CN1383487A - 细胞外记录的多电极 - Google Patents

Abstract

一种用于测定生物标本的电生理特征的多电极包含多个设置在基板上的第一区中的微电极、及设置在基板上的第二区中的参照电极。该参照电极包含至少一个用于作用电信号在该多个微电极上的刺激参照电极。最好,该参照电极包含至少一个用于检测来自该多个微电极的电信号的测量参照电极,且该刺激参照电极与该测量参照电极电绝缘。最好,将第二区放置在距第一区的外边沿一定距离处,并包围第一区。

Description

细胞外记录的多电极

技术领域

本发明涉及用于细胞外记录的多电极，这是在电生理学领域中有用的并用于组织的活动的电测定，特别是测定与神经元的活动相关的电势变化。

背景技术

近来，除了医学研究之外，已强劲地研究将神经元应用在电子器件上。在活性状态中的神经元中生成动态电势。神经元的离子渗透性的改变导致负责生成动态电势的细胞内与外离子浓度的改变。因此，如果测定了与神经元周围的离子浓度变化相关的电势变化，便能监视神经元的活动。

传统上通过在微操作器之类的协助下在细胞周围放置用于测定细胞外电势的玻璃或金属(诸如铂等)电极来测定与神经元活动相关的上述动态电势。此外，将类似的电极插入细胞以便测定细胞的动态电势。

这些传统技术具有下述缺点：需要电极制备技巧；电极具有高阻抗并因而信号易受外部噪声影响；以及如将电极插入细胞则细胞或组织受到损伤。因此，传统电极不适用于长期监视。

为了避免这些问题，发明人已研制出包含用设置在绝缘基板上的导电材料制成的多个微电极与引线图案的可在其上面培养细胞或组织的多电极(日本公开公布号6-78889及日本公开公布号6-296595)。用这一多电极能监视神经元的活动而在长时间内不损伤细胞或组织。在上述多电极中，接触细胞的电极最上层表面镀有铂黑(日本公开公布号6-78889)将电极的阻抗调节到实用电平，即大约50kΩ或以下。

在该多电极中，在测定神经元的动态电势时，例如将刺激(电流或电压)从外部作用在位于组织位置上的神经元上，并在另一位置上监视对该刺激的反应，借此便有可能分析组织中的神经网络。在本例中，从多电极上的多个电极中选择位于最适合于作用刺激的位置上的微电极作为刺激电极。该刺激电极附近的任何微电极可用作参照电极。将刺激作用在这两个电极之间，并测定多个微电极的反应电势。

然而，其它细胞或组织存在于刺激电极附近的参照电极上，并因而如果从外部作用刺激(电流或电压)，所刺激的不仅是刺激电极上的细胞还有参照电极上的其它细胞。因此，通常不精确地测定所要求的信号。此外，如果提高参照电极的阻抗，不能防止提高由外部噪声或刺激产生的赝象。

发明内容

本发明旨在解决上述。问题本发明的目的为提供适于测定细胞的电信号的多电极，它不易受外部噪声影响并减少由刺激产生的赝象。

本发明人发现以将参照电极放置在距刺激电极充分远的距离上并因而在参照电极上不存在细胞或组织的方式制造细胞外记录多电极时，该电极不易受外部噪声影响并减少由刺激引起的赝象。根据这一发现，本发明人完成了本发明。

本发明人还发现刺激参照电极与测量参照电极是互相电隔离的，借此进一步减小外部噪声及由刺激引起的赝象的影响。根据这一发现，本发明人完成了本发明。

本发明涉及用于测定生物标本的电生理特征的多电极。本多电极包含设置在基板的第一区上的多个微电极、及设置在基板上的第二区中的参照电极。该参照电极至少包含一个用于在该多个微电极上作用电信号的刺激参照电极。

最好，该参照电极包含至少一个用于检测来自多个微电极的电信号的测量参照电极，并且刺激参照电极是与该测定参照电极电绝缘的。

最好，将第二区放置在距第一区一定距离处，并包围第一区。

最好，以与第一区重叠而不与第二区重叠的方式放置生物标本。

最好，将该距离设定为这样的值，使得检测到从接收作用电信号的微电极所生成的电信号，而检测不到从不接收作用电信号的微电极所生成的电噪声。

最好，将各参照电极放置在使参照电极不与放置在第一区上的生物标本重叠的位置上。

最好，该距离为0.1mm或以上，并更好是在从1mm至10mm的范围内。

最好，将各测量参照电极放置在距第一区中心1mm或更大的距离上，更好是5至11mm。

最好，如果有多个刺激参照电极或测量参照电极，这些参照电极是在第一区的中心周围对称布置的。

最好，该多个微电极是布置在第一区内的矩阵中的。

最好，多电极包含能向各微电极提供电信号或从各微电极抽取电信号的布线部分。

按照本发明的一个方面，集成细胞支座包含上述多电极，其中该集成细胞支座具有用于将生物标本放置在多电极的基板上的细胞装入区。

按照本发明的另一方面，细胞电势测定装置包含上述集成细胞支座、连接在微电极上用于处理由生物标本的电生理活动产生的输出信号的输出信号处理器、及用于可选择向生物标本提供电刺激的刺激信号提供器。

本发明还涉及细胞电势测定系统，包含上述细胞电势测量装置、及用于光学监视生物标本的光学监视装置：与/或用于控制生物标本的培养环境的细胞培养装置。

附图说明

图1为展示按照本发明包含多电极的细胞电势测量装置的示意框图。图中的参照数字指示下述部件：1刺激信号提供器；2输出信号处理器；3a刺激微电极  10多电极；4包含微电极的区；5a测量参照电极；5b刺激参照电极；及6表示电短路的线。

图2为展示包含传统多电极的细胞电势测量装置的示意框图。图中参照数字指示与图1中相同的部件，但除外3a指示刺激参照微电极。

图3为展示在64个通道上显示包含按照本发明的多电极的细胞电势测量装置的噪声电平与赝象相对于恒定电流的双极刺激的计算机屏幕的打印输出的图。

图4为展示在64个通道上显示包含传统多电极的细胞电势测量装置的噪声电平与赝象相对于恒定电流的双极刺激的计算机屏幕的打印输出的图。

图5为展示包含按照本发明的多电极的细胞电势测量装置改型的示意框图。图中的参照数字指示与图1中相同的部件。此外，参照数字7指示要测定的细胞，而参照数字10指示该多电极。

图6为展示包含传统多电极的细胞电势测量装置的示意框图。图中的参照数字指示与图2或图5中相同的部件。

图7为展示在64个通道上显示包含按照本发明的多电极的改型的细胞电势测量装置的噪声电平与赝象相对于电流刺激的计算机屏幕的打印输出的图。

图8为展示在64个通道上显示包含传统多电极的细胞电势测量装置的噪声电平与赝象相对于电流刺激的计算机屏幕的打印输出的图。

图9为展示其中设置微电极的第一区与其中设置参照电极的第二区之间的关系的概念图。

具体实施方式

下面将详细描述本发明。

(微电极与参照电极)

按照本发明的多电极包含设置在绝缘基板上的第一区上的多个微电极。将诸如细胞或组织等生物标本放置在第一区中来测定该生物标本的电活动。

本发明的多电极的特征在于包含与该多个微电极不同的至少一个参照电极(刺激参照电极)。该参照电极用于以电信号激励各微电极。

本发明的多电极可进一步包含用于检测来自各微电极的电信号的至少一个参照电极(测量参照电极)。上述参照电极(刺激参照电极与测量参照电极)是设置在绝缘基板上的第二区中的。最好，将这些参照电极各放置在距包含微电极的第一区充分大的距离上。最好，将刺激参照电极与测量参照电极互相电隔离。

在本发明的多电极中，代表性地以放置在矩阵型式的格栅的交点上的形式将该多个电极设置在第一区中。在这一布置中，多个电极可以是等间隔的。因此，可将生物标本中的相邻神经元放置在相邻的电极上来检测相邻细胞之间的电信号的传递。

在本发明的多电极中，代表性地以相对于第一区的中心对称的形式将该多个参照电极布置在第二区中。因此，得以减少由刺激引发的来自微电极的电噪声的检出。

从外部向各微电极提供电信号。此外，将用于从各微电极向外部抽取电信号的布线部分连接在各电极上。代表性地，布线部分包含连接在各微电极上并从该电极向基板周边抽出的引线。布线部分还可包含连接在通常位于基板周边上的引线端点上的电结点。布线部分的材料的实例最好包含铟锡氧化物(ITO)。

代表性地，引线表面覆盖有绝缘层。绝缘层可以只设置在引线上，但最好在除了向有与电结点附近以外的基板的几乎整个上表面上。绝缘层的实例最好包含容易处理的丙烯酸树脂或光敏聚酰亚胺。

(多电极的配置)

对于本发明的多电极的详细设计，只需不干扰刺激参照电极的设置，可采用已知的多电极(例如日本公开公布号6-78889)的任何结构特征。下面示出多电极配置的代表性实例。这里所描述的实施例可通过考虑诸如要测定的生物标本的特征、要测定的数据的性质等各种因素有选择地加以修正。

为了在细胞培养后光学监视的目的，包含在多电极中的基板最好是用透明绝缘材料制成的。这种材料的实例包含：玻璃，诸如石英玻璃、铅玻璃、光学玻璃；无机物，诸如石英；有机玻璃或共聚物；以及透明有机物，诸如聚苯乙烯及聚乙烯对酞酸盐。最好是具有机械强度与透明性的无机物。

设置在基板上的电极的材料的实例包含铟锡氧化物(ITO)、氧化锡、Cr、Au、Cu、Ni、Al与Pt。除了其它东西，最好是ITO与氧化锡。具有透明性与高导电性的ITO尤其好。上述微电极通常是通过在具有所要求的位置与形状的一部分电极材料的最上层表面上设置多孔导电材料覆盖层来制成的。

通常，以相邻之间的距离全部互相相等的形式将多个微电极相等地分隔开。相邻电极之间的距离可代表性地在大约10至大约1000μm的范围内。代表性地，电极的形状为基本上正方形或圆形，其边或直径在大约20至大约200μm的范围内。以上述设定值，如果诸如神经元(即细胞体、树突与轴突)的细胞体等要测定的生物标本位于一个微电极上，该细胞体的树突所连接的另一细胞体高度可能位于相邻电极上。

通常，以最靠近的参照电极之间的距离互相相等的方式将多个参照电极同样相等地间隔开。最靠近的参照电极之间的距离通常在大约8mm至大约16mm的范围内。代表性地，电极的形状为基本上正方形或圆形，其边或直径在大约80μm至大约800μm的范围内。以上述设定值，能减少微电极生成的电噪声的检出。

在本发明的多电极中，通常将第二区设在距第一区的周边大约0.1mm或以上的距离上。理论上，距离越大，参照电极检测到噪声的概率越小。这一距离的上限主要是由多电极的结构特征确定的。在典型的多电极中，将参照电极设置在定义下面描述的细胞装入区的环形的内直径之内(代表性地大约20mmΦ)。因此，这一距离通常不超过大约10mm并通常在大约1mm至大约10mm的范围内。

当将第二区设在距第一区的周边大约0.1mm或以下的距离上时，由于与第一区重叠的生物标本的影响而在参照电极与相邻的微电极之间出现交扰。

图9为展示第一区与第二区之间的关系的概念图。图9中，有三个用虚线表示的同心圆。由最内侧的圆包围的区便是包含微电极(在图中用小的黑色正方形表示)的第一区。置于中间的圆与最外侧的圆之间的圈饼区便是包含参照电极(图中用小的黑色正方形表示)的第二区。字母d表示第一区的外侧边沿与第二区之间的距离。

连接在微电极上的引线可用与上面描述的电极材料相同的材料制成。在本例中，ITO也是最好的。通常将这一电极材料淀积在基板上。然后，用光刻胶进行蚀刻，从而形成微电极与包含引线的布线部分的最底层的要求的集成图案。在本例中，微电极与布线部分的最底层的厚度可以是大约500至5000埃。

通常将引线布置成基本上从各微电极径向地伸出。与这一基本上径向布置结合，以将它们的中心放置在8×8的格栅的各自的交点上的形式特别好地布置多个微电极。

用于覆盖引线的绝缘层的材料的实例包含诸如聚酰亚胺(PI)树脂与环氧树脂等透明树脂。最好是诸如负光敏聚酰亚胺等光敏树脂。例如，当将光敏树脂用作绝缘层材料时，有可能通过利用由光刻形成的图案在微电极上的绝缘层部分上形成开口而只暴露电极。如上所述，以基本上覆盖除外电极及与外部电路的电结点附近以外的绝缘基板的整个表面的方式设置绝缘层。这对于生产效率等是最好的。

(测定细胞电势的装置与系统)

对于高效地利用本发明的多电极测定神经元等的系统的各种部件的详细设计，可采用已知多电极的任何结构特征(见诸如日本公开公布号8-62209)。

通常，本发明的多电极附加设置有用于方便在多电极上进行细胞培养的结构及可选择地设置有用于方便多电极的操作的另一结构。得出的多电极可作为集成的细胞支座提供。

为了在多电极上进行细胞培养，可通过基本上整个用绝缘层覆盖的基板上的绝缘层设置能保持培养基的结构件。例如，可以以包围包含多个微电极的第一区及包含参照电极的第二区的形式将用聚苯乙烯制成的圆柱形框固定在基板上。在这一情况中，聚苯乙烯框的内部限定细胞保持区。

为了方便在测定细胞中操作多电极，例如，可使用印刷电路板。该印刷电路板具有导电地连接在多电极上的电结点上的导线图案，借此起到将从微电极设置到电结点的电连接延伸到外界的作用。诸如夹住多电极的两部分分开的电极夹等适当形状的电极夹可用于可靠地固定印刷电路板与多电极，同时保持它们之间的电连接。

可将集成细胞支座与刺激信号提供器及输出信号处理器进一步组合，借此得到用于电刺激多电极上的细胞并处理作为该刺激的反应的输出信号的细胞电势测量装置。

刺激信号提供器能将刺激信号作用在多个微电极中任何微电极及任何刺激参照电极上。当细胞对刺激信号作出反应时，另一电极检测引起的电势变化并将对应于这一变化的输出信号输出到信号处理器。通过适当的处理将输出信号传送给例如显示装置等。注意可同时测定细胞中生成的自发电势而不接收刺激信号。

通常用具有适当测量软件的单一计算机来实现刺激信号提供器与输出信号处理器。测量软件在计算机屏幕上提供用于设置刺激条件等的参数设定窗口、用于记录从细胞检测到的电势变化及通过多通道实时显示数据的记录窗口、用于分析所记录的数据的数据分析窗口等。最好，将来自计算机的刺激信号通过D/A转换器传输给多电极，而将来自细胞的输出信号通过A/D转换器传输给计算机。

可将细胞电势测量装置进一步与光学监视装置及细胞培养装置组合，从而获得用于长期培养神经元及稳定与精确地测定神经元的电生理活动的细胞电势测量系统。光学监视装置可包含倒象显微镜及进一步包含用于具有高清晰度显示器与图象文件装置的显微镜的SIT照相机。

作为细胞培养装置，可采用能控制培养环境的温度、培养基的循环、空气与二氧化碳的气体混合物的供应等的任何装置或其组合。

利用本发明的多电极、集成细胞支座、细胞电势测量装置、或细胞电势测量系统来分析神经网络之类，例如在其中将刺激(电流或电压)作用在标本上(即神经元)，及监视作为对该刺激的反应获得的电信号模式。如果在存在或不存在预定的化合物时获得电信号模式并将它们互相比较，可为它们在标本上的作用筛选这些化合物。

此外，例如可在存在已知在神经元上起作用的化合物时获得电信号模式。因此，能建立关于神经试剂的作用的电信号模式的数据库。

如果建立了这一数据库，便能通过将存在未知化合物时获得的电信号模式与数据库比较来标别出在神经元上具有类似于该化合物的作用的已知化合物而推导出在神经元上具有未知作用的化合物的作用方式。

因此，本发明的多电极、集成细胞支座、细胞电势测量装置、或细胞电势测量系统可用作药物筛选装置。

下面将用示例方式具体描述本发明。本发明不限于这些实例。

(实例1)

图1为展示用于测定细胞的电生理特征的包含按照本发明的多电极的细胞电势装置的示意框图。为了比较，图2中示出包含传统多电极的细胞电势测量装置的示意框图。

本发明的多电极10包含：以矩阵的形式布置在用虚线4包围的基本上正方形区内的64个微电极3a(各微电极具有50×50μm的尺寸并且其中心部分放置在8×8格栅的对应交点上)；以及4个参照电极(5a：测量参照电极及5b：刺激参照电极)(各参照电极具有200μm×200μm的尺寸并且各参照电极的中心部分放置在具有边长大约8.5mm的正方形的对应顶点上。在本例中，第一区与第二区之间的距离大约5mm)。将多电极10连接在刺激信号提供器1及细胞电势测量装置2上。刺激参照电极5b与测量参照电极5a各具有大约0.04mm²的表面积。刺激参照电极5b是与测量参照电极5a电隔离的。注意图1、2、5与6中，各测量参照电极之间的虚线与各刺激参照电极之间的点划线表示通常用放大器中的电路建立的电短路。

开始，电极上不放置任何标本使用图1中所示装置。将具有双极脉冲(脉冲宽度为100μsec)的10μA恒定电流作为刺激作用在位于第二行第六列的微电极上。在这一情况中，测定各微电极的噪声电平与研究赝象的影响。噪声电平测量是通过在具有对应于各自的微电极的64个通道的计算机屏幕上显示所引起的电势反应进行的。注意各微电极是通过基板上的引线及A/D转换器连接到计算机上的。

从恒定电流双极脉冲的激励之前5msec到激励之后20msec监视64个微电极的反应。结果示出在图3中。

为了对照，使用包含图2中所示的传统多电极的装置。在包含位于图2中所示的第二行第六列的微电极在内的一对微电极之间作用具有与上述类似的双极脉冲的10μA恒定电流。监视64个通道。其结果示出在图4中。

如图4所示，在对照装置中，用作刺激电极的位于第二行第六列的微具有可观地高的带锯齿状波形的噪声电平。此外，刺激微电极附近的微电极具有明显的赝象。电势返回到正常电平占用5至20msec。

与之相反，在包含本发明的多电极的装置中，在位于矩阵的第二行第六列上的微电极上基本上未检测到噪声，如图3中所示。在刺激电极附近的微电极上具有相当小的赝象。

(实例2)

使用图1中所示的本发明的多电极。此外，制成包含4个刺激参照电极的图5中所示的多电极的细胞电势测量装置。使用鼠的海马趾切片(脑)实际测定各微电极的引起的电势。

在图5中所示的装置中，将四个刺激参照电极放置在具有边长8.5mm的基本上正方形的顶点上。装置的其它特征与图1所示的装置相同。以这一装置，用鼠的海马趾切片(脑)实际测定各微电极的引起的电势。图5为展示将鼠的海马趾切片放在该装置上时的状态的示意框图。

将四周大的SD/slc鼠用Fluothane(氟烷)麻醉并断头取出整个脑。将取出的脑立即在冰上的Ringer氏溶液中冷却。解剖只包含海马趾的脑块。然后用组织切片机将得到的脑块切片得出具有厚度300μm的切片。将该切片放在微电极上测试。

类似于实例1，在存在具有双极脉冲(脉冲宽度为100μsec)的10μA作用恒定电流时测定引起的电势。将刺激作用在位于图1中所示的装置中的矩阵中的第二行第二列上的微电极上及位于图5中所示的装置中的矩阵中的第二行第六列上的微电极上。测量结果示出在图7中所示的计算机屏幕上。图7示出采用图5中所示的装置时的结果。为了对照，使用了包含图4中所示的传统多电极的装置。将类似于上述的具有双极脉冲的10μA恒定电流作用在包含位于图6中所示的第二行第六列上的微电极在内的一对微电极上，并进行类似的测试。其结果示出在图8中。

如图8中所示，在传统多电极的几乎所有通道上，用基线以下并具有最小点的波表示的神经元的电信号占用20msec才返回到正常电势(在图8中所示的通道中20msec对应于4个单位或以上)。与之相反，在包含图7中所示的本发明的多电极的装置中，在20msec以内所有通道上来自所有细胞的电信号都返回到正常电势。在包含图1中所示的本发明的多电极的装置中，在20msec以内所有通道上来自所有细胞的电信号也都返回到正常电势。如上所述，包含本发明的多电极具有低噪声电平并较少受赝象影响，从而能满意地测定引起的电势。

虽然参照上述实例描述了本发明，本发明不限于这些实例。可以根据熟悉本技术的人员的知识将本发明实现为修正的、改进的、及改变的实施例而不脱离本发明的范围。

工业可应用性

提供了适于记录细胞的电信号多电极，它不易受外部噪声影响并减少了由刺激引起的赝象。

Claims (10)

1、一种用于测定生物标本的电生理特征的多电极，包括：

设置在基板上的第一区上的多个微电极；及

设置在基板上的第二区中的参照电极，

其中该参照电极包含至少一个用于将电信号作用在该多个微电极上的刺激参照电极。

2、按照权利要求1的多电极，其中该参照电极包含至少一个用于检测来自该多个微电极的电信号的测量参照电极，且该刺激参照电极是与该测量参照电极电绝缘的。

3、按照权利要求1或2的多电极，其中将该第二区放置在距第一区的外边沿一定距离处，并包围该第一区。

4、按照权利要求1至3中任何一项的多电极，其中该生物标本是与第一区重叠而不与第二区重叠的形式放置的。

5、按照权利要求3或4的多电极，其中将该距离设定为这样的值使得能检测到从接收作用的电信号的微电极生成的电信号而检测不到从不接收作用的电信号的微电极生成的电噪声。

6、按照权利要求2至5中任何一项的多电极，包含多个刺激参电极与多个测量参照电极，及该多个刺激参照电极或该多个测量参照电极是相对于第一区的中心基本上对称地设置的。

7、按照权利要求1至6中任何一项的多电极，其中该多个微电极是在第一区内的矩阵中的。

8、一种包括按照权利要求1至7中任何一项的多电极的集成细胞支座，其中该集成细胞支座具有用于在多电极的基板上放置生物标本的细胞装入区。

9、一种细胞电势测量装置，包括：按照权利要求8的集成细胞支座；连接在微电极上用于处理由生物标本的电生理活动引起的输出信号的输出信号处理器；以及用于可选择地提供电刺激给生物标本的刺激信号提供器。

10、一种细胞电势测量系统，包括：按照权利要求9的细胞电势测量装置；及光学监视生物标本的光学监视装置；与/或用于控制该生物标本的培养环境的细胞培养装置。

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