CN1309714A - 调节真核细胞中程序性细胞死亡的方法和手段 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过引入影响内源聚－ADP－核糖聚合酶(PARP)基因表达和/或表观活性的“PCD调节嵌合基因”调节真核细胞和有机体,特别是植物细胞和植物中程序性细胞死亡(PCD)的手段和方法。可以抑制或刺激程序性细胞死亡。本发明特别涉及编码具有PARP活性的蛋白质的核苷酸序列在调节PCD、提高产生耐逆境细胞和有机体的生长速度中的用途。

Description

调节真核细胞中程序性细胞死亡的方法和手段

                          发明领域

本发明涉及聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)蛋白质，特别是突变体PARP蛋白质或其部分，以及编码它们的基因在生产具有改变的程序性细胞死亡的真核细胞和有机体，特别是植物细胞和植物中的用途。提供了真核细胞和有机体，特别是植物细胞和植物，其中或者在至少部分细胞，优选所选细胞中程序性细胞死亡(PCD)得到激发，或者相反，通过调节PARP蛋白质在有机体的细胞或至少部分细胞中PARP蛋白质的水平或活性而将这些细胞中的PCD抑制。本发明还涉及表达这些基因的真核细胞和有机体，特别是植物细胞和植物。

                         相关技术描述

程序性细胞死亡(PCD)为生理性细胞死亡过程，涉及动物和植物在发育过程中或响应环境指示时所选细胞的除去(参见Ellis等人，1991；Pennell和Lamb.1997)。经历PCD的细胞分解在形态上伴随着细胞质和核的浓缩、收缩和断裂，通常成为小的密封囊(Cohen 1993,Wang等人，1996)。在生物化学上，PCD的特征在于将核DNA一般断裂成代表大约50kb片段的寡核小体，以及诱导半胱氨酸蛋白酶和核酸内切酶。DNA的断裂可以通过在细胞切片中DNA 3’-OH基团的末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)来检测(Gavrieli等人，1992)。通过PCD的细胞死亡与通过坏死的细胞死亡完全不同，后者涉及细胞膨胀、细胞内容物溶解和漏出。

在动物中，PCD涉及不需要的细胞的除去或死亡，这些细胞例如有处于变态的蝌蚪尾细胞、在脊椎动物中发育的指之间的细胞、过量生产的脊椎动物神经元、细胞特化过程中的细胞如角膜细胞等。不再能正常行使其功能的损坏细胞也可以通过PCD除去，防止它们繁殖和/或扩散。PCD,或其缺乏，还涉及人体中大量的病理状态(AIDS、Alzheimer病、Huntington病、Lou Gehring病、癌症)。

在植物中，已证实或据信PCD涉及大量发育过程，例如，在胚发育过程中胚柄细胞的除去、单子叶种子发芽之后糊粉细胞的除去、种子发芽和幼苗生长之后根冠细胞的除去、在木质部管状分子或细胞列发育中见到的细胞特化过程中的细胞死亡、或者单性花中花器官败育。在低氧条件下在根中形成通气组织以及在一些植物中叶裂片或穿孔的形成似乎也涉及PCD。在植物中当叶或其它器官衰老时发生细胞大规模死亡。在植物中的过敏反应，换句话说在无毒力病原体进入部位发生细胞快速死亡产生限制性病斑，为响应环境指示的PCD的另一例子。

动物或植物细胞在悬浮培养物，特别是在低密度细胞悬浮培养物中死亡也证实了PCD的特征。

已暗示涉及PCD或细胞程序死亡中的酶为聚(ADP-核糖)聚合酶。聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)，也称之为聚(ADP-核糖)转移酶(ADPRT)(EC2.4.2.30)，是在大多数真核细胞中发现的细胞核中的酶，这些真核细胞包括脊椎动物、节肢动物、软体动物、粘菌、腰鞭毛虫、真菌和除酵母之外的其它低等真核细胞。在许多植物中也已证实了其酶活性(Payne等人，1976；Willmitzer和Wagner,1982；Chen等人，1994；O’Farrell,1995)。

PARP催化将来自NAD⁺的ADP-核糖部分主要转移到靶蛋白质的谷氨酸残基的羧基上，随后进行ADP-核糖聚合。主要靶蛋白质为PARP本身，但是已显示组蛋白、高速迁移率族染色体蛋白质、拓扑异构酶、内切核酸酶和DNA聚合酶经受该修饰。

来自动物的PARP蛋白质为113-120kDa的核内蛋白，它在大多数细胞类型中都丰富，由三个主要的功能域组成：包括两个Zn-指结构域的氨基末端DNA结合域、羧基端催化域和经过自动修饰的内结构域(de Murcia和Menissier de Murcia,1994；Kameshita等人，1984；Lindahl等人，1995)。当结合到DNA的单链断裂处时其体外酶活性大大增加。其体内活性通过最终导致DNA断裂的条件诱导(Alvarez-Gonzalez和Althaus,1989lkejima等人，1990)。中心域的自动修饰显然用作PARP的负反馈调节。

通过检测来自标记NAD⁺的³H掺入根尖细胞的细胞核中首次证实了植物细胞中的PARP活性(Payne等人，1976；Willmitzer和Wagner,1982)。还从玉米幼苗中将该酶活性部分提纯并发现与表观分子量为113kDa的蛋白质有关，这暗示植物PARP可能与来自动物的该酶相似(Chen等人，1994；O’Farrell,1995)。

相应于PARP蛋白质的cDNA已从包括哺乳动物、鸡、非洲蟾蜍属、昆虫和Caenorhabditis elegans的几个种中分离。Chen等人(1994)已报道了玉米细胞核中的PARP活性并且将该酶活性与玉米细胞核的提取液中存在约114kDa蛋白质联系起来。O’Farrel(1995)报道了在从玉米中分离的RNA上的RT-PCR-扩增(使用基于最高保守序列的简并引物)产生一300bp片段，在氨基酸水平上与人PARP蛋白质显示出有60％的相同性。Lepiniec等人(1995)已从编码具有与脊椎动物PARP的催化域高度相似的72kDa蛋白质的拟南芥中分离并克隆了全长cDNA。该蛋白质的N端域未显示与来自脊椎动物的PARP的相应域相似的任意序列，但是由四个氨基酸链(命名为A1、A2、B和C)组成，显示出与大量核内蛋白和DNA结合蛋白的N-末端具有相似性。A1和A2的推断的二级结构为螺旋-环-螺旋结构。

该基因库数据库包括两个来自玉米的cDNA序列，其翻译产物的氨基酸序列或者与传统PARP蛋白质具有同源性(AJ22589)或者与拟南芥属中所鉴定的非传统PARP蛋白质具有同源性(AJ222588)。

在真核细胞中PARP和聚-ADP核糖基化的功能不完全清楚。PARP涉及或据信直接或间接涉及大量细胞过程，如DNA修复、复制和重组、细胞分裂和细胞分化或者在基因组整合中有义改变的信号途径中。由于PARP活性可以大大降低细胞NAD⁺库，因此这也暗示该酶可以在程序性细胞死亡中起至关重要的作用(Heller等人，1995；Zhang等，1994)。而且，已暗示导致NAD⁺水解或通过聚-ADP-核糖葡糖水解酶的聚-ADP-核糖的转换产物的烟酰胺可以是真核细胞中的应激响应信号。

目前以植物PARP的生物功能获得的信息来自涉及PARP抑制剂的实验，由于施加3-氨基苯甲酰胺(3ABA)后在烟草中同源染色体重组的速度增加(Puchta等人，1995)，这暗示PARP抑制剂在预防在DNA损伤位置同源重组上的体内作用。而且，已显示，使用PARP抑制剂如3ABA、烟酰胺和6(5H)-菲啶酮分化Zinnia或Helianthus tuberosum的细胞，可预防管状分子发育(Hawkins和Phillips,1983；Phillips和Hawkins,1985；Shoji等人，1987；Sugiyama等人，1995)，它被认为是程序性细胞死亡在植物中的例子。

PCT申请WO97/06267描述了PARP抑制剂在提高真核细胞，特别是植物细胞转化(定性或定量)中的用途。

Lazebnik等人(1994)鉴定了具有与白介素1-β-转化酶相似性能的蛋白酶能够裂解PARP，它是动物细胞程序性细胞死亡的早期事件。Kuepper等人(1990)和Molinette等人(1993)描述了46kDa人PARPDNA-结合域及其不同突变体形式在转染CV-1猴细胞或人成纤维细胞中的过量生产，并且已证实残留PARP活性的反式显性抑制和这些细胞中碱基切除DNA修复的随后抑制。

Ding等人(1992)和Smulson等人(1995)描述了通过在哺乳动物细胞中的反义RNA表达排除PARP并观察到延迟了DNA链断裂连接和抑制了3T3-L1前脂肪细胞分化。

Menissier de Murcia等人(1997)和Wang等人(1995,1997)已产生在PARP基因中突变的转基因“敲除”小鼠，这说明PARP不是必需蛋白质。然而，PARP缺陷型小鼠的细胞对DNA损伤更敏感并在诱导细胞死亡的某些方面与正常动物的细胞不同(Heller等人，1995)。

                        发明简述和目的

本发明提供了一种在真核细胞中调节程序性细胞死亡的方法，包括使用ZAP类的PARP基因的核苷酸序列和NAP类的PARP基因的核苷酸序列降低真核细胞中总PARP活性的功能水平，优选降低内源性PARP基因的表达，以降低内源性PARP基因所编码的蛋白质的表观活性或改变内源性PARP基因的核苷酸序列。

本发明还提供了一种调节真核细胞中程序性细胞死亡的方法，包括将第一和第二PCD调节嵌合基因导入真核细胞，优选植物细胞中，其中该第一PCD调节嵌合基因包括以下可操纵地连接的DNA区：启动子，在真核细胞中可操作；DNA区，当转录时产生RNA分子，该分子或者可以降低ZAP类含Zn-指的PARP蛋白质的功能水平；或者可以被翻译成肽或蛋白质，当表达时该肽或蛋白质降低ZAP类的PARP蛋白质的功能水平；以及涉及转录终止和聚腺苷酸化的DNA区；并且其中该第二PCD调节嵌合基因包括以下可操纵地连接的DAN区：启动子，在真核细胞中可操作；DNA区，当转录时产生RNA分子，该分子或者可以降低NAP类的PARP蛋白质的功能水平；或者可以被翻译成肽或蛋白质，当表达时该肽或蛋白质降低NAP类的PARP蛋白质的功能水平；以及涉及转录终止和聚腺苷酸化的DNA区；并且其中真核细胞中的总表观PARP活性被大大降低，(优选总表观PARP活性比真核细胞中正常表观PARP活性降低约75％到约90％，并且防止该真核细胞程序性细胞死亡)或者几乎完全(优选总表观PARP活性比真核细胞中正常表观PARP活性降低约90％到约100％，并且该细胞经程序性细胞死亡被杀死)。

优选第一转录DNA区或者第二转录DNA区或者两者都包括至少约100个核苷酸的核苷酸序列，这些核苷酸与ZAP或NAP类的内源PARP基因的有义DNA链有75％的相同性，并且这些区域编码能够降低ZAP或NAP类的内源PARP基因的表达的有义RNA分子。

在本发明提供的调节程序性细胞死亡的另一方法中，第一转录DNA区或第二转录DNA区或者二者都包括至少约100个核苷酸的核苷酸序列，这些核苷酸与ZAP或NAP类的内源PARP基因的有义DNA链的互补链有75％的相同性，并且这些区域编码能够降低ZAP或NAP类的所述内源PARP基因的表达的RNA分子。

在本发明提供的调节编程性细胞死亡的又一方法中，第一和/或第二转录DNA区编码包括至少约100个核苷酸的有义核苷酸序列的RNA分子，这些核苷酸与ZAP或NAP类的内源PARP基因转录产生的mRNA有75％的相同性，并且该RNA分子还包括至少约100个核苷酸的反义核苷酸序列，这些核苷酸与ZAP或NAP类的内源PARP基因转录产生的mRNA的互补体有75％的相同性，其中有义和反义核苷酸序列能够形成双链RNA区，并且其中RNA分子能够降低ZAP或NAP类的内源PARP基因的表达。

在本发明提供的调节编程性细胞死亡的又一方法中，第一和/或第二转录DNA区编码显性阴性PARP突变体，该突变体能够降低被ZAP或NAP类的内源PARP基因编码的PARP蛋白质的表观活性，该突变体优选包括选自SEQ ID No 4氨基酸序列中氨基酸1-159或SEQ ID No 6氨基酸序列中氨基酸1-138的氨基酸序列或者包括选自SEQ ID No 2氨基酸序列中氨基酸1-370、SEQ ID No 11氨基酸序列中氨基酸1-98或氨基酸序列SEQ ID No 2中氨基酸1-88被SEQ ID No 11的氨基酸序列取代的该氨基酸序列中氨基酸1-370的氨基酸序列。

第一和第二嵌合PCD调节基因的启动子或两者，可以是组织特异性或可诱导的启动子，例如启动子选自真菌响应启动子、线虫响应启动子、花药选择性启动子、柱头选择性启动子、裂开区选择性启动子。

本发明还提供了调节植物细胞中编程性细胞死亡的方法，包括将PCD调节嵌合基因导入所述植物细胞中，其中该PCD调节嵌合基因包括以下可操纵地连接的DNA区：植物表达的启动子，DNA区，当转录时产生RNA分子，该分子或者能够降低内源PARP基因的表达；或者能够被翻译成肽或蛋白质，当表达时该肽或蛋白质降低植物细胞中的表观PARP活性，以及涉及转录终止和聚腺苷酸化的DNA区，其中植物细胞中的总表观PARP活性比植物细胞中的正常表观PARP活性降低约75％到约100％。

本发明的另一目的是提供一级和二级嵌合PCD调节基因以及真核细胞，特别是包括第一和第二嵌合PCD调节基因的植物细胞和非人真核有机体，特别是包括这些细胞的植物。

本发明的又一目的是提供一种调节植物细胞中编程性细胞死亡的方法，包括将PCD调节嵌合基因导入植物细胞中，其中该PCD调节嵌合基因包括以下可操纵地连接的DNA区：植物表达的启动子，DNA区，当转录时产生RNA分子，该分子能够降低ZAP类的内源PARP基因的表达；以及涉及转录终止和聚腺苷酸化的DNA区。

本发明还涉及增加植物生长速度的方法，包括将PCD调节嵌合基因导入植物细胞中，其中该PCD调节嵌合基因包括以下可操纵地连接的DNA区：植物表达的启动子，DNA区，当转录时产生RNA分子，该分子能够降低ZAP类的内源PARP基因的表达；以及涉及转录终止和聚腺苷酸化的DNA区。

本发明的又一目的是提供一种生产耐逆境的植物细胞的方法，包括将PCD调节嵌合基因导入植物细胞中，其中该PCD调节嵌合基因包括以下可操纵地连接的DNA区：植物表达的启动子，DNA区，当转录时产生RNA分子，该RNA分子能够降低ZAP类的内源PARP基因的表达；以及涉及转录终止和聚腺苷酸化的DNA区。

本发明还涉及编码具有PARP活性的蛋白质，优选ZAP类的PARP蛋白质的核苷酸序列在调节植物细胞或植物中编程性细胞死亡或生产耐逆境植物细胞或植物或增加植物细胞或植物的生长速度中的用途。

                         附图简述

图1：植物聚(ADP-核糖)聚合酶的推断N-末端氨基酸序列。

(A)在Arabidopsis thaliana APP(A.th.APP；EMBL登记号Z48243；SEQ ID No 6)和玉米同源物NAP(Z.m.NAP；EMBL登记号AJ222588；SEQ IDNo 4)中发现的NAD⁺-结合域上游的序列对比。所显示的该域分裂正如以前所提出的(Lepiniec等人，1995)。位于该B域的核定位信号(NLS)通过括号显示。在双子叶植物和单子叶植物之间B域的序列不是非常保守。C域在功能上可以与来自动物的PARP的自动修饰域相比。不完全重复的A1和A2也存在于玉米NAP中。为了说明重复序列中内部不完全的两重对称性，在如下的序列中氨基酸残基的性能被突出显示：补平环，亲油残基；开环，甘氨酸；(+)，正电荷残基；(-)，负电荷残基；波状线，任意残基。通过垂直箭头指示对称轴，并且箭头线标记具有氨基酸侧链性能转化重复性的区域。

(B)小鼠PARP和玉米ZAP的DNA-结合域和自动催化域的序列对比。含Zn-指的玉米ZAP1和ZAP2(通过5’RACE PCR分析发现的部分cDNA)分别被指示为Z.m.ZAP(EMBL登记号AJ222589；SEQ ID No 2)和Z.m.ZAP(race)(SEQ ID No 11中氨基酸位置1-氨基酸位置98)，以及小鼠PARP,M.m.ADPRT(Swissprot登记号P11103)。该小鼠酶的Zn-指和一式两份的NLS通过括号指示，通过星号显示Caspase 3裂解位点，并且在下面玉米序列中通过粗体括号显示ZAP蛋白质中的推定NLS。将在所有序列中保守的氨基酸序列用方框表示；将具有相似物理-化学性能的氨基酸残基用最上面的序列遮蔽作为参考。

图2：小鼠PARP和植物PARP蛋白质的NAD⁺-结合域的对比。“PARP特征”的范围如上面序列所示。名称和序列对比如图1。

图3：nap和zap基因的基因拷贝数和转录大小的评价。

变种LG2080的(A)和(B)玉米基因组DNA，用所示限制性内切核酸酶消化、通过琼脂糖凝胶电泳分离、印迹、并与由nap和zap cDNA的5’域制备的放射性标记的DNA探针杂交，它不编码NAD⁺-结合域。用nap探针(A)获得的杂交图简单且在玉米基因组中显示单一nap基因。正如从杂交图(B)中可以看到的，可以有至少两个zap基因。为了检测由zap和nap基因编码的转录物的大小，在用乙二醛变性之后在琼脂糖凝胶上分离约1μg从6天龄幼苗的根(路线1)和枝条(路线2)提取的聚(A)⁺RNA，印迹并用nap(C)和zap(D)³²P-标记的cDNA杂交。使用λDNA的³³P5’末端标记的BstEⅡ片段作为DNA和RNA凝胶印迹试验中的分子量标记物；它们的位置以kb示于每个方格的左边。

图4：在酵母中分析APP表达。

(A)在pV8SPA中的表达盒的示意图。通过嵌合酵母启动子驱动appcDNA的表达，该启动子由包括cyc1基因(CYC1)的启动区和gal10基因(GAL10)的上游激活启动区的最小TATA盒组成，后者通过半乳糖提供启动子激活。下游调节序列是由编码磷酸甘油激酶(3PGK)编码的基因获得的(Kuge和Jones,1994)。app编码区由假定域中的分区获得，正如早期所提出的(Lepiniec等人，1995)；A1和A2相应于不完全27-氨基酸重复，其中有一序列(B域)，富含正电荷氨基酸并类似于大量DNA结合蛋白的DNA结合域。该B域的氨基酸序列显示如下图并且以粗体画出了可以起NLS功能的精氨酸和赖氨酸残基的链。可以起翻译启动密码子功能的甲硫氨酸残基(M¹、M⁷²)如上图所示。C域富含谷氨酸残基，在其组成上，但不是在其序列上类似于，来自动物的PARP自动修饰域。

(B)DY(pYeDP1/8-2)和DY(pV8SPA)菌株的免疫印迹(Western印迹)和Northern印迹分析，分别如(载体)和(app)所示。菌株在补充有葡萄糖(GLU)、半乳糖(GAL)、半乳糖和3mM的3ABA(GAL+3ABA)、或半乳糖和5mM烟酰胺(GAL+NIC)的SDC培养基中生长。从相同培养物中提取所有RNA或所有蛋白质。10个微生物的总蛋白质通过电泳在10％SDS-PAGE上分离、电印迹、并用抗-APP抗血清探测。5个微生物的总RNA通过电泳在1.5％琼脂糖凝胶上分离，印迹在尼龙膜上并与得自app cDNA的³²p-标记的DNA片段杂交。分子量标记带的位置以千对碱基(kb)和千道尔顿(kDa)计显示在左边。

图5：APP蛋白质的聚(ADP-核糖)聚合酶活性。

(A)总蛋白质提取液是由在带有2％半乳糖的SDC(载体GAL)上生长的DY(pYeDP1/8-2)以及在带有2％葡萄糖的SDC(app GLU)、带有2％半乳糖的SDC(app GAL)、或带有2％半乳糖和3mM 3ABA的SDC(app GAL+3ABA)上生长的DY(pV8SPA)制备的。为了检测在这些提取液中合成的聚(ADP-核糖)，在室温下将样品用³²P-NAD⁺培养40分钟。进行两个对照反应：将100ng经过提纯的人PARP或者仅在反应缓冲剂(PARP)中培养(泳道5)，或者用由在葡萄糖上生长的DY(pYeDP1/8-2)培养物制备的蛋白质提取液(载体GLU+PARP)培养(泳道6)。显示在将该干凝胶曝光到X-Omat Kodak胶片上后获得的放射自显影照片。ORi相应于测序凝胶的开始。

(B)通过来自DY(pV8SPA)的蛋白质提取液中的DNA刺激聚(ADP-核糖)合成。以μml^-1显示加入到缺失酵母提取液的核酸中的超声鲑精DNA的量。通过3ABA阻断聚(ADP-核糖)的合成，在这些反应每个以3mM的浓度加入3ABA(泳道5)。为了确保聚(ADP-核糖)的最大回收，在沉淀步骤中包括20μg糖原作为载体；然而，正如所看到的，这样将导致大量夹带未加入的标记。

图6：图示了包括本发明PCD调节嵌合基因的T-DNA载体。P35S:CaMV35S启动子；L:cab22前导区；ZAP；ZAP类的PARP基因的编码区；5’ZAP：以逆取向的ZAP类的PARP基因的编码区的N-端部分；3’35S:CaMV35S 3’末端转录终止信号和聚腺苷酸化信号；pACT2：肌动蛋白基因的启动区；pNOS；胭脂氨酸合成酶基因启动子；gat：庆大霉素乙酰转移酶；bar：膦丝菌素乙酰转移酶；3’NOS：胭脂氨酸合成酶基因的3’末端转录终止信号和聚腺苷酸化信号；APP:NAP类的PARP基因的编码区；5’APP：以逆取向的NAP类的PARP基因的编码区的N端部分；LB：左T-DNA边界；RB：右T-DNA边界；pTA29：花药特异性启动子，pNTP303：花粉特异性启动子。

                    优选实施方式的详述

为了本发明的目的，术语“植物表达的启动子”意思是能够在植物细胞中驱动转录的启动子。它包括植物源的任意启动子，但是也包括能够在植物细胞中指导转录的非植物源的任意启动子，例如病毒或细菌源的某些启动子如CaMV35S或T-DNA基因启动子。

术语“基因的表达”是指在调节区特别是启动子的控制下DNA区转录成有生物活性的RNA(即：或者能够与另一核酸或蛋白质相互作用，或者能够翻译成生物活性的多肽或蛋白质)的过程。据说当该基因表达的最终产物为生物活性RNA如反义RNA或核酶时基因编码RNA。据说当该基因表达的最终产物为生物活性蛋白质或多肽时基因编码蛋白质。

术语“基因”意思是包括在细胞中在适宜调节区如植物表达的启动子的控制下被转录成RNA分子(例如mRNA)的DNA区(“转录DNA区”)的任意DNA片段。因此一基因可以包括几个可操纵地连接的DNA片段如启动子、5’前导区序列、编码区和包括聚腺苷酸化位点的3’区。内源植物基因为在植物种中天然发现的基因。嵌合基因为在正常情况下在植物种中不能发现的任意基因，或者启动子在自然状态下与部分或全部转录DNA区或者与至少一个该基因的其它调节区不相联的任意基因。

本文所用的“包括”解释成限定存在所述特征、整体、步骤或组分，但是不排除存在或添加一种或多种特征、整体、步骤或组分或其组合。因此，例如，包括核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质可以包括比实际所指的多的核苷酸或氨基酸，即包括在更大核酸或蛋白质中。包括以功能或结构定义的DNA区的嵌合基因可以包括其它DNA区等。

本发明一方面基于发现真核细胞，特别是植物细胞，更具体地说是Zeamays细胞同时含有至少两个功能性主PARP蛋白质同种型(类)，它们在大小和氨基酸序列上都不同，还都能够结合DNA，特别是具有单链裂口的DNA，并且都具有聚-ADP核糖基化活性。另一方面，本发明人已意识到，真核细胞，特别是植物中编程性细胞死亡可以通过改变PARP的表达水平或者通过遗传改变编码蛋白质的活性来调节，并且特别是为了实现该目标，两个基因的表达都需要改变或者两类蛋白质之一在其活性上需要改变。

很显然，现有技术的缺点在于真核细胞，特别是植物细胞包括两个功能同种型的PARP蛋白质，它们通过不同类基因编码，在这些细胞中通过重组DNA法阻碍PARP活性的有效调节。这些方法和手段的不同实施方式通过本说明书、实施例和权利要求书来表示。

因此，本发明涉及通过改变PARP基因表达的水平，或者通过改变PARP蛋白质在真核细胞中的活性或表观活性，调节，即提高或抑制真核细胞，优选植物细胞中的编程性细胞死亡。方便地，PARP基因表达的水平或PARP蛋白质的活性通过加入改变PARP基因表达的PCD调节嵌合基因和/或通过加入改变PARP蛋白质的表观活性的PCD调节嵌合基因和/或通过改变内源PARP编码基因来遗传控制。

本文所用的关于特定细胞的“提高的PCD”是指通过本发明方法刺激的这些细胞的死亡，由此当与未通过本发明方法修饰的正常植物的相似细胞相比，在相似条件下该杀死细胞预定不经历PCD。

关于特定细胞的“抑制PCD”应理解为在特定条件下正常(没有通过本发明方法干预)经受编程性细胞死亡的大部分这些细胞或细胞族在这些条件下保持活的。

因此引入PCD调节嵌合基因或经过修饰的内源基因的表达将影响PARP蛋白质的功能水平，并间接干扰编程性细胞死亡。PARP蛋白质功能水平的适度降低导致抑制编程性细胞死亡，特别是预防编程性细胞死亡，同时PARP蛋白质的功能水平严重降低将导致诱导编程性细胞死亡。

根据本发明，优选为了抑制或预防真核细胞，特别是植物细胞中编程性细胞死亡，将PARP蛋白质和/或其活性或表观活性的组合水平大大降低，但是避免以以下方式抑制DNA修复(通过PARP直接或间接支配)：细胞中PARP蛋白质的功能被抑制，细胞不能从DNA损伤恢复或者不能保持其基因组整合性。优选地，在靶细胞中的PARP蛋白质的水平和/或活性应降低靶细胞中正常水平和/或活性的约75％，优选约80％，特别是约90％，以便在该靶细胞中保留约25％，优选约20％，特别是约10％的PARP的正常水平和/或活性。还应考虑PARP蛋白质的水平和/或活性降低不应超过95％，优选不超过该靶细胞中正常活性和/或水平的90％。测定特定蛋白质如PARP蛋白质的含量的方法对本领域技术人员来说为公知，并包括，但不限于使用特定抗体(组织化学)定量这些蛋白质。在现有技术中还可以获得定量PARP活性的方法，包括上述的TUNEL测定(体内)或Collinge和Althaus(1994)描述用于合成聚(ADP-核糖)的体外测定(参见实施例)。

还根据本发明，优选为了触发真核细胞特别是植物细胞中编程性细胞死亡，PARP蛋白质和/或其活性或表观活性的组合水平大大降低，优选几乎完全降低，以便DNA修复和基因组整合性的保持不再成为可能。优选地，靶细胞中PARP蛋白质的组合水平和/或活性应降低该靶细胞中正常水平和/或活性的至少约90％，优选约95％，更优选约99％，特别是应完全抑制PARP活性。特别优选两类PARP蛋白质的功能水平分别降低至所述水平。

为了本发明目的，PARP蛋白质被定义为具有聚(ADP-核糖)聚合酶活性的蛋白质，优选包括所谓“PARP特征”。该PARP特征为在PARP蛋白质间高度保守的氨基酸序列，该氨基酸序列被de Murcia和Menussier deMurcia(1994)定义为从Mus musculus PARP蛋白质的氨基酸第858位延伸至氨基酸第906位。该域相应于Zea mays(ZAP1；SEQ ID No 2)的传统PARP蛋白质的第817-865位的氨基酸序列，或者相应于Zea mays(ZAP1；SEQ ID No 11)的传统PARP蛋白质的第827-875位的氨基酸序列，或者相应于玉米(SEQ ID No 4)的非传统PARP蛋白质的第500-547位的氨基酸序列，或者相应于Arabidopsis thaliana(SEQ ID No 6)的非传统PARP蛋白质的第485-532位的氨基酸序列。该氨基酸序列在不同PARP蛋白质之间高度保守(具有约90％-100％序列相同性)。在来自Mus musculus的PARP蛋白质的第891位(相应于SEQ ID No 2的第850位，SEQ ID No 11的第861位，SEQ ID No 4的第532位，SEQ ID No 6的第517位)的赖氨酸特别保守，它被认为是涉及PARP蛋白质的催化活性。特别是可以获得Musmusculus的PARP蛋白质的第865、866、893、898和899位或其它序列的相应位置的氨基酸。PARP蛋白质还可以包括N端DNA结合域和/或核定位信号(NLS)。

目前，已描述了两类PARP蛋白质。本文中定义的第一类包括含有Zn-指的所谓的典型PARP蛋白质(ZAP)。这些蛋白质大小范围在113-120kDA，还通过位于蛋白质N-端域中，特别是位于蛋白质中前面约355至约375个氨基酸中存在至少一个，优选两个Zn-指域来鉴定。该Zn-指定义为具有能够络合Zn原子的序列CxxCx_nHxxC(其中n可以为26-30)的肽序列。来自ZAP类的PARP蛋白质的氨基酸序列的例子包括在登记号为P18493(Bos taurus)、P26466(Gallus gallus)、P35875(Drosophilamelanogaster)、P09874 (Homo sapiens)、P11103(Mus musculus)、Q08824(Oncorynchus masou)、P27008(Rattus norvegicus)、Q11208(Sarcophagaperegrina)、P31669(Xenopus laevis)的PIR蛋白质数据库中可以发现的序列和目前鉴定的来自Zea mays的ZAP1和ZAP2的序列(SEQ ID No 2/SEQID No 11)。

相应cDNA的核苷酸序列可以在登记号为D90073(Bos taurus)、X52690(Gallus gallus)、D13806(Drosophila melanogaster)、M32721(Homosapiens)、X14206(Mus musculus)、D13809(Oncorynchus masou)、X65496(Rattus norvegicus)、D16482(Sarcophaga peregrina)、D14667(Xenopuslaevis)的EMBL数据库中以及SEQ ID No 1和10(玉米)中发现。

本文中定义的第二类包括所谓的非经典PARP蛋白质(NAP)。这些蛋白质较小(72-73kDa)并且其它特征是在该蛋白质的N-端缺少Zn-指结构域，但存在包括具有与DNA结合蛋白质相似的氨基酸段的N-端结构域。优选地，这类PARP蛋白质包括至少一个约30-32个氨基酸的氨基酸序列，该序列包括序列RG××××G×K×××××RL(以标准一字母码代表氨基酸，由此×代表任意氨基酸；SEQ ID No 7)。甚至更优选这些PARP蛋白质包括至少1个约32个氨基酸的具有序列×L×V×××R××L××RGL×××GVK××LV×RL××AI(SEQ ID No 8)的氨基酸序列(所谓的A1结构域)或者至少1个约32个氨基酸的具有序列GM×××EL×××A××RG××××G×KKD××RL××(SEQ ID No 9)(所谓A2结构域)或者两者。特别地，该A1和A2结构域能够形成螺旋-环-螺旋结构。这些PARP蛋白质还可以包括碱性“B”结构域(约35-约56个氨基酸的富含K/R的氨基酸序列，涉及将该蛋白质导向该核仁)和/或一酸性“C”结构域(约36个氨基酸的富含D/E的氨基酸序列)。来自该NAP类的蛋白质序列的例子包括来自拟南芥的APP蛋白质(可从登记号为Q11207的PIR蛋白质数据库中得到；SEQ ID No 6)和来自玉米的NAP蛋白质(SEQ ID No 4)。相应cDNA的序列可在登记号为Z48243的EMBL数据库(SEQ ID No 5)和SEQ ID No 3中发现。该第二类PARP蛋白质为真正的功能性PARP蛋白质，即能够催化DNA依赖性聚(ADP-核糖)聚合，这已得到本发明人证实(参见实施例2)。

本发明人还证实了真核细胞，特别是植物细胞，同时表达编码来自这两类PARP蛋白质的基因。

显而易见，为了本发明目的，编码来自所定义的这两类的PARP蛋白质的其它基因或cDNA，或其部分，可以将其从其它真核种或变体中分离，特别是从其它植物种或变体中分离。这些PARP基因或cDNA例如可以使用具有上述PARP基因或cDNA，或其部分，优选被保守的部分如含有编码如上所述PARP特征的核苷酸序列的基因片段的核苷酸序列的DNA片段作为探针通过Southern杂交(或者低严格或者高严格杂交，这依赖人们打算分离该PARP基因的种和探针最终所得自的种之间的关系)分离。相应于来自植物基因编码的PARP蛋白质的PARP特征的核苷酸序列是来自SEQID No 1的核苷酸2558-2704的核苷酸序列或来自SEQ ID No 3的核苷酸1595-1747的核苷酸序列或来自SEQ ID No 5的核苷酸1575-1724的核苷酸序列。如果在这些类PARP基因之间进行鉴定时，应优选使用对这类特异性的PARP基因部分，如在催化域之前的N-端域或其部分。

另外，编码PARP蛋白质或其部分的基因或cDNA，还可以使用适宜引物如具有相应于SEQ ID No 13、SEQ ID No 14中所示序列的核苷酸序列的简并引物或具有相应于SEQ ID No 15-20中所示序列的核苷酸序列的引物通过PCR扩增分离。但是，很显然，本领域技术人员可以设计其它低聚核苷酸用于PCR，或者可以使用包括至少20个，优选至少约30个，特别是至少约50个核苷酸序列的低聚核苷酸、任意PARP基因的保守核苷酸以通过PCR扩增分离这些基因或其部分。

很显然，本领域技术人员结合在部分片段和其核苷酸序列的基础上分离基因或cDNA的这些技术或其它技术(包括例如RACE-PCR)，例如通过PCR扩增获得的，可以将其用于分离适宜用于本发明方法的PARP基因或其部分。

而且，编码其中一些氨基酸已替换为其他化学上相似的氨基酸(所谓保守替换)的PARP蛋白质的PARP基因或合成PARP基因(根据遗传密码的简并性，编码与天然PARP基因相似的蛋白质但具有不同核苷酸序列)及其部分也适宜本发明方法。

在本发明的一个方面，在真核细胞，特别是植物细胞中的PCD通过适当降低这些真核细胞中的PARP功能水平来抑制。

在本发明该第一个方面的一个实施方式中，在真核细胞，特别是植物细胞中的PARP的功能水平通过在这些细胞中加入至少一个PCD调节嵌合基因来降低，该PCD调节嵌合基因包括能够引导在这些细胞中转录的启动子，优选植物表达的启动子，和可操纵地连接到DNA区的功能性3’转录端和聚腺苷酸化区域，当该DNA区转录时产生能够降低这两类PARP基因编码的内源PARP活性的功能水平的生物活性RNA分子。

在一优选实施方式中，将至少2个这样的PCD调节嵌合基因加入这些细胞中，由此通过第一PCD调节嵌合基因编码的生物活性RNA降低该NAP类编码的内源PARP活性的功能水平，由此第二PCD调节嵌合基因编码的生物活性RNA降低该ZAP类基因编码的内源PARP活性的功能水平，因此结合的PARP活性被适度降低。

在一特别优选的实施方式中，该PCD调节嵌合基因降低通过降低内源PARP基因的表达水平的内源PARP活性的功能水平。为此，该转录DNA区编码降低编码NAP和ZAP类PARP蛋白质的mRNA的生物活性RNA，它可以通过翻译获得。这可以通过例如反义RNA、共抑制或核酶作用的技术实现。

本文中所用的“共抑制”是指RNA以序列特异性方式积聚的转录和/或转录后抑制，使得同源内源基因或转基因的表达得到抑制。

通过引入包括可操纵地连接到DNA区的强启动子的转基因，由此所得转录RNA为包括具有与编码或转录DNA序列(有义)或待抑制其表达的PARP基因部分的互补链(反义)有至少75％，优选至少80％，特别是至少85％，更特别至少90％，特别是至少95％序列相同性或与其相同的核苷酸序列的有义RNA或反义RNA。优选该转录DNA区不编码功能蛋白质。特别地，该转录区不编码蛋白质。而且，有义或反义区的核苷酸序列应优选为至少约100个核苷酸长，更优选至少约250个核苷酸，特别是至少约500个核苷酸，但是可以延伸至待减少其表达的基因的编码区的全长。

为了本发明目的，两个相关核苷酸或氨基酸序列的“序列相同性”，以百分比表示，是指具有相同残基的两个最佳对比序列的位置数除以比较位置数(×100)。缺口，即残基在一个序列但不在另一个序列中的对比位置被认为是具有不相同残基的位置。使用20个核苷酸或氨基酸的窗口大小、字长2个氨基酸和缺口扣4分的Wilbur和Lipmann算法(Wilbur和Lipmann,1983)进行两个序列的对比。序列数据的计算机辅助分析和解释，包括如上所述的序列对比，可以使用商购软件包如Intelligenetics^TM Suite程序(Intelligenetics Inc.,CA)方便地进行。

显而易见，本领域技术人员可以使用一个或多个有义或反义PCD调节嵌合基因实现本发明的第一个目标。当使用一个有义或反义PCD调节嵌合基因时，该基因必须能够同时降低这两类PARP基因的表达。这例如可以通过以通过一有义或反义RNA调节两类基因的表达的方式选择该嵌合基因的转录区实现，即通过选择相应于两类PARP基因的最高同源性DNA区的靶子区并加入相应于两类靶子区的同义或反义转录DNA区，保证如上所述用于有义和反义RNA的条件。或者，不同同义或反义RNA区，每个特异性地调节一类PARP基因的表达，可以将其合并到一个RNA分子中，通过一个PCD调节嵌合基因的一个转录区编码。显而易见，可以加入对调节一类PARP基因的表达特异性的不同有义或反义RNA区作为单个PCD调节嵌合基因。

优选的有义和反义编码转录区包括相应于至少约100个选自PARP基因的N-端域的保守核苷酸的核苷酸序列(序列相同性约束如上所述)，优选相应于至少约100个选自SEQ ID No 1的核苷酸位置113-1189的保守核苷酸的序列，SEQ ID No 3的核苷酸位置107-583的序列、SEQ ID No 5的核苷酸位置131-542的序列或SEQ ID No 10的核苷酸位置81-1180的序列。但是，很显然，可以使用含有相应于PARP基因的N-端域的全序列，甚至相应于PARP基因的全序列，特别是其蛋白质编码区的序列的有义或反义编码转录区。而且优选含有相应于至少约100个保守核苷酸的核苷酸序列(序列相同性约束如上所述)的有义和反义编码转录区，该保守核苷酸选自PARP基因的C-端催化域，优选至少100个含有PARP特征编码核苷酸序列的核苷酸的序列，特别是如上所述的PARP特征编码核苷酸序列。而且，很显然，可以使用含有相应于PARP基因的C-端域的全序列的序列的有义或反义编码转录区。

在另一特别优选的实施方式中，该PCD调节嵌合基因通过降低两类内源PARP的表观活性水平降低内源PARP活性的功能水平。为此，这些转录DNA区编码生物活性RNA，它翻译成抑制NAP或ZAP类PARP蛋白质或两者的蛋白质或肽，如无活性抗体或显性阴性PARP突变体。

“PARP蛋白质的无活性抗体”为特异性地至少结合PARP蛋白质的一些表位的抗体或其部分，例如覆盖来自ZAP1的位置111-118的部分ZN指Ⅱ的肽或在ZAP2中的相应肽，并且它抑制靶蛋白的活性。

本文中所用的“显性阴性PARP突变体”是含有至少部分PARP蛋白质(或其变体)的蛋白质或肽，优选与真核靶宿主细胞内源的PARP蛋白质，它没有PARP活性，并且当在宿主细胞中表达时对内源PARP蛋白质的活性具有抑制影响。优选的显性阴性PARP突变体为含有功能性DNA结合域(或其变体)或由其组成的蛋白质，但没有催化域(例如含有约355-约375个ZAP类的PARP氨基酸的N-端Zn-指，特别是含有SEQ ID No 2的氨基酸1-370的氨基酸序列的DNA结合蛋白域或含有SEQ ID No 11的氨基酸1-98的氨基酸序列的DNA结合蛋白域，或者含有SEQ ID No 2的氨基酸1-370的氨基酸序列的DNA结合蛋白域，其中氨基酸1-88的氨基酸序列被SEQ ID No 11的氨基酸1-98的氨基酸序列替换，或者例如含有约135-160个NAP类的PARP氨基酸的N-端DNA结合蛋白域，特别是含有SEQ ID No 4的氨基酸1-159的氨基酸序列的DNA结合蛋白域或含有SEQ ID No 6的氨基酸1-138的氨基酸序列的DNA结合蛋白域)或者没有功能催化域(例如无活性PARP突变体，在所谓PARP特征方面突变，特别是在SEQ ID No 2的第850位置、SEQ ID No 4的第532位置、SEQ ID No 6的第517位置的保守赖氨酸突变)。优选地，显性阴性PARP突变体应保留其DNA结合活性。显性阴性PARP突变体可以被融合到载体蛋白质如β-葡糖醛酸糖苷酶(SEQ ID No 12)上。

再者，可以使用编码一种或多种显性阴性PARP突变体的一种或多种PCD调节基因实现本发明的第一个目标。当使用一个PCD调节嵌合基因时，该基因必需能够同时降低两类PARP基因的表达。

在本发明第一方面的另一实施方式中，真核细胞，特别是植物细胞中PARP的功能水平通过调节这些细胞中内源PARP基因的核苷酸序列来降低，这样编码突变体PARP蛋白质保留约10％的活性。实现内源PARP基因的这种调节的方法包括同源重组将该内源PARP基因变成突变体PARP基因，例如通过US5527695中所述的方法。在一优选实施方式中通过如WO96/22364或US5565350中所述加入嵌合DNA/RNA低聚核苷酸来实现该内源PARP基因的核苷酸的这种位置介导调节。

对植物细胞来说，然而已发现加入一种PCD调节嵌合基因，优选编码在降低一类PARP基因，特别是ZAP类的PARP基因的表达起作用的生物活性RNA，根据本发明的第一方面可以足够降低这些植物细胞中的总PARP活性，即抑制或预防这些植物细胞中程序性细胞死亡。

在本发明的该实施方式中，该PCD调节嵌合基因优选包括编码生物活性RNA的转录区，该RNA包括至少一个RNA区，优选至少100个核苷酸长，根据本文提到的标准分类成用于内源PARP基因之一的有义RNA，并且该有义RNA含有至少一个其它RNA区，优选至少100个核苷酸长，根据本文提到的标准分类成用于内源PARP基因之一的反义RNA，由此该反义和有义RNA区能够组成双链区，优选长度为至少约100个核苷酸。

根据本发明的第一方面，希望加入可以降低一类PARP蛋白质，特别是本文所述的ZAP类的PARP蛋白质的功能性或表观水平的一种PCD调节嵌合基因，同样可以足够降低植物细胞中的总PARP活性。

根据本发明的第一方面，包括至少一个PCD调节嵌合基因的植物细胞中程序性细胞死亡的降低或抑制可以导致对不利条件的提高的抗性，如用化学物质处理的应激抗性，低温应激抗性，病原体和瘟疫赋予的应激抗性、抗旱性、高温应激抗性等。

在本发明的另一方面，真核细胞，优选所选细胞，特别是所选植物细胞的程序性死亡通过PARP的功能水平的严重降低，优选几乎完全降低得到提高，这样该DNA不再能修复并且该基因组完整性不再能保持。

在本发明该方面的一个实施方式中，通过将至少一个PCD调节嵌合基因导入真核细胞，特别是植物细胞中，这些细胞中PARP的功能水平严重降低，特别是几乎完全被消除，该嵌合基因包括能够介导在这些细胞中转录的启动子，优选植物表达的启动子，和功能性3’转录终止和聚腺苷酸化区，可操纵地连接到DAN区，当转录时产生生物活性RNA分子，该RNA分子能降低被两类PARP基因编码的内源PARP活性的功能水平。

在本发明第二方面的优选实施方式中，将至少两种这样的PCD调节嵌合基因导入这些细胞中，由此由第一PCD调节嵌合基因编码的生物活性RNA降低由NAP类的基因编码的内源PARP活性的功能水平，并且由此由第二PCD调节嵌合基因编码的生物活性RNA降低由ZAP类的基因编码的内源PARP活性的功能水平，这样组合PARP活性大大降低，特别是几乎完全被消除。

正如本发明第一方面所提到的，PCD调节嵌合基因的转录区编码生物活性RNA，它能够干扰内源PARP基因的表达(例如通过反义作用、共抑制或核酶作用)或者该生物活性RNA还可以被翻译成肽或蛋白质，它能够抑制NAP和ZAP类的PARP蛋白质，如无活性抗体或显性阴性PARP突变体。

在本发明第二方面的特别优选实施方式中，PCD调节嵌合基因(PCD增强嵌合基因)的转录区编码生物活性RNA，该RNA含有至少一个RNA区(优选至少约100个核苷酸长)，根据上述标准分类成用于至少一个内源PARP基因的有义RNA和至少一个其它RNA区(优选至少约100个核苷酸长)，根据上述标准分类成用于至少一个内源PARP基因的反义RNA，由此反义和有义RNA区能够组合成双链RNA区(优选以至少约100个核苷酸的距离)。在一特别优选的实施方式中，两个这样的PCD调节基因，一个靶向降低NAP类的PARP蛋白质的功能水平，另一个靶向降低ZAP类的PARP蛋白质的功能水平，将其导入真核细胞或有机体，优选植物细胞或植物中。

很显然，可以不同组合使用本发明的嵌合PCD调节基因的转录DNA区的不同实施方式，从而达到本发明的目标。例如，第一嵌合PCD调节基因可以设计成编码降低ZAP类的内源PARP基因的表达的有义RNA，同时该第二嵌合PCD调节基因可以设计成编码降低ZAP类的内源PARP基因的表达的显性阴性PARP突变体。

PCD调节嵌合基因是否引入真核细胞中将最终导致这些细胞中组合PARP的功能水平适度降低还是严重降低，即PCD的抑制或PCD的增强将总是由这些PCD调节基因的表达水平来决定(或者以转录水平或者以组合转录/翻译水平)。对PCD调节基因的表达水平有影响的主要因素为启动区的选择，尽管其它因素(例如，但不限于，3’端的选择、内含子的存在、转录区的密码子选择、mRNA稳定性、在翻译开始位置周围的共有序列、5’和3’未翻译RNA区的选择、PEST序列的存在、围绕稳定整合PCD调节基因的插入位置的染色质结构的影响、引入的PCD调节基因的拷贝数等)或其组合也对PCD调节基因的最终表达水平有影响。一般来说，可以假设组合PARP功能水平的适度降低可以通过含有相当弱的启动子的PCD调节基因实现，然而组合PARP的功能水平的严重降低可以通过含有相当强的启动子的PCD调节基因实现。但是，含有特异性启动子的PCD调节基因的表达水平和最终对PCD的影响可以随其它影响因素的功能变化，如已叙及的。

为了本发明具体实施方式的目的，该PCD调节嵌合基因可以包括组成型启动子，或者在整个有机体，特别是整个植物中所有或主要细胞类型中表达的启动子，如得自T-DNA基因的启动区，特别是农杆菌属Ti-或Ri-质粒的冠瘿氨基酸(例如，nos、ocs启动子)、或者病毒基因的启动区(例如CaMV35S启动子或其变体)。

还可以有利地随意或相响环境提示控制PCD调节基因的表达，例如通过包括可诱导的启动子，它可以通过例如(但不限于)使用化合物(如安全剂、除草剂、糖皮质素)、光条件、暴露于无生命逆境(例如伤害、重金属、极端温度、盐度或旱度)或有生命逆境(例如病原体或瘟疫感染，包括通过真菌、病毒、细菌、昆虫、线虫、菌质和支原体类有机体等)的外界刺激激活。适宜本发明的植物表达的可诱导启动子的例子有：可线虫诱导的启动子(WO 93/19188,WO 96/28561)、在使用例如地塞米松的糖皮质素之后诱导的启动子、或在使用四环素之后呈现或激活的启动子(Gatz等人，1988；Weimann等人，1994)。

在本发明的几个实施方式，特别是本发明的第二方面(即提高的PCD)中，可以方便地或按需要限制程序性细胞死亡对有机体，特别是植物的特定细胞亚类的影响，因此该PCD调节基因可以包括组织特异性或细胞类特异性启动子。选择性地在特定组织或细胞类型中表达的适宜植物表达的启动子的例子在本领域为公知并包括(但不限于)种子特异性启动子(例如WO89/03887)、器官-原基特异性启动子(An等人，1996)、茎特异性启动子(Keller等人，1988)、叶特异性启动子(Hudspeth等人，1989)、叶肉特异性启动子(例如光诱导的Rubisco启动子)、根特异性启动子(Keller等人，1989)、块茎特异性启动子(Keil等人，1989)、血管组织特异性启动子(Peleman等人，1989)、分生组织特异性启动子(例如SHOOTMERISTEMLESS(STM)基因的启动子，Long等人，1996)、原基特异性启动子(例如Antirrhinum CycD3a基因的启动子，Doonan等人，1998)、花药特异性启动子(WO 89/10396、WO9213956、WO9213957)、柱头特异性启动子(WO 91/02068)、裂开区特异性启动子(WO 97/13865)、种子特异性启动子(WO 89/03887)等。

优选本发明的嵌合PCD调节基因伴随着标记基因，优选含有标记DNA的嵌合标记基因，该标记DNA可操纵地连接在植物表达的启动子的5’端，优选组成型启动子如CaMV 35S启动子，或者光诱导启动子如编码Rubisco的小亚基的基因的启动子；以及可操纵地连接在适宜植物转录3’端形成和聚腺苷酸化信号的3’端。所需标记DNA的选择不是至关重要的，并且可以使用任意适宜的标记DNA。例如，标记DNA可以编码赋予转化植物细胞区别“颜色”的蛋白质，如A1基因(Meyer等人，1987)或绿色荧光蛋白质(Sheen等人，1995)，可以赋予转化植物细胞除草剂抗性，例如，bar基因，编码膦丝菌素抗性(EP 0242246)，或者可以赋予转化细胞抗生素抗性，如aac(6’)基因，编码庆大霉素抗性(WO94/01560)。

将PCD调节嵌合基因引入真核细胞的方法，特别是转化植物细胞的方法在本领域中为公知，并且据信对本发明方法不重要。转化获得或者过渡型或者稳定型转化细胞(由此将该PCD调节嵌合基因稳定地插入该细胞的基因组，特别是该细胞的核基因组中)。

很显然，本发明中所述改变真核细胞和有机体，特别是植物细胞和植物中编程性细胞死亡的方法和手段具有几种重要的应用可能性。通过本发明方法和手段的PCD的抑制，可以被用于减轻在转化过程中施加给这些细胞，特别是植物细胞的压力并因此增加转化效率，如WO97/06267中所述。PCD的抑制还可以被用于提高真核细胞，特别是植物细胞的细胞培养。使用本发明手段和方法的特别是细胞类型的PCD的触发，可以被用于号召使用细胞毒素的方法。由于PCD为细胞死亡的“天然”途径，因此本发明的PCD增强性嵌合基因的用途构成对其它细胞毒素基因如RNAse或导致细胞溶解的白喉毒素基因的用途的改进。而且，PCD增强性基因在不同于定向细胞的细胞中的低水平表达，将导致PARP活性在这些细胞中适度降低而不是严重降低，因此实际上抑制了非靶细胞中的PCD。

对植物来说，PCD增强性嵌合基因的优选应用包括，但不限于：

1、产生防止真菌感染的植物，由此所述PCD增强性嵌合基因包括如WO 93/19188或WO 96/28561中所述的真菌响应性启动子。

2、产生线虫抗性植物，由此所述PCD增强性嵌合基因包括如WO92/21757中所述的线虫诱导性启动子。

3、产生雄性或雌性无子植物，由此所述PCD增强性嵌合基因包括花药特异性启动子(如WO 89/10396、WO9213956、WO9213957中所述)或柱头特异性启动子(如WO91/02068中公开的)。

4、产生种子掉果特征得到提高的植物，由此所述PCD增强性嵌合基因包括开裂区特异性启动子(如WO97/13865中公开的)。

出人意料地，已发现根据本发明第一方面通过引入PCD调节嵌合基因，优选调节ZAP类的PARP基因的表达的嵌合基因，特别是调节ZAP类的PARP基因的表达的嵌合基因，在该ZAP类中转录区编码同时含有如本文所述的有义和反义RNA的生物活性RNA，转化的植物细胞、植物愈伤组织和植物呈现出提高的生长。

尽管不打算将本发明限制在具体操作模式中，但是据信该生长的改善是由于细胞数降低的结果，这些细胞可以通过增加信号抑制性细胞分裂的阈值经受编程性细胞死亡，因此使植物更茂盛地生长。这些植物还具有较好的如本申请其它地方解释的逆境抗性。

因此，在第三个方面，本发明还涉及提高含有至少一种根据本发明第一个方面的PCD调节嵌合基因，优选调节ZAP类的PARP基因的表达的嵌合基因的植物细胞、植物组织和植物的生长，优选营养生长的方法，在该ZAP类中转录区编码同时含有有义和反义RNA的生物活性RNA。

很显然，尽管基本上可以将本发明用于所有植物种和变种中，但是本发明应特别适宜于改变具有商业价值的植物中的程序性细胞死亡。可以使用本发明的特别优选的植物为玉米、油籽性油菜、亚麻籽、小麦、草类、苜蓿、豆类、芸苔植物、西红柿、莴苣、棉花、水稻、大麦、马铃薯、烟草、甜菜、向日葵和观赏植物如康乃馨、菊花、玫瑰、郁金香等。

可以将所得的转化植物用于传统育种计划，以生产具有相同特征的更多转化的植物或将本发明的嵌合细胞分裂控制基因引入相同或相关植物种的其它变种中。由该转化植物获得的种子含有作为稳定的基因组插入片段的本发明的PCD调节基因。

以下非限制性实施例描述了嵌合细胞程序死亡控制基因的构建和这些基因在调节真核细胞和有机体程序性细胞死亡中的用途。在这些实施例中除非另有说明，根据Sambrook等人(1989)在“分子克隆：实验手则”第二版，冷泉港实验室出版社，NY以及Ausubel等人(1994)的“分子生物学现代方法，现代方法”美国的第1卷和第2卷中所述的标准方案进行所有重组DNA技术。植物分子研究的标准材料和方法描述在英国BIOS科学出版有限公司和英国Blackwell科学出版社共同出版的R.D.D.Croy的“Plant Molecular Biology Labfax”(1993)中。

整个说明和实施例，参考了以下序列：

SEQ ID No 1：玉米的ZAP基因的DNA序列(zap 1)

SEQ ID No 2：玉米的ZAP蛋白质的蛋白质序列(ZAP 1)

SEQ ID No 3：玉米的NAP基因的DNA序列(nap)

SEQ ID No 4：玉米的NAP蛋白质的蛋白质序列(NAP)

SEQ ID No 5：拟南芥的NAP基因的DNA序列(app)

SEQ ID No 6：拟南芥的NAP蛋白质的蛋白质序列(APP)

SEQ ID No 7：非传统PARP蛋白质的A结构域的共有序列

SEQ ID No 8：非传统PARP蛋白质的A1结构域的共有序列

SEQ ID No 9：非传统PARP蛋白质的A2结构域的共有序列

SEQ ID No 10：玉米的第二ZAP基因的DNA序列(Zap 2)

SEQ ID No 11：玉米的ZAP蛋白质的蛋白质序列(ZAP 2)

SEQ ID No 12：在APP的DNA结合域和GUS蛋白质之间的融合蛋白质的氨基酸序列

SEQ ID No 13：简并的PCR引物

SEQ ID No 14：简并的PCR引物

SEQ ID No 15：PCR引物

SEQ ID No 16：PCR引物

SEQ ID No 17：PCR引物

SEQ ID No 18：PCR引物

SEQ ID No 19：PCR引物

SEQ ID No 20：PCR引物

SEQ ID No 21：app启动子-gus翻译融合

序列表自由内容

在本申请的序列表部分中使用以下自由内容

<223>人工序列的描述：非传统PARP蛋白质的A域

<223>人工序列的描述：非传统PARP蛋白质的A1域

<223>人工序列的描述：非传统PARP蛋白质的A2域

<223>人工序列的描述：在APP N-端域和GUS蛋白质之间的融合蛋白质

<223>人工序列的描述：简并PCR引物

<223>人工序列的描述：用作PCR引物的寡聚核苷酸

<223>人工序列的描述：APP启动子与β-葡萄糖醛酸酶基因的融合

<223>翻译起始密码子

实施例

实验步骤

酵母和细菌菌株

使用啤酒糖酵母菌株DY(MATa his3 can1-10 ade2 leu2 trp1 ura3::(3×SV40 AP1-lacZ)(Kuge和Jones,1994)表达APP蛋白质。根据Dohmen等人(1991)进行酵母转化。菌株在基础SDC培养基(0.67％酵母氮碱、0.37％酪蛋白氨基酸、2％葡萄糖、50mg/l的腺嘌呤和40mg/l的色氨酸)上生长。为了诱导APP表达，在SDC中的葡萄糖用2％半乳糖替换。

将大肠杆菌菌株XL-1(Stratagene,La Jolla,CA)用于质粒操作和文库筛选，它是根据标准方法(Ausubel等人，1987；Sambrook等人，1989)进行的。将大肠杆菌BL21(Studier和Moffat,1986)用于APP蛋白质表达并将根癌土壤杆菌C58C1Rif^R(pGV2260)(Deblaere等人，1985)用于植物的稳定转化。

聚(ADP-核糖)聚合酶活性测定

在如下制备的酵母菌株的总蛋白质提取液中测定APP的酶活性。在30℃下在150rpm的转动摇床上将DY(pV8SPA)或DY(pYeDP1/8-2)在50ml的SDC培养基中生长过夜。通过在1000×g下离心收获酵母细胞，用150ml的0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.5)冲洗3次，并再悬浮于5ml山梨醇缓冲液(1.2M山梨醇、0.12M K₂HPO₄,0.033M柠檬酸，pH5.9)中。将溶细胞酶(Boehringer,Mannheim，德国)添加到细胞悬浮液中至最终浓度为30Uml^-1，并将细胞在30℃下培养1小时。然后将酵母原生质球用山梨醇缓冲液冲洗3次，并再悬浮于2ml的冰冷溶胞缓冲液(100mM Tris-HCl,pH7.5,400mM NaCl,1mM EDTA,10％甘油，1mM DTT)中。超声处理之后，在4℃下将该溶胞产物在20000×g下离心20分钟，上清液在用反应缓冲液(100mM Tris-HCl,pH8.0,10mM MgCl₂,1mM DTT)平衡的Econo-Pack^TM 10DG柱(Bio-Rad,Richmond,CA)上脱盐。为了减少蛋白质的蛋白水解降解，用蛋白酶抑制剂混合物(Boehringer)以每50ml一片补充该溶胞和反应缓冲液。通过加入NaCl和硫酸鱼精蛋白至最终浓度分别为600mM和10mg ml^-1将核酸从该总提取液中除去。在室温下培养10分钟之后，通过在4℃、20000×g下离心15分钟除去沉淀物。在Econo-Pack^TM 10DG柱上通过凝胶过滤将上清液的缓冲液交换为反应缓冲液。

合成聚(ADP-核糖)的测定是由Collinge和Althaus(1994)改良而来的。将约500μg总酵母蛋白质在补充有30μCi的³²P-NAD⁺(500 Ci mmol^-1)、至60μm最终浓度的未标记的NAD⁺和10μg ml^-1超声处理的鲑精DNA的反应缓冲液中培养。在室温下培养40分钟之后，加入500μl的终止缓冲液(200mM Tris-HCl,pH7.6,0.1M NaCl,5mM EDTA,1％Na⁺-N-月桂酰-肌氨酸和20μg ml^-1蛋白酶K)，在37℃下将反应物培养过夜。酚和酚/氯仿提取之后，将聚合物用2.5体积带有0.1M NaAc(pH5.2)的乙醇沉淀。用70％乙醇冲洗该颗粒，干燥并溶于70％甲酰胺、10mM EDTA、0.01％溴酚蓝和0.01％二甲苯腈蓝中。样品在80℃下加热10分钟，然后上样到12％聚丙稀酰胺/6M脲的测序凝胶上。将凝胶在3MM纸(Whatman International,Maidstone,UK)上干燥，将其或者曝光在柯达X-Omat X射线胶片(EastmanKodak,Richmond,NY)上或者使用一Phosphorlmager^TM 445SI(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)扫描。

免疫学技术

在用1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导500ml的大肠杆菌BL21(pETΔNdeSPA)的培养液之后，编码从氨基酸Met³¹⁰到His⁶³⁷的APP多肽的截短的app cDNA表达为在N端上有6个组氨酸残基的翻译融合物。在变性条件(在有6M盐酸胍的情况下)下在Ni-NTA-琼脂糖柱上根据厂家方案(Qiagen,Chatsworth,CA)通过亲和色谱将该APP多肽提纯至将近同质。用PBS透析之后，按照标准免疫方案(Harlow和Lane,1988)使用可溶性和不溶性APP多肽混合物免疫两只新西兰白兔。为了Western印迹分析，通过变性SDS-PAGE(Sambrook等人，1989；Harlow和Lane,1988)溶解蛋白质，并使用Semi-Dry BlotterⅡ(Kem-En-Tec,Copenhagen,Denmark)将其转移到硝化纤维素膜(Hybond-C；Amersham)上。

如所述(Harlow和Lane,1988)进行酵母细胞内的原位抗原定位。为了在酵母原生质球中定位该APP蛋白质，在Tris缓冲盐水-BSA缓冲液中以1∶3000-1∶5000稀释抗-APP血清。将特异性地识别聚(ADP-核糖)聚合物(Ikajima等人，1990)的10H单克隆抗体以1∶100稀释度用于PBS缓冲液中。用1∶200稀释度的与荧光素异硫氰酸盐偶联的羊抗-小鼠IgGF(ab’)₂(Sigma)检测该小鼠抗体。用1∶200的稀释度的CY-3共轭的羊抗-兔IgG羊F(ab’)₂片断(Sigma)检测兔IgG。为了观察DNA，将载玻片在有10μg ml^-1的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；Sigma)的PBS中培养1分钟。在一Axioskop落射荧光显微镜(Zeiss,Jena,Germany)上进行荧光成像。为了观察FITC和CY-3荧光染料，分别使用23和15滤光片。细胞用富士彩色-100优质正胶片照相。

植物材料和组织化学分析

按照将叶片与根癌土壤杆菌C58C1Rif^R(pGCNSPAGUS)共同培养(DeBlock等人，1987)的方法将烟草(Nicotiana tabacum)SR1(Maliga等人，1975)用于产生稳定的转化体。用在35S CaMV的控制下的真正GUS转化的烟草SR1株系用作对照。按照原位渗滤方法将拟南芥生态型Columbia用于app-启动子-GUS融合体的转化。

为了进行GUS活性的原位组织化学染色，在30分钟内将植物样品固定在冰冷的90％丙酮中，用0.1M K₂HPO₄(pH7.8)冲洗，然后在染色缓冲液(0.1M K₂HPO₄,pH7.8,2mM X-Gluc,20mM Fe³⁺-EDTA)中在37℃下培养。将染色过的植物组织贮藏在4℃下70％的乙醇中。必要时，因酚氧化的组织变暗可以通过用乳酸酚(Beeckman和Engler,1994)的培养降低。在Jenalumar光学显微镜(Zeiss)下检测该GUS染色。植物组织用富士彩色-100优质正胶片照相。

其它方法

根据USB生物化学提供的方案(Cleveland,OH)进行的DNA测序常规地验证质粒构建步骤。由准备引物DNA标记盒(Amersham)合成用于核酸杂交的³²P-标记的DNA探针。为了DNA和RNA杂交实验，使用Church和Gilbert的缓冲系统(1984)(0.25M磷酸钠，pH7.2,7％SDS,1％BSA,1mMEDTA)。为了Western印迹分析，基本上如用于植物组织所述的(Hurkman和Tanaka,1986)用酚提取酵母总蛋白。为了Northern印迹分析，如所述(Ausubel等人，1987)用热酚提取总酵母RNA。在用乙二醛变性之后，将RNA溶于1.5％琼脂糖凝胶上(Sambrook等人，1989)。使用Hybond-N尼龙滤膜(Amersham)用于核酸印迹。

实施例1：编码玉米PARP同源物的基因的分离

为了分离编码PARP同源物的玉米cDNA，进行两个试验。首先，在低度严格DNA-DNA杂交条件下使用由拟南芥属app cDNA制备的DNA探针筛选玉米cDNA文库。其次，使用作为模板的第一链cDNA和根据“PARP特征”的序列-所有已知PARP蛋白质中最保守的氨基酸序列设计的两个简并引物，进行部分玉米PARP的PCR扩增。

来自近交系B734的玉米(Zea mays L.)叶的λZAP(Stratagene)cDNA文库。根据标准步骤(Sambrook等人，1989)筛选噬菌斑(500000)。在用拟南芥属app探针筛选之后，提纯一个1.4kbp的非全长cDNA。在原始cDNA文库用该app探针筛选以及接着cDNA末端的5’快速扩增(RACE)PCR分析之后，鉴定该nap基因-该拟南芥属app的玉米同源物。对5’RACE PCR来说，用Marathon试剂盒(Clontech,Palo Alto,CA)和0.5μg从1周龄玉米幼苗的内鞘、外鞘和叶分离的玉米聚(A)⁺RNA制备该模板。用于PCR扩增的该基因特异性嵌套引物为nap引物的5’-GGGACCATGTAGTTTATCTTGACCT-3’(SEQ ID No 15)和5’-GACCTCGTACCCCAACTCTTCCCCAT-3’(SET ID No 16。扩增PCR产物经亚克隆和测序。用允许重组2295-bp-长nap cDNA序列(SEQ ID No 3)的nap特异性引物扩增一800bp的片段。

该NAP蛋白质为653个氨基酸长(分子量约73kDa；SEQ ID No 4)并与该APP高度相似(61％序列相同性和69％相似性)。最重要的是，NAP具有N-末端与APP一致的结构(图1A)，这暗示在植物中在APP类蛋白质的结构上相当严格的选择压力。该nap基因在玉米基因组中是唯一的(图2A)并编码2.4kb的转录物(图2C)。

使用以“PARP特征”的非常高度保守的区域为基础的简并引物和来自玉米的第一链cDNA为模板，扩增一310bp片段。对用具有Y=C/T、R=A/G、N=A/G/C/T的简并引物5’-CCGAATTCGGNTAYATGTTYGGNAA-3’(SEQ ID No 13)和5’-CCGAATTCACNATRTAYTCRTTRTA-3’(SEQ ID No 14)的该PCR来说，使用第一链cDNA作为模板并使用5μg来自玉米嫩叶的聚(A)⁺RNA和MuMLV逆转录酶合成。用在100μl体积中的Taq DNA聚合酶使用以下条件进行PCR扩增：在95℃下1分钟，在45℃下2分钟，在72℃下3分钟，接着在95℃下1分钟、45℃下2分钟、72℃下3分钟循环38次，最后在72℃下培养10分钟。

该310bp片段的序列显示出在相同区域内与人PARP的55％的序列相同性和64％的序列相似性，但是，无论如何，与nap cDNAD的序列有差异。在用通过PCR用简并引物获得的310-bp片段筛选之后鉴定了三个zapcDNA。这三个提纯的cDNA都得自相同转录物，这是因为它们具有相同的3’非编码区；将最长克隆(#9)在两条链(SEQ ID No 1)上测序。该cDNA编码689个氨基酸的PARP同源多肽(SEQ ID No 2；分子量-109kDa)，将其命名为ZAP1(图1B)。由于ZAP1的第一Zn-指具有序列CKSCxxxHASV(不含第三个半胱氨酸残基)，因此它可能为非功能性。

如上所述使用以下zap特异性引物5’-AAGTCGACGCGGCCGCCACACCTAGTGCCAGGTCAG-3’(SEQ ID No 17)和5’-ATCTCAATTGTACATTTCTCAGGA-3’(SEQ ID No 18)进行来自玉米品系LG2080(由近交系B734制备该筛选cDNA文库)的zap转录物的5’RACE PCR分析。在用zap-特异性引物的PCR之后获得450-bp PCR产物。由于在其5’端的长度略有差异，因此将用zap-特异性引物产生的8个独立的5’RACEPCR片段测序。在来自LG2080玉米植物的所有转录物中，在编码区中存在其它序列的插入片段，它使该ZAP蛋白质增长11个氨基酸(980个氨基酸，分子量约110.4kDa)。该ZAP2的Zn-指Ⅰ为标准且可读为CKSCxxxHARC(图1B；SEQ ID No 11)。该序列差异可能是由于或者玉米变种之间的差异、两个同源基因的表达、或者可变剪接。事实上，玉米可能具有至少两个zap基因(图2B)，它编码3.4-3.5kb的转录物(图2D)。用该zap cDNA制备的探针的该DNA凝胶印迹试验显示了同源基因存在于拟南芥属中。

结构性ZAP与来自动物的PARP非常相似。它具有由两个Zn-指组成的良好保守的DNA结合域(与小鼠PARP的DNA结合域具有36％的相同性和45％的相似性)。甚至通过仅比较这些Zn-指的序列--在小鼠酶(44％相同性和54％相似性)中的Ala¹-Phe¹⁶²，或者来自核定位信号(NLS)的亚结构域下游-在小鼠PARP(40％相同性和50％相似性)中的Leu²³⁷-Ser³⁶⁰，显示出较高的同源性。鉴于在ZAP中不能鉴定哺乳动物PARP的二分核定位信号特征，因此该序列KRKK配备一分NLS(图1B)。该推定自动修饰域比小鼠PARP中的保守性差且在ZAP中短。在ZAP、NAP、APP和小鼠PARP之间催化域的同源性编辑显示在图2中。应说明的是，与APP和NAP中的(分别为40％和42％序列相同性)相比，ZAP的NAP⁺-结合域与哺乳动物酶(48％相同性)更相似，然而APP和NAP在其催化域中为68％相同和76％相似。

实施例2：证实非传统PARP蛋白质具有DNA-依赖性聚(ADP-核糖)聚合酶活性

APP为DNA-依赖性聚(ADP-核糖)聚合酶

进行APP蛋白质(在酵母中表达的)的更详细研究，以了解来自该NAP类的PARP样蛋白质的活性。选择酵母作为用于拟南芥属APP蛋白质的表达和酶分析的有机体有许多原因。作为真核细胞啤酒酵母更适宜来自其它真核有机体的天然蛋白质的表达，并且不同于大多数其它真核细胞，因此它不具有内源PARP活性(Lindahl等人，1995)。

在半乳糖诱导的酵母启动子的控制下按以下方式将全长app cDNA导入pYeDP1/8-2中。该全长app cDNA从pC3(Lepiniec等人，1995)作为Xhol-EcoRⅠ片段切除。将末端用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段填充，并将该片段亚克隆到酵母表达载体pYeDP1/8-2的Smal位置(Cullin和Pompon,1988)。将所得表达载体pV8SPA(图4A)转化进啤酒酵母菌株DY。

为了在大肠杆菌中的APP表达，用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)使用引物5’-AGGATCCCATGGCGAACAAGCTCAAAGTGAC-3’(SEQ ID No 19)和5’-AGGATCCTTAGTGCTTGTAGTTGAAT-3’(SEQ ID No 20)将该app cDNA的全编码区进行PCR扩增，并以BamHl片段亚克隆进pET19b(Novagene,Madison,WI)，获得pETSPA。在大肠杆菌BL21中由pETSPA的全长APP的表达非常差。为了获得更好的表达，用Ncol和Ndel或用Smal将pETSPA消化，末端通过DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段填充，然后将这些质粒自连接。所得质粒pETΔNdeSPA和pETΔSmaSPA中仅pETΔNdeSPA在大肠杆菌BL21中满意地表达了截短的APP多肽(Met³¹⁰-His⁶³⁷)。

通过Northern和Western印迹分析评价该APP在酵母中的表达。(图4)由于当细胞在葡萄糖上生长和在含半乳糖的培养基上去抑制时pV8SPA中的启动子无活性，因此希望该表达紧密地受该碳源调节。然而，RNA的Northern印迹分析和与含空白载体的对照DY菌株比较的蛋白质在DY(pV8SPA)中的免疫印迹分析显示出，甚至当在含葡萄糖的培养基上生长时app mRNA和APP蛋白质在酵母中表达(图4B，泳道2)。在含葡萄糖的培养基上观察到的表达特异性在于app mRNA和APP蛋白质比在用半乳糖诱导后检测到的(在图4B中的对比泳道2和4)短。尽管这些细胞也表达截短的mRNA和蛋白质，但是在含半乳糖的培养基上仅检测到分子量较高的APP多肽(显然是全长蛋白质)。这种发现的最可靠的解释是当该DY(pV8SPA)菌株在葡萄糖上生长时，存在来自表达盒的渗漏表达，这是由于在半乳糖诱导之后观察到从转录起点200-300bp下游开始转录。该较短mRNA可能不编码APP的第一个甲硫氨酸(Met¹)，因此在Met⁷²开始翻译。这应解释来自在葡萄糖或半乳糖上生长的菌株的APP多肽的分子量中所观察的约5kDa差异(计算差为7.5kDa)。通过在有PARP抑制剂如3ABA和烟酰胺的情况下生长菌株，排除了分子量中的差异通过聚(ADP-核糖)化可能对自修饰有利的可能性(图4B，将泳道6和8与泳道4相比)。

为了检测聚(ADP-核糖)的合成，从在不同条件下生长并在有放射活性标记的NAD⁺下培养的酵母菌株中提取总蛋白质。为了防止APP在体内合成聚(ADP-核糖)和可能的自动修饰，菌株也在有3ABA、PARP的可逆抑制剂的情况下生长，然后在脱盐过程中将它们从蛋白质提取液中除去。图5显示了聚(ADP-核糖)是通过在半乳糖上生长的DY(pV8SPA)的蛋白质提取物合成的(图5A，泳道1和2)，但不通过含空白载体的菌株合成(图5A，泳道4)。还可以看出，拟南芥属APP能够合成长度高达40个残基的聚合物(图5A，泳道1)，大多数放射活性以10-15-聚物加入。该观察与其它专家(Chen等人，1994)所检测的聚合物大小一致。当该酵母菌株与3ABA一起生长时加入聚合物的放射活性比没有3ABA的多(图5A，泳道1与泳道2相比)；原因可能是或者从抑制培养物提取的该APP的自动修饰少(据信自动修饰抑制PARP的活性)，或者标记的NAD⁺被来自用于现存聚合物的延伸的未抑制培养物的酶所使用，导致整体特异性活性降低。在相同反应条件下或者仅在反应缓冲液中或者在有来自DY(pYeDP1/8-2)的酵母总蛋白质提取物的情况下通过人PARP合成的聚(ADP-核糖)(图5A，分别为泳道5和6)显示出链更长，可能高达400-聚体(de Murcia和Menissierde Murcia,1994)。

通过带缺口的DNA刺激酶活性为来自动物的PARP的公知性能(Alvarez-Gonzalez和Althaus,1989)。因此我们试验是否APP蛋白质的活性为DNA依赖性。在除去酵母核酸(DNA、RNA)和半乳糖生长的DY(pV8SPA)蛋白质提取物中一些碱性蛋白质之后，在递增浓度的超声鲑精DNA下分析聚(ADP-核糖)的合成。从图5B中可以看出，存在于³²P-NAD⁺的反应和加入中的DNA量之间有直接相关性。磷图像扫描说明，加入含40μg ml^-1 DNA的反应混合物中的聚(ADP-核糖)的放射活性比具有2μgml^-1DNA的多约6倍(图5B，分别为泳道4和2)。在反应混合物中聚合物的合成对3ABA过敏(图5B，泳道5)。

APP为核内蛋白

在动物细胞中PARP活性位于细胞核内(Schreiber等人，1992)。如果细胞核的话，APP的胞内定位可以提供重要的其它指示：APP为真实植物PARP。为此，使用抗-APP抗血清分析该APP多肽在酵母细胞中的定位。在半乳糖上生长的酵母中合成的APP多肽发现主要在该核心中。存在于PARP抑制剂的培养基中对该定位没有影响。

此外，我们试验了APP在酵母细胞中的活性是否一致，而人PARP的已有报道(Collinge和Althaus,1994)。本文中，将固定酵母原生质球用单克隆10H抗体培养，该抗体特异性地识别聚(ADP-核糖)聚合物(Kawamitsu等人，1984)。具有10H抗体的阳性浅黄色-绿色荧光信号位于该核心中并且仅在半乳糖上生长的DY(pV8SPA)中观察到。在有PARP抑制剂-3ABA和烟酰胺的情况下生长的细胞阳性染色大大降低。

为了鉴定APP在植物细胞中的胞内定位，试验在植物研究中广泛适用的方法，即检测正在讨论的蛋白质和报道基因之间形成的融合蛋白质的亚细胞定位，曾经在转基因植物或转染细胞中产生该蛋白质融合(Citovsky等人，1994；Sakamoto和Nagatani,1996；Terzaghi等人，1997；von Arnim和Deng,1994)。制备GUS与具有从Met¹到Pro⁴⁰⁷延伸的部分APP多肽的N-端翻译融合体。APP与细菌GUS的翻译融合体的构建如下。将质粒pETSPA用Smal切割，经碱性磷酸酶处理，并连接到来自pGUS1(Plant Genetic Systems N.V.,Gent,Belgium)的平端Ncol-Xbal片段上。将该连接混合物转化到大肠杆菌XL-1中并将细胞移植在补充有0.1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷、40μg ml^-15-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸化物和100μg ml^-1氨苄青霉素的LB培养基上。在这种方式中，选择pETSPAGUS作为蓝色集落。通过原位GUS活性凝胶证实在大肠杆菌中表达约110kDa融合蛋白质(Lee等人，1995)。在CaMV的35S启动子的控制下放置该APP-GUS融合体(将来自pETSPAGUS的Klenow平端BamHⅠ片段亚克隆至Smal消化的pJD330；Gallie和Walbot,1992)，所得表达盒以Xbal片段亚克隆到pCGN1547二元载体的Xbal位置(McBride和Summerfelt,1990)中，从而获得pGCNSPAGUS。最后通过冷冻-复苏转化步骤将该pGCNSPAGUS导入根癌土壤杆菌C58C1Rif^R(pGV2260)中。

在大肠杆菌中验证该融合蛋白质的表达。在35S CaMV启动子的控制下将该嵌合cDNA稳定地整合到烟草基因组中。在原位组织化学染色之后分析来自四个非依赖性转基因烟草植物的子代的GUS活性的亚细胞分布。在2天龄幼芽中在子叶和根中可以检测到GUS活性，但是在下胚轴和根端部不能检测到。由于根组织的透过性，GUS染色清楚地位于根毛和表皮细胞的核心。此外，看到其它根细胞的一些散开、未定位的染色，特别是沿维管柱。该非核GUS染色在叶组织中更显著。鉴于幼嫩真叶或子叶呈现出该核心强的蓝色染色，因此也存在细胞质的一些分散染色。然而，在整个展开叶中，GUS染色与CaMV 35S启动子的控制下用GUS转化的对照植物的染色均匀和相似，其中GUS在该细胞质中表达。最后，除了维管束之外，较老叶和子叶实际上呈现出组织化学不能检测出的GUS活性，其中该GUS染色不能被限制在任意特定细胞小室中。

DNA连接酶Ⅰ的缺陷诱导该app基因的表达

动物细胞中的PARP是最丰富的核内蛋白之一，其活性通过蛋白质因结合到损伤的DNA上的变构变化来调节。我们发现，拟南芥属中的app基因具有相当低水平的表达，这暗示该基因的转录激活可能对APP在体内的功能是不可缺少的。为了试验该假设，在通过DNA连接酶Ⅰ缺陷造成的体内基因组去稳定化过程中研究该app基因的表达。提前将该拟南芥属DNA连接酶Ⅰ基因中的T-DNA插入突变系SK1B2分离(Babiychuk等人，1997)。该突变在纯合状态是致命的，但是该突变体等位基因显示出通过配子的正常传递。因此我们希望用于该突变纯合的细胞将因细胞循环的S相过程中不完全DNA合成，不久以后该突变体胚囊用突变体花粉受精而死亡。

app启动子-GUS翻译融合体，其中GUS的编码区与APP的前5个氨基酸在阅读框中融合并构建2kb的app 5’阅读框序列(SEQ ID No 21)。将编码融合蛋白质的该基因转移到拟南芥属中。在与野生型2次回交之后，用app启动子-GUS转化的杂合植物与拟南芥属品系SK1B2杂交。对照植物和用于该连接酶突变杂合的植物的花序被染色GUS活性。尽管我们没有有力的证据证实所有调节序列存在于所用的构建体中，但是大多数在老化组织中测定的该GUS染色图谱可以反映该app基因的表达。在对照植物的花序中该图谱都是相同的，不运送用于突变杂合的突变体连接酶基因和植物。在基因融合蛋白质的突变植物中约1/4的胚珠为GUS阳性。更严密的显微镜检测显示，在GUS阳性胚珠中仅配子体染色。在对照植物和突变植物之间的唯一差异是在DNA连接酶基因中的突变。因此我们推断该app基因或者因为DNA断裂的积聚或者因为用突变花粉受精的突变胚囊的死亡而被诱导。发现在授粉之后24小时内或者因此受精之后很快出现胚囊的GUS染色。

实施例3：构建PCD调节嵌合基因和将含有这些PCD调节基因的T-DNA载体引入土壤杆菌属菌株中

3.1.构建p35S:(dsRNA-APP)和p35S:(dsRNA-ZAP)基因

使用标准重组DNA步骤，可操纵地连接以下DNA区，如图6中图示所列(构建体1和5)：

对p35S:(dsRNA-ZAP)嵌合基因来说

·一CaMV 35S启动区(Odell等人，1985)

·一Cab22前导区(Harpster等人，1988)

·一编码ZAP的DNA区(约整个)(SEQ ID No 10的拟南芥同源物，通过杂交分离)

·约500bp的以逆取向编码ZAP的DNA区2的5’端

·一CaMV35S 3’端区(Mogen等人，1990)

对p35S:(dsRNA-APP)嵌合基因来说

·一CaMV 35S启动区(Odell等人，1985)

·一Cab22前导区(Harpster等人，1988)

·一编码APP的DNA区(约整个)(SEQ ID No 5)

·约500bp的以逆取向编码APP的DNA区的5’端

·一CaMV35S 3’端区(Mogen等人，1990)

3.2.构建pNOS:(dsRNA-APP)和pPOS:(dsRNA-ZAP)基因

使用标准重组DNA步骤，可操纵地连接以下DNA区，如图6中图示所列(构建体2和6)：

对pNOS:(dsRNA-ZAP)嵌合基因来说

·一NOS启动区(Herrera-Estrella等人，1983)

·一Cab22前导区(Harpster等人，1988)

·一编码ZAP的DNA区(约整个)(SEQ ID No 10的拟南芥同源物，通过杂交分离)

·约500bp的以逆取向编码ZAP的DNA区2的5’端

·一CaMV35S 3’端区(Mogen等人，1990)

对pNOS:(dsRNA-APP)嵌合基因来说

·一NOS启动区(Herrera-Estrella等人，1983)

·一Cab22前导区(Harpster等人，1988)

·一编码APP的DNA区(约整个)(SEQ ID No 5)

·约500bp的以逆取向编码APP的DNA区的5’端

·一CaMV35S 3’端区(Mogen等人，1990)

3.3.构建pTA29:(dsRNA-APP)和pTA29:(dsRNA-ZAP)基因

使用标准重组DNA步骤，可操纵地连接以下DNA区，如图6中图示所列(构建体3和7)：

对pTP29:(dsRNA-ZAP)嵌合基因来说

·一TP29启动区(WO 89/10396)

·一Cab22前导区(Harpster等人，1988)

·一编码ZAP的DNA区(约整个)(SEQ ID No 10的拟南芥同源物，通过杂交分离)

·约500bp的以逆取向编码ZAP的DNA区2的5’端

·一CaMV35S 3’端区(Mogen等人，1990)

对pTP29:(dsRNA-APP)嵌合基因来说

·一TA29启动区(WO 89/10396)

·一Cab22前导区(Harpster等人，1988)

·一编码APP的DNA区(约整个)(SEQ ID No 5)

·约500bp的以逆取向编码APP的DNA区的5’端

·一CaMV35S 3’端区(Mogen等人，1990)

3.4.构建pNTP303:(dsRNA-APP)pNTP303:(dsRNA-ZAP)基因

使用标准重组DNA步骤，可操纵地连接以下DNA区，如图6中图示所列(构建体4和8)：

对pNTP303:(dsRNA-ZAP)嵌合基因来说

·一NTP303启动区(Wetering 1994)

·一Cab22前导区(Harpster等人，1988)

·一编码ZAP的DNA区(约整个)(SEQ ID No 10的Arabidopsis thaliana同源物，通过杂交分离)

·约500bp的以逆取向编码ZAP的DNA区2的5’端

·一CaMV35S 3’端区(Mogen等人，1990)

对pNTP303:(dsRNA-APP)嵌合基因来说

·一NTP303启动区(Wetering,1994)

·一Cab22前导区(Harpster等人，1988)

·一编码APP的DNA区(约整个)(SEQ ID No 5)

·约500bp的以逆取向编码APP的DNA区的5’端

·一CaMV35S 3’端区(Mogen等人，1990)

3.5.构建嵌合标记基因

使用标准重组DNA步骤，可操纵地连接以下DNA区，如图6中图示所列：

对gat标记基因来说

·一Act2启动区(An等人，1996)

·一编码氨基苷类6’-乙酰基转移酶的DNA(WO 94/26913)

·一胭脂氨酸合成酶基因的3’端区(Depicker等人，1982)

对bar标记基因来说

·一Act2启动区(An等人，1996)

·一编码膦丝菌素乙酰基转移酶的DNA(US5646024)

·一胭脂氨酸合成酶基因的3’端区(Depicker等人，1982)

3.6.构建含有该PCD调节嵌合基因的T-DNA载体

使用适当限制酶，将3.1-3.5下所述的嵌合PCD调节基因切除并引入来自或者与gat标记基因或bar标记基因一起的pGSV5(WO 97/13865)的T-DNA载体的T-DNA边界之间的多接头中。所得T-DNA载体图示于图6中。

3.7.将T-DNA载体引入土壤杆菌属中

通过Walkerpeach和Velten(1995)所述的电穿孔将T-DNA载体引入根癌土壤杆菌C58C1Rif(pGV4000)中并使用壮观霉素和链霉素选择转化体。

实施例4：用实施例3中的T-DNA载体对拟南芥进行土壤杆菌属介导的转化

运用Valvekens等人(1992)所述的根转化法使用土壤杆菌属菌株转化拟南芥变种C24。将这些外植体用分别含有dsRNA-APP和dsRNA-ZAP构建体的土壤杆菌属菌株共感染。将该dsRNA-APP构建体与pact∶bar基因组合使用。将该dsRNA-ZAP构建体与pact∶gat基因组合使用。选择具有膦丝菌素抗性的转化体。通过卡那霉素抗性的筛选检测这些再生根转基因系存在其它T-DNA。将含有两种T-DNA的转基因系转移到温室中。将表型T0-转基因系计数并进一步更详细地研究该T1-代。

实施例5：用实施例3的T-DNA载体对Brassica napus进行土壤杆菌属介导转化

除了以下修饰之外，运用主要由De Block等人(1989)所述的下胚轴转化法使用土壤杆菌属菌株转化该Brassica napus变种N90-740：-将下胚轴外植体在A2培养基[MS、0.5g/l Mes (pH5.7)、1.2％葡萄糖、0.5％琼脂糖、1mg/l 2,4-D、0.25mg/l萘乙酸(NAA)和1mg/l 6-苄氨基嘌呤(BAP)]上预培养1天。

-感染培养基A3为MS、0.5g/l Mes(pH5.7)、1.2％葡萄糖、0.1mg/lNAA、0.75mg/l BAP和0.01mg/l伪赤霉酸(GA3)。

-选择培养基A5G为MS、0.5g/l Mes (pH5.7)、1.2％葡萄糖、40mg/l硫酸腺嘌呤、0.5g/l聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、0.5％琼脂糖、0.1mg/l NAA、0.75mg/l BAP、0.01mg/l GA3、250mg/l羧苄青霉素、5mg/l硝酸银三周。在该时期之后连续选择在A25J培养基(与A5G相似但有3％蔗糖)上。

-再生培养基A6为MS、0.5g/l Mes(pH5.7)、2％蔗糖、40mg/l硫酸腺嘌呤、0.5g/l PVP、0.5％琼脂糖、0.0025mg/l BAP和250mg/ltriacillin。

将健康枝条转移到在1升容器中的A9的生根培养基中：半浓缩的MS、1.5％蔗糖(pH5.8)、100mg/l triacillin、0.6％琼脂。

MS代表Murashige和Skoog培养基(Murashige和Skoog,1962)。

为了将dsRNA-APP和dsRNA-ZAP T-DNA构建体都引入相同植物细胞中，运用共转化法，主要如De Block和Debrouwer(1991)所述。在含膦丝菌素的培养基上选择转化植物系，之后通过检测再生根枝条的卡那霉素抗性筛选存在的二级T-DNA。在这些共转化试验中，将该dsRNA-APP构建体与pact∶bar基因组合使用。将该dsRNA-ZAP构建体与pact∶gat基因组合使用。将含有两种T-DNA的转基因系转移到温室中。将表型T0-转基因系计数壁挂对该T1-代进行进一步更详细的研究。

实施例6：测定植物品系活力的体外测定

6.1.Brassica napus的健康测定

培养基和反应缓冲液

播种培养基：

半浓缩的Murashige和Skoog盐

2％蔗糖

pH5.8

0.6％琼脂

愈伤组织诱导培养基：A2S

MS培养基、0.5g/l Mes (pH5.8)、3％蔗糖、40mg/l硫酸腺嘌呤、0.5g/l琼脂糖、1mg/l 2,4-D、0.25mg/l NAA、1mg/l BAP

培育培养基：

25mM K-磷酸盐缓冲液pH5.8

2％蔗糖

每25ml培养基1滴吐温20

反应缓冲液：

50mM K-磷酸盐缓冲液pH7.4

10mM氯化2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)(=3.35mg/ml)

每25ml培养基1滴吐温20

种子的灭菌和幼苗的生长

将种子在70％乙醇中浸泡2分钟，然后在含0.1％吐温20的次氯酸钠溶液(具有约6％的活性氯)中表面灭菌15分钟。最后，将这些种子用1升无菌蒸馏水冲洗。1升含约75ml播种培养基的容器(Weck)中放7粒种子。在23℃和30μEinstein/s^-1m^-2及日长16小时下这些种子发芽。

株系N90-740总是包括试验之间的标准化。

下胚轴外植体的预培养

-播种后12-14天，将这些下胚轴切成约7mm段。

25个下胚轴/Optilux陪替氏培养皿(Falcon S1005)

-在培养基A2S上在23-25℃将这些下胚轴外植体培养4天(在30μEinstein/s^-1m^-2下)。

-附注：每株系需要约150-300个下胚轴外植体进行该测定

-将这些下胚轴外植体转移到含30ml培育培养基的Optilux陪替氏培养皿(Falcon S1005)中。

-在24℃下在黑暗中培育约20小时。

TTC-测定

-将150个下胚轴外植体转移到一50ml的Falcon管中。

-用反应缓冲液(不含TTC)冲洗。

-每只管中添加25ml-30ml的反应缓冲液。

管1没有添加TTC

   *用于测定本底吸收

   *每个试验一个株系就足够

管2+10mM TTC

(外植体必需被浸没，但不要真空浸润！)

-上下颠倒管

-在黑暗中在26℃下培育约1小时(不结束反应！)

-用去离子水冲洗下胚轴

-除去水

-在-70℃下冷冻30分钟

在室温下复苏(在黑暗中)

-添加50ml乙醇(工业用)

-通过摇晃1小时提取还原TTC-H

-在485nm下测定提取物的吸光度

附注：还原TTC-H不稳定保持在黑暗中并尽快测定O.D.485

O.D._485(TTC-H)=(O.D.₄₈₅+TTC)-(O.D.₄₈₅-TTC)

-可以通过在不同试验中将N90-740的TTC-还原能力设置为100％来进行不同非依赖性试验的样品间的TTC-还原能力的比较。

-具有高TTC-还原能力的株系生长茂盛，然而具有低TTC-还原能力的株系生长不茂盛。

6.2.拟南芥属健康测定

培养基和反应缓冲液

植物培养基：半浓缩的Murashige和Skoog盐

1.5％蔗糖

pH5.8

0.6％琼脂

→高压灭菌15分钟。

加入经过滤灭菌的-100mg/l肌醇

                -0.5mg/l维生素B6

                -0.5mg/l烟酸

                -1mg/l硫胺素

培育培养基：10mM K-磷酸盐缓冲液pH5.8

        2％蔗糖

        每25ml培养基1滴吐温20

反应缓冲液：50mM K-磷酸盐缓冲液pH7.4

            10mM氯化2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)(=3.35mg/ml)

            每25ml缓冲液1滴吐温20

拟南芥属植物

-拟南芥属种子的灭菌

2分钟70％乙醇

10分钟漂白剂(6％活性氯)+每20ml溶液1滴吐温20

用无菌水冲洗5次

    附注：在2ml eppendorf管中进行灭菌

        拟南芥属种子浸没在管底，通过1ml自动移液器移去液体

-拟南芥属植物的生长

以1粒种子/网格将种子播种在含±100ml植物培养基的“IntergridTissue Culture disks of Falcon”(nr.3025)中。

植物在23℃、40μEinstein s^-1m^-2、16小时光照-8小时黑暗下生长约3周(植物开始形成花蕾)。

→附注：*每株系需要约90-110株植物进行该测定

        *包括用于校准的对照株系(C24；Columbia；…)

预培育

-通过切割根收获拟南芥属枝条(利用剪刀)

立即将每个枝条放入培育培养基中(枝条必需被浸没，但不要真空浸润)

培育培养基：±150ml于“Intergrid Tissue Culture disks ofFalcon”(nr.3025)中

a)培育培养基：用于定量本底吸收(参见TTC-测定)

b)培育培养基

c)培育培养基+2mM烟酰胺

30-35个枝条/陪替氏培养皿(但是对所有株系以及每种条件使用相同量的枝条)

-在24℃下在黑暗中培育±20小时

TTC-测定

-将枝条转移到50ml的Falcon管中

-用反应缓冲液(不含TTC)冲洗

-每只管中添加30-35ml的反应缓冲液

  a)不加TTC(用于本底吸收测定)

  b)和c)+10mM TTC

(枝条必需被浸没，但不要真空浸润！)

-在黑暗中在26℃下培育约2小时(不结束反应！)

-用去离子水冲洗枝条

-除去水

-在-70℃下冷冻30分钟

在室温下复苏(在黑暗中)

-添加50ml乙醇(工业用)

-通过摇晃1小时提取还原TTC-H

-在485nm下测定提取物的吸光度

  附注：还原TTC-H不稳定→保持在黑暗中并尽快测定O.D.₄₈₅

-比较试验株系与对照株系的还原图谱(相对30-35个植物的种群)

    O.D._485(TTC-H)=(O.D.₄₈₅+TTC)-(O.D.₄₈₅-TTC)

-可以通过在不同试验中将对照株系(C24；Columbia；…)的TTC-还原能力设置为100％来进行不同非依赖性试验的样品间的TTC-还原能力的比较。

-具有高TTC-还原能力的株系生长茂盛，然而具有低TTC-还原能力的株系生长不茂盛。

-如果将烟酰胺添加到培育培养基中导致更高TTC-还原能力，说明其健康状况更低(如C24和Columbia所示)。

实施例7：含dsRNA-APP和dsRNA-ZAP构建体的转基因株系的表型分析

计数在花药或花粉特异性启动子的控制下含dsRNA-APP和dsRNA-ZAP的T0-株系的花表型和花粉生存力(Alexander染色(Alexander,1969)和发芽测定)。对拟南芥属来说，通过自花授精或者如果该植物为雄性不育使用未转化野生型植物的花粉通过回交获得T1-子代。对Brassica napus来说，总是使用未转化植物通过回交获得T1-子代。

T1-种子在含卡那霉素的培养基上发芽，之后通过膦丝菌素抗性的氨多孔测定(De Block等人，1995)计数抗性植物。将含有两种T-DNA的一半植物转移到温室中，计数植物的雄性生育力，同时使用另一半通过健康测定定量植物的活力。

对在35S或NOS启动子的控制下含有PCD调节基因的组合(APP/ZAP)的植物来说，在许多转基因株系中观察到高活力。

对在TA29的控制下含有PCD调节基因的组合(APP/ZAP)的植物来说，在许多转基因株系中观察到雄性生育力。

对在NTP303的控制下含有PCD调节基因的组合(APP/ZAP)的植物来说，在许多转基因株系中观察到不育花粉。

实施例8：含PCD调节嵌合基因的植物的表型分析

使用标准重组DNA步骤，通过可操纵地连接以下DNA区构建另一实例p35S::(dsRNA-ZAP)嵌合基因：

·一CaMV 35S2启动区(Odell等人，1985)

·一编码Cab22前导区的DNA (Harpster等人，1988)

·一具有SEQ ID No 10从核苷酸第279位置至核苷酸第1728位置的核苷酸序列的从Hincll位置到SnaBl位置的玉米的编码ZAP2的DNA区

·以逆取向从Hincll位置到EcoRV位置的ZAP2编码区的5’端(具有SEQID No 10从核苷酸第279位置至核苷酸第792位置的核苷酸序列的互补序列)

·一CaMV35S 3’端区(Mogen等人，1990)

将该嵌合基因引入来自与bar标记基因一起的pGSV5(WO 97/13865中所述)的T-DNA载体的T-DNA边界之间的多接头中，并产生T-DNA载体pTYG33，通过所述的电穿孔将其引入土壤杆菌C58C1Rif(pGV4000)。

使用标准重组DNA步骤，通过可操纵地连接以下DNA区构建另一实例pNos::(dsRNA-ZAP)嵌合基因：

·一胭脂氨酸合成酶启动区(Herrera-Estrella等人，1985)

·一编码Cab22前导区的DNA (Harpster等人，1988)

·一具有SEQ ID No 10从核苷酸第279位置至核苷酸第1728位置的核苷酸序列的从Hincll位置到SnaBl位置的玉米的编码ZAP2的DNA区

·以逆取向从Hincll位置到EcoRV位置的ZAP2编码区的5’端(具有SEQID No 10从核苷酸第279位置至核苷酸第792位置的核苷酸序列的互补序列)

·一CaMV35S 3’端区(Mogen等人，1990)

将该嵌合基因引入来自与bar标记基因一起的pGSV5(WO 97/13865中所述)的T-DNA载体的T-DNA边界之间的多接头中，并产生T-DNA载体pTYG34，通过所述的电穿孔将其引入土壤杆菌C58C1Rif(pGV4000)。

使用标准重组DNA步骤，通过可操纵地连接以下DNA区构建另一实例p35S::(dsRNA-APP)嵌合基因：

·一CaMV 35S2启动区(Odell等人，1985)

·一编码Cab22前导区的DNA (Harpster等人，1988)

·一具有SEQ ID No 5从核苷酸第189位置至核苷酸第1349位置的核苷酸序列的从Scal位置到Smal位置的拟南芥的编码APP的DNA区

·以逆取向从Scal位置到Haelll位置的ZAP2编码区的5’端(具有SEQID No 5从核苷酸第189位置至核苷酸第784位置的核苷酸序列的互补序列)

·一CaMV35S 3’端区(Mogen等人，1990)

将该嵌合基因引入来自与bar标记基因一起的pGSV5(WO 97/13865中所述)的T-DNA载体的T-DNA边界之间的多接头中，并产生T-DNA载体pTYG29，通过所述的电穿孔将其引入土壤杆菌C58C1Rif (pGV4000)。

使用标准重组DNA步骤，通过可操纵地连接以下DNA区构建另一实例pNos::(dsRNA-APP)嵌合基因：

·一胭脂氨酸合成酶启动区(Herrera-Estrella等人，1985)

·一编码Cab22前导区的DNA(Harpster等人，1988)

·一具有SEQ ID No 5从核苷酸第189位置至核苷酸第1349位置的核苷酸序列的从Scal位置到Smal位置的拟南芥属的编码APP的DNA区

·以逆取向从Scal位置到Haelll位置的ZAP2编码区的5’端(具有SEQID No 5从核苷酸第189位置至核苷酸第784位置的核苷酸序列的互补序列)

·一CaMV35S 3’端区(Mogen等人，1990)

将该嵌合基因引入来自与bar标记基因一起的pGSV5(WO 97/13865中所述)的T-DNA载体的T-DNA边界之间的多接头中，并产生T-DNA载体pTYG30，通过所述的电穿孔将其引入土壤杆菌C58C1Rif(pGV4000)。

所得土壤杆菌菌株被用于将不同PCD调节基因分别引入实施例4和5所述的Brassica napus和拟南芥(Columbia和C24)植物中。

通过T0子代(T1子代)自花授精获得的转基因拟南芥植物在含膦丝菌素的培养基上发芽。进一步培育抗性转基因植物。

含有基于pTYG33的pNOS::(dsRNA-ZAP)构建体或基于pTYG34的p35S::(dsRNA-ZAP)构建体的转基因T1植物(都来自Columbia或C24)的生长，明显快于通过没有PCD调节嵌合基因的T-DNA载体的T-DNA转化的对照转基因植物的(参见表1)。

通过将小植物漂浮在或10或50mg/L的水杨酸溶液上或作为对照的水上评价拟南芥属T1转基因植物(来自Columbia)的逆境耐性。逆境敏感的植物在培育1-2天之后长出漂白且卷曲的叶，然而耐逆境植物保持完整持续至少5天。另外，含有基于pTYG33的pNOS::(dsRNA-ZAP)构建体或基于pTYG34的p35S::(dsRNA-ZAP)构建体的转基因植物，明显比对照转基因植物更耐逆境(参见表1)。

由通过pTYG29、pTYG30、pTYG33或pTYG34的dsRNA-ZAP或dsRNA-APP转化的Brassica napus获得的抗PPT的转基因愈伤组织，在含50mg/L阿司匹林的培养基上培育2天。2天之后，测定这些愈伤组织的重量并将这些愈伤组织转移到没有阿司匹林的培养基上并且再培育5天。在这5天之后，测定这些愈伤组织的重量，将重量增加以培育2天后的重量的百分比表示。作为对照，将通过没有PCD调节嵌合基因的T-DNA转化的转基因愈伤组织通过相同步骤呈现，只是在2天培育中没有添加阿司匹林。结果汇总于表Ⅱ中，这些结果说明了含有PCD调节嵌合基因的转基因Brassica napus细胞比对照细胞耐逆境。

表1：转基因拟南芥属植物(T1子代)的评价

嵌合PCD调节基因	生长(Columbia和C24)	逆境耐性(Columbia)
			pNOS::(dsRNA-ZAP)	+++	++
p35S::(dsRNA-ZAP)	++	+
			pNOS::(dsRNA-APP)	+	+/-
p35S::(dsRNA-APP)	+	-
			对照	+	+/-(**)

**A．thalina Columbia对阿司匹林有一定程度的天然耐性。

表2：在阿司匹林上培育之后转基因Brassica calli的再生长

嵌合PCD调节基因	重量增加(％)
		pNOS::(dsRNA-ZAP)	80
p35S::(dsRNA-ZAP)	90
		pNOS::(dsRNA-APP)	75
p35S::(dsRNA-APP)	85
		对照	70

平均标准误差＜5％。

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                                                      Met Ala

                                                        1gcg ccg cca aag gcg tgg aag gcg gag tat gcc aag tct ggg cgg gcc   166Ala Pro Pro Lys Ala Trp Lys Ala Glu Tyr Ala Lys Ser Gly Arg Ala

      5                  10                  15tcg tgc aag tca tgc cgg tcc cct atc gcc aag gac cag ctc cgt ctt   214Ser Cys Lys Ser Cys Arg Ser Pro Ile Ala Lys Asp Gln Leu Arg Leu

 20                  25                  30ggc aag atg gtt cag gcg tca cag ttc gac ggc ttc atg ccg atg tgg   262Gly Lys Met Val Gln Ala Ser Gln Phe Asp Gly Phe Met Pro Met Trp35                  40                  45                  50aac cat gcc agc gtt gac gat gtt gaa ggg ata gat gca ctt aga tgg   310Asn Mis Ala Ser Val Asp Asp Val Glu Gly Ile Asp Ala Leu Arg Trp

             55                  60                  65gat gat caa gag aag ata cga aac tac gtt ggg agt gcc tca gct ggt    358Asp Asp Gln Glu Lys Ile Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ala Ser Ala Gly

         70                  75                  80aca agt tct aca gct gct cct cct gag aaa tgt aca att gag att gct    406Thr Ser Ser Thr Ala Ala Pro Pro Glu Lys Cys Thr Ile Glu Ile Ala

     85                  90                  95cca tct gcc cgt act tca tgt aga cga tgc agt gaa aag att aca aaa    454Pro Ser Ala Arg Thr Ser Cys Arg Arg Cys Ser Glu Lys Ile Thr Lys

100                 105                 110gga tcg gtc cgt ctt tca gct aag ctt gag agt gaa ggt ccc aag ggt    502Gly Ser Val Arg Leu Ser Ala Lys Leu Glu Ser Glu Gly Pro Lys Gly115                 120                125                  130ata cca tgg tat cat gcc aac tgt ttc ttt gag gta tcc ccg tct gca    550Ile Pro Trp Tyr His Ala Asn Cys Phe Phe Glu Val Ser Pro Ser Ala

            135                 140                 145act gtt gag aag ttc tca ggc tgg gat act ttg tcc gat gag gat aag    598Thr Val Glu Lys Phe Ser Gly Trp Asp Thr Leu Ser Asp Glu Asp Lys

        150                 155                 160aga acc atg ctc gat ctt gtt aaa aaa gat gtt ggc aac aat gaa caa    646Arg Thr Met Leu Asp Leu Val Lys Lys Asp Val Gly Asn Asn Glu Gln

    165                 170                 175aat aag ggt tcc aag cgc aag aaa agt gaa aat gat att gat agc tac    694Asn Lys Gly Ser Lys Arg Lys Lys Ser Glu Asn Asp Ile Asp Ser Tyr

180                 185                 190aaa tcc gcc agg tta gat gaa agt aca tct gaa ggt aca gtg cga aac    742Lys Ser Ala Arg Leu Asp Glu Ser Thr Ser Glu Gly Thr Val Arg Asn195                 200                 205                 210aaa ggg caa ctt gta gac cca cgt ggt tcc aat act agt tca gct gat    790Lys Gly Gln Leu Val Asp Pro Arg Gly Ser Asn Thr Ser Ser Ala Asp

            215                 220                 225atc caa cta aag ctt aag gag caa agt gac aca ctt tgg aag tta aag    838Ile Gln Leu Lys Leu Lys Glu Gln Ser Asp Thr Leu Trp Lys Leu Lys

        230                 235                 240gat gga ctt aag act cat gta tcg gct gct gaa tta agg gat atg ctt    886Asp Gly Leu Lys Thr Mis Val Ser Ala Ala Glu Leu Arg Asp Met Leu

    245                 250                 255gag gct aat ggg cag gat aca tca gga cca gaa agg cac cta ttg gat    934Glu Ala Asn Gly Gln Asp Thr Ser Gly Pro Glu Arg His Leu Leu Asp

260                 265                 270cgc tgt gcg gat gga atg ata ttt gga gcg ctg ggt cct tgc cca gtc    982Arg Cys Ala Asp Gly Met Ile Phe Gly Ala Leu Gly Pro Cys Pro Val275                 280                 285                 290tgt gct aat ggc atg tac tat tat aat ggt cag tac caa tgc agt ggt    1030Cys Ala Asn Gly Met Tyr Tyr Tyr Asn Gly Gln Tyr Gln Cys Ser Gly

            295                 300                 305aat gtg tca gag tgg tcc aag tgt aca tac tct gcc aca gaa cct gtc    1078Asn Val Ser Glu Trp Ser Lys Cys Thr Tyr Ser Ala Thr Glu Pro Val

        310                 315                 320cgc gtt aag aag aag tgg caa att cca cat gga aca aag aat gat tac    1126Arg Val Lys Lys Lys Trp Gln Ile Pro His Gly Thr Lys Asn Asp Tyr

    325                 330                 335ctt atg aag tgg ttc aaa tct caa aag gtt aag aaa cca gag agg gtt    1174Leu Met Lys Trp Phe Lys Ser Gln Lys Val Lys Lys Pro Glu Arg Val

340                 345                 350ctt cca cca atg tca cct gag aaa tct gga agt aaa gca act cag aga    1222Leu Pro Pro Met Ser Pro Glu Lys Ser Gly Ser Lys Ala Thr Gln Arg355                 360                 365                 370aca tca ttg ctg tct tct aaa ggg ttg gat aaa tta agg ttt tct gtt    1270Thr Ser Leu Leu Ser Ser Lys Gly Leu Asp Lys Leu Arg Phe Ser Val

            375                 380                 385gta gga caa tca aaa gaa gca gca aat gag tgg att gag aag ctc aaa    1318Val Gly Gln Ser Lys Glu Ala Ala Asn Glu Trp Ile Glu Lys Leu Lys

        390                 395                 400ctt gct ggt gcc aac ttc tat gcc agg gtt gtc aaa gat att gat tgt    1366Leu Ala Gly Ala Asn Phe Tyr Ala Arg Val Val Lys Asp Ile Asp Cys

    405                 410                 415tta att gca tgt ggt gag ctc gac aat gaa aat gct gaa gtc agg aaa    1414Leu Ile Ala Cys Gly Glu Leu Asp Asn Glu Asn Ala Glu Val Arg Lys

420                 425                 430gca agg agg ctg aag ata cca att gta agg gag ggt tac att gga gaa    1462Ala Arg Arg Leu Lys Ile Pro Ile Val Arg Glu Gly Tyr Ile Gly Glu435                 440                 445                 450tgt gtt aaa aag aac aaa atg ctg cca ttt gat ttg tat aaa cra gag    1510Cys Val Lys Lys Asn Lys Met Leu Pro Phe Asp Leu Tyr Lys Leu Glu

            455                 460                 465aat gcc tta gag tcc tca aaa ggc agt act gtc act gtt aaa gtt aag    1558Asn Ala Leu Glu Ser Ser Lys Gly Ser Thr Val Thr Val Lys Val Lys

        470                 475                 480ggc cga agt gct gtt cat gag tcc tct ggt ttg caa gat act gct cac    1606Gly Arg Ser Ala Val His Glu Ser Ser Gly Leu Gln Asp Thr Ala His

    485                 490                 495att ctt gaa gat ggg aaa agc ata tac aat gca acc tta aac atg tct    1654Ile Leu Glu Asp Gly Lys Ser Ile Tyr Asn Ala Thr Leu Asn Met Ser

500                 505                 510gac ctg gca cta ggt gtg aac agc tac tat gta ctc cag atc att gaa    1702Asp Leu Ala Leu Gly Val Asn Ser Tyr Tyr Val Leu Gln Ile Ile Glu515                 520                 525                 530cag gat gat ggg tct gag tgc tac gta ttt cgt aag tgg gga cgg gtt    1750Gln Asp Asp Gly Ser Glu Cys Tyr Val Phe Arg Lys Trp Gly Arg Val

            535                 540                 545ggg agt gag aaa att gga ggg caa aaa ctg gag gag atg tca aaa act    1798Gly Ser Glu Lys Ile Gly Gly Gln Lys Leu Glu Glu Met Ser Lys Thr

        550                 555                 560gag gca atc aag gaa ttc aaa aga tta ttt ctt gag aag act gga aac    1846Glu Ala Ile Lys Glu Phe Lys Arg Leu Phe Leu Glu Lys Thr Gly Asn

    565                 570                 575tca tgg gaa gct tgg gaa tgt aaa acc aat ttt cgg aag cag cct ggg    1894Ser Trp Glu Ala Trp Glu Cys Lys Thr Asn Phe Arg Lys Gln Pro Gly

580                 585                 590aga ttt tac cca ctt gat gtt gat tat ggt gtt aag aaa gca cca aaa    1942Arg Phe Tyr Pro Leu Asp Val Asp Tyr Gly Val Lys Lys Ala Pro Lys595                 600                 605                 610cgg aaa gat atc agt gaa atg aaa agt tct ctt gct cct caa ttg cta    1990Arg Lys Asp Ile Ser Glu Met Lys Ser Ser Leu Ala Pro Gln Leu Leu

            615                 620                 625gaa ctc atg aag atg ctt ttc aat gtg gag aca tat aga gct gct atg    2038Glu Leu Met Lys Met Leu Phe Asn Val Glu Thr Tyr Arg Ala Ala Met

        630                 635                 640atg gaa ttt gaa att aat atg tca gaa atg cct ctt ggg aag cta agc    2086Met Glu Phe Glu Ile Asn Met Ser Glu Met Pro Leu Gly Lys Leu Ser

    645                 650                 655aag gaa aat att gag aaa gga ttt gaa gca tta act gag ata cag aat    2134Lys Glu Asn Ile Glu Lys Gly Phe Glu Ala Leu Thr Glu Ile Gln Asn

660                 665                 670tta ttg aag gac acc gct gat caa gca ctg gct gtt aga gaa agc tta    2182Leu Leu Lys Asp Thr Ala Asp Gln Ala Leu Ala Val Arg Glu Ser Leu675                 680                 685                 690att gtt gct gcg agc aat cgc ttt ttc act ctt atc cct tct att cat    2230Ile Val Ala Ala Ser Asn Arg Phe Phe Thr Leu Ile Pro Ser Ile His

            695                 700                 705cct cat att ata cgg gat gag gat gat ttg atg atc aaa gcg aaa atg    2278Pro His Ile Ile Arg Asp Glu Asp Asp Leu Met Ile Lys Ala Lys Met

        710                 715                 720ctt gaa gct ctg cag gat att gaa att gct tca aag ata gtt ggc ttc    2326Leu Glu Ala Leu Gln Asp Ile Glu Ile Ala Ser Lys Ile Val Gly Phe

    725                 730                735gat agc gac agt gat gaa tct ctt gat gat aaa tat atg aaa ctt cac    2374Asp Ser Asp Ser Asp Glu Ser Leu Asp Asp Lys Tyr Met Lys Leu His

740                 745                 750tgt gac atc acc ccg ctg gct cac gat agt gaa gat tac aag tta att    2422Cys Asp Ile Thr Pro Leu Ala His Asp Ser Glu Asp Tyr Lys Leu Ile755                 760                 765                 770gag cag tat ctc ctc aac aca cat gct cct act cac aag gac tgg tcg    2470Glu Gln Tyr Leu Leu Asn Thr His Ala Pro Thr His Lys Asp Trp Ser

            775                 780                 785ctg gaa ctg gag gaa gtt ttt tca ctt gat cga gat gga gaa ctt aat    2518Leu Glu Leu Glu Glu Val Phe Ser Leu Asp Arg Asp Gly Glu Leu Asn

        790                 795                 800aag tac tca aga tat aaa aat aat ctg cat aac aag atg cta tta tgg    2566Lys Tyr Ser Arg Tyr Lys Asn Asn Leu His Asn Lys Met Leu Leu Trp

    805                 810                 815cac ggt tca agg ttg acg aat ttt gtg gga att ctt agt caa ggg cta    2614Mis Gly Ser Arg Leu Thr Asn Phe Val Gly Ile Leu Ser Gln Gly Leu

820                 825                 830aga att gca cct cct gag gca cct gtt act ggc tat atg ttc ggc aaa    2662Arg Ile Ala Pro Pro Glu Ala Pro Val Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys835                 840                 845                 850ggc ctc tac ttt gca gat cta gta agc aag agc gca caa tac tgt tat    2710Gly Leu Tyr Phe Ala Asp Leu Val Ser Lys Ser Ala Gln Tyr Cys Tyr

            855                 860                 865gtg gat agg aat aat cct gta ggt ttg atg ctt ctt tct gag gtt gct    2758Val Asp Arg Asn Asn Pro Val Gly Leu Met Leu Leu Ser Glu Val Ala

        870                 875                 880tta gga gac atg tat gaa cta aag aaa gcc acg tcc atg gac aaa cct    2806Leu Gly Asp Met Tyr Glu Leu Lys Lys Ala Thr Ser Met Asp Lys Pro

    885                 890                 895cca aga ggg aag cat tcg acc aag gga tta ggc aaa acc gtg cca ctg    2854Pro Arg Gly Lys His Ser Thr Lys Gly Leu Gly Lys Thr Val Pro Leu

900                 905                 910gag tca gag ttt gtg aag tgg agg gat gat gtc gta gtt ccc tgc ggc    2902Glu Ser Glu Phe Val Lys Trp Arg Asp Asp Val Val Val Pro Cys Gly915                 920                 925                 930aag ccg gtg cca tca tca att agg agc tct gaa ctc atg tac aat gag    2950Lys Pro Val Pro Ser Ser Ile Arg Ser Ser Glu Leu Met Tyr Asn Glu

            935                 940                 945tac atc gtc tac aac aca tcc cag gtg aag atg cag ttc ttg ctg aag    2998Tyr Ile Val Tyr Asn Thr Ser Gln Val Lys Met Gln Phe Leu Leu Lys

        950                 955                 960gtg cgt ttc cat cac aag agg tag ctgggagact aggcaagtag agttggaagg   3052Val Arg Phe His His Lys Arg

    965                 970tagagaagca gagttaggcg atgcctcttt tggtattatt agtaagcctg gcatgtattt  3112atgggtgctc gcgcttgatc cattttggta agtgttgctt gggcatcagc gcgaatagca  3172ccaatcacac acttttacct aatgacgttt tactgtata                         3211<210>2<211>969<212>PRT<213>Zea mays<400>2Met Ala Ala Pro Pro Lys Ala Trp Lys Ala Glu Tyr Ala Lys Ser Gly1               5                  10                  15Arg Ala Ser Cys Lys Ser Cys Arg Ser Pro Ile Ala Lys Asp Gln Leu

         20                  25                  30Arg Leu Gly Lys Met Val Gln Ala Ser Gln Phe Asp Gly Phe Met Pro

     35                  40                  45Met Trp Asn His Ala Ser Val Asp Asp Val Glu Gly Ile Asp Ala Leu

 50                  55                  60Arg Trp Asp Asp Gln Glu Lys Ile Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ala Ser65                  70                  75                  80Ala Gly Thr Ser Ser Thr Ala Ala Pro Pro Glu Lys Cys Thr Ile Glu

             85                  90                  95Ile Ala Pro Ser Ala Arg Thr Ser Cys Arg Arg Cys Ser Glu Lys Ile

        100                 105                 110Thr Lys Gly Ser Val Arg Leu Ser Ala Lys Leu Glu Ser Glu Gly Pro

    115                 120                 125Lys Gly Ile Pro Trp Tyr His Ala Asn Cys Phe Phe Glu Val Ser Pro

130                 135                 140Ser Ala Thr Val Glu Lys Phe Ser Gly Trp Asp Thr Leu Ser Asp Glu145                 150                 155                 160Asp Lys Arg Thr Met Leu Asp Leu Val Lys Lys Asp Val Gly Asn Asn

            165                 170                 175Glu Gln Asn Lys Gly Ser Lys Arg Lys Lys Ser Glu Asn Asp Ile Asp

        180                 185                 190Ser Tyr Lys Ser Ala Arg Leu Asp Glu Ser Thr Ser Glu Gly Thr Val

    195                 200                 205Arg Asn Lys Gly Gln Leu Val Asp Pro Arg Gly Ser Asn Thr Ser Ser

210                 215                 220Ala Asp Ile Gln Leu Lys Leu Lys Glu Gln Ser Asp Thr Leu Trp Lys225                 230                 235                 240Leu Lys Asp Gly Leu Lys Thr His Val Ser Ala Ala Glu Leu Arg Asp

            245                 250                 255Met Leu Glu Ala Asn Gly Gln Asp Thr Ser Gly Pro Glu Arg His Leu

        260                 265                 270Leu Asp Arg Cys Ala Asp Gly Met Ile Phe Gly Ala Leu Gly Pro Cys

    275                 280                 285

Pro Val Cys Ala Asn Gly Met Tyr Tyr Tyr Asn Gly Gln Tyr Gln Cys

290                 295                 300Ser Gly Asn Val Ser Glu Trp Ser Lys Cys Thr Tyr Ser Ala Thr Glu305                 310                 315                 320Pro Val Arg Val Lys Lys Lys Trp Gln Ile Pro His Gly Thr Lys Asn

            325                 330                 335Asp Tyr Leu Met Lys Trp Phe Lys Ser Gln Lys Val Lys Lys Pro Glu

        340                 345                 350Arg Val Leu Pro Pro Met Ser Pro Glu Lys Ser Gly Ser Lys Ala Thr

    355                 360                 365Gln Arg Thr Ser Leu Leu Ser Ser Lys Gly Leu Asp Lys Leu Arg Phe

370                 375                 380Ser Val Val Gly Gln Ser Lys Glu Ala Ala Asn Glu Trp Ile Glu Lys385                 390                 395                 400Leu Lys Leu Ala Gly Ala Asn Phe Tyr Ala Arg Val Val Lys Asp Ile

            405                 410                 415Asp Cys Leu Ile Ala Cys Gly Glu Leu Asp Asn Glu Asn Ala Glu Val

        420                 425                 430Arg Lys Ala Arg Arg Leu Lys Ile Pro Ile Val Arg Glu Gly Tyr Ile

    435                 440                 445Gly Glu Cys Val Lys Lys Asn Lys Met Leu Pro Phe Asp Leu Tyr Lys

450                 455                 460Leu Glu Asn Ala Leu Glu Ser Ser Lys Gly Ser Thr Val Thr Val Lys465                 470                 475                 480Val Lys Gly Arg Ser Ala Val His Glu Ser Ser Gly Leu Gln Asp Thr

            485                 490                 495Ala Mis Ile Leu Glu Asp Gly Lys Ser Ile Tyr Asn Ala Thr Leu Asn

        500                 505                 510Met Ser Asp Leu Ala Leu Gly Val Asn Ser Tyr Tyr Val Leu Gln Ile

    515                 520                 525Ile Glu Gln Asp Asp Gly Ser Glu Cys Tyr Val Phe Arg Lys Trp Gly

530                 535                 540Arg Val Gly Ser Glu Lys Ile Gly Gly Gln Lys Leu Glu Glu Met Ser545                 550                 555                 560Lys Thr Glu Ala Ile Lys Glu Phe Lys Arg Leu Phe Leu Glu Lys Thr

            565                 570                 575Gly Asn Ser Trp Glu Ala Trp Glu Cys Lys Thr Asn Phe Arg Lys Gln

        580                 585                 590Pro Gly Arg Phe Tyr Pro Leu Asp Val Asp Tyr Gly Val Lys Lys Ala

    595                 600                 605Pro Lys Arg Lys Asp Ile Ser Glu Met Lys Ser Ser Leu Ala Pro Gln

610                 615                 620Leu Leu Glu Leu Met Lys Met Leu Phe Asn Val Glu Thr Tyr Arg Ala625                 630                 635                 640Ala Met Met Glu Phe Glu Ile Asn Met Ser Glu Met Pro Leu Gly Lys

            645                 650                 655Leu Ser Lys Glu Asn Ile Glu Lys Gly Phe Glu Ala Leu Thr Glu Ile

        660                 665                 670Gln Asn Leu Leu Lys Asp Thr Ala Asp Gln Ala Leu Ala Val Arg Glu

    675                 680                 685Ser Leu Ile Val Ala Ala Ser Asn Arg Phe Phe Thr Leu Ile Pro Ser

690                 695                 700Ile His Pro His Ile Ile Arg Asp Glu Asp Asp Leu Met Ile Lys Ala705                 710                 715                 720Lys Met Leu Glu Ala Leu Gln Asp Ile Glu Ile Ala Ser Lys Ile Val

            725                 730                 735Gly Phe Asp Ser Asp Ser Asp Glu Ser Leu Asp Asp Lys Tyr Met Lys

        740                 745                 750Leu His Cys Asp Ile Thr Pro Leu Ala His Asp Ser Glu Asp Tyr Lys

    755                 760                 765Leu Ile Glu Gln Tyr Leu Leu Asn Thr His Ala Pro Thr His Lys Asp

770                 775                 780Trp Ser Leu Glu Leu Glu Glu Val Phe Ser Leu Asp Arg Asp Gly Glu785                 790                 795                 800Leu Asn Lys Tyr Ser Arg Tyr Lys Asn Asn Leu His Asn Lys Met Leu

            805                 810                 815Leu Trp His Gly Ser Arg Leu Thr Asn Phe Val Gly Ile Leu Ser Gln

        820                 825                 830Gly Leu Arg Ile Ala Pro Pro Glu Ala Pro Val Thr Gly Tyr Met Phe

    835                 840                 845Gly Lys Gly Leu Tyr Phe Ala Asp Leu Val Ser Lys Ser Ala Gln Tyr

850                 855                 860Cys Tyr Val Asp Arg Asn Asn Pro Val Gly Leu Met Leu Leu Ser Glu865                 870                 875                 880Val Ala Leu Gly Asp Met Tyr Glu Leu Lys Lys Ala Thr Ser Met Asp

            885                 890                 895Lys Pro Pro Arg Gly Lys His Ser Thr Lys Gly Leu Gly Lys Thr Val

        900                 905                 910Pro Leu Glu Ser Glu Phe Val Lys Trp Arg Asp Asp Val Val Val Pro

    915                 920                 925Cys Gly Lys Pro Val Pro Ser Ser Ile Arg Ser Ser Glu Leu Met Tyr

930                 935                 940Asn Glu Tyr Ile Val Tyr Asn Thr Ser Gln Val Lys Met Gln Phe Leu945                 950                 955                 960Leu Lys Val Arg Phe His His Lys Arg

            965<210>3<211>2295<212>DNA<213>Zea mays<220><221>CDS<222>(107)..(2068)<400>3tgacctgttc catcccgcca gcccttccgc tcccacgacc caaccccact gcccggagcc  60cccgagcctt ctcgaatctt gcgagaaccc caggggcgag gagcag atg tcg gcg     115

                                               Met Ser Ala

                                                 1agg cta cgg gtg gcg gac gtc cgc gcg gag ctt cag cgc cgc ggc ctc    163Arg Leu Arg Val Ala Asp Val Arg Ala Glu Leu Gln Arg Arg Gly Leu

  5                  10                  15gat gta tcc ggc acc aag cct gct ctc gtg cgg agg ctg gac gcc gca    211Asp Val Ser Gly Thr Lys Pro Ala Leu Val Arg Arg Leu Asp Ala Ala20                  25                  30                  35att tgc gag gcg gag aag gcc gtg gtg gct gct gcg cca acc agt gtg    259Ile Cys Glu Ala Glu Lys Ala Val Val Ala Ala Ala Pro Thr Ser Val

             40                  45                  50gca aat ggg tat gac gta gcc gta gat ggc aaa agg aac tgc ggg aat    307Ala Asn Gly Tyr Asp Val Ala Val Asp Gly Lys Arg Asn Cys Gly Asn

         55                  60                  65aat aag agg aaa agg tcc ggg gat ggg ggt gaa gag gga aac ggc gat    355Asn Lys Arg Lys Arg Ser Gly Asp Gly Gly Glu Glu Gly Asn Gly Asp

     70                  75                  80acg tgt aca gat gtg aca aaa cta gag ggc atg agc tat cgt gag ctg    403Thr Cys Thr Asp Val Thr Lys Leu Glu Gly Met Ser Tyr Arg Glu Leu

 85                  90                  95cag gga ttg gcc aag gca cgt gga gtt gcg gca aat ggg ggc aag aaa    451Gln Gly Leu Ala Lys Ala Arg Gly Val Ala Ala Asn Gly Gly Lys Lys100                 105                 110             115gat gtt atc cag agg ttg ctc tcg gcg act gct ggt cct gct gca gtt    499Asp Val Ile Gln Arg Leu Leu Ser Ala Thr Ala Gly Pro Ala Ala Val

            120                 125                 130gca gat ggt ggt cct ctg ggc gcc aag gaa gtc ata aaa ggt ggt gat    547Ala Asp Gly Gly Pro Leu Gly Ala Lys Glu Val Ile Lys Gly Gly Asp

        135                 140                 145gag gag gtt gag gtg aaa aag gag aag atg gtt act gcc acg aag aag   595Glu Glu Val Glu Val Lys Lys Glu Lys Met Val Thr Ala Thr Lys Lys

    150                 155                 160gga gct gca gtg ctg gat cag cac att ccc gat cac ata aaa gtg aac   643Gly Ala Ala Val Leu Asp Gln His Ile Pro Asp His Ile Lys Val Asn

165                 170                 175tat cat gtc ttg caa gtg ggc gat gaa atc tat gat gcc acc ttg aac   691Tyr His Val Leu Gln Val Gly Asp Glu Ile Tyr Asp Ala Thr Leu Asn180                 185                 190                 195cag act aat gtt gga gac aac aac aat aag ttc tat atc att caa gtt   739Gln Thr Asn Val Gly Asp Asn Asn Asn Lys Phe Tyr Ile Ile Gln Val

            200                 205                 210tta gaa tct gat gct ggt gga agc ttt atg gtt tac aat aga tgg gga   787Leu Glu Ser Asp Ala Gly Gly Ser Phe Met Val Tyr Asn Arg Trp Gly

        215                 220                 225aga gtt ggg gta cga ggt caa gat aaa cta cat ggt ccc tcc cca aca   835Arg Val Gly Val Arg Gly Gln Asp Lys Leu His Gly Pro Ser Pro Thr

    230                 235                 240cga gac caa gca ata tat gaa ttt gag ggg aag ttc cac aac aaa acc   883Arg Asp Gln Ala Ile Tyr Glu Phe Glu Gly Lys Phe His Asn Lys Thr

245                 250                 255aat aat cat tgg tct gat cgc aag aac ttc aaa tgt tat gca aag aaa   931Asn Asn His Trp Ser Asp Arg Lys Asn Phe Lys Cys Tyr Ala Lys Lys260                 265                 270                 275tac act tgg ctt gaa atg gat tat ggt gaa act gag aaa gaa ara gag   979Tyr Thr Trp Leu Glu Met Asp Tyr Gly Glu Thr Glu Lys Glu Ile Glu

            280                 285                 290aaa ggt tcc att act gat cag ata aaa gag aca aaa ctt gaa act aga   1027Lys Gly Ser Ile Thr Asp Gln Ile Lys Glu Thr Lys Leu Glu Thr Arg

        295                 300                 305att gcg cag ttc ata tcc ctg atc tgc aat att agc atg atg aag caa   1075Ile Ala Gln Phe Ile Ser Leu Ile Cys Asn Ile Ser Met Met Lys Gln

    310                 315                 320aga atg gtg gaa ata ggt tat aat gct gaa aag ctt ccc ctt gga aag   1123Arg Met Val Glu Ile Gly Tyr Asn Ala Glu Lys Leu Pro Leu Gly Lys

325                 330                 335cta agg aaa gct aca ata ctt aag ggt tat cat gtt ttg aaa agg ata   1171Leu Arg Lys Ala Thr Ile Leu Lys Gly Tyr His Val Leu Lys Arg Ile340                 345                 350                 355tcc gat gtt att tca aag gcg gac agg aga cat ctt gag caa ttg act   1219Ser Asp Val Ile Ser Lys Ala Asp Arg Arg His Leu Glu Gln Leu Thr

            360                 365                 370ggg gaa ttc tac acc gtg att cct cat gac ttt ggt ttc aga aag atg   1267Gly Glu Phe Tyr Thr Val Ile Pro His Asp Phe Gly Phe Arg Lys Met

        375                 380                 385cgt gaa ttt att atc gat act cct cag aaa cta aaa gct aag ctg gag   1315Arg Glu Phe Ile Ile Asp Thr Pro Gln Lys Leu Lys Ala Lys Leu Glu

    390                 395                 400atg gtt gaa gcc ctt ggt gag att gaa att gca act aaa ctt ttg gag   1363Met Val Glu Ala Leu Gly Glu Ile Glu Ile Ala Thr Lys Leu Leu Glu

405                 410                 415gat gat tca agt gac cag gat gat ccg ttg tat gct cga tac aag caa   1411Asp Asp Ser Ser Asp Gln Asp Asp Pro Leu Tyr Ala Arg Tyr Lys Gln420                 425                 430                 435ctt cat tgt gat ttc aca cct ctt gaa gct gat tca gat gag tac tct   1459Leu His Cys Asp Phe Thr Pro Leu Glu Ala Asp Ser Asp Glu Tyr Ser

            440                 445                 450atg ata aaa tca tat ttg aga aat aca cat gga aaa aca cac tct ggt   1507Met Ile Lys Ser Tyr Leu Arg Asn Thr His Gly Lys Thr His Ser Gly

        455                 460                 465tat acg gtg gac ata gtg caa ata ttt aag gtt tca agg cat ggt gaa   1555Tyr Thr Val Asp Ile Val Gln Ile Phe Lys Val Ser Arg His Gly Glu

    470                 475                 480aca gag cga ttt caa aaa ttt gct agt aca aga aat agg atg ctt ttg   1603Thr Glu Arg Phe Gln Lys Phe Ala Ser Thr Arg Asn Arg Met Leu Leu

485                 490                 495tgg cat ggt tct cgg ttg agc aac tgg gct ggg atc ctt tct cag ggt   1651Trp His Gly Ser Arg Leu Ser Asn Trp Ala Gly Ile Leu Ser Gln Gly500                 505                 510                 515ctg cga atc gct cct cct gaa gca cct gtt act ggt tac atg ttt ggc   1699Leu Arg Ile Ala Pro Pro Glu Ala Pro Val Thr Gly Tyr Met Phe Gly

            520                 525                 530aag ggt gtt tac ttt gct gac atg ttt tca aag agt gca aac tat tgc    1747Lys Gly Val Tyr Phe Ala Asp Met Phe Ser Lys Ser Ala Asn Tyr Cys

        535                 540                 545tac gcc tct gaa gca tgt aga tct gga gta ctg ctt tta tgt gag gtt    1795Tyr Ala Ser Glu Ala Cys Arg Ser Gly Val Leu Leu Leu Cys Glu Val

    550                 555                 560gca ttg ggc gat atg aat gag cta ctg aat gca gat tac gat gct aat    1843Ala Leu Gly Asp Met Asn Glu Leu Leu Asn Ala Asp Tyr Asp Ala Asn

565                 570                 575aac ctg ccc aaa gga aaa tta aga tcc aag gga gtt ggt caa aca gca    1891Asn Leu Pro Lys Gly Lys Leu Arg Ser Lys Gly Val Gly Gln Thr Ala580                 585                 590                 595cct aac atg gtc gag tct aag gtc gct gac gat ggt gtt gtt gtt ccc    1939Pro Asn Met Val Glu Ser Lys Val Ala Asp Asp Gly Val Val Val Pro

            600                 605                 610ctt ggc gaa ccc aaa cag gaa cct tcc aaa agg ggt ggc ttg ctt tat    1987Leu Gly Glu Pro Lys Gln Glu Pro Ser Lys Arg Gly Gly Leu Leu Tyr

        615                 620                 625aat gag tac ata gtg tac aac gta gac cag ata aga atg cgg tat gtc    2035Asn Glu Tyr Ile Val Tyr Asn Val Asp Gln Ile Arg Met Arg Tyr Val

    630                 635                 640tta cat gtt aac ttc aat ttc aag aga cgg tag atgttgcaaa gagctgaaac  2088Leu His Val Asn Phe Asn Phe Lys Arg Arg

645                 650tgttgctgag atcttagcag aacatatgtg gacttatagc accaggtgcc ctcagcctca  2148ttttctgagc aaatttggta gcctttgcat ttcgattttg gtttcagctt ctagccccat  2208tgatgattga tactgagtgt atatatgaac cattgatatc caccttccat gtacttaagt  2268ttttttaaca tgtcccatgc ataataa                                      2295<210>4<211>653<212>PRT<213>Zea mays<400>4Met Ser Ala Arg Leu Arg Val Ala Asp Val Arg Ala Glu Leu Gln Arg  1               5                  10                  15Arg Gly Leu Asp Val Ser Gly Thr Lys Pro Ala Leu Val Arg Arg Leu

         20                  25                  30Asp Ala Ala Ile Cys Glu Ala Glu Lys Ala Val Val Ala Ala Ala Pro

     35                  40                  45Thr Ser Val Ala Asn Gly Tyr Asp Val Ala Val Asp Gly Lys Arg Asn

 50                  55                  60Cys Gly Asn Asn Lys Arg Lys Arg Ser Gly Asp Gly Gly Glu Glu Gly65                  70                  75                  80Asn Gly Asp Thr Cys Thr Asp Val Thr Lys Leu Glu Gly Met Ser Tyr

             85                  90                  95Arg Glu Leu Gln Gly Leu Ala Lys Ala Arg Gly Val Ala Ala Asn Gly

        100                 105                 110Gly Lys Lys Asp Val Ile Gln Arg Leu Leu Ser Ala Thr Ala Gly Pro

    115                 120                 125Ala Ala Val Ala Asp Gly Gly Pro Leu Gly Ala Lys Glu Val Ile Lys

130                 135                 140Gly Gly Asp Glu Glu Val Glu Val Lys Lys Glu Lys Met Val Thr Ala145                 150                 155                 160Thr Lys Lys Gly Ala Ala Val Leu Asp Gln His Ile Pro Asp His Ile

            165                 170                 175Lys Val Asn Tyr His Val Leu Gln Val Gly Asp Glu Ile Tyr Asp Ala

        180                 185                 190Thr Leu Asn Gln Thr Asn Val Gly Asp Asn Asn Asn Lys Phe Tyr Ile

    195                 200                 205Ile Gln Val Leu Glu Ser Asp Ala Gly Gly Ser Phe Met Val Tyr Asn

210                 215                 220Arg Trp Gly Arg Val Gly Val Arg Gly Gln Asp Lys Leu His Gly Pro225                 230                 235                 240Ser Pro Thr Arg Asp Gln Ala Ile Tyr Glu Phe Glu Gly Lys Phe His

            245                 250                 255Asn Lys Thr Asn Asn His Trp Ser Asp Arg Lys Asn Phe Lys Cys Tyr

        260                 265                 270Ala Lys Lys Tyr Thr Trp Leu Glu Met Asp Tyr Gly Glu Thr Glu Lys

    275                 280                 285Glu Ile Glu Lys Gly Ser Ile Thr Asp Gln Ile Lys Glu Thr Lys Leu

290                 295                 300Glu Thr Arg Ile Ala Gln Phe Ile Ser Leu Ile Cys Asn Ile Ser Met305                 310                 315                 320Met Lys Gln Arg Met Val Glu Ile Gly Tyr Asn Ala Glu Lys Leu Pro

            325                 330                 335Leu Gly Lys Leu Arg Lys Ala Thr Ile Leu Lys Gly Tyr His Val Leu

        340                 345                 350Lys Arg Ile Ser Asp Val Ile Ser LysAla Asp Arg Arg His Leu Glu

    355                 360                365Gln Leu Thr Gly Glu Phe Tyr Thr Val Ile Pro His Asp Phe Gly Phe

370                 375                 380Arg Lys Met Arg Glu Phe Ile Ile Asp Thr Pro Gln Lys Leu Lys Ala385                 390                 395                 400Lys Leu Glu Met Val Glu Ala Leu Gly Glu Ile Glu Ile Ala Thr Lys

            405                 410                 415Leu Leu Glu Asp Asp Ser Ser Asp Gln Asp Asp Pro Leu Tyr Ala Arg

        420                 425                 430Tyr Lys Gln Leu His Cys Asp Phe Thr Pro Leu Glu Ala Asp Ser Asp

    435                 440                 445Glu Tyr Ser Met Ile Lys Ser Tyr Leu Arg Asn Thr His Gly Lys Thr

450                 455                 460His Ser Gly Tyr Thr Val Asp Ile Val Gln Ile Phe Lys Val Ser Arg465                 470                 475                 480His Gly Glu Thr Glu Arg Phe Gln Lys Phe Ala Ser Thr Arg Asn Arg

            485                 490                 495Met Leu Leu Trp His Gly Ser Arg Leu Ser Asn Trp Ala Gly Ile Leu

        500                 505                 510Ser Gln Gly Leu Arg Ile Ala Pro Pro Glu Ala Pro Val Thr Gly Tyr

    515                 520                 525Met Phe Gly Lys Gly Val Tyr Phe Ala Asp Met Phe Ser Lys Ser Ala

530                 535                 540Asn Tyr Cys Tyr Ala Ser Glu Ala Cys Arg Ser Gly Val Leu Leu Leu545                 550                 555                 560Cys Glu Val Ala Leu Gly Asp Met Asn Glu Leu Leu Asn Ala Asp Tyr

            565                 570                 575Asp Ala Asn Asn Leu Pro Lys Gly Lys Leu Arg Ser Lys Gly Val Gly

        580                 585                 590Gln Thr Ala Pro Asn Met Val Glu Ser Lys Val Ala Asp Asp Gly Val

    595                 600                 605Val Val Pro Leu Gly Glu Pro Lys Gln Glu Pro Ser Lys Arg Gly Gly

610                 615                 620Leu Leu Tyr Asn Glu Tyr Ile Val Tyr Asn Val Asp Gln Ile Arg Met625                 630                 635                 640Arg Tyr Val Leu His Val Asn Phe Asn Phe Lys Arg Arg

            645                 650<210>5<211>2147<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<220><221>CDS<222>(129)..(2042)<400>5attgatgaag aagaaaacga agaagaagac tcttcaaatg ctcgcgcgaa ctcacttctg 60acgaaaacca tacttcctca gtctcattcc ctttccgacg aactattctc ctgaagaaga 120agacgaaa atg gcg aac aag ctc aaa gtc gac gaa ctc cgt tta aaa ctc  170

     Met Ala Asn Lys Leu Lys Val Asp Glu Leu Arg Leu Lys Leu

       1               5                  10gcc gag cgt gga ctc agt act act gga gtc aaa gcc gtt ctg gtg gag   218Ala Glu Arg Gly Leu Ser Thr Thr Gly Val Lys Ala Val Leu Val Glu15                  20                  25                  30agg ctt gaa gag gct atc gca gaa gac act aag aag gaa gaa tca aag   266Arg Leu Glu Glu Ala Ile Ala Glu Asp Thr Lys Lys Glu Glu Ser Lys

             35                  40                  45agc aag agg aaa aga aat tct tct aat gat act tat gaa tcg aac aaa   314Ser Lys Arg Lys Arg Asn Ser Ser Asn Asp Thr Tyr Glu Ser Asn Lys

         50                  55                  60ttg att gca att ggc gaa ttt cgt ggg atg att gtg aag gaa ttg cgt   362Leu Ile Ala Ile Gly Glu Phe Arg Gly Met Ile Val Lys Glu Leu Arg

     65                  70                  75gag gaa gct att aag aga ggc tta gat aca aca gga acc aaa aag gat   410Glu Glu Ala Ile Lys Arg Gly Leu Asp Thr Thr Gly Thr Lys Lys Asp

 80                  85                  90ctt ctt gag agg ctt tgc aat gat gct aat aac gtt tcc aat gca cca   458Leu Leu Glu Arg Leu Cys Asn Asp Ala Asn Asn Val Ser Asn Ala Pro95                 100                 105                 110gtc aaa tcc agt aat ggg aca gat gaa gct gaa gat gac aac aat ggc   506Val Lys Ser Ser Asn Gly Thr Asp Glu Ala Glu Asp Asp Asn Asn Gly

            115                 120                 125ttt gaa gaa gaa aag aaa gaa gag aaa atc gta acc gcg aca aag aag   554Phe Glu Glu Glu Lys Lys Glu Glu Lys Ile Val Thr Ala Thr Lys Lys

        130                 135                 140ggt gca gcg gtg cta gat cag tgg att cct gat gag ata aag agt cag   602Gly Ala Ala Val Leu Asp Gln Trp Ile Pro Asp Glu Ile Lys Ser Gln

    145                 150                 155tac cat gtt cta caa agg ggt gat gat gtt tat gat gct atc tta aat   650Tyr His Val Leu Gln Arg Gly Asp Asp Val Tyr Asp Ala Ile Leu Asn

160                 165                 170cag aca aat gtc agg gat aat aat aac aag ttc ttt gtc cta caa gtc   698Gln Thr Asn Val Arg Asp Asn Asn Asn Lys Phe Phe Val Leu Gln Val175                 180                 185                 190cta gag tcg gat agt aaa aag aca tac atg gtt tac act aga tgg gga   746Leu Glu Ser Asp Ser Lys Lys Thr Tyr Met Val Tyr Thr Arg Trp Gly

            195                 200                 205aga gtt ggt gtg aaa gga caa agt aag cta gat ggg cct tat gac tca   794Arg Val Gly Val Lys Gly Gln Ser Lys Leu Asp Gly Pro Tyr Asp Ser

        210                 215                 220tgg gat cgt gcg ata gag ata ttt acc aat aag ttc aat gac aag aca    842Trp Asp Arg Ala Ile Glu Ile Phe Thr Asn Lys Phe Asn Asp Lys Thr

    225                 230                 235aag aat tat tgg tct gac aga aag gag ttt atc cca cat ccc aag tcc    890Lys Asn Tyr Trp Ser Asp Arg Lys Glu Phe Ile Pro His Pro Lys Ser

240                 245                 250tat aca tgg ctc gaa atg gat tac gga aaa gag gaa aat gat tca ccg    938Tyr Thr Trp Leu Glu Met Asp Tyr Gly Lys Glu Glu Asn Asp Ser Pro255                 260                 265                 270gtc aat aat gat att ccg agt tca tct tcc gaa gtt aaa cct gaa caa    986Val Asn Asn Asp Ile Pro Ser Ser Ser Ser Glu Val Lys Pro Glu Gln

            275                 280                 285tca aaa cta gat act cgg gtt gcc aag ttc atc tct ctt ata tgt aat    1034Ser Lys Leu Asp Thr Arg Val Ala Lys Phe Ile Ser Leu Ile Cys Asn

        290                 295                 300gtc agc atg atg gca cag cat atg atg gaa ata gga tat aac gct aac    1082Val Ser Met Met Ala Gln His Met Met Glu Ile Gly Tyr Asn Ala Asn

    305                 310                 315aaa ttg cca ctc ggc aag ata agc aag tcc aca att tca aag ggt tat    1130Lys Leu Pro Leu Gly Lys Ile Ser Lys Ser Thr Ile Ser Lys Gly Tyr

320                 325                 330gaa gtg ctg aag aga ata tcg gag gtg att gac cgg tat gat aga acg    1178Glu Val Leu Lys Arg Ile Ser Glu Val Ile Asp Arg Tyr Asp Arg Thr335                 340                 345                 350agg ctt gag gaa ctg agt gga gag ttc tac aca gtg ata cct cat gat    1226Arg Leu Glu Glu Leu Ser Gly Glu Phe Tyr Thr Val Ile Pro His Asp

            355                 360                 365ttt ggt ttt aag aaa atg agt cag ttt gtt ata gac act cct caa aag    1274Phe Gly Phe Lys Lys Met Ser Gln Phe Val Ile Asp Thr Pro Gln Lys

        370                 375                 380ttg aaa cag aaa att gaa atg gtt gaa gca tta ggt gaa att gaa ctc    1322Leu Lys Gln Lys Ile Glu Met Val Glu Ala Leu Gly Glu Ile Glu Leu

    385                 390                 395gca aca aag ttg ttg tcc gtc gac ccg gga ttg cag gat gat cct tta    1370Ala Thr Lys Leu Leu Ser Val Asp Pro Gly Leu Gln Asp Asp Pro Leu

400                 405                 410tat tat cac tac cag caa ctt aat tgt ggt ttg acg cca gta gga aat   1418Tyr Tyr His Tyr Gln Gln Leu Asn Cys Gly Leu Thr Pro Val Gly Asn415                 420                 425                 430gat tca gag gag ttc tct atg gtt gct aat tac atg gag aac act cat   1466Asp Ser Glu Glu Phe Ser Met Val Ala Asn Tyr Met Glu Asn Thr His

            435                 440                 445gca aag acg cat tcg gga tat acg gtt gag att gcc caa cta ttt aga   1514Ala Lys Thr His Ser Gly Tyr Thr Val Glu Ile Ala Gln Leu Phe Arg

        450                 455                 460gct tcg aga gct gtt gaa gct gat cga ttc caa cag ttt tca agt tcg   1562Ala Ser Arg Ala Val Glu Ala Asp Arg Phe Gln Gln Phe Ser Ser Ser

    465                 470                 475aag aac agg atg cta ctc tgg cac ggt tca cgt ctc act aac tgg gct   1610Lys Asn Arg Met Leu Leu Trp His Gly Ser Arg Leu Thr Asn Trp Ala

480                 485                 490ggt att tta tct caa ggt ctg cga ata gct cct cct gaa gcg cct gta   1658Gly Ile Leu Ser Gln Gly Leu Arg Ile Ala Pro Pro Glu Ala Pro Val495                 500                 505                 510act ggt tac atg ttt gga aaa ggg gtt tac ttt gcg gat atg ttc tcc   1706Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys Gly Val Tyr Phe Ala Asp Met Phe Ser

            515                 520                 525aag agt gcg aac tat tgc tat gcc aac act ggc gct aat gat ggc gtt   1754Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Tyr Ala Asn Thr Gly Ala Asn Asp Gly Val

        530                 535                 540ctg ctc ctc tgc gag gtt gct ttg gga gac atg aat gaa ctt ctg tat   1802Leu Leu Leu Cys Glu Val Ala Leu Gly Asp Met Asn Glu Leu Leu Tyr

    545                 550                 555tca gat tat aac gcg gat aat cta ccc ccg gga aag cta agc aca aaa   1850Ser Asp Tyr Asn Ala Asp Asn Leu Pro Pro Gly Lys Leu Ser Thr Lys

560                 565                 570ggt gtg ggg aaa aca gca cca aac cca tca gag gct caa aca cta gaa   1898Gly Val Gly Lys Thr Ala Pro Asn Pro Ser Glu Ala Gln Thr Leu Glu575                 580                 585                 590gac ggt gtt gtt gtt cca ctt ggc aaa cca gtg gaa cgt tca tgc tcc   1946Asp Gly Val Val Val Pro Leu Gly Lys Pro Val Glu Arg Ser Cys Ser

            595                 600                 605aag ggg atg ttg ttg tac aac gaa tat ata gtc tac aat gtg gaa caa   1994Lys Gly Met Leu Leu Tyr Asn Glu Tyr Ile Val Tyr Asn Val Glu Gln

        610                 615                 620atc aag atg cgt tat gtg atc caa gtc aaa ttc aac tac aag cac taa   2042Ile Lys Met Arg Tyr Val Ile Gln Val Lys Phe Asn Tyr Lys His

    625                 630                 635aacttatgta tattagcttt tgaacatcaa ctaattatcc aaaaatcagc gttttattgt 2102atttctttca aactccttca tctctgattt tgcacggttc actcg                 2147<210>6<211>637<212>PRT<213>Arabidopsis thaliana<400>6Met Ala Asn Lys Leu Lys Val Asp Glu Leu Arg Leu Lys Leu Ala Glu1               5                  10                  15Arg Gly Leu Ser Thr Thr Gly Val Lys Ala Val Leu Val Glu Arg Leu

         20                  25                  30Glu Glu Ala Ile Ala Glu Asp Thr Lys Lys Glu Glu Ser Lys Ser Lys

     35                  40                  45Arg Lys Arg Asn Ser Ser Asn Asp Thr Tyr Glu Ser Asn Lys Leu Ile

 50                  55                  60Ala Ile Gly Glu Phe Arg Gly Met Ile Val Lys Glu Leu Arg Glu Glu65                  70                  75                  80Ala Ile Lys Arg Gly Leu Asp Thr Thr Gly Thr Lys Lys Asp Leu Leu

             85                  90                  95Glu Arg Leu Cys Asn Asp Ala Asn Asn Val Ser Asn Ala Pro Val Lys

        100                 105                 110Ser Ser Asn Gly Thr Asp Glu Ala Glu Asp Asp Asn Asn Gly Phe Glu

     115                120                 125Glu Glu Lys Lys Glu Glu Lys Ile Val Thr Ala Thr Lys Lys Gly Ala

130                 135                 140Ala Val Leu Asp Gln Trp Ile Pro Asp Glu Ile Lys Ser Gln Tyr Mis145                 150                 155                 160Val Leu Gln Arg Gly Asp Asp Val Tyr Asp Ala Ile Leu Asn Gln Thr

            165                 170                 175Asn Val Arg Asp Asn Asn Asn Lys Phe Phe Val Leu Gln Val Leu Glu

        180                 185                 190Ser Asp Ser Lys Lys Thr Tyr Met Val Tyr Thr Arg Trp Gly Arg Val

    195                 200                 205Gly Val Lys Gly Gln Ser Lys Leu Asp Gly Pro Tyr Asp Ser Trp Asp

210                 215                 220Arg Ala Ile Glu Ile Phe Thr Asn Lys Phe Asn Asp Lys Thr Lys Asn225                 230                 235                 240Tyr Trp Ser Asp Arg Lys Glu Phe Ile Pro His Pro Lys Ser Tyr Thr

            245                 250                 255Trp Leu Glu Met Asp Tyr Gly Lys Glu Glu Asn Asp Ser Pro Val Asn

        260                 265                 270Asn Asp Ile Pro Ser Ser Ser Ser Glu Val Lys Pro Glu Gln Ser Lys

    275                 280                 285Leu Asp Thr Arg Val Ala Lys Phe Ile Ser Leu Ile Cys Asn Val Ser

290                 295                 300Met Met Ala Gln His Met Met Glu Ile Gly Tyr Asn Ala Asn Lys Leu305                 310                 315                 320Pro Leu Gly Lys Ile Ser Lys Ser Thr Ile Ser Lys Gly Tyr Glu Val

            325                 330                 335Leu Lys Arg Ile Ser Glu Val Ile Asp Arg Tyr Asp Arg Thr Arg Leu

        340                 345                 350Glu Glu Leu Ser Gly Glu Phe Tyr Thr Val Ile Pro His Asp Phe Gly

    355                 360                 365Phe Lys Lys Met Ser Gln Phe Val Ile Asp Thr Pro Gln Lys Leu Lys

370                 375                 380Gln Lys Ile Glu Met Val Glu Ala Leu Gly Glu Ile Glu Leu Ala Thr385                 390                 395                 400Lys Leu Leu Ser Val Asp Pro Gly Leu Gln Asp Asp Pro Leu Tyr Tyr

            405                 410                 415His Tyr Gln Gln Leu Asn Cys Gly Leu Thr Pro Val Gly Asn Asp Ser

        420                 425                 430Glu Glu Phe Ser Met Val Ala Asn Tyr Met Glu Asn Thr His Ala Lys

    435                 440                 445Thr His Ser Gly Tyr Thr Val Glu Ile Ala Gln Leu Phe Arg Ala Ser

450                 455                 460Arg Ala Val Glu Ala Asp Arg Phe Gln Gln Phe Ser Ser Ser Lys Asn465                 470                 475                 480Arg Met Leu Leu Trp His Gly Ser Arg Leu Thr Asn Trp Ala Gly Ile

            485                 490                 495Leu Ser Gln Gly Leu Arg Ile Ala Pro Pro Glu Ala Pro Val Thr Gly

        500                 505                 510Tyr Met Phe Gly Lys Gly Val Tyr Phe Ala Asp Met Phe Ser Lys Ser

    515                 520                 525Ala Asn Tyr Cys Tyr Ala Asn Thr Gly Ala Asn Asp Gly Val Leu Leu

530                 535                 540Leu Cys Glu Val Ala Leu Gly Asp Met Asn Glu Leu Leu Tyr Ser Asp545                 550                 555                 560Tyr Asn Ala Asp Asn Leu Pro Pro Gly Lys Leu Ser Thr Lys Gly Val

            565                 570                 575Gly Lys Thr Ala Pro Asn Pro Ser Glu Ala Gln Thr Leu Glu Asp Gly

        580                 585                 590Val Val Val Pro Leu Gly Lys Pro Val Glu Arg Ser Cys Ser Lys Gly

    595                 600                 605Met Leu Leu Tyr Asn Glu Tyr Ile Val Tyr Asn Val Glu Gln Ile Lys

610                 615                 620Met Arg Tyr Val Ile Gln Val Lys Phe Asn Tyr Lys His625                 630                 635<210>7<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的名称：非常规PARP蛋白质的A结构域<400> 7Arg Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Leu1               5                  10                  15<210>8<211>33<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的名称：非常规PARP蛋白质的A1结构域<400>8Xaa Leu Xaa Val Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Arg Gly Leu1               5                  10                  15Xaa Xaa Xaa Gly Val Lys Xaa Xaa Leu Val Xaa Arg Leu Xaa Xaa Ala

         20                  25                  30Ile<210>9<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的名称：非常规PARP蛋白质的A2.结构域<400>9Gly Met Xaa Xaa Xaa Glu Leu Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Arg Gly Xaa1               5                  10                  15Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Lys Lys Asp Xaa Xaa Arg Leu Xaa Xaa

         20                  25                  30<210>10<211>3212<212>DNA<213>Zea mays<220><221>CDS<222>(81)..(3020)<400>10gcttcctctg tcgtccggcc tccaactcca tcgaaggggc tagggagagg agggaacccg 60aaccacagca ggccggcgca atg gcg gcg ccg cca aag gcg tgg aag gcg gag 113

                  Met Ala Ala Pro Pro Lys Ala Trp Lys Ala Glu

                    1               5                  10tat gcc aag tct ggg cgg gcc tcg tgc aag tca tgc cgg tcc cct atc   161Tyr Ala Lys Ser Gly Arg Ala Ser Cys Lys Ser Cys Arg Ser Pro Ile

         15                  20                  25gcc aag gac cag crc cgt ctt ggc aag atg gtt cag gcg tca cag ttc   209Ala Lys Asp Gln Leu Arg Leu Gly Lys Met Val Gln Ala Ser Gln Phe

     30                  35                  40gac ggc ttc atg ccg atg tgg aac cat gcc agg tgc atc ttc agc aag   257Asp Gly Phe Met Pro Met Trp Asn His Ala Arg Cys Ile Phe Ser Lys

 45                  50                  55aag aac cag ata aaa tcc gtt gac gat gtt gaa ggg ata gat gca ctt   305Lys Asn Gln Ile Lys Ser Val Asp Asp Val Glu Gly Ile Asp Ala Leu60                  65                  70                  75aga tgg gat gat caa gag aag ata cga aac tac gtt ggg agt gcc tca   353Arg Trp Asp Asp Gln Glu Lys Ile Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ala Ser

             80                   85                 90gct ggt aca agt tct aca gct gct cct cct gag aaa tgt aca att gag   401Ala Gly Thr Ser Ser Thr Ala Ala Pro Pro Glu Lys Cys Thr Ile Glu

         95                 100                 105att gct cca tct gcc cgt act tca tgt aga cga tgc agt gaa aag att   449Ile Ala Pro Ser Ala Arg Thr Ser Cys Arg Arg Cys Ser Glu Lys Ile

    110                 115                 120aca aaa gga tcg gtc cgt ctt tca gct aag ctt gag agt gaa ggt ccc   497Thr Lys Gly Ser Val Arg Leu Ser Ala Lys Leu Glu Ser Glu Gly Pro

125                 130                 135aag ggt ata cca tgg tat cat gcc aac tgt ttc ttt gag gta tcc ccg   545Lys Gly Ile Pro Trp Tyr His Ala Asn Cys Phe Phe Glu Val Ser Pro140                 145                 150                 155tct gca act gtt gag aag ttc tca ggc tgg gat act ttg tcc gat gag   593Ser Ala Thr Val Glu Lys Phe Ser Gly Trp Asp Thr Leu Ser Asp Glu

            160                 165                 170gat aag aga acc atg ctc gat ctt gtt aaa aaa gat gtt ggc aac aat   641Asp Lys Arg Thr Met Leu Asp Leu Val Lys Lys Asp Val Gly Asn Asn

        175                 180                 185gaa caa aat aag ggt tcc aag cgc aag aaa agt gaa aat gat att gat   689Glu Gln Asn Lys Gly Ser Lys Arg Lys Lys Ser Glu Asn Asp Ile Asp

    190                 195                 200agc tac aaa tcc gcc agg tta gat gaa agt aca tct gaa ggt aca gtg   737Ser Tyr Lys Ser Ala Arg Leu Asp Glu Ser Thr Ser Glu Gly Thr Val

205                 210                 215cga aac aaa ggg caa ctt gta gac cca cgt ggt tcc aat act agt tca   785Arg Asn Lys Gly Gln Leu Val Asp Pro Arg Gly Ser Asn Thr Ser Ser220                 225                 230                 235gct gat atc caa cta aag ctt aag gag caa agt gac aca ctt tgg aag   833Ala Asp Ile Gln Leu Lys Leu Lys Glu Gln Ser Asp Thr Leu Trp Lys

            240                 245                 250tta aag gat gga ctt aag act cat gta tcg gct gct gaa tta agg gat   881Leu Lys Asp Gly Leu Lys Thr His Val Ser Ala Ala Glu Leu Arg Asp

        255                 260                 265atg ctt gag gct aat ggg cag gat aca tca gga cca gaa agg cac cta   929Met Leu Glu Ala Asn Gly Gln Asp Thr Ser Gly Pro Glu Arg His Leu

    270                 275                 280ttg gat cgc tgt gcg gat gga atg ata ttt gga gcg ctg ggt cct tgc   977Leu Asp Arg Cys Ala Asp Gly Met Ile Phe Gly Ala Leu Gly Pro Cys

285                 290                 295cca gtc tgt gct aat ggc atg tac tat tat aat ggt cag tac caa tgc   1025Pro Val Cys Ala Asn Gly Met Tyr Tyr Tyr Asn Gly Gln Tyr Gln Cys300                 305                 310                 315agt ggt aat gtg tca gag tgg tcc aag tgt aca tac tct gcc aca gaa   1073Ser Gly Asn Val Ser Glu Trp Ser Lys Cys Thr Tyr Ser Ala Thr Glu

            320                 325                 330cct gtc cgc gtt aag aag aag tgg caa att cca cat gga aca aag aat    1121Pro Val Arg Val Lys Lys Lys Trp Gln Ile Pro His Gly Thr Lys Asn

        335                 340                 345gat tac ctt atg aag tgg ttc aaa tct caa aag gtt aag aaa cca gag    1169Asp Tyr Leu Met Lys Trp Phe Lys Ser Gln Lys Val Lys Lys Pro Glu

    350                 355                 360agg gtt ctt cca cca atg tca cct gag aaa tct gga agt aaa gca act    1217Arg Val Leu Pro Pro Met Ser Pro Glu Lys Ser Gly Ser Lys Ala Thr

365                 370                 375cag aga aca tca ttg ctg tct tct aaa ggg ttg gat aaa tta agg ttt    1265Gln Arg Thr Ser Leu Leu Ser Ser Lys Gly Leu Asp Lys Leu Arg Phe380                 385                 390                 395tct gtt gta gga caa tca aaa gaa gca gca aat gag tgg att gag aag    1313Ser Val Val Gly Gln Ser Lys Glu Ala Ala Asn Glu Trp Ile Glu Lys

            400                 405                 410ctc aaa ctt gct ggt gcc aac ttc tat gcc agg gtt gtc aaa gat att    1361Leu Lys Leu Ala Gly Ala Asn Phe Tyr Ala Arg Val Val Lys Asp Ile

        415                 420                 425gat tgt tta att gca tgt ggt gag ctc gac aat gaa aat gct gaa gtc    1409Asp Cys Leu Ile Ala Cys Gly Glu Leu Asp Asn Glu Asn Ala Glu Val

    430                 435                 440agg aaa gca agg agg ctg aag ata cca att gta agg gag ggt tac att    1457Arg Lys Ala Arg Arg Leu Lys Ile Pro Ile Val Arg Glu Gly Tyr Ile

445                 450                 455gga gaa tgt gtt aaa aag aac aaa atg ctg cca ttt gat ttg tat aaa    1505Gly Glu Cys Val Lys Lys Asn Lys Met Leu Pro Phe Asp Leu Tyr Lys460                 465                 470                 475cta gag aat gcc tta gag tcc tca aaa ggc agt act gtc act gtt aaa    1553Leu Glu Asn Ala Leu Glu Ser Ser Lys Gly Ser Thr Val Thr Val Lys

            480                 485                 490gtt aag ggc cga agt gct gtt cat gag tcc tct ggt ttg caa gat act    1601Val Lys Gly Arg Ser Ala Val His Glu Ser Ser Gly Leu Gln Asp Thr

        495                 500                 505gct cac att ctt gaa gat ggg aaa agc ata tac aat gca acc tta aac    1649Ala His Ile Leu Glu Asp Gly Lys Ser Ile Tyr Asn Ala Thr Leu Asn

    510                 515                 520atg tct gac ctg gca cta ggt gtg aac agc tac tat gta ctc cag atc   1697Met Ser Asp Leu Ala Leu Gly Val Asn Ser Tyr Tyr Val Leu Gln Ile

525                 530                 535att gaa cag gat gat ggg tct gag tgc tac gta ttt cgt aag tgg gga   1745Ile Glu Gln Asp Asp Gly Ser Glu Cys Tyr Val Phe Arg Lys Trp Gly540                 545                 550                 555cgg gtt ggg agt gag aaa att gga ggg caa aaa ctg gag gag atg tca   1793Arg Val Gly Ser Glu Lys Ile Gly Gly Gln Lys Leu Glu Glu Met Ser

            560                 565                 570aaa act gag gca atc aag gaa ttc aaa aga tta ttt ctt gag aag act   1841Lys Thr Glu Ala Ile Lys Glu Phe Lys Arg Leu Phe Leu Glu Lys Thr

        575                 580                 585gga aac tca tgg gaa gct tgg gaa tgt aaa acc aat ttt cgg aag cag   1889Gly Asn Ser Trp Glu Ala Trp Glu Cys Lys Thr Asn Phe Arg Lys Gln

    590                 595                 600cct ggg aga ttt tac cca ctt gat gtt gat tat ggt gtt aag aaa gca   1937Pro Gly Arg Phe Tyr Pro Leu Asp Val Asp Tyr Gly Val Lys Lys Ala

605                 610                 615cca aaa cgg aaa gat atc agt gaa atg aaa agt tct ctt gct cct caa   1985Pro Lys Arg Lys Asp Ile Ser Glu Met Lys Ser Ser Leu Ala Pro Gln620                 625                 630                 635ttg cta gaa ctc atg aag atg ctt ttc aat gtg gag aca tat aga gct   2033Leu Leu Glu Leu Met Lys Met Leu Phe Asn Val Glu Thr Tyr Arg Ala

            640                 645                 650gct atg atg gaa ttt gaa att aat atg tca gaa atg cct ctt ggg aag   2081Ala Met Met Glu Phe Glu Ile Asn Met Ser Glu Met Pro Leu Gly Lys

        655                 660                 665cta agc aag gaa aat att gag aaa gga ttt gaa gca tta act gag ata   2129Leu Ser Lys Glu Asn Ile Glu Lys Gly Phe Glu Ala Leu Thr Glu Ile

    670                 675                 680cag aat tta ttg aag gac acc gct gat caa gca ctg gct gtt aga gaa   2177Gln Asn Leu Leu Lys Asp Thr Ala Asp Gln Ala Leu Ala Val Arg Glu

685                 690                 695agc tta att gtt gct gcg agc aat cgc ttt ttc act ctt atc cct tct   2225Ser Leu Ile Val Ala Ala Ser Asn Arg Phe Phe Thr Leu Ile Pro Ser700                 705                 710                 715att cat cct cat att ata cgg gat gag gat gat ttg atg atc aaa gcg   2273Ile His Pro His Ile Ile Arg Asp Glu Asp Asp Leu Met Ile Lys Ala

            720                 725                 730aaa atg ctt gaa gct ctg cag gat att gaa att gct tca aag ata gtt   2321Lys Met Leu Glu Ala Leu Gln Asp Ile Glu Ile Ala Ser Lys Ile Val

        735                 740                 745ggc ttc gat agc gac agt gat gaa tct ctt gat gat aaa tat atg aaa   2369Gly Phe Asp Ser Asp Ser Asp Glu Ser Leu Asp Asp Lys Tyr Met Lys

    750                 755                 760ctt cac tgt gac atc acc ccg ctg gct cac gat agt gaa gat tac aag   2417Leu His Cys Asp Ile Thr Pro Leu Ala His Asp Ser Glu Asp Tyr Lys

765                 770                 775tta att gag cag tat ctc ctc aac aca cat gct cct act cac aag gac   2465Leu Ile Glu Gln Tyr Leu Leu Asn Thr His Ala Pro Thr His Lys Asp780                 785                 790                 795tgg tcg ctg gaa ctg gag gaa gtt ttt tca ctt gat cga gat gga gaa   2513Trp Ser Leu Glu Leu Glu Glu Val Phe Ser Leu Asp Arg Asp Gly Glu

            800                 805                 810ctt aat aag tac tca aga tat aaa aat aat ctg cat aac aag atg cta   2561Leu Asn Lys Tyr Ser Arg Tyr Lys Asn Asn Leu His Asn Lys Met Leu

        815                 820                 825tta tgg cac ggt tca agg ttg acg aat ttt gtg gga att ctt agt caa   2609Leu Trp His Gly Ser Arg Leu Thr Asn Phe Val Gly Ile Leu Ser Gln

    830                 835                 840ggg cta aga att gca cct cct gag gca cct gtt act ggc tat atg ttc   2657Gly Leu Arg Ile Ala Pro Pro Glu Ala Pro Val Thr Gly Tyr Met Phe

845                 850                 855ggc aaa ggc ctc tac ttt gca gat cta gta agc aag agc gca caa tac   2705Gly Lys Gly Leu Tyr Phe Ala Asp Leu Val Ser Lys Ser Ala Gln Tyr860                 865                 870                 875tgt tat gtg gat agg aat aat cct gta ggt ttg atg ctt ctt tct gag   2753Cys Tyr Val Asp Arg Asn Asn Pro Val Gly Leu Met Leu Leu Ser Glu

            880                 885                 890gtt gct tta gga gac atg tat gaa cta aag aaa gcc acg tcc atg gac   2801Val Ala Leu Gly Asp Met Tyr Glu Leu Lys Lys Ala Thr Ser Met Asp

        895                 900                 905aaa cct cca aga ggg aag cat tcg acc aag gga tta ggc aaa acc gtg   2849Lys Pro Pro Arg Gly Lys His Ser Thr Lys Gly Leu Gly Lys Thr Val

    910                 915                 920cca ctg gag tca gag ttt gtg aag tgg agg gat gat gtc gta gtt ccc   2897Pro Leu Glu Ser Glu Phe Val Lys Trp Arg Asp Asp Val Val Val Pro

925                 930                 935tgc ggc aag ccg gtg cca tca tca att agg agc tct gaa ctc atg tac   2945Cys Gly Lys Pro Val Pro Ser Ser Ile Arg Ser Ser Glu Leu Met Tyr940                 945                 950                 955aat gag tac atc gtc tac aac aca tcc cag gtg aag atg cag ttc ttg   2993Asn Glu Tyr Ile Val Tyr Asn Thr Ser Gln Val Lys Met Gln Phe Leu

            960                 965                 970ctg aag gtg cgt ttc cat cac aag agg tagctgggag actaggcaag         3040Leu Lys Val Arg Phe His His Lys Arg

        975                 980tagagttgga aggtagagaa gcagagttag gcgatgcctc ttttggtatt attagtaagc 3100ctggcatgta tttatgggtg ctcgcgcttg atccattttg gtaagtgttg cttgggcatc 3160agcgcgaata gcaccaatca cacactttta cctaatgacg ttttactgta ta         3212<210>11<211>980<212>PRT<213>Zea mays<400>11Met Ala Ala Pro Pro Lys Ala Trp Lys Ala Glu Tyr Ala Lys Ser Gly1               5                  10                  15Arg Ala Ser Cys Lys Ser Cys Arg Ser Pro Ile Ala Lys Asp Gln Leu

         20                  25                  30Arg Leu Gly Lys Met Val Gln Ala Ser Gln Phe Asp Gly Phe Met Pro

     35                  40                  45Met Trp Asn His Ala Arg Cys Ile Phe Ser Lys Lys Asn Gln Ile Lys

 50                  55                  60Ser Val Asp Asp Val Glu Gly Ile Asp Ala Leu Arg Trp Asp Asp Gln65                  70                  75                  80Glu Lys Ile Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ala Ser Ala Gly Thr Ser Ser

             85                   90                 95Thr Ala Ala Pro Pro Glu Lys Cys Thr Ile Glu Ile Ala Pro Ser Ala

        100                 105                 110Arg Thr Ser Cys Arg Arg Cys Ser Glu Lys Ile Thr Lys Gly Ser Val

    115                 120                 125Arg Leu Ser Ala Lys Leu Glu Ser Glu Gly Pro Lys Gly Ile Pro Trp

130                 135                 140Tyr His Ala Asn Cys Phe Phe Glu Val Ser Pro Ser Ala Thr Val Glu145                 150                 155                 160Lys Phe Ser Gly Trp Asp Thr Leu Ser Asp Glu Asp Lys Arg Thr Met

            165                 170                 175Leu Asp Leu Val Lys Lys Asp Val Gly Asn Asn Glu Gln Asn Lys Gly

        180                 185                 190Ser Lys Arg Lys Lys Ser Glu Asn Asp Ile Asp Ser Tyr Lys Ser Ala

    195                 200                 205Arg Leu Asp Glu Ser Thr Ser Glu Gly Thr Val Arg Asn Lys Gly Gln

210                 215                 220Leu Val Asp Pro Arg Gly Ser Asn Thr Ser Ser Ala Asp Ile Gln Leu225                 230                 235                 240Lys Leu Lys Glu Gln Ser Asp Thr Leu Trp Lys Leu Lys Asp Gly Leu

            245                 250                 255Lys Thr His Val Ser Ala Ala Glu Leu Arg Asp Met Leu Glu Ala Asn

        260                 265                 270Gly Gln Asp Thr Ser Gly Pro Glu Arg His Leu Leu Asp Arg Cys Ala

    275                 280                 285Asp Gly Met Ile Phe Gly Ala Leu Gly Pro Cys Pro Val Cys Ala Asn

290                 295                 300Gly Met Tyr Tyr Tyr Asn Gly Gln Tyr Gln Cys Ser Gly Asn Val Ser305                 310                 315                 320Glu Trp Ser Lys Cys Thr Tyr Ser Ala Thr Glu Pro Val Arg Val Lys

            325                 330                 335Lys Lys Trp Gln Ile Pro His Gly Thr Lys Asn Asp Tyr Leu Met Lys

        340                 345                 350Trp Phe Lys Ser Gln Lys Val Lys Lys Pro Glu Arg Val Leu Pro Pro

    355                 360                 365Met Ser Pro Glu Lys Ser Gly Ser Lys Ala Thr Gln Arg Thr Ser Leu

370                 375                 380Leu Ser Ser Lys Gly Leu Asp Lys Leu Arg Phe Ser Val Val Gly Gln385                 390                 395                 400Ser Lys Glu Ala Ala Asn Glu Trp Ile Glu Lys Leu Lys Leu Ala Gly

            405                 410                 415Ala Asn Phe Tyr Ala Arg Val Val Lys Asp Ile Asp Cys Leu Ile Ala

        420                 425                 430Cys Gly Glu Leu Asp Asn Glu Asn Ala Glu Val Arg Lys Ala Arg Arg

    435                 440                 445Leu Lys Ile Pro Ile Val Arg Glu Gly Tyr Ile Gly Glu Cys Val Lys

450                 455                 460Lys Asn Lys Met Leu Pro Phe Asp Leu Tyr Lys Leu Glu Asn Ala Leu465                 470                 475                 480Glu Ser Ser Lys Gly Ser Thr Val Thr Val Lys Val Lys Gly Arg Ser

            485                 490                 495Ala Val His Glu Ser Ser Gly Leu Gln Asp Thr Ala His Ile Leu Glu

        500                 505                 510Asp Gly Lys Ser Ile Tyr Asn Ala Thr Leu Asn Met Ser Asp Leu Ala

    515                 520                 525Leu Gly Val Asn Ser Tyr Tyr Val Leu Gln Ile Ile Glu Gln Asp Asp

    530             535                 540Gly Ser Glu Cys Tyr Val Phe Arg Lys Trp Gly Arg Val Gly Ser Glu545                 550                 555                 560Lys Ile Gly Gly Gln Lys Leu Glu Glu Met Ser Lys Thr Glu Ala Ile

            565                 570                 575Lys Glu Phe Lys Arg Leu Phe Leu Glu Lys Thr Gly Asn Ser Trp Glu

        580                 585                 590Ala Trp Glu Cys Lys Thr Asn Phe Arg Lys Gln Pro Gly Arg Phe Tyr

    595                 600                 605Pro Leu Asp Val Asp Tyr Gly Val Lys Lys Ala Pro Lys Arg Lys Asp

610                 615                 620Ile Ser Glu Met Lys Ser Ser Leu Ala Pro Gln Leu Leu Glu Leu Met625                 630                 635                 640Lys Met Leu Phe Asn Val Glu Thr Tyr Arg Ala Ala Met Met Glu Phe

            645                 650                 655Glu Ile Asn Met Ser Glu Met Pro Leu Gly Lys Leu Ser Lys Glu Asn

        660                 665                 670Ile Glu Lys Gly Phe Glu Ala Leu Thr Glu Ile Gln Asn Leu Leu Lys

    675                 680                 685Asp Thr Ala Asp Gln Ala Leu Ala Val Arg Glu Ser Leu Ile Val Ala

690                 695                 700Ala Ser Asn Arg Phe Phe Thr Leu Ile Pro Ser Ile His Pro His Ile705                 710                 715                 720Ile Arg Asp Glu Asp Asp Leu Met Ile Lys Ala Lys Met Leu Glu Ala

            725                 730                 735Leu Gln Asp Ile Glu Ile Ala Ser Lys Ile Val Gly Phe Asp Ser Asp

        740                 745                 750Ser Asp Glu Ser Leu Asp Asp Lys Tyr Met Lys Leu His Cys Asp Ile

    755                 760                 765Thr Pro Leu Ala His Asp Ser Glu Asp Tyr Lys Leu Ile Glu Gln Tyr

770                 775                 780Leu Leu Asn Thr His Ala Pro Thr His Lys Asp Trp Ser Leu Glu Leu785                 790                 795                 800Glu Glu Val Phe Ser Leu Asp Arg Asp Gly Glu Leu Asn Lys Tyr Ser

            805                 810                 815Arg Tyr Lys Asn Asn Leu His Asn Lys Met Leu Leu Trp His Gly Ser

        820                 825                 830Arg Leu Thr Asn Phe Val Gly Ile Leu Ser Gln Gly Leu Arg Ile Ala

    835                 840                 845Pro Pro Glu Ala Pro Val Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys Gly Leu Tyr

850                 855                 860Phe Ala Asp Leu Val Ser Lys Ser Ala Gln Tyr Cys Tyr Val Asp Arg865                 870                 875                 880Asn Asn Pro Val Gly Leu Met Leu Leu Ser Glu Val Ala Leu Gly Asp

            885                 890                 895Met Tyr Glu Leu Lys Lys Ala Thr Ser Met Asp Lys Pro Pro Arg Gly

        900                 905                 910Lys His Ser Thr Lys Gly Leu Gly Lys Thr Val Pro Leu Glu Ser Glu

    915                 920                 925Phe Val Lys Trp Arg Asp Asp Val Val Val Pro Cys Gly Lys Pro Val

930                 935                 940Pro Ser Ser Ile Arg Ser Ser Glu Leu Met Tyr Asn Glu Tyr Ile Val945                 950                 955                 960Tyr Asn Thr Ser Gln Val Lys Met Gln Phe Leu Leu Lys Val Arg Phe

            965                 970                 975His His Lys Arg

        980<210>12<211>1010<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的名称：在APP N-端结构域和GUS蛋白质之间的融合蛋白<400>12Met Ala Asn Lys Leu Lys Val Asp Glu Leu Arg Leu Lys Leu Ala Glu1               5                  10                  15Arg Gly Leu Ser Thr Thr Gly Val Lys Ala Val Leu Val Glu Arg Leu

         20                  25                  30Glu Glu Ala Ile Ala Glu Asp Thr Lys Lys Glu Glu Ser Lys Ser Lys

     35                  40                  45Arg Lys Arg Asn Ser Ser Asn Asp Thr Tyr Glu Ser Asn Lys Leu Ile

 50                  55                  60Ala Ile Gly Glu Phe Arg Gly Met Ile Val Lys Glu Leu Arg Glu Glu65                  70                  75                  80Ala Ile Lys Arg Gly Leu Asp Thr Thr Gly Thr Lys Lys Asp Leu Leu

             85                  90                  95Glu Arg Leu Cys Asn Asp Ala Asn Asn Val Ser Asn Ala Pro Val Lys

        100                 105                 110Ser Ser Asn Gly Thr Asp Glu Ala Glu Asp Asp Asn Asn Gly Phe Glu

    115                 120                 125Glu Glu Lys Lys Glu Glu Lys Ile Val Thr Ala Thr Lys Lys Gly Ala

130                 135                 140Ala Val Leu Asp Gln Trp Ile Pro Asp Glu Ile Lys Ser Gln Tyr His145                 150                 155                 160Val Leu Gln Arg Gly Asp Asp Val Tyr Asp Ala Ile Leu Asn Gln Thr

            165                 170                 175Asn Val Arg Asp Asn Asn Asn Lys Phe Phe Val Leu Gln Val Leu Glu

        180                 185                 190Ser Asp Ser Lys Lys Thr Tyr Met Val Tyr Thr Arg Trp Gly Arg Val

    195                 200                 205Gly Val Lys Gly Gln Ser Lys Leu Asp Gly Pro Tyr Asp Ser Trp Asp

210                 215                 220Arg Ala Ile Glu Ile Phe Thr Asn Lys Phe Asn Asp Lys Thr Lys Asn225                 230                 235                 240Tyr Trp Ser Asp Arg Lys Glu Phe Ile Pro His Pro Lys Ser Tyr Thr

            245                 250                 255Trp Leu Glu Met Asp Tyr Gly Lys Glu Glu Asn Asp Ser Pro Val Asn

        260                 265                 270Asn Asp Ile Pro Ser Ser Ser Ser Glu Val Lys Pro Glu Gln Ser Lys

    275                 280                 285Leu Asp Thr Arg Val Ala Lys Phe Ile Ser Leu Ile Cys Asn Val Ser

290                 295                 300Met Met Ala Gln His Met Met Glu Ile Gly Tyr Asn Ala Asn Lys Leu305                 310                 315                 320Pro Leu Gly Lys Ile Ser Lys Ser Thr Ile Ser Lys Gly Tyr Glu Val

            325                 330                 335Leu Lys Arg Ile Ser Glu Val Ile Asp Arg Tyr Asp Arg Thr Arg Leu

        340                 345                 350Glu Glu Leu Ser Gly Glu Phe Tyr Thr Val Ile Pro His Asp Phe Gly

    355                 360                 365Phe Lys Lys Met Ser Gln Phe Val Ile Asp Thr Pro Gln Lys Leu Lys

370                 375                 380Gln Lys Ile Glu Met Val Glu Ala Leu Gly Glu Ile Glu Leu Ala Thr385                 390                 395                 400Lys Leu Leu Ser Val Asp Pro Met Val Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr

            405                 410                 415Arg Glu Ile Lys Lys Leu Asp Gly Leu Trp Ala Phe Ser Leu Asp Arg

        420                 425                 430Glu Asn Cys Gly Ile Asp Gln Arg Trp Trp Glu Ser Ala Leu Gln Glu

    435                 440                 445Ser Arg Ala Ile Ala Val Pro Gly Ser Phe Asn Asp Gln Phe Ala Asp

450                 455                 460Ala Asp Ile Arg Asn Tyr Ala Gly Asn Val Trp Tyr Gln Arg Glu Val465                 470                 475                 480Phe Ile Pro Lys Gly Trp Ala Gly Gln Arg Ile Val Leu Arg Phe Asp

            485                 490                 495Ala Val Thr His Tyr Gly Lys Val Trp Val Asn Asn Gln Glu Val Met

        500                 505                 510Glu His Gln Gly Gly Tyr Thr Pro Phe Glu Ala Asp Val Thr Pro Tyr

    515                 520                 525Val Ile Ala Gly Lys Ser Val Arg Ile Thr Val Cys Val Asn Asn Glu

530                 535                 540Leu Asn Trp Gln Thr Ile Pro Pro Gly Met Val Ile Thr Asp Glu Asn545                 550                 555                 560Gly Lys Lys Lys Gln Ser Tyr Phe His Asp Phe Phe Asn Tyr Ala Gly

            565                 570                 575Ile His Arg Ser Val Met Leu Tyr Thr Thr Pro Asn Thr Trp Val Asp

        580                 585                 590Asp Ile Thr Val Val Thr His Val Ala Gln Asp Cys Asn His Ala Ser

    595                 600                 605Val Asp Trp Gln Val Val Ala Asn Gly Asp Val Ser Val Glu Leu Arg

610                 615                 620Asp Ala Asp Gln Gln Val Val Ala Thr Gly Gln Gly Thr Ser Gly Thr625                 630                 635                 640Leu Gln Val Val Asn Pro His Leu Trp Gln Pro Gly Glu Gly Tyr Leu

            645                 650                 655Tyr Glu Leu Cys Val Thr Ala Lys Ser Gln Thr Glu Cys Asp Ile Tyr

        660                 665                 670Pro Leu Arg Val Gly Ile Arg Ser Val Ala Val Lys Gly Glu Gln Phe

    675                 680                 685Leu Ile Asn His Lys Pro Phe Tyr Phe Thr Gly Phe Gly Arg His Glu

690                 695                 700Asp Ala Asp Leu Arg Gly Lys Gly Phe Asp Asn Val Leu Met Val His705                 710                 715                 720Asp His Ala Leu Met Asp Trp Ile Gly Ala Asn Ser Tyr Arg Thr Ser

            725                 730                 735His Tyr Pro Tyr Ala Glu Glu Met Leu Asp Trp Ala Asp Glu His Gly

        740                 745                 750Ile Val Val Ile Asp Glu Thr Ala Ala Val Gly Phe Asn Leu Ser Leu

    755                 760                 765Gly Ile Gly Phe Glu Ala Gly Asn Lys Pro Lys Glu Leu Tyr Ser Glu

770                 775                 780Glu Ala Val Asn Gly Glu Thr Gln Gln Ala His Leu Gln Ala Ile Lys785                 790                 795                 800Glu Leu Ile Ala Arg Asp Lys Asn His Pro Ser Val Val Met Trp Ser

            805                 810                 815Ile Ala Asn Glu Pro Asp Thr Arg Pro Gln Gly Ala Arg Glu Tyr Phe

        820                 825                 830Ala Pro Leu Ala Glu Ala Thr Arg Lys Leu Asp Pro Thr Arg Pro Ile

    835                 840                 845Thr Cys Val Asn Val Met Phe Cys Asp Ala His Thr Asp Thr Ile Ser

850                 855                 860Asp Leu Phe Asp Val Leu Cys Leu Asn Arg Tyr Tyr Gly Trp Tyr Val865                 870                 875                 880Gln Ser Gly Asp Leu Glu Thr Ala Glu Lys Val Leu Glu Lys Glu Leu

            885                 890                 895Leu Ala Trp Gln Glu Lys Leu His Gln Pro Ile Ile Ile Thr Glu Tyr

        900                 905                 910Gly Val Asp Thr Leu Ala Gly Leu His Ser Met Tyr Thr Asp Met Trp

    915                 920                 925Ser Glu Glu Tyr Gln Cys Ala Trp Leu Asp Met Tyr His Arg Val Phe

930                 935                 940Asp Arg Val Ser Ala Val Val Gly Glu Gln Val Trp Asn Phe Ala Asp945                 950                 955                 960Phe Ala Thr Ser Gln Gly Ile Leu Arg Val Gly Gly Asn Lys Lys Gly

            965                 970                 975Ile Phe Thr Arg Asp Arg Lys Pro Lys Ser Ala Ala Phe Leu Leu Gln

        980                 985                 990Lys Arg Trp Thr Gly Met Asn Phe Gly Glu Lys Pro Gln Gln Gly Gly

    995                1000                1005Lys Gln1010<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的名称：简并PCR引物<400>13ccgaattcgg ntayatgtty ggnaa            25<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的名称：简并PCR引物<400>14ccgaattcac natrtaytcr ttrta            25<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的名称：用作PCR引物的低聚核苷酸<400>15gggaccatgt agtttatctt gacct                  25<210>16<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的名称：用于PCR的低聚核苷酸<400>16gacctcgtac cccaactctt ccccat                26<210>17<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的名称：用于PCR的低聚核苷酸<400>17aagtcgacgc ggccgccaca cctagtgcca ggtcag    36<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的名称：用于PCR的低聚核苷酸<400>18atctcaattg tacatttctc agga                 24<210>19<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的名称：用于PCR的低聚核苷酸<400>19aggatcccat ggcgaacaag ctcaaagtga c          31<210>20<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的名称：用于PCR的低聚核苷酸<400>20aggatcctta gtgcttgtag ttgaat                26<210>21<211>4947<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的名称：具有β-葡萄糖醛酸酶基因的APP启动子融合体<220><221>启动子<222>(1)..(1961)<220><221>misc-信号<222>(1962)..(1964)<223>翻译启始密码子<400>21ctcgagatag tatatttttt agttactatc attacataag tatattttaa aaaactaatt 60atatgaatta tgtagctaac tagatagata atcgtataac caattcatgt tagtatagta 120tagtttaagt atgtattttg ggattacaag tgtggttggc atcaagacaa ggatggtgat 180agcctttctc tgtaatttgg tttaagaaaa gtttttgcat tttatgtata aacgtgtttt 240ttttttataa tttcaaattt caacaaaaaa caattttttt taataatgat tgaccactat 300agacaattta aatgataaaa aaaaggggga atttttcaca atgttttgga gattagtcta 360gattttttgt ccaaattttc cgattgtaag aattaagaag caatgaacat ttgtgttaag 420cttaatgatt tgtactcaca atatctttta aatttaaaat tgttaaccaa aatatcctat 480atattgtact tgtaatagaa atataaacta ttaaaaacaa cactttattc atataatata 540agttaaaaca tatgtttttt ttagtatgtt ctaatcacac ctattaaaaa aagttgaagc 600taaatgagcc aaaaagaaaa ataaagatag gggatgggga caggctgtaa tgttaggcgg 660ttggtatatg aactgagaac atgtctgttg gttcggtcca tctacgccac tcaaccattt 720ggctatgttt tctttttggc ttttgcatgt tctctctact tttcttcttt ggtcaaaatc 780tctatctcgt cttttacatg gcttacccga atgttagttg tcatgtaaat ttggttatga 840aaagatattt tatataaact ttatcgtata ttaatatcgt tatcatctaa ccatttttta 900aaactaaact agaaccatcc agttttacaa gagttttttt tttttttttc taactaaata 960atatttgaag tgtacaatat taacaatata tgggccaaat aatagtggaa accaaatcgt 1020tagtcccact ttatgatggg cctgttgatt cttatgtctt cttcgtaagt tgtgattatg 1080cagattacgg gctaataaac atgcatgttt agtttttact gtccaagtaa cgaaatttta 1140tcttttgggt tgttggccca tttcatatat tccaaatgcc aaatccagcc cggctcgaca 1200cagcactgct cggctcaaca ctcgtatgcg gttggtagcc acttaagacc ttggtttgat 1260taacatgtta cgaataattt gtgtcccttt ttcttcaagg agactaatct cttttaataa 1320aaaagaattg tgtcattagt caacacaagt cctataatcc gtttacgtaa tttgtatgca 1380cgtccttgga aaagtgagta gtggcgtacg ttacagccaa aaactatttg tatattttct 1440ttcgttaaac aaccagcaaa attttcagaa aaatgttctt aaattataaa ttagtagtac 1500attttaaaac atagagattt tttgtttctt ttaatagaag agttaaacct atgtacaaaa 1560tttcaactcc ttttcaaagt atttgcctgt tactagattt ttaacctttt tttttttatc 1620tttcatgatt ttctattgct tgccatcatc aatggtagga aataaatact attttaaaaa 1680ggtcaggggt ggatttaaga atcaatccaa aagtttgggg tcttttggag attaaaaagt 1740tatatgggaa atatccacaa atatgaacga gaacttttgt caaaaaaatt taaaataatt 1800tttcaaaaag ccctaaagct ttcaagggaa gccatcgatg aagaagaaaa cgaagaagaa 1860gactcttcaa acgttcgcgc gaactcactt ctgacgaaaa ccatacttcc tcagtctcat 1920tccctttccg acgaactatt ctcctgaaga agaagacgaa aatggcgaac aagctcaaag 1980tcgacatggt ccgtcctgta gaaaccccaa cccgtgaaat caaaaaactc gacggcctgt 2040gggcattcag tctggatcgc gaaaactgtg gaattgatca gcgttggtgg gaaagcgcgt 2100tacaagaaag ccgggcaatt gctgtgccag gcagttttaa cgatcagttc gccgatgcag 2160atattcgtaa ttatgcgggc aacgtctggt atcagcgcga agtctttata ccgaaaggtt 2220gggcaggcca gcgtatcgtg ctgcgtttcg atgcggtcac tcattacggc aaagtgtggg 2280tcaataatca ggaagtgatg gagcatcagg gcggctatac gccatttgaa gccgatgtca 2340cgccgtatgt tattgccggg aaaagtgtac gtatcaccgt ttgtgtgaac aacgaactga 2400actggcagac tatcccgccg ggaatggtga ttaccgacga aaacggcaag aaaaagcagt 2460cttacttcca tgatttcttt aactatgccg gaatccatcg cagcgtaatg ctctacacca 2520cgccgaacac ctgggtggac gatatcaccg tggtgacgca tgtcgcgcaa gactgtaacc 2580acgcgtctgt tgactggcag gtggtggcca atggtgatgt cagcgttgaa ctgcgtgatg 2640cggatcaaca ggtggttgca actggacaag gcactagcgg gactttgcaa gtggtgaatc 2700cgcacctctg gcaaccgggt gaaggttatc tctatgaact gtgcgtcaca gccaaaagcc 2760agacagagtg tgatatctac ccgcttcgcg tcggcatccg gtcagtggca gtgaagggcg 2820aacagttcct gattaaccac aaaccgttct actttactgg ctttggtcgt catgaagatg 2880cggacttacg tggcaaagga ttcgataacg tgctgatggt gcacgaccac gcattaatgg 2940actggattgg ggccaactcc taccgtacct cgcattaccc ttacgctgaa gagatgctcg 3000actgggcaga tgaacatggc atcgtggtga ttgatgaaac tgctgctgtc ggctttaacc 3060tctctttagg cattggtttc gaagcgggca acaagccgaa agaactgtac agcgaagagg 3120cagtcaacgg ggaaactcag caagcgcact tacaggcgat taaagagctg atagcgcgtg 3180acaaaaacca cccaagcgtg gtgatgtgga gtattgccaa cgaaccggat acccgtccgc 3240aagtgcacgg gaatatttcg ccactggcgg aagcaacgcg taaactcgac ccgacgcgtc 3300cgatcacctg cgtcaatgta atgttctgcg acgctcacac cgataccatc agcgatctct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Claims (41)

1．一种调节真核细胞中程序性细胞死亡的方法，所述方法包括使用(Ⅰ)ZAP类的聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)基因的核苷酸序列，和(Ⅱ)NAP类的PARP基因的核苷酸序列，以降低所述真核细胞中总PARP活性的功能水平。

2．权利要求1的方法，还包括通过使用ZAP类的所述PARP基因的所述核苷酸序列和NAP类的所述PARP基因的核苷酸序列降低与所述真核细胞同源的PARP基因的表达。

3．权利要求1的方法，还包括通过使用ZAP类的所述PARP基因的所述核苷酸序列和NAP类的所述PARP基因的核苷酸序列降低由内源PARP基因编码的蛋白质的表观活性。

4．权利要求1的方法，还包括用ZAP类的所述PARP基因的所述核苷酸序列和NAP类的所述PARP基因的核苷酸序列改变同源的PARP基因的核苷酸序列。

5．一种调节真核细胞中程序性细胞死亡(PCD)的方法，包括将第一和第二PCD调节嵌合基因引入所述真核细胞中，其中所述第一PCD调节嵌合基因包括以下可操纵地连接的DNA区：

a)第一启动子，在所述真核细胞中可操作；

b)第一DNA区，当转录时产生RNA分子，所述RNA分子或者

ⅰ)可以降低ZAP类含Zn-指的PARP蛋白质的功能水平；或者

ⅱ)可以被翻译成肽或蛋白质，当表达时该肽或蛋白质降低ZAP类的PARP蛋白质的功能水平；

c)涉及转录终止和聚腺苷酸化的DNA区；

并且其中所述第二PCD调节嵌合基因包括以下可操纵地连接的DAN区：

a)第二启动子，在所述真核细胞中可操作；

b)第二DNA区，当转录时产生RNA分子，所述RNA分子或者

ⅰ)可以降低NAP类的PARP蛋白质的功能水平；或者

ⅱ)可以被翻译成肽或蛋白质，当表达时该肽或蛋白质降低NAP类的PARP蛋白质的功能水平；

c)涉及转录终止和聚腺苷酸化的DNA区；

其中所述真核细胞中的总表观PARP活性被显著或者几乎完全降低。

6．权利要求5的方法，其中所述第一转录DNA区编码有义RNA分子，所述DNA区含有与ZAP类的内源PARP基因的有义DNA链具有75％相同性的至少约100个核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述有义RNA分子能够降低ZAP类的所述内源PARP基因的表达。

7．权利要求5的方法，其中所述第二转录DNA区编码有义RNA分子，所述DNA区含有与NAP类的内源PARP基因的有义DNA链具有75％相同性的至少约100个核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述有义RNA分子能够降低NAP类的所述内源PARP基因的表达。

8．权利要求7的方法，其中所述第一转录DNA区编码有义RNA分子，所述DNA区含有与ZAP类的内源PARP基因的有义DNA链具有75％相同性的至少约100个核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述有义RNA分子能够降低ZAP类的所述内源PARP基因的表达。

9．权利要求5的方法，其中所述第一转录DNA区编码反义RNA分子，所述DNA区含有与ZAP类的内源PARP基因的DNA链的互补序列具有75％相同性的至少约100个核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述反义RNA分子能够降低ZAP类的所述内源PARP基因的表达。

10．权利要求5的方法，其中所述的第二转录DNA区编码反义RNA分子，所述DNA区含有与NAP类的内源PARP基因的有义DNA链的互补体具有75％相同性的至少约100个核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述反义RNA分子能够降低NAP类的所述内源PARP基因的表达。

11．权利要求10的方法，其中所述第一转录DNA区编码反义RNA分子，所述DNA区含有与ZAP类的内源PARP基因的有义DNA链的互补链具有75％相同性的至少约100个核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述反义RNA分子能够降低ZAP类的所述内源PARP基因的表达。

12．权利要求5的方法，其中所述第一转录DNA区编码RNA分子，所述RNA分子含有与由ZAP类的内源PARP基因转录获得的mRNA具有75％相同性的至少约100个核苷酸的有义核苷酸序列，所述RNA分子还含有与由ZAP类的所述内源PARP基因转录获得的所述mRNA的互补链具有75％相同性的至少约100个核苷酸的反义核苷酸序列，其中所述有义和反义核苷酸序列能够形成双链RNA区，并且其中所述RNA分子能够降低ZAP类的所述内源PARP基因的表达。

13．权利要求5的方法，其中所述第二转录DNA区编码RNA分子，所述RNA分子含有与由NAP类的内源PARP基因转录获得的mRNA具有75％相同性的至少约100个核苷酸的有义核苷酸序列，所述RNA分子还含有与由NAP类的所述内源PARP基因转录获得的所述mRNA的互补链具有75％相同性的至少约100个核苷酸的反义核苷酸序列，其中所述有义和反义核苷酸序列能够形成双链RNA区，并且其中所述RNA分子能够降低NAP类的所述内源PARP基因的表达。

14．权利要求10的方法，其中所述第一转录DNA区编码RNA分子，所述RNA分子含有与由ZAP类的内源PARP基因转录获得的mRNA具有75％相同性的至少约100个核苷酸的有义核苷酸序列，所述RNA分子还含有与由ZAP类的所述内源PARP基因转录获得的所述mRNA的互补链具有75％相同性的至少约100个核苷酸的反义核苷酸序列，其中所述有义和反义核苷酸序列能够形成双链RNA区，并且其中所述RNA分子能够降低ZAP类的所述内源PARP基因的表达。

15．权利要求5的方法，其中所述第一转录DNA区编码显性阴性PARP突变体，该突变体能够降低由ZAP类的内源PARP基因编码的PARP蛋白质的表观活性。

16．权利要求5的方法，其中所述第二转录DNA区编码显性阴性PARP突变体，该突变体能够降低由NAP类的内源PARP基因编码的PARP蛋白质的表观活性。

17．权利要求16的方法，其中所述第一转录DNA区编码显性阴性PARP突变体，该突变体能够降低由ZAP类的内源PARP基因编码的PARP蛋白质的表观活性。

18．权利要求16的方法，其中所述显性阴性PARP突变体含有选自SEQID No 4从氨基酸1到159的氨基酸序列或SEQ ID No 6从氨基酸1到138的氨基酸序列的氨基酸序列。

19．权利要求17的方法，其中所述显性阴性PARP突变体含有选自SEQID No 2从氨基酸1到370的氨基酸序列、SEQ ID No 11从氨基酸1到98的氨基酸序列或SEQ ID No 2从氨基酸1到370的氨基酸序列的氨基酸序列，其中该氨基酸序列从氨基酸1到88被SEQ ID No 11的氨基酸序列替换。

20．权利要求5的方法，其中所述第一或所述第二启动子为组织特异性或可诱导的启动子。

21．权利要求20的方法，其中所述第一或所述第二启动子选自真菌响应性启动子、线虫响应性启动子、花药选择性启动子、柱头选择性启动子、开裂区选择性启动子。

22．权利要求5-21任一项的方法，其中所述总表观PARP活性从所述真核细胞中正常表观PARP活性的约75％降低至约90％，并且其中所述真核细胞防止了程序性细胞死亡。

23．权利要求5-21任一项的方法，其中所述总表观PARP活性比所述真核细胞中正常表观PARP活性降低约90％至约100％，并且其中所述真核细胞受程序性细胞死亡杀死。

24．权利要求22的方法，其中所述真核细胞为植物细胞。

25．权利要求23的方法，其中所述真核细胞为植物细胞。

26．一种调节植物细胞中程序性细胞死亡的方法，包括将PCD调节嵌合基因引入所述植物细胞中，其中所述PCD调节嵌合基因包括以下可操纵地连接的DNA区：

a)植物表达的启动子；

b)DNA区，当转录时产生RNA分子，所述RNA分子或者

ⅰ)能够降低内源PARP基因的表达；或者

ⅱ)能够被翻译成肽或蛋白质，当表达时该肽或蛋白质降低所述植物细胞中的表观PARP活性；以及

c)涉及转录终止和聚腺苷酸化的DNA区；其中所述植物细胞中的总表观PARP活性比所述植物细胞中的正常表观PARP活性降低约75％至约100％。

27．权利要求5-21任一所述的第一和第二嵌合PCD调节基因。

28．含有权利要求27的第一和第二嵌合PCD调节基因的真核细胞。

29．权利要求28的真核细胞，它为植物细胞。

30．含有权利要求28的真核细胞的非人真核有机体。

31．含有权利要求29的植物细胞的植物。

32．权利要求31的植物的种子，含有权利要求27的第一和第二嵌合PCD调节基因。

33．一种调节植物细胞中程序性细胞死亡的方法，所述方法包括将PCD调节嵌合基因引入所述植物细胞中，其中所述PCD调节嵌合基因包括以下可操纵地连接的DNA区：

a)植物表达的启动子；

b)DNA区，当转录时产生RNA分子，所述RNA分子能够降低ZAP类的内源PARP基因的表达；和

c)涉及转录终止和聚腺苷酸化的DNA区。

34．一种增加植物生长速度的方法，所述方法包括将PCD调节嵌合基因引入所述植物细胞中，其中所述PCD调节嵌合基因包括以下可操纵地连接的DNA区：

a)植物表达的启动子；

b)DNA区，当转录时产生RNA分子，所述RNA分子能够降低ZAP类的内源PARP基因的表达；和

c)涉及转录终止和聚腺苷酸化的DNA区。

35．一种生产植物的耐逆境细胞的方法，所述方法包括将PCD调节嵌合基因引入所述植物细胞中，其中所述PCD调节嵌合基因包括以下可操纵地连接的DNA区：

a)植物表达的启动子；

b)DNA区，当转录时产生RNA分子，所述RNA分子能够降低ZAP类的内源PARP基因的表达；和

c)涉及转录终止和聚腺苷酸化的DNA区。

36．编码具有PARP活性的蛋白质的核苷酸序列在调节植物细胞或植物中程序性细胞死亡的用途。

37．根据权利要求36的用途，其中所述具有PARP活性的蛋白质为ZAP类的PARP蛋白质。

38．编码具有PARP活性的蛋白质的核苷酸序列在产生耐逆境植物细胞或植物的用途。

39．根据权利要求38的用途，其中具有PARP活性的所述蛋白质为ZAP类的PARP蛋白质。

40．编码具有PARP活性的蛋白质的核苷酸序列在增加植物细胞或植物生长速度的用途。

41．根据权利要求40的用途，其中具有PARP活性的所述蛋白质为ZAP类的PARP蛋白质。

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