针(Mutant)：5′-CATACACTGAAGTGAAA-3′在各个第1和第2基因检测用FET的栅上固定化。使具有与第1和第2核酸探针的序列不同的核酸探针，例如全部由A构成的17碱基长的核酸探针在参照用FET的栅上固定化。试样DNA从血液中的白血球提取，在使包含SNP部位的100碱基长的区域增幅的同时，对于Normal DNA用缬氨霉素标识化，对于Mutant DNA用双冠醚标识化。
在第1、第2基因检测用FET和参照FET中导入由Normal DNA构成的试样，在45℃进行8小时杂交。杂交后，用缓冲液洗净，除去未反应的试样，导入50mM的NaCl水溶液，测定第1、第2基因检测用FET和参照FET的输出电压、第1基因检测用FET和参照用FET的差动输出以及第2基因检测用FET和参照用FET的差动输出。第1基因检测用FET和参照用FET的差动输出是4mV，第2基因检测用FET和参照用FET的差动输出是0.2mV。此后，导入50mM的KCl水溶液，同样地测定输出电压的结果，第1基因检测用FET和参照用FET的差动输出是0.1mV，第2基因检测用FET和参照用FET的差动输出是0.3mV，试样中的NormalDNA只和第1核酸探针发生杂交反应，证实了第1基因检测用FET选择性地进行应答。
另一方面，由Mutant DNA构成的试样，如果进行和上述同样的测定，导入50mM的NaCl水溶液时的第1基因检测用FET和参照用FET的差动输出是0.1mV，第2基因检测用FET和参照用FET的差动输出是0.2mV。导入50mM的KCl水溶液后的第1基因检测用FET和参照用FET的差动输出是0.1mV，第2基因检测用FET和参照用FET的差动输出是5.0mV，试样中的Mutant DNA只和第2核酸探针发生杂交反应，证实了第2基因检测用FET选择性地进行应答。每一半具有NormalMutant的DNA的试样(异源)，导入50mM的NaCl水溶液时的第1基因检测用FET和参照用FET的差动输出是2.3mV，第2基因检测用FET和参照用FET的差动输出是0.1mV，导入50mM的KCl水溶液后的第1基因检测用FET和参照用FET的差动输出是0.1mV，第2基因检测用FET和参照用FET的差动输出是2.5mV，得到大致1对1的比。
从以上可知，通过本发明的SNP解析，能够识别Normal/Normal的同源，Mutant/Mutant的同源、Normal/Mutant的异源的3种试样。本实施例，在SNP解析的过程中，包括杂交和离子配体复合体的形成的2个选择的化学反应过程。因此，能够进行高精度的SNP解析。
在SNP解析以外，使数种核酸探针在FET的栅上固定化，在各个目标用和参照用的试样上将缬氨霉素和双冠醚标识化，也能够进行表达解析。
实施例5
图5是表示具备本发明的薄膜栅型基因检测电场效应晶体管的DNA微阵列的制作过程例的图。首先，如图5(a)所示，利用低压化学气相淀积法(Low pressure chemical vapor deposition)，在玻璃基板17上形成p型的聚硅薄膜19。聚硅薄膜的厚度希望是10～10000nm的范围，在本实施例中，规定为1000nm。如图5(b)所示，进行聚硅膜的图案形成和氧化。使用光刻法，涂布抗蚀剂，进行通过光掩模的光照射、抗蚀剂显像，通过干蚀刻或者利用氟酸和硝酸的混合液的湿蚀刻，形成硅膜形成区域19。此后，在氧气氛中，在900℃使硅膜热氧化，在聚硅薄膜19的表面形成二氧化硅膜44。
接着，如图5(c)所示，进行氧化膜的蚀刻和杂质核酸区域的形成。使用光刻法，涂布抗蚀剂，进行通过光掩模的光照射、抗蚀剂显像，通过干蚀刻或者利用氟酸和氟化铵的混合液的湿蚀刻，除去杂质扩散区域的二氧化硅膜。通过注入As+或者P+的离子，在p型的聚硅薄膜19中形成n型区域，来设置pn结20。此后，在氧气氛中，在900℃使杂质扩散区域的硅膜热氧化，其表面形成二氧化硅膜44。
接着，如图5(d)所示，形成金属电极配线。使用光刻法，涂布抗蚀剂，进行通过光掩模的光照射、抗蚀剂显像，通过干蚀刻或者利用氟酸和氟化铵的混合液的湿蚀刻，除去电极用接点孔部的二氧化硅膜。利用真空蒸镀形成铝薄膜，使用光刻法，涂布抗蚀剂，进行通过光掩模的光照射、抗蚀剂显像，通过利用磷酸的湿蚀刻，使铝配线25形成图案，进行与外部电路的连接。在氢气氛中进行退火，作为各个FET的源极·漏极区域21、加热元件22、温度传感器23。源极·漏极区域间成为电场效应晶体管的沟道24。
最后，如图5(e)所示，将DNA探针固定化。在玻璃基板17的第2表面(与已形成硅膜的面相反的表面)26上，使核酸探针3在对应于电场效应晶体管的沟道的部分固定化，作为基因检测用FET。为了谋求测定的高精度化，希望在同一硅膜形成区域19至少将基因检测用FET、参照FET、加热元件、温度传感器集成化。
在绝缘物基板17的表面之中，因为已形成核酸探针3的表面导入溶液，所以作为配线、晶体管等电子器件的信号线时，与溶液接触而短路，往往发生动作不良。在本实施例中，在与溶液接触的、形成核酸探针3的面的相反侧的面上形成配线25，形成取出信号线的结构，因此没有由和溶液的接触而引起的动作不良的问题，能够提供可靠性高的测定系统。
图6是表示这样制成的DNA微阵列的一例的平面图。本例的DNA微阵列，在绝缘物基板17上分离形成144个硅膜形成区域19。一个硅膜形成区域19的大小是500μm的四方形。在图7中表示从里面观察硅膜形成区域19时的放大图。在硅膜形成区域19中，各自形成数个pn结20。在硅膜是p型的情况下，形成n型的杂质扩散区域，在硅膜是n型的情况下，形成p型的杂质扩散区域。以这些杂质扩散区域作为电场效应晶体管的源极·漏极区域21、或者加热元件22、或者温度传感器23。各杂质扩散区域通过电气配线25与外部的驱动电路连接。
如图7所示，在本实施例中，在1个硅膜形成区域19中形成2个电场效应晶体管，以其中一个作为基因检测用FET，以另一个作为参照FET。使用温度传感器23的输出来控制加热元件22，由此能够将各硅膜形成区域19的温度设定在规定的值，通过使离解温度(熔融温度，Tm)一致的核酸探针在同一硅膜形成区域19的基因检测用FET上固定化，使离解温度不同的核酸探针在硅膜形成区域固定化，能够实现高精度的基因检测。随着温度变化，FET的特性也发生变化，但通过进行基因检测用FET和参照FET的差动测定，就能够抵消各FET输出的温度变化。
图8表示从里面观察图6所示的DNA微阵列的斜视图。在里面形成电气配线25，核酸探针在相反侧的面被固定化。
实施例6
使用图9和图10来说明本发明的其他实施例。图9表示带散热片的本发明DNA微阵列的平面图，图10是从里面观察该阵列的斜视图。和实施例5同样地在绝缘物基板17的第1表面18形成硅膜，通过光刻和蚀刻除去不要部分的硅膜，分离成数个硅膜形成区域19。硅膜的厚度以0.1～10μm为佳，在本实施例中规定为1μm。在个硅膜形成区域19，和实施例5同样地形成基因检测用FET、参照FET、加热元件和温度传感器。
为了根据在各基因检测用FET上形成的核酸探针的离解温度，以各自最适宜的温度进行杂交·洗净，在本实施例中，用硅膜形成格子状散热片27，以便包围各硅膜形成区域19，提高各硅膜形成区域19的温度控制精度。散热片27用硅膜形成，因此导热性良好，使在相邻的硅膜形成区域产生的热高效率地放热，降低对相邻的硅膜形成区域的影响，能够独立地控制各硅膜形成区域19的温度。在本实施例中，一个硅膜形成区域19的大小是1mm的四方形，硅膜形成区域19和散热片27的间隔是0.5mm，散热片27的宽度是0.5mm，利用这种结构能够以1℃的精度将各硅膜形成区域19的温度从室温控制至95℃。
图10是从里面观察上述芯片的斜视图。在本实施例中，因为使用干蚀刻技术形成硅膜形成区域和散热片，所以其剖面形状成为三角形和梯形，但例如若使用反应离子蚀刻(Reactive Ion Etching)技术，就能够制作矩形状的剖面形状的硅膜形成区域和散热片。
实施例7
图11是表示本发明的薄膜栅型基因检测用FET芯片的一例的剖面图。
本实施例的薄膜栅型基因检测用FET芯片，在实施例5中说明的DNA微阵列中，是使基因检测用FET和参照FET的栅部的玻璃基板薄的结构。薄膜栅部28的玻璃基板的厚度以0.01～1μm的范围为佳，在本实施例中，规定为0.1μm。按照本结构能够使FET的互导大，能够高精度地检测在栅部上发生的电荷变化。不仅能够使FET的栅部薄膜化，而且也能够使硅膜形成区域的玻璃基板部分全体薄膜化，能够以薄膜化的凹部作为反应单元使用。
实施例8
图12是表示本发明的薄膜栅型基因检测用FET芯片的其他例子的剖面图。
是在实施例5、6、7中在和硅膜形成区域相反面的玻璃表面上形成核酸探针3的方式，但在本实施例中，在是硅膜形成区域19上已形成的绝缘膜2的硅氧化膜上形成第2绝缘膜29，使核酸探针3在其上固定化。作为第2绝缘膜29的材料，可以使用氮化硅、氮化铝、氧化钽。在本实施例中，能够正确地控制FET的栅绝缘物的厚度，使互导大，能够高灵敏度地检测在栅上发生的电荷变化。
实施例9
图13是说明使用本发明的表面栅型基因检测用FET芯片的测定系统的一例的图。在液流单元30上安装至少搭载基因检测用FET和操作FET的DNA微阵列芯片，与流路31连接。杂交液32和洗涤液33通过阀34与流路31连接，驱动泵35，就能够将杂交液和洗涤液导入液流单元30中。另外，试样和嵌入剂通过分注器36分注到阀34中，导入液流单元30，就能够与基因检测用FET和参照FET发生反应。反应后，使用过的液通过泵35送入废液瓶37中。反应后的基因检测用FET和参照FET的输出信号通过信号处理电路38进行处理/计算。
在图14中表示液流单元30的结构。在液流单元30中的印刷基板39上安装基因检测用FET芯片40，用导线41与印刷基板39电连接。在印刷基板39上设置引线42，与信号处理电路38连接。试样溶液43通过流路31导入基因检测用FET芯片40中。为了试样溶液43与成为信号线的导线41不接触，用保护罩44保护导线的一部分。保护罩44的材料，丙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等是合适的。
在图15中示出液流单元30的分解图。在液流单元本体中形成成为流路31的直径1mm的孔，在基因检测用FET芯片(DNA微阵列)40的表面导入/试剂。在流路31的入口部和出口部加工成螺纹45，拧入通过管道46的螺栓47，借此与外部的流路系连接。管道46的端面实施平坦化处理，通过拧入螺栓，该平坦部作为密封48件发挥作用，防止液漏。
本构成的基因检测用FET测定系统，是流体方式测定，因此能够连续自动地处理许多试样，对高物料通过量的测定是有效的。在使用实施例3所示的嵌入剂的场合，按以下的步骤进行测定。
(1)在液流单元中导入洗涤液
(2)在液流单元中导入杂交液(置换洗涤液)
(3)将各核酸探针的最合适温度设定在各硅膜形成区域的温度
(4)测定基因检测用FET和参照FET的输出，计算其差
(5)将试样分注到阀中，用杂交液导入液流单元中
(6)在液流单元中杂交
(7)在液流单元中导入缓冲液，除去未反应的试样
(8)在液流单元中导入嵌入剂，并进行反应
(9)导入缓冲液，除去未反应的嵌入剂
(10)测定基因检测用FET和参照FET的输出，计算其差
(11)将各硅膜形成区域的温度设定在95℃
(12)导入洗涤液，洗涤液流单元
(13)回到(1)
在图16中示出上述测定程序。导入试样和嵌入剂，进行洗净，测定FET的输出电位后，使硅膜形成区域的温度升至95℃，使杂交过的双链DNA离解，成为单链，用洗涤液同时除去已插入双链中的嵌入剂。这样一来，在FET的栅上仅残留核酸探针，而回到最初的状态，就可以进行以下的测定。
在使用形成实施例4所示的离子和复合体的分子(配体)的SNP解析的场合，按以下的步骤进行测定。
(1)在液流单元中导入洗涤液
(2)在液流单元中导入杂交液(置换洗涤液)
(3)将各核酸探针的最合适温度设定在各硅膜形成区域的温度
(4)测定基因检测用FET和参照FET的输出，计算其差
(5)将试样分注到阀中，用杂交液导入液流单元中
(6)在液流单元中杂交
(7)在液流单元中导入缓冲液，除去未反应的试样
(8)在液流单元中导入50mM NaCl溶液，并进行反应
(9)测定基因检测用FET和参照FET的输出，计算其差
(10)在液流单元中导入50mM KCl溶液，并进行反应
(11)测定基因检测用FET和参照FET的输出，计算其差
从各FET的核酸探针信息以及NaCl中和KCl中的差动输出判断Normal/Normal Mutant/Mutant Normal/Mutant
(12)导入缓冲液来除去KCl溶液
(13)将各硅膜形成区域的温度设定在95℃
(14)导入洗涤液，洗涤液流单元
(15)回到(1)
产业上的应用可能性
本发明提供，使核酸探针在电场效应晶体管的栅绝缘物表面固定化，在栅绝缘物表面和目标基因进行杂交，利用电场效应检测此时产生的表面电荷密度变化的方式的DNA微阵列。物料使表面电荷密度的变化大，除了核酸自身保持的电荷以外，还通过嵌入剂的导入或在核酸上标识和离子等电荷粒子形成复合体的分子，以大的信号/杂音比能够实现表面电位变化的电位滴定检测是可能的DNA微阵列。本发明的DNA微阵列系统不需要高价的激光器或复杂的光学检测系统，并且与电流检测(电流滴定)方式不同，使核酸探针在绝缘物基板上固定化，检测平衡状态下的表面电位，因此由基板的腐蚀或气体的产生、氧化/还原物质的阻碍等引起的信号值的不稳定不成为问题，稳定性优良的高精度的基因检测成为可能。

Claims (11)

1.一种电位滴定DNA微阵列，其特征在于，具备使单链核酸探针或分支核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的数个绝缘栅电场效应晶体管以及参照电极。
2.一种电位滴定DNA微阵列，其特征在于，具备形成有数个绝缘栅电场效应晶体管的基板，在上述基板的表面，使各个不同种类的单链核酸探针或者分支核酸探针直接或者通过载体在各绝缘栅电场效应晶体管的沟道部的栅绝缘物上固定化。
3.一种电位滴定DNA微阵列，其特征在于，其具备：使具有和应该检测的核酸的一部分互补的碱基序列的核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的第1绝缘栅电场效应晶体管、使具有和应该检测的核酸的哪个部分都不互补的碱基序列的核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的第2绝缘栅电场效应晶体管、将上述第1绝缘栅电场效应晶体管和上述第2绝缘栅电场效应晶体管的输出进行比较检测的电路。
4.一种核酸解析方法，其特征在于，具有：
(a)在具有各个不同种类的单链核酸探针或者分支核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的数个绝缘栅电场效应晶体管的基板上，导入含有至少一种核酸的试样溶液，和上述单链核酸探针或者分支核酸探针进行杂交的步骤；
(b)在上述基板上导入洗涤液，从上述基板上除去未反应的核酸的步骤；
(c)在上述基板上导入嵌入剂溶液，和成为双链的核酸发生反应的步骤；
(d)在上述基板上导入洗涤液，从基板上除去未反应的嵌入剂的步骤；
(e)在上述基板上导入缓冲液，测定上述绝缘栅电场效应晶体管的输出值的步骤。
5.根据权利要求4所述的核酸解析方法，其特征在于，还具有：
(f)加热上述基板，使和上述单链核酸探针或者分支核酸探针杂交过的核酸离解的步骤；
(g)在上述基板上导入洗涤液，从上述单链核酸探针或者分支核酸探针除去已离解的核酸和嵌入剂的步骤；
随后，反复上述步骤(a)～步骤(e)。
6.一种核酸解析方法，其特征在于，其具备：
(a)在具有各个不同种类的单链核酸探针或者分支核酸探针直接或者通过载体在栅绝缘物表面固定化的数个绝缘栅电场效应晶体管的基板上，导入含有以获取电荷粒子的分子标识的核酸片段的试样溶液，与上述单链核酸探针或者分支核酸探针进行杂交的步骤；
(b)在上述基板上导入洗涤液，从基板上除去未反应的核酸片段的步骤；
(c)在上述基板上导入含有和上述标识分子形成复合体的离子的溶液，与成为双链的核酸中被标识的分子发生反应，形成上述离子和上述标识分子的复合体的步骤；
(d)测定上述绝缘栅电场效应晶体管的输出值的步骤。
7.根据权利要求6所述的核酸解析方法，其特征在于，能获取电荷粒子的分子是与1价或者2价阳离子或者阴离子选择性地形成复合体的分子。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的核酸解析方法，其特征在于，在各个不同的核酸片段上标识能获取电荷粒子的数种分子，通过在上述基板上导入对应上述各分子的电荷粒子(离子)，同时或者依次地测定数种基因或者基因多型。
9.根据权利要求6～8中的任一权利要求所述的核酸解析方法，其特征在于，还具有：
(e)加热上述基板，使和上述单链核酸探针或者分支核酸探针杂交过的核酸片段离解的步骤，
(g)在上述基板上导入洗涤液，从上述单链核酸探针或者分支核酸探针除去已离解的核酸片段的步骤，
随后，反复上述步骤(a)～步骤(d)。
10.一种DNA微阵列的制造方法，其特征在于，其具有：
在绝缘物基板的第1表面形成硅膜的步骤；
使上述硅膜形成图案，而分离成数个硅膜形成区域的步骤；
在各硅膜形成区域中形成成为各个电场效应晶体管的源极·漏极区域、加热元件、温度传感器的数个pn结的步骤；
以上述源极·漏极区域之间作为沟道，从上述源极·漏极区域形成信号配线的步骤；
在上述绝缘物基板的和形成上述硅膜的面相反侧的第2表面上，使核酸探针直接或者通过载体在对应于上述电场效应晶体管的沟道部分固定化的步骤。
11.一种DNA微阵列的制造方法，其特征在于，具有：
在绝缘物基板的表面形成硅膜的步骤；
使上述硅膜形成图案，而分离成数个硅膜形成区域的步骤；
在各硅膜形成区域中形成成为各个电场效应晶体管的源极·漏极区域、加热元件、温度传感器的数个pn结的步骤；
以上述源极·漏极区域之间作为沟道，从上述源极·漏极区域形成信号配线的步骤；
在已形成上述信号配线的面上形成绝缘膜的步骤；
在上述绝缘膜的表面上，使核酸探针直接或者通过载体在对应于上述电场效应晶体管的沟道部分固定化的步骤。
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