CN1262555C

CN1262555C - 柚皮甙、柚皮芸香甙、橙皮甙和新橙皮甙高纯度分离纯化方法

Info

Publication number: CN1262555C
Application number: CN 200410053284
Authority: CN
Inventors: 范国荣; 彭金咏; 吴玉田; 洪战英; 柴逸峰; 汪学昭
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2004-07-29
Filing date: 2004-07-29
Publication date: 2006-07-05
Anticipated expiration: 2024-07-29
Also published as: CN1587272A

Abstract

应用高速逆流色谱分离纯化高纯度柚皮甙、柚皮芸香甙、橙皮甙和新橙皮甙；它包括(1)配制构成固定相、流动相的溶剂体系，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱内，由进样阀进样，根据检测谱图接收目标成份。所构成的两相溶剂体系由乙酸乙酯、脂肪醇和水组成，(2)，由(1)得到的部分分离物再以高速逆流色谱作分离纯化，溶剂体系为氯仿、脂肪醇和水。该方法适用于以各种途径获得的各种含柚皮甙、柚皮芸香甙、橙皮甙和新橙皮甙中的一种或几种成份的天然产物、天然产物的提取物为原料制备高纯度单体，并且制备量大，分离效率高，简便易行，易于推广使用。

Description

柚皮甙、柚皮芸香甙、橙皮甙和新橙皮甙高纯度分离纯化方法

技术领域

本发明涉及中药有效成分的分离纯化方法，更具体地说，本发明涉及一种高纯度柚皮甙、柚皮芸香甙、橙皮甙和新橙皮甙的高速逆流色谱分离制备方法。

背景技术

枳壳为芸香科Rulaceae植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实，是临床上常用的理气药之一，具有理气开胸、行滞消胀等功效。所含化学成分主要有三大类：挥发油、黄酮和生物碱类，其中柚皮甙(Naringin)、柚皮芸香甙(Narirutin)、橙皮甙(Hesperidin)和新橙皮甙(Neohesperidin)是其黄酮的主要成分，结构如下。

柚皮甙新橙皮甙

柚皮芸香甙橙皮甙

现代药理研究表明，枳壳黄酮具有广泛的药理活性，如抗氧化、抗炎、抗癌等，为了对枳壳黄酮进行更深入的药理活性与作用机制等研究，同时需要黄酮等指标性成份对枳壳类药材和相关中药制剂进行质量控制，这就需要大量的单体化合物。因此，如何快速、高效的从枳壳等中药中分离纯化柚皮甙、柚皮芸香甙、橙皮甙和新橙皮甙，对开发具有特殊疗效的现代中药制剂和充分利用我国的药材资源等具有重要意义。

采用普通柱色谱法、重结晶和高效液相色谱法等传统的分离制备方法分离植物中的有效单体，不仅费时费力、污染环境[C.L Ky，M.Noirot，S.Hamon，J.Agric.Food.Chem.1997，45：786；W.M.Yan，Acta BotanicaSinica，1979，20：54；J.J Liu，G.L. Zhao，H.Wang，X.H.Zhang，J.Cent.South.Univ.T.2002，9：246]，而且所用固定相对样品有不可逆性吸附作用，这就需要一种新型的分离技术来解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种从粗提物中分离纯化高纯度柚皮甙、柚皮芸香甙、橙皮甙和新橙皮甙的方法，以克服现有技术中存在的上述问题。

本发明是从粗提物中分离纯化高纯度单体化合物，具体包括：

1.粗提物的制备

粗提物可以由中药枳壳、枳实、橙皮、青皮或饮料橙汁为原料，采用乙醇提取后萃取或过大孔吸附树脂等方法获得。原料粗粉用60％乙醇回流提取，减压浓缩至无醇味后，加到1300型大孔吸附树脂上，用水和不同浓度乙醇剃度洗脱，接收70％乙醇洗脱物，减压浓缩后真空干燥即得粗提物。

2.粗提物的的分离纯化

应用高速逆流色谱分离纯化，它包括步骤(1)配制构成固定相、流动相的溶剂体系，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱内，由进样阀进样，其溶剂体系由乙酸乙酯、正丁醇、水组成，根据检测谱图接收目标成份，分离得到“I”、“II”、“III”三个部分。

步骤(2)，由步骤(1)得到的分离物“I”、“II”这两部分再以高速逆流色谱作分离纯化，其溶剂体系由氯仿、脂肪醇、水组成。脂肪醇为甲醇、正丁醇，遂根据检测谱图接收目标成份。

其中，乙酸乙酯、正丁醇、水体系的用量体积比为2∶1∶3，氯仿、甲醇、正丁醇、水体系的用量体积比为4∶3∶0.5-1∶2-3。

3.分离物的纯度检测与结构鉴定

采用高效液相色谱法对分得组分进行纯度检测(峰面积归一化法)，挥干溶剂后溶于DMSO进行¹HNMR和¹³CNMR分析，根据核磁数据进行结构确认。

本发明是采用高速逆流色谱仪，配以适宜的溶剂体系对粗提物进行分离纯化，由于不用固态支撑体，完全排除了支撑体对样品组分的吸附、沾染、变性、失活等不良影响，避免了不可逆吸附所造成的溶质色谱峰拖尾现象，提高了回收率；由于分配分离是在旋转运动中完成的，两相溶剂都被剧烈振动的离心力场依其界面特征甩成极微小的颗粒，样品各组分会在两相微粒的极大表面上分配，并且能在颗粒振荡与对流的环境中有效地传递，所以，它就象是把通常的溶剂萃取过程成千上万地、高效地、自动连续地予以完成；没有填料在柱内的占空体积，逆流色谱的分离柱又容易做得容积大些，柱内空间全部是有效空间，所以，它的样品负载能力很强，制备量较大，而且重现性很好；由于不用填料，分离过程不是淋洗或洗脱过程，而是对流穿透过程，所以，能节省昂贵的材料消耗和溶剂消耗，运行使用的后续投入较低，而它对于样品预处理条件的放松以及它的回收率高、制备量大的优点，作为特定部位的特定组分的分离纯化与制备则是十分可取的。克服了传统制备方法操作繁琐、分离周期长等缺点，并具有制备量大、分离效率高、产品纯度好、简便易行等优点，易于推广使用。

下面结合具体实施例及附图对本发明进行说明。

附图说明

图1为枳壳粗提物半制备型高速逆流色谱(HSCCC)的色谱图

图2为分离图1中“I”部分的高速逆流色谱(HSCCC)的色谱图

图3为分离图1中“II”部分的高速逆流色谱(HSCCC)的色谱图

图4为枳壳粗提物及各分离部分的高效液相色谱(HPLC)的色谱图

具体实施方式

实施例1：

1.称取200g枳壳生药，磨成粗粉，置2000ml圆底烧瓶中，加入60％乙醇1600ml，回流提取2次，每次1.5h，过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪减压挥去乙醇(温度60℃)，得水混悬物。

2.取500g 905型大孔吸附树脂，用95％的药用乙醇浸泡，使其充分溶涨后再换液数次直到取1ml乙醇浸泡液加5ml水不显白色浑浊为止。再将此树脂装柱(6.0×70cm)，用蒸馏水冲洗树脂直到无醇味。

3.将枳壳提取得到的水混悬物加到预处理好的层析柱上，吸附一段时间后，依次用水、20％乙醇、70％乙醇洗脱，接收70％乙醇洗脱物，用旋转蒸发仪减压浓缩成浸膏，浓缩温度60℃，再减压干燥，干燥温度60℃，得到粗提物20.6g，提取率10.3％。

4.应用高速逆流色谱(深圳同田生化有限公司)分离纯化枳壳粗提物。

a溶剂体系及用量体积比为乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3，逆流色谱柱体积为300ml，上样量500mg，转速800rpm，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0ml/min，固定相保留率45％，检测波长280nm，在此情况下记录的色谱图见图1。

具体的操作步骤是：按上述溶剂体积比配制溶剂体系，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，分取上下相，上相为固定相，下相为流动相。先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，再泵入流动相，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成份，结果分离得到三个部分。

高效液相色谱分析表明：“I”部分为一未知成份与橙皮甙的混合物，“II”部分为柚皮芸香甙和新橙皮甙的混合物，“III”部分为柚皮甙，峰纯度大于99％。

b将a分离得到的“I”部分应用高速逆流色谱仪再次分离纯化。

柱体积300ml，转速800rpm，所用溶剂体系为氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水＝4∶3∶1∶3，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0ml/min，检测波长280nm，操作同a，固定相保留率为50％，分离见图2，其中1号峰为橙皮甙，2号峰为未知成份。

c将a分离得到的“II”部分应用高速逆流色谱仪再次分离纯化。

柱体积300ml，转速800rpm，溶剂体系为氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水＝4∶3∶0.5∶2，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0ml/min，操作方法同a，固定相保留率为75％，分离见图3，其中3号峰为新橙皮甙，4号峰为柚皮芸香甙。

对分离得到的1、3、4号峰再进行峰纯度检测，

按上述条件得到的柚皮甙、柚皮芸香甙、橙皮甙和新橙皮甙的纯度用HPLC进行检测，结果都高达99％以上(峰面积归一化法)。

HPLC分析条件：色谱柱Lichrospher C18(6.0×150mm i.d.5μm)，流动相为CH₃CN∶H₂0∶HAC＝20∶80∶1，流速0.8ml/min，检测波长280nm，在此条件下枳壳粗提物及各分离部分的色谱图见图4，其中①为枳壳粗提物色谱图，②为“I”部分色谱图，③为“II”部分色谱图，④为“III”部分即柚皮甙的色谱图，⑤为橙皮甙的色谱图，⑥为柚皮芸香甙的色谱图，⑦为新橙皮甙的色谱图。

结构鉴定：对分离得到的柚皮芸香甙、柚皮甙、橙皮甙和新橙皮甙在Varian INOVA-400型核磁共振仪上，以DMSO为溶剂进行¹HNMR和¹³CNMR分析，核磁数据如下。

柚皮芸香甙：¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.06(1H，s，5-OH)，9.64(1H，s，4′-OH)，7.36(2H，d，J＝9.1Hz，H-2′，6′)，6.74(1H，d，J＝1.8Hz，H-3′，5′)，6.14(1H，d，J＝2.2Hz，H-8)，6.07(1H，d，J＝1.8Hz，H-6)，5.49(1H，m，H-2)，3.05(1H，m，H-3).¹³C-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：C₂-C₁₀：147.88，135.45，177.56，161.31，98.81，164.24，93.76，156.94，104.28；C_1″-C_6′：121.58，129.4，115.47，159.36，115.53，129.55；C_1″-C_6″：98.42，77.28，77.15，70.14，76.77，60.90；C_1-C_6:100.47，70.32，70.68，72.01，68.14，17.68.

柚皮甙：¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.01(1H，s，5-OH)，9.59(1H，s，4′-OH)，7.32(2H，d，J＝9.0Hz，H-2′，6′)，6.78(2H，d，J＝2.0Hz，H-3′，5′)，6.11(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.07(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，5.32(1H，d，J＝6.0Hz，H-1″)，5.15(1H，d，J＝2.0Hz，H-1)，3.13(1H，m，H-3)，2.78(1H，m，H-6).¹³C-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：C₂-C₁₀(79.01，42.12，197.29，163.21，96.51，164.79，95.22，163.13，103.51)，128.81(C-1′)，115.54(C-3′)，157.93(C-4′)，115.44(C-5′)，128.62(C-2′，6′)，97.78(C-1″)，77.34(C-2″)，77.03(C-3″)，69.79(C-4″)，76.54(C-5″)，60.72(C-6″)，100.54(C-1)，70.61(C-2)，70.69(C-3)，71.91(C-4)，68.38(C-5)，18.09(C-6).

橙皮甙：¹用NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.02(1H，s，5-OH)，9.12(1H，s，3′-OH)，6.91(3H，m，H-2′，5′，6′)，6.13(1H，H-8)，5.47(1H，m，H-2)，3.15(2H，dd，H-3)，6.11(1H，H-6)，4.97(1H，d，J＝6.8Hz，H-1″)，4.51(1H，H-1)，1.11(3H，d，J＝6.2Hz，CH₃).¹³C-NMR(400Mz，DMSO-d₆)δ：196.81(C-4)，164.80(C-7)，162.89(C-5)，162.18(C-9)，147.80(C-4′)，146.27(C-3′)，130.78(C-1′)，117.88(C-6′)，114.05(C-2′)，111.20(C-5′)，103.24(C-10)，96.31(C-6)，95.50(C-8)，78.34(C-2)，42.07(C-3)，55.68(C-4)，99.30(C-1″)，76.20(C-3″)，75.48(C-5″)，73.01(C-2″)，69.56(C-4″)，66.10(C-6″)，100.56(C-1)，70.28(C-2)，70.68(C-3)，72.05(C-4)，68.32(C-5)，17.95(C-6).

新橙皮甙：¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.03(1H，s，OH-5)，9.13(1H，S，OH-3′)，6.95(1H，d，J＝8.1Hz，H-5′)，6.91(1H，d，J＝2.7Hz，H-2′)，6.88(1H，dd，J＝8.1，2.7Hz，H-6′)，6.12(1H，d，J＝0.9Hz，H-6)，6.10(1H，d，J＝0.9Hz，H-8)，5.49(1H，dd，J＝12.0，1.2Hz，H-2)，5.30(1H，d，J＝4.8Hz，OH)，5.12(1H，d，J＝5.1HZ，H-1″)，5.10(1H，d，J＝2.0Hz，H-1)，4.72((1H，d，J＝.2Hz，OH)，4.66(1H，d，J＝4.2Hz，OH)，4.58(1H，m，OH)，4.48(1H，d，J＝6.0Hz，OH)，3.75(3H，s，4′-OCH₃)，3.68(3H，m)，3.45(4H，m)，3.16(1H，dd，J＝17.1，12.0Hz，H-3a)，3.12(1H，m)，2.74(1H，dd，＝17.1，1.2Hz，H-3β)，1.14(3H，d，J＝6.0Hz，H-6).¹³C-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：196.87(C-4)，164.65(C-7)，163.01(C-5)，162.37(C-9)，147.80(C-4′)，146.31(C-3′)，130.75(C-1′)，117.70(C-6′)，113.97(C-5′)，111.90(C-2′)，103.22(C-10)，100.30(C-1″)，97.31(C-1)，96.18(C-6)，95.07(C-8)，78.35(C-2)，77.08(C-3″)，76.86(C-5″)，75.99(C-2″)，71.70(C-4)，70.39(C-3)，70.30(C-2)，69.54(C-4″)，68.25(C-5)，60.38(C-6″)，55.65(4′-OCH₃)，42.17(C-3)，18.12(C-6).

实施例2：

1.称取200g青皮生药，磨成粗粉，置2000ml圆底烧瓶中，加入60％乙醇1600ml，回流提取2次，每次1.5h，过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪减压挥去乙醇(温度60℃)，得浸膏。

2.取青皮浸膏物加500ml水混悬后，用石油醚脱脂两次，每次500ml，分取水层，再用正丁醇萃取3次，每次500ml，减压回收正丁醇萃取液至浸膏，将所得浸膏真空干燥，得浅黄色粉末，称重15.8g，提取率为7.9％。

3.应用高速逆流色谱(深圳同田生化有限公司)分离纯化青皮正定丁醇萃取物。

a粗提物分离所用溶剂体系及用量体积比与分离结果同“实施例1”。

b将a分离得到的“I”部分应用高速逆流色谱仪再次分离纯化，所用溶剂体系为氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水＝4∶3∶1∶2，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0ml/min，固定相保留率为48％。

c将a分离得到的“II”部分应用高速逆流色谱仪再次分离纯化，溶剂体系为氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水＝4∶3∶0.5∶3，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0ml/min，固定相保留率为55％。

具体操作基本上同“实施例1”。所得流份经液相色谱和核磁分析表明产物纯度高于98％。

Claims

1.一种柚皮甙、柚皮芸香甙、橙皮甙和新橙皮甙的高纯度分离纯化方法，由粗提物的制备和粗提物的分离纯化两部分组成，其特征在于粗提物的分离纯化应用高速逆流色谱，它包括步骤(1)配制构成固定相、流动相的溶剂体系，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱内，由进样阀进入制备好的粗提物样品，所构成的两相溶剂体系由乙酸乙酯、正丁醇和水组成，它们的用量体积比为2∶1∶3，以上相为固定相，下相为流动相，根据检测谱图接收目标成份，分离得到“I”、“II”、“III”三个部分，步骤(2)由步骤(1)得到的分离物“I”、“II”这两部分再以高速逆流色谱作分离纯化，溶剂体系为氯仿、甲醇、正丁醇和水，它们的用量体积比为4∶3∶0.5-1∶2-3，根据检测谱图接收目标成份。

2.根据权利要求1所述的柚皮甙、柚皮芸香甙、橙皮甙和新橙皮甙的高纯度分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)中所述的制备好的粗提物样品以中药枳壳、枳实、橙皮、青皮或饮料橙汁为原料制备，粗提物的制备采用乙醇提取后萃取或过大孔吸附树脂方法获得。

3.根据权利要求1或2所述的柚皮甙、柚皮芸香甙、橙皮甙和新橙皮甙的高纯度分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)中所述的制备好的粗提物样品是以枳壳为原料经乙醇提取后过大孔吸附树脂获得。

4.根据权利要求1所述的柚皮甙、柚皮芸香甙、橙皮甙和新橙皮甙的高纯度分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述的溶剂体系乙酸乙酯、正丁醇、水的用量比为2∶1∶3，所述步骤(2)中，从步骤(1)得到的分离物“I”再以高速逆流色谱作分离纯化，所用的溶剂体系中氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水的用量体积比为4∶3∶1∶3。

5.根据权利要求1所述的柚皮甙、柚皮芸香甙、橙皮甙和新橙皮甙的高纯度分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述的溶剂体系乙酸乙酯、正丁醇、水的用量比为2∶1∶3，所述步骤(2)中，从步骤(1)得到的分离物“II”再以高速逆流色谱作分离纯化，所用的溶剂体系中氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水的用量体积比为4∶3∶0.5∶2。