CN1362394A - 叶黄素的分离制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用高速逆流色谱法从万寿菊花粗提物中分离制备出高纯度单体叶黄素的方法。其特点是所用的溶剂可为正构烷烃、卤代烃、脂肪醇、脂肪酮、脂肪酯、醚类、水等溶剂,其溶剂的两相组合可由其中的三个、四个或二个组分构成,其适用于对各种途径获得的万寿菊花粗提物提纯,纯度可达到98%以上,适用于用各种型号的逆流色谱仪分离制备叶黄素单体,能直接进大量粗品或合成混合物,分离效果能达到很高的纯度。
Description
本发明涉及一种采用高速逆流色谱法从万寿菊花粗提物中分离制备出高纯度单体叶黄素(Lutein)的制备分离方法。
目前，叶黄素的药用价值可以应用在眼部健康，甚至可以扩大到其它的治疗领域。最近的研究结果表明，叶黄素在治疗心脏病上有所帮助。研究者发现在受试志愿者中血液中叶黄素含量水平与动脉壁增厚之间的相互关系，并发现叶黄素可以预防动脉壁变厚。叶黄素(黄体制剂)由于在治疗眼科疾病有较大的疗效，近年来在供应市场上增长速度较快，得到越来越广泛的认可，相应的临床开发研究已经完成。特别是近来对叶黄素纯品的安全性得到了明确的肯定，这有利于扩大产品在食品饮料市场上的市场地位。现在生产商希望叶黄素在不久的将来可以大量使用在食品饮料工业。叶黄素最近被批准为是一种可确认的安全有效的品种，这样该品就可以大张旗鼓的扩大其应用市场。目前专家预测该品在食品饮料中的应用将大有作为。现有文献报道采用柱层析及高效液相色谱的方法分离，但纯度不高，回收率低。逆流色谱分离制备方法可以达到高纯度，优于传统的柱层析及高效液相色谱分离方法在两方面，一方面没有固态支持体无不可逆吸附损失，另一方面粗品可以直接上柱。采用柱色谱分离方法得到较高纯度的叶黄素未见报道。由于高速逆流色谱(High-speedCountercurrent Chromatography，HSCCC)是近些年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，它避免了固态支持体或载体带来的各种问题---样品易被吸附、损耗和变性，使用其它液相色谱法进行制备量分离时，其分配效率会明显降低，溶剂消耗量大，HSCCC保证较高峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂。逆流色谱仪能直接进大量粗提样品或合成混合物，分离结果能达到相当高的纯度，甚至能直接接质谱仪等仪器，已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。本发明的目的是采用高速逆流色谱的方法得到纯度98％以上的叶黄素。本发明的方案是：首先选择溶剂的两相组合，可选用的两相体系有多个，可为非水溶剂，也可为含水溶剂。非水溶剂体系由三个组分构成，一号体系A组分可选正庚烷、正己烷、正戊烷等正构烷烃，B组分可选用氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等卤代烃，C组分为乙腈、丙酮等脂肪酮。优选正己烷-氯仿-乙腈。也可以采用两个组分构成，A组分与C组分组成二元体系进行分离纯化。二号体系A组分：正庚烷、正己烷、正戊烷等正构烷烃，B组分：乙醚、石油醚、叔丁基甲基醚等醚类，C组分为乙腈、丙酮等脂肪酮。优选正己烷-叔丁基甲基醚-乙腈。溶剂体系也可由四个组分构成。A组分可选正庚烷、正己烷、正戊烷等正构烷烃，B组分可选乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯等脂肪酯类。C组分为乙腈。D组分为甲醇、乙醇、丙酮等脂肪醇及脂肪酮。优选正己烷-乙酸乙酯-乙腈-甲醇。含水由溶剂体系三个组分构成，A组分可选自石油醚，正庚烷、正己烷、正戊烷等正构烷烃，及氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等卤代烃。B组分可选乙腈、甲醇、乙醇、丙酮等脂肪醇及脂肪酮。C组分为水。
采用一号体系，仪器反转，以下相为固定相，上相为流动相，在保证上下相体积比大于1前提下，根据溶解度常数，在不破坏体系平衡的情况下，调节A，B，C三组分的体积比：2-6∶0.5-1.5∶2-6，经过一次分离得到叶黄素纯品。
采用二号体系，仪器反转，以下相为固定相，上相为流动相，在保证上下相体积比大于1前提下，根据溶解度常数，在不破坏体系平衡的情况下，调节A，B，C三组分的体积比：11-4∶0.5-1.5∶11-4经过一次分离得到叶黄素纯品。
采用四组分体系，以上相为固定相，下相为流动相，在保证上下相体积比小于1前提下，根据溶解度常数，在不破坏体系平衡的情况下，调节A∶B∶C∶D四组分的体积比：4-6∶1.5-2.5∶4-6∶3-5，经过一次分离得到叶黄素纯品。
采用含水溶剂体系，以上相为固定相，下相为流动相，在保证上下相体积比小于1前提下，根据溶解度常数，在不破坏体系平衡的情况下，调节A∶B∶C三组分的体积比：6.5-5.5∶5-3∶0.5-1.5，经过一次分离得到叶黄素纯品。
实验条件适合室温15-30℃，室温对分离效率影响不大。在上述温度范围内，室温较高时，出峰时间略有提前，分离效率变化不大，对叶黄素峰形无影响。
由于叶黄素遇光遇氧的不稳定性，在分离和收集目标成分的过程中采用氮气保护，收集的纯品密闭，置于冰柜保存。
首先按体积比将上述溶剂体系配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开。采用分析型或半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，2mL或20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为40或240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。将万寿菊花粗提物样溶解于流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为500-1000rpm(半制备型仪器转速)1500-2000rpm(分析型仪器转速)，以0.5-3.0mL/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，得到固体。
用本方法提取的叶黄素其纯度可达到98％以上。适用于从各种工艺途径制备的不同含量叶黄素的万寿菊花粗提物分离制备高纯度(98％以上)的叶黄素单体。适用于用各种型号的逆流色谱仪分离制备叶黄素单体，能直接进大量粗提样品或合成混合物，分离结果能达到相当高的纯度。
实施例1：
选取正己烷-乙醚-乙醇在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化万寿菊花粗提物中的叶黄素，首先按8∶1.5∶8体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。称取400mg万寿菊粗提物样溶解于20mL流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，仪器反转，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分。得到黄色固体，其HPLC纯度达到98％左右。
实施例2：
选取正庚烷-二氯甲烷-乙腈在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化万寿菊花粗提物中叶黄素。先按5∶1.5∶6体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。称取100mg万寿菊花粗提物样溶解于20mL流动相中待用，进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，仪器反转，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分。得到黄色固体，其HPLC纯度达到98％左右。
实施例3：
取正己烷-氯仿-乙腈组分在分析型逆流色谱仪上来分离纯化万寿菊花粗提物中叶黄素。首先按3∶1∶2.5体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用分析型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，1mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为40mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。称取15mg万寿菊花粗提物样溶解于1mL流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为1900rpm，仪器反转，以1.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分。得到黄色固体，其HPLC纯度达到98％以上。
实施例4：
选取正己烷-乙酸乙酯-乙腈-甲醇在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化万寿菊花粗提物中叶黄素，首先按10∶1∶7∶2体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。称取370mg万寿菊花粗提物样溶解于20mL流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，仪器反转，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分。得到黄色固体，其HPLC纯度达到98％左右。
实施例5：
选取正己烷-乙酸乙酯-乙腈-甲醇在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化万寿菊花粗提物中叶黄素。首先按10∶1∶8∶1体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。称取360mg万寿菊花粗提物样溶解于20mL流动相中待用。
进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，仪器反转，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分。得到黄色固体，其HPLC纯度达到98％左右。
实施例6：
选取正己烷-乙酸异丙酯-乙腈-丙酮在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化万寿菊花粗提物中叶黄素，首先按10∶1.8∶7∶2.2体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。称取360mg万寿菊花粗提物样溶解于20mL流动相中待用。
进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，仪器反转，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分。得到黄色固体，其HPLC纯度达到97％左右。
实施例7：
选取正己烷-乙腈在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化万寿菊花粗提物中叶黄素。首先按1∶1体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。称取370mg万寿菊花粗提物样溶解于20mL流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，仪器反转，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分。得到黄色固体，其HPLC纯度达到98％左右。
实施例8：
选取正己烷-乙酸异丙酯-乙腈-丙酮在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化万寿菊花粗提物中叶黄素，首先按9∶0.8∶7∶2.2体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。称取340mg万寿菊花粗提物样溶解于20mL流动相中进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，仪器反转，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分。得到黄色固体，其HPLC纯度达到98％左右。实施例9：
选取氯仿-甲醇-水在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化万寿菊花粗提物中叶黄素。首先按6∶4∶2体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取上相作为固定相，下相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪，FC-95自动馏份收集器。称取340mg万寿菊花粗提物样溶解于20mL流动相中进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分。得到黄色固体，其HPLC纯度达到98％左右。
Claims (10)
1、一种叶黄素的分离制备方法，其特征在于：它是采用逆流色谱法从万寿菊花粗提物中分离制备出高纯度叶黄素，其溶剂可为正构烷烃、卤代烃、脂肪醇、脂肪酮、脂肪酯、腈类、醚类、水等溶剂，溶剂的组分可由其中的三个、四个或二个组分构成。
2、根据权利要求1所述的一种叶黄素的分离制备方法，其特征在于：其三个组分构成的溶剂体系是由正构烷烃、卤代烃、脂肪醇或脂肪酮或乙腈构成，体积为：2-6∶0.5-1.5∶2-6。
3、根据权利要求1所述的一种叶黄素的分离制备方法，其特征在于：其三个组分构成的溶剂体系是由正构烷烃、醚类、脂肪醇或脂肪酮或乙腈构成，体积比依次为：11-4∶0.5-1.5∶11-4。
4、根据权利要求1所述的一种叶黄素的分离制备方法，其特征在于：其二组分构成的溶剂体系是由正构烷烃或卤代烃与脂肪醇或脂肪酮或乙腈构成，体积比依次为：4-6∶4-6。
5、根据权利要求1所述的一种叶黄素的分离制备方法，其特征在于：其四个组分构成的溶剂体系是由正构烷烃、脂肪酯、乙腈、脂肪醇或脂肪酮构成，体积比依次为：4-6∶1.5-2.5∶4-6∶3-5。
6、根据权利要求1所述的一种叶黄素的分离制备方法，其特征在于：正构烷烃是正己烷、正庚烷、正戊烷。
7、根据权利要求1所述的一种叶黄素的分离制备方法，其特征在于：卤代烃是氯仿、二氯甲烷、四氯化碳。
8、根据权利要求1所述的一种叶黄素的分离制备方法，其特征在于：脂肪醇、脂肪酮是：甲醇、乙醇、丙酮。
9、根据权利要求1所述的一种叶黄素的分离制备方法，其特征在于：脂肪酯是乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯。
10、根据权利要求1所述的一种叶黄素的分离制备方法，其特征在于：醚类是乙醚、石油醚、叔丁基甲基醚等。
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