CN1233256A - 作为激肽原酶抑制剂的二肽苄脒 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了式Ⅰ化合物及其制备方法:其中R,R1,R2,R3,R4,R5和R6,以及l,m和n的定义见说明书所述。这些新化合物适于防治疾病。本发明还描述了具有式(Ⅱ)的化合物,其中基团R,R1,R2,R3,R4,R5和R6以及,m和n具有权利要求1中所给定的意义。本发明还描述了式(Ⅲ)化合物,其中l和R具有权利要求1中所给定的意义,Y是N保护基或N－端基保护的或未护的氨基酸或代表H。

Description

作为激肽原酶抑制剂的二肽苄脒
本发明涉及新的苄脒类化合物，其制备方法以及它们作为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(特别是凝血酶和激肽原酶如激肽释放酶)的竞争性抑制剂的应用。本发明还涉及包含所述化合物作为活性成分的药物组合物，以及所述化合物作为凝血酶抑制剂、抗凝血剂和消炎药的用途。
凝血酶属于丝氨酸蛋白酶一族，并且作为末端酶在凝血级联系统中起着重要作用。内源性和外源性凝血级联系统经过多次放大阶段由凝血酶原产生凝血酶。凝血酶催化血纤蛋白原裂解成血纤蛋白，进而引发血液凝聚和血小板聚集，且这种作用本身由于血小板因子3与凝聚因子ⅩⅢ以及大量高活性介质的结合而增强了凝血酶形成。
凝血酶的形成及作用对于动脉白血栓和静脉红血栓的形成都是重要的，并因此是药物进攻的有效位点。与肝素相比，凝血酶抑制剂能完全不依赖辅因子而同时抑制自由凝血酶的作用和与血小板结合的凝血酶作用。它们能防止经皮经管腔冠状血管成形术(PTCA)和松解术后的急性期血栓栓塞突发，并且在体外循环(人工心-肺机，血液透析)方面用作抗凝聚剂。通常它们还可用于预防凝血，例如在外科手术后的凝血。
业已知道，合成精氨酸衍生物通过与蛋白酶凝血酶的活性丝氨酸残基相互作用而影响凝血酶的酶活性。已经证明，基于Phe-Pro-Arg的肽(其中N-端氨基酸为D型)特别有效。D-Phe-Pro-Arg异丙酯已被称作竞争性凝血酶抑制剂(C.Mattson等，Folia Haematol,109(1983)43-51)。
将精氨酸的C端衍生成醛能够提高抑制效果。例如，现有技术中已记载了大量能与“活性”丝氨酸的羟基基团结合成半缩醛的精氨醛(EP 185390,479489,526877,542525；WO 93/15756,93/18060)。
同样，根据与丝氨酸的这种相互作用可以解释肽酮、氟化烷基酮和酮酯、硼酸衍生物、磷酸酯和α-酮基甲酰胺类化合物的凝血酶抑制活性(EP 118280,195212,362002,364344,410411,471651,589741,293881,503203,504064,530167；WO 92/07869,94/08941)。
Oleksyszyn等人在药物化学杂志(J.Med.Chem.)37(1994)226-231中记载的肽4-脒基苯甘氨酸膦酸二苯酯是对其它丝氨酸蛋白酶具有不适当选择性的不可逆凝血酶抑制剂。
DE 3108810,WO 93/11152和EP601459中记载了不能与丝氨酸蛋白酶中活性丝氨酸相互作用的胍基丁胺和相应的精氨酸衍生物。
WO 94/29336,EP 0601459和WO95/23609中描述了用芳脒残基置换胍基丁胺的进一步研究。
激肽原酶是能促进激肽原释出称作激肽(缓激肽，胰激肽和Met-Lys-缓激肽)的血管活性肽的丝氨酸蛋白酶。而激肽原则是存在于凝血和炎症级联反应中的多功能蛋白质。作为抑制剂，它们保护细胞免受半胱氨酸蛋白酶引起的损伤(Muller Esterl,FEBS Lett.182(1985)310-314)。
重要的激肽原酶包括血浆激肽释放酶，组织激肽释放酶和肥大细胞类胰蛋白酶。
象缓激肽和胰激肽之类的激肽是能影响大量生物过程的血管活性肽。它们在炎症过程中起着重要作用。通过增强血管通透性，它们引起低血压和水肿。此外，它们是非常有效的致痛素，而且作为细胞介质在哮喘、变应性鼻炎及关节炎的病理生理学方面也具有非常重要作用(K.D.Bhoola,C.D.Figueroa,K.Worthy,PharmacologicalReviews 44(1992)1-80)。
与炎症过程的作用机理无关，在血液循环过程中，包含所有蛋白质系统的液体都可以自血管中逸出。这意味着，血浆液体自血管中选出可能与诸如哮喘、鼻炎以及炎症性内质病之类疾病有关。此外，在变应性过程中还特别释出肥大细胞类胰蛋白酶(Sal omonsson等，Am.Rev.Respir.Dis.,1992,146,1535-1542)。
Kettner和Shaw描述了可用作血浆激肽释放酶抑制剂的精氨酸氯甲基酮H-(D)-Pro-Phe-Arg-CH2Cl和H-(D)-Phe-Phe-Arg-CH2-Cl(Biochem.17(1978)4778-4874和Meth.Enzym.80(1981)826-842)。
苄脒和苄胺的各种合成衍生物已被证实是血浆激肽释放酶抑制剂，而且其中苄脒类化合物具有更强的抑制作用(F.Markward,S.Drawert,P.Walsmann,Biochemical Pharmacology 23(1974)2247-2256)。
PKSI-527,即N-(反式4-氨基甲基环己基羰基)-L-苯丙氨酸-4-羧甲基苯胺也是这种激肽原酶的有效抑制剂(Wanaka,Ohamoto等人，Thromb.Res.,57(1990)889-895)。
本发明涉及式Ⅰ化合物及其与生理上所耐受的酸成的盐：Ⅰ，其中R,R1,R2,R3,R4,R5和R6，以及l,m和n的定义如下：l代表0或1,m代表0,1或2,n代表0,1或2,R代表H或C1-4-烷基-,R1代表HOOC-,C1-6-烷基-OOC-，苄基-OOC-或-OH,R2代表H-,C1-4-烷基-或R1-(CH2)m-,R3代表H-或C1-4-烷基-，该烷基可被-OH或-COOH取代，R4代表H-,C1-6-烷基-，HOOC-C1-6-亚烷基-,R5代表C1-8-烷基-，环烷基-(CR8R9)r-,(r=0或1,R8,R9=H-，环烷基-或C1-6-烷基)，其中环烷基中多至4个CH2基团可彼此独立地被CR10R11(R10=H-或C1-4-烷基-,R11=C1-4-烷基-)置换，和/或环烷基基团中与CR8R9键连的CH2基团可以被CR12(R12=C1-4-烷基-)置换，和/或环中的一个或两个C-C单键可以被C=C双键置换，R6代表H-,C1-4-烷基-，或者R4与R5一起代表-CH2-CH2-CH(R7)-,(R7=H-，苯基-或环己基-)R2与R5-起代表-CH2-CH2-或-CH2-CH2-CH2-，其中的一个氢原子可以被C1-4-烷基-，苯基-或环烷基-置换。
-NR4-C(R5R6)-CO-所示的氨基酸残基优选具有(D)构型，且3,4-脱氢脯氨酸和4,5-脱氢-2-哌啶酸优选具有(L)构型。
优选的式Ⅰ化合物为这些化合物，其中
Figure A9719872100081
代表HOOC-(CH2)t-(t=1,2或3),(HOOC-CH2)2-CH-,(HO-CH2)2CH-,HOOC-CH2-CH(COOH)-,HOOC-CH(CH2-CH2-OH)-,HOOC-CH(C1-4-烷基-),C1-4-烷基-OOC-CH2-，苄基-OOC-CH2-，以及其中的代表：
Figure A9719872100083
(Ra,Rb=H,环己基-或C1-4-烷基-)
(Rc,Rd,Re,Rf,Rg,Rh=H-或C1-4-烷基-，其中环中的CH2-基团可以被单-或二取代)，
Figure A9719872100091
(R1=苯基-或环己基-)，(Rj=环戊基-，环庚基-，1-金刚烷基-，1-降冰片基-，1-二环[2.2.2]辛基-，新戊基-，叔丁基-，二异丙基甲基-或1-(1,4-环己二烯基-))，其中该结构单元优选具有D构型，l代表0，且R代表H-或CH3-。
进一步优选这些式Ⅰ化合物，其中代表HOOC-(CH2)t-(t=1,2或3),(HOOC-CH2)2-CH-,(HO-CH2)2CH-,HOOC-CH2-CH(COOH)-,HOOC-CH(CH2-CH2-OH)-,HOOC-CH(C1-4-烷基)-,C1-4-烷基-OOC-CH2-，苄基-OOC-CH2，以及其中的
Figure A9719872100094
代表：
Figure A9719872100101
(Ra,Rb=H，环己基-或C1-4-烷基-)(Rc,Rd,Re,Rf,Rg,Rh=H-或C1-4-烷基-，其中环上的CH2基团可被单或二取代)，
Figure A9719872100102
(R1=苯基-或环己基-)，
Figure A9719872100104
(Rj=环戊基-,环庚基-,1-金刚烷基-,1-降冰片基-,1-二环[2.2.2]辛基-,新戊基-,叔丁基-,二异丙基甲基-或1-(1,4-环己二烯基-))，其中该结构单元优选具有D构型，l代表1，和R代表H-或CH3-。
同样还优选具有下式结构单元的化合物：
Figure A9719872100111
其中l为0或1，且R为H或C1-4-烷基，特别是CH3。
优选的中间体为式Ⅱ化合物：
Figure A9719872100112
Ⅱ其中：代表HOOC-(CH2)t-(t=1,2或3),(HOOC-CH2)2-CH-,(HO-CH2)2CH-,HOOC-CH2-CH(COOH)-,HOOC-CH(CH2-CH2-OH)-,HOOC-CH(C1-4-烷基)-，C1-4-烷基-OOC-CH2-，苄基-OOC-CH2，且其中的代表：
Figure A9719872100121
(Ra,Rb=H，环己基-或C1-4-烷基-)(Rc,Rd,Re,Rf,Rg,Rh=H-或C1-4-烷基-，其中环上的CH2基团可被单或二取代)，
Figure A9719872100122
Figure A9719872100123
(Ri=苯基-或环己基-)，
Figure A9719872100124
(Rj=环戊基-，环庚基-,1-金刚烷基-,1-降冰片基-,1-二环[2.2.2]辛基-，新戊基-，叔丁基-，二异丙基甲基-或1-(1,4-环己二烯基-))，其中该结构单元优选具有D构型，l代表0或1，和R代表H-或CH3-。
进一步有价值的中间体为下式化合物：Ⅲ，其中l和R具有权利要求1中所述的含义，且Y代表N保护基，N-端被保护的或未保护的氨基酸或H-。
优选的式Ⅲ化合物为如下定义的化合物，其中：Y代表Boc-,Boc-Cha-,H-Cha-,Boc-Chg-,H-Chg或H,l代表0或1，且R代表H或CH3。
下列物质特别优选：1．HOOC-CH2-(D)-Cha-Pyr-NH-4-amb2．HOOC-(CH2)2-(D)-Cha-Pyr-NH-4-amb3．(HOOC-CH2)2CH-(D)-Cha-Pyr-NH-4-amb4．(HO-CH2)2CH-(D)-Cha-Pyr-NH-4-amb5．HOOC-CH2-CH(COOH)-(D)-Cha-Pyr-NH-4-amb6．HOOC-CH2-(D)-Chg-Pyr-NH-4-amb7．HOOC-CH2-(D)-(α-Me)Cha-Pyr-NH-4-amb8．HOOC-CH2-(D,L)-(1-Me)Cha-Pyr-NH-4-amb9．HOOC-CH2-(D,L)-(β,β-Me2)Cha-Pyr-NH-4-amb10．HOOC-CH2(D,L)-(反4-Me)Cha-Pyr-NH-4-amb11．HOOC-CH2-(D,L)-环庚基丙氨酸-Pyr-NH-4-amb12．HOOC-CH2-(D,L)-1-金刚烷基丙氨酸-Pyr-NH-4-amb13．HOOC-CH2-(D,L)-2-降冰片基甘氨酸-Pyr-NH-4-amb14．HOOC-CH2-(D,L)-(3,3-Me2)Cha-Pyr-NH-4-amb15．HOOC-CH2-(D)-叔丁基丙氨酸-Pyr-NH-4-amb16．HOOC-CH2-(D,L)(1,4-环己二烯-1-基)丙氨酸-Pyr-NH-4-amb17．HOOC-CH2-(D)-Cha-Dep-NH-4-amb18．HOOC-CH2-(D)-Chg-Dep-NH-4-amb19．HOOC-CH2-(D,L)-Dch-Pyr-NH-4-amb
这里及实施例中所用的缩写词含义如下：amb=脒基苄基Boc=叔丁氧基羰基Cha=环己基丙氨酸Chea=环庚基丙氨酸Chg=环己基甘氨酸Dch=二环己基丙氨酸Dpa=二苯基丙氨酸Me=甲基Pyr=3,4-脱氢脯氨酸Dep=4,5-脱氢-2-哌啶酸
在其中-NR4-CR5R6-CO-代表环己基丙氨酸残基的情况下，其中的各个碳原子标记如下：
Figure A9719872100141
式Ⅰ化合物可以以其本身形式存在，或者还可以以与生理上可耐受的酸所成的盐形式存在。这类酸的实例包括：盐酸，柠檬酸，酒石酸，乳酸，磷酸，甲磺酸，乙酸，甲酸，马来酸，富马酸，琥珀酸，羟基琥珀酸，硫酸，戊二酸，天冬氨酸，丙酮酸，苯甲酸，葡糖醛酸，草酸，抗坏血酸和乙酰甘氨酸。
式Ⅰ新化合物可用于下列适应症：-其发病机理直接或间接由凝血酶的蛋白酶解作用所致的疾病，-其发病机理由受体的凝血酶依赖性活化和信号转导所致的疾病，-与体细胞中基因表达的刺激[例如受PAI-1,PDGF(血小板衍生生长因子)，P-选择蛋白，ICAM-1，组织因子刺激]或抑制(例如在平滑肌细胞中不进行合成)有关的疾病，-由凝血酶的促有丝分裂作用所致的疾病，-上皮细胞(例如血管上皮细胞)的收缩性和通透性的凝血酶依赖性变化所致的疾病，-凝血酶依赖性血栓栓塞情况如深静脉血栓形成，肺栓塞，心肌或脑梗塞，心房纤维性颤动，旁路闭塞，-播散性血管内凝血(DIC),-再闭塞，以及与溶栓剂(如链激酶，尿激酶，尿激酶原，t-PA,APSAC，得自动物体唾液腺的血纤蛋白溶酶激活物，以及所有这些物质的重组和突变物)联合用于缩短再灌注时间，-PTCA后的早期再闭塞和晚期再狭窄的发生，-平滑肌细胞的凝血酶依赖性增殖，-活性凝血酶在CNS中(例如在Alzhemier病中)的聚集，-肿瘤生长，以及用于预防肿瘤细胞的粘连和转移。
具体讲，本发明的新化合物可用于治疗和预防凝血酶依赖性血栓栓塞情况如深静脉血栓形成，肺栓塞，心肌或脑梗塞和不稳定性心绞痛，同样还可以用于治疗播散性血管内凝血(DIC)。此外，它们还适于与溶栓剂如链激酶，尿激酶，尿激酶原，t-PA,APSAC和其它血纤蛋白溶酶激活物一起进行联合治疗，以缩短再灌注时间和延长再闭塞时间。
进一步优选的使用领域是用于预防经皮经管腔冠状血管成形术的凝血酶依赖性的早期再闭塞和晚期再狭窄、预防平滑肌细胞的凝血酶依赖性增殖、预防活化凝血酶在CNS中(例如在Alzheimer病中)的聚集、控制肿瘤以及防止导致肿瘤细胞粘连和转移的机理。
本发明的新化合物还可用于涂布各种人造器官的表面，例如血液透析膜和需要涂布的管道系统和线系(line)，以及用于涂布血管外循环的氧合器、斯坦特固定膜和心瓣膜的表面。
此外，本发明的新化合物还可用于其发病机理直接或间接由激肽原酶(特别是激肽释放酶)的蛋白酶解作用所致的疾病，例如用于炎症性疾病如哮喘，胰腺炎，鼻炎，关节炎，荨麻疹和其它内部炎症性疾病。
本发明新化合物的特别优越之处在于，通过用3,4-脱氢脯氨酸置换脯氨酸和用4,5脱氢2-哌啶酸置换2哌啶酸，它们显示出改进的药理作用，并因此而不同于WO94/29336中所记载的化合物。
本发明化合物可以以常规方式经口服或非肠道(皮下、静脉内、肌内、腹膜内、直肠)途径施用，也可以以气雾剂或喷雾剂形式通过鼻腔施用。
施用剂量取决于患者的年龄、病症和体重以及给药方式。因此，对于每位患者而言，活性物质的日剂量为大约10-2000mg(口服给药)和大约1-200mg(非肠道给药)。这一剂量可以分成2-4个单剂量形式，或者也可以积存形式每天给用一次。
本发明新化合物可以以常规的固体或液体药剂形式使用，例如未包衣或包衣片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、栓剂、溶液、软膏剂、霜剂或喷雾剂。它们按常规方式生产。为此，可将活性物质与常规药物助剂混合，其中所述药物助剂如压片用粘合剂，填料，防腐剂，片剂崩解剂，流动调节剂，成形剂，湿润剂，分散剂，乳化剂，溶剂，缓释剂，抗氧化剂和/或推进剂(参见H.Sucker等：制药技术(Pharmazeutische Technologie),Thieme-Verlag,Stuttgart,1978)。按这种方式得到的施用形式通常含有0.1-99wt.％活性物质。实验部分
式Ⅰ化合物可如反应路线Ⅰ-Ⅲ所示制备，其中A代表 B代表 C代表 D代表
Figure A9719872100164
且E具有反应路线中所述的含义。基团R,R1,R2,R3,R4,R5和R6，以及l,m和n的定义同上。
结构单元A,B,C和D最好先预先分别装配好，并以适当被护形式使用(参见反应路线Ⅰ-Ⅲ)。
如反应路线Ⅰ-Ⅲ所示，式Ⅰ化合物可以从适当保护的结构单元A,B,C,D和E开始制备。反应路线Ⅰ:
Figure A9719872100171
(P=保护基，(P)=保护基或H,(U)=离去基团或者(如果合适的话)为醛或酮，参见下文)。
反应路线Ⅰ描述了线性装配分子Ⅰ的过程，即将胺H-D-CN偶联到N-被护氨基酸P-C-OH上，得到P-C-D-CN，然后消去N-端保护基得到M-C-D-CN，再与N-被护氨基酸P-B-OH偶联得到P-B-C-D-CN，继之消去保护基P得到H-B-C-D-CN，随后用未保护或被护的(P)-A-U结构单元(U=离去基团)烷基化或用(P)-A′-U(U=醛、酮)还原性胺化，得到(P)-A-B-C-D-CN。按照经典的Pinner合成法(R.Boder,D.G.Neilson，化学评论(Chem.Rev.)61(1962)179)可以将腈官能团转化为脒基，这一转化还可以按照改进的Pinner合成法(该合成法经由作为中间体的亚氨基硫酯盐来进行)(H.Vieweg等，Pharmazie 39 1984)226)或按照A.Eschenmoser在Helv.Chimica Acta 69(1986)1224中所述方法直接进行。随后消去分子中仍然存在的保护基，优选通过加酸水解进行。
如果结构单元D以H-D-CONH2形式加入到合成中，酰胺脱水成腈官能团的反应则采用任一种被护中间体来进行。反应路线Ⅱ
Figure A9719872100181
反应路线Ⅱ描述了线性装配分子Ⅰ的过程，即通过烷基化，还原性胺化或迈克尔加成H-B-P到适当未保护或保护的A结构单元上形成(P)-A-B-P，然后消去C-端保护基得到(P)-A-B-OH，继之与H-C-P偶联，得到(P)-A-B-C-P，再消去C-端保护基，得到(P)-A-B-C-OH，再与H-D-CN偶合形成(P)-A-B-C-D-CN，随后按反应路线Ⅰ所述反应这一中间体，得到最终产物。
当化合物(P)-A-B-P的B上仍含有游离NH官能团时，在消去C-端保护基之前，必须将这一官能团用适当保护基加以保护。这些保护基在所有情况下都必须是彼此正交(orthogonal)的。
作为H-D-CN结构单元的替换物，也可以使用H-D-CONH2,H-D-C(NH)NH2,H-D-C(NP)NH2,H-D-C(NP)NHP，而在第一种情况下偶联中间体(P)-A-B-C-D-CONH2被脱水成(P)-A-B-C-D-CN。反应路线Ⅲ
Figure A9719872100191
反应路线Ⅲ描述了一条通过趋同合成法(convergentsynthesis)非常有效地制备化合物Ⅰ的路线。其中包括偶联适当保护的结构单元(P)-A-B-OH与H-C-D-CN，然后如反应路线Ⅰ所述反应所得中间体(P)-A-B-C-D-CN，以得到最终产物。
所用的N-端保护基为Boc,Cbz或Fmoc，且优选Boc，而C-端保护基则为甲基，叔丁基和苄基。如果分子中存在多个保护基，当这些保护基不是被同时消去时，则它们必须是彼此正交的。如果中间体包含结构单元C，则Cbz和苄基保护基是不适宜的。
所需的偶联反应以及引入和消去保护基的其它反应在肽化学标准条件下进行(参见M.Bodanszky,A.Bodanszky“肽合成策略”(The Practice of Peptide Synthesis)，第二版，Springer VerlagHeidelberg,1994)。
Boc保护基采用二噁烷/HCl或TFA/DCM除去，而Cbz保护基则通过氢解或用HF除去。酯官能团的水解采用LiOH在醇类溶剂或在二噁烷/水中进行。TFA用于裂解叔丁基酯。
反应采用TLC检测，通常使用下列流动相：A．DCM/MeOH              95∶5B．DCM/MeOH              9∶1C．DCM/MeOH              8∶2D．DCM/MeOH/50％HOAc   40∶10∶5E．DCM/MeOH/50％HOAc   35∶15∶5
当提及柱色谱分离时，这种分离采用上述流动相在硅胶上进行。
反相HPLC分离采用乙腈/水和HOAc缓冲液进行。
起始化合物可采用下列方法制备：
用于烷基化的结构单元A的实例包括α-溴乙酸叔丁酯，β-溴丙酸叔丁酯，α-溴丙酸叔丁酯，γ溴丁酸叔丁酯，α-溴丁酸叔丁酯，THP保护的溴乙醇，THP保护的γ-溴丙醇，α-溴-γ-丁内酯，而用于还原性胺化的结构单元A的实例则包括二羟基丙酮，丙酮二羧酸二叔丁酯，以及用于迈克尔加成的结构单元A的实例包括丙烯酸叔丁酯，甲基丙烯酸叔丁酯，富马酸叔丁酯。所述叔丁基酯中那些不能购买到的可按照G.Uray,w.Lindner在四面体44 1988 4357-4362中有关相应羧酸的制备的类似方法制得。B结构单元：
关于氨基酸的普通及特殊合成法，可以从文献中找到各种不同的可能方法。有关它们的综述尤其见Houbeh-Weyl，第E16d卷，第一部分的第406页及其后面内容中所述。
经常使用的前体是二苯酮亚胺乙酸乙酯，乙酰氨基丙二酸二乙酯和异氰基乙酸乙酯。
各种不同的甘氨酸和丙氨酸衍生物例如可由异氰基乙酸乙酯和合适的酮或醛制得(参见H.-J.Prtorius,J.F1ossdorf,M.-R.Kula Chem.Ber.108(1975)3079)。
2-降冰片基甘氨酸、金刚烷基丙氨酸、甲基环己基丙氨酸、4-异丙基环己基丙氨酸、4-甲基-1-环己基丙氨酸和4-甲基-1-环己基甘氨酸的合成可以按照下列通用方法以异氰基乙酸乙酯为原料与相关羰基化合物2-降冰片酮、1甲酰基金刚烷、1-甲酰基-1甲基环己烷、1-甲酰基-4-异丙基环己烷、1-甲酰基-4-甲基环己烷和4-甲基环己酮经相应的2-甲酰基氨基丙烯酸乙酯(U.Schollkopf和R.Meyer,Liebigs Ann.Chem.1977,1174)合成得到：
合成2-甲酰基氨基丙烯酸乙酯的通用方法
在0至-10℃下，将100mmol异氰基乙酸乙酯在50ml THF中的溶液逐滴加入到100mMol叔丁醇钾/150ml THF的溶液内。15分钟后，在相同温度下加入100mMol合适的羰基化合物在50ml THF中的溶液，并使反应混合物缓慢升温到室温，用旋转蒸发器除去溶剂。将残留物与50ml水、100ml乙酸和100ml DCM混合，并用DCM提取产物。经Na2SO4干燥DCM相后，用旋转蒸发器除去溶剂。得到几乎纯净产物，但如果需要的话还可以通过硅胶柱色谱进一步纯化(流动相：乙醚/石油醚混合物)。
由2-甲酰基氨基丙烯酸乙酯制备氨基酸盐酸盐的通用方法
将100mMol 2-甲酰基氨基丙烯酸乙酯在200ml冰乙酸中用Pd/C(10％)和氢气氢化，直至反应完全。然后滤除催化剂，利用旋转蒸发器尽可能除去乙酸，并将残留物在200ml 50％浓盐酸中回流5小时。随后利用旋转蒸发器除去盐酸，将产物在50℃下减压干燥，尔后用乙醚洗涤数次。得到浅色结晶盐酸盐。
由16.5g(150mMol)2-降冰片酮得到26.6g2-降冰片基甘氨酸盐酸盐。由19.7g(120mMol)1-甲酰基金刚烷得到26.0g金刚烷基甘氨酸盐酸盐，由12.6g(100mMol)1-甲酰基-1-甲基环己烷得到16.6gγ-甲基环己基丙氨酸盐酸盐。由16.8g(150mMol)4-甲基环己酮为原料得到25.9g 4-甲基环己基甘氨酸盐酸盐。
由15g反式-1-甲酰基-4-甲基环己烷得到18g反式-4-甲基-1-环己基丙氨酸盐酸盐。
由9g 3,3-二甲基-1-甲酰基环己烷得到10g 3,3-二甲基-1环己基丙氨酸盐酸盐。
合成所需的醛1-甲酰基-3,3-二甲基环己烷采用基于Moskal和Leusen的方法制备(Rec.Trav.Chim.Pays-Bas 106(1978)137-141)：
在-60℃及搅拌下，于10分钟内向异氰基甲基膦酸二乙酯(17ml,105mMol)的280ml无水乙醚溶液内逐滴加入正丁基锂的正己烷溶液(72ml,115mMol)。然后在-60℃搅拌所得悬浮液15分钟，之后在10分钟内加入3,3-二甲基环己酮(13g,105mMol)的100ml无水乙醚溶液，期间保持温度低于-45℃。随后使反应混合物升温到0℃，并在这一温度下搅拌90分钟，接着小心加入150-200ml 38％强度盐酸。在室温下剧烈搅拌混合物15小时以完成水解。分出有机相，用水、碳酸氢钠饱和溶液和氯化钠饱和溶液洗涤，各200ml。用硫酸镁干燥，过滤，用旋转蒸发器浓缩除去溶剂，所得残留物无需进一步纯化而便可作为起始物质用于合成氨基酸。Boc-(D)-α-甲基-环己基丙氨酸：
在250mg 5％Rh/Al2O3存在下，将3.4g(12.2mMol)Boc-(D)-α-甲基-Phe-OH在10巴氢气压下于50℃氢化24小时。过滤并除去溶剂，得到2.8g Boc-(D)-α-甲基-Cha-OH。1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)):12(极宽单峰，COOH)；1.7-0.8(25H；1.35(s,Boc),1.30(s,Me)).
Boc-(3-Ph)-Pro-OH按照与J.Y.L.Chung等人所述类似的方法合成(J.Y.L.Chung等人，J.Org.Chem.)1990,55,270)。
Boc-(D,L)-Dch-OH的制备：
将Boc-(D,L)-Dpa-OH(1mMol)在其中含催化量5％Rh/Al2O3的12ml MeOH中于5巴氢气压下氢化。过滤，减压除去溶剂后以定量产率得到产物。
H-(D,L)-Chea-OH的制备：
惰性气氛下，将4.0g甲磺酸环庚基甲酯(19.39mmol)[由环庚基甲醇和甲磺酰氯制得]与4.9g二苯酮亚胺甘氨酸乙酯(18.47mMol)、8.9g无水细粉状碳酸钾(64.65mMol)和1g溴化四丁铵(3mMol)在50ml无水乙腈中回流10小时。然后滤除碳酸钾，蒸发滤液至干。将粗产物直接在40ml乙醇中用20ml 2N盐酸进行水解，在室温下搅拌1.5小时。然后稀释反应溶液，在酸性条件下用乙酸乙酯提取二苯酮，随后再于碱性条件下(pH=9)用DCM提取H-(D,L)-Chea-OEt，溶液用硫酸镁干燥，之后用旋转蒸发器浓缩。产量3.7g,≥理论值的95％。
D-(1,4-环己二烯1-基)ala-OH按照G.Zivichoysky,V.Gurvich J.Chem.Soc.,Perkin Trans I 19(1995)2509-15中的方法制备。
H-(D,L)-β,β-Me2Cha-OH按照U.Schollkopf,R.Meyer,L.Ann.Chem.(1977)1174-82中的方法制备。
在所有情况下，都可以按照常规方法在水/二噁烷中用二碳酸二叔丁酯将所述氨基酸转化为Boc-保护形式，随后可用乙酸乙酯/己烷混合物重结晶或通过硅胶柱色谱纯化(流动相：乙酸乙酯/石油醚混合物)。
如反应路线Ⅰ所示，Boc-保护的氨基酸用作B结构单元。
在某些情况下，用作B结构单元的所述氨基酸还可以转化成相应的苄基酯，并与适当被护的A结构单元连接。对于仍含有游离N-H官能团的化合物，接着用Boc基团予以保护，然后再通过氢化除去苄酯基，并将所得结构单元A-B-OH通过结晶、盐沉淀或柱色谱纯化。该路线通过下面tBuOOC-CH2-(Boc)(D)Cha实施例加以说明。
(D)-环己基丙氨酸苄酯的合成：
在配有水分离器的情况下，将100g(481mMol)D-环己基丙氨酸盐酸盐，104g(962mMol)苄基醇和110g(577mMol)对-甲苯磺酸一水合物在2200ml甲苯中缓慢加热回流。在80-90℃下观察到有氯化氢逸出，并且悬浮液溶解形成一清亮溶液。当不再有水分离出后(大约4小时)，蒸去500ml甲苯，然后将反应混合物冷却过夜，滤出所剩残留物，用己烷洗涤两次，每次1000ml。然后将所得残留物(195g)悬浮在2000ml二氯甲烷内，加入1000ml水，接着在搅拌下逐渐加入50％浓度氢氧化钠溶液调节pH到9-9.5。分出有机相，水洗，(每次用水500ml)，硫酸钠干燥，然后滤除干燥剂，浓缩滤液后得到115g(94％)浅色油状产物。
N-(叔丁氧基羰基甲基)-(D)-环己基丙氨酸苄酯：
将115g(440mMol)(D)-环己基丙氨酸苄酯溶于2000ml乙腈内，在室温下加入608g(4.40Mol)碳酸钾和94g(484mMol)溴乙酸叔丁酯，然后在此温度下搅拌混合物3天。滤出碳酸盐，用乙腈洗涤，然后浓缩母液(30℃,20毫巴)，并将残留物溶于1000ml甲基叔丁基醚中，用5％浓度柠檬酸和碳酸氢钠饱和溶液提取有机相。将有机相用硫酸钠干燥，滤除干燥剂并浓缩，所得油状物(168g)直接用于下步反应。
N-Boc-N-(叔丁氧基羰基甲基)-(D)-环己基丙氨酸苄酯
将前一反应中得到的油状物(168g,447mMol)溶于1400ml乙腈，加入618g(4.47mMol)碳酸钾粉末和107g(492mMol)二碳酸二叔丁酯，随后在室温下搅拌6天。抽滤去碳酸钾，用大约1000ml乙腈洗涤，并浓缩滤液，得到230g所需产物。
N-Boc-N-(叔丁氧基羰基甲基)-(D)-环己基丙氨酸环己基铵盐：
将115g N-Boc-N-(叔丁氧基羰基甲基)-(D)-环己基丙氨酸苄酯溶于1000ml纯乙醇中，然后在9g 10％Pd/活性炭存在下，于大气压力和25-30℃下用氢气氢化2小时。过滤并用旋转蒸发器除去溶剂，得到100g(260mMol)黄色油状物，进而将其溶于1600ml丙酮内，并加热回流。移去加热浴，然后通过滴液漏斗迅速加入27g(273mMol)环己胺的丙酮溶液。冷却反应混合物到室温后立刻结晶析出所需盐。滤出固体，用200ml丙酮洗涤。作为最终纯化步骤，再一次用丙酮重结晶。在大约30℃下真空干燥残留物，得到70.2g所需盐，为白色粉末。
用作C结构单元的(L)-3,4-脱氢脯氨酸可以从市场上购得，而(D,L)-4,5-脱氢-2哌啶酸则可以按下列文献中的方法制备：J.Org.Chem.25(1960)489或C.Herdeis,W.Engel Arch.Pharm.326(1993)297，随后用Boc2O转化为Boc-(D,L)-Dep-OH。
D结构单元的合成见DE 4443390中所述。
实施例1N-羟基羰基亚甲基-(D)-环己基丙氨酰-3,4-脱氢脯氨酰(4-脒基)苄基酰胺：Boc-3,4-脱氢脯氨酰4-氰基苄基酰胺：
将Boc-3,4-脱氢脯氨酸(4.7g,22.0mMol)和4氰基苄胺(4.1g,24.2mMol；DE 4443390)溶于二氯甲烷(25ml)。冷却溶液到0℃，加入乙基二异丙胺(26.4ml,154mMol)。随后缓慢滴加入50％浓度丙膦酸酐的乙酸乙酯溶液(23.3ml,110mMol)。将混合物先在0℃搅拌1小时，然后再在室温下搅拌30分钟，尔后加二氯甲烷稀释，用硫酸氢钠稀溶液(3x)、碳酸氢钠稀溶液(3x)和氯化钠饱和溶液洗涤。用硫酸钠干燥，然后在水泵真空下浓缩，得到7.47g粗产物。3,4-脱氢脯氨酰4-氰基苄基酰胺
将上一实验中所得的Boc-3,4-脱氢脯氨酰4-氰基苄基酰胺粗产物(7.47g)溶于二氯甲烷(88ml),加入醚合氢氯酸(88ml,5M)。然后将混合物在室温下搅拌1.5小时。在水泵真空下蒸除溶剂。将残留物与二氯甲烷混合两次，并在水泵真空下蒸除溶剂。随后在搅拌下用乙醚提取两次，得到5.32g粗产物。N-(叔丁氧羰基亚甲基)-(N-Boc)-(D)-环己基丙氨酰-3,4-脱氢脯氨酰4-氰基苄基酰胺：
将tBuOOC-CH2-(Boc)-(D)-Cha-OH(7.59g,19.68mMol)和H-Pyr-4-氰基苄基酰胺(5.19g,19.68mMol)溶于二氯甲烷(100ml)，加入乙基二异丙胺(12.72g,98.4mMol)。冷却溶液到0℃，在20分钟内滴加入50％浓度丙膦酸酐的乙酸乙酯溶液(20ml)，在0-10℃搅拌3小时后，将混合物用二氯甲烷(100ml)稀释，并用10％浓度硫酸氢钠溶液(3x)、碳酸氢钠饱和溶液(2x)和水洗涤。用硫酸钠干燥，继之在水泵真空下蒸除溶剂。得到13.28g浅棕色油状物。N-(叔丁氧羰基亚甲基)(N-Boc)-(D)-环己基丙氨酰-3,4-脱氢脯氨酰4氨基硫代羰基苄基酰胺：
将前一实验中所得的t-BuOOC-CH2-(Boc)-(D)-Cha-Pyr-4-氰基苄基酰胺(13.28g)粗产物溶于吡啶(70ml)和三乙胺(12ml)内,并冷却此溶液到0℃，用硫化氢饱和(溶液颜色变成绿色)。然后在室温下搅拌48小时。用氮气置换过量硫化氢，在水泵真空下蒸除溶剂。将残留物溶于乙醚，且用20％浓度硫酸氢钠溶液(3x)、碳酸氢钠饱和溶液(2x)和水洗涤。经硫酸钠干燥后在水泵真空条件下蒸除溶剂。将所得粗产物(14.3g)通过快速色谱进一步纯化(硅胶，二氯甲烷→二氯甲烷∶甲醇=50∶1梯度洗脱)。产量：13.3g(包含少量溶剂)。N-(叔丁氧羰基亚甲基)-(N-Boc)-(D)-环己基丙氨酰-3,4-脱氢脯氨酰-4-S-甲基亚氨基羰基苄基酰胺：
向前一实验所得的t-BuOOC-CH2-(Boc)-(D)-Cha-Pyr-氨基硫代羰基-苄基酰胺(13.3g)在二氯甲烷(135ml)中的溶液内加入甲基碘(7.97ml,126.90mMol)。室温搅拌24小时后，在水泵真空下蒸除溶剂。得到15.73g浅黄色油状物。N-(叔丁氧羰基亚甲基)-(N-Boc)-(D)-环己基丙氨酰-3,4-脱氢脯氨酰-4-脒基苄基酰胺：
将前一实验所得的t-BuOOC-CH2-(Boc)-(D)-Cha-Pyr-4-S甲基亚氨基羰基苄基酰胺氢碘酸盐(15.73g)粗产物溶于乙腈(1290ml)，加入乙酸铵(3.25g,42.3mMol)。然后将混合物在50□加热1.5小时，在水泵真空下浓缩之后加入二氯甲烷。滤除沉淀出的盐，在水泵真空下浓缩滤液。得到15.17g黄色泡沫物。通过离子交换剂(Fluka,Order No.00402，乙酸盐/聚合物载体)，将粗产物转化为乙酸盐。产量：13.3g。N-(羟基羰基亚甲基)-(D)-环己基丙氨酰-3,4-脱氢脯氨酰-(4-脒基)苄基酰胺：
将t-BuOOC-CH2-(Boc)-(D)-Cha-Pyr-4-脒基苄基酰胺氢乙酸盐(13.3g)溶于二氯甲烷(200ml)，加入醚合HCl(45ml)。在室温下搅拌2小时，继之在水泵真空下蒸发至干。残留物与二氯甲烷混合两次，然后在水泵真空下蒸除溶剂。得到11.6g粗产物。
取部分粗产物(3g)，通过离子交换剂(Fluka,Order No.00402,乙酸盐/聚合物载体)转化为乙酸盐，并将所得产物通过快速色谱纯化(硅胶，二氯甲烷∶甲醇=4∶1→二氯甲烷∶甲醇∶50％浓度乙酸=40∶10∶2→二氯甲烷∶甲醇∶50％浓度乙酸=35∶15∶5梯度洗脱)，得到淡黄色油状物，进而将其溶于水中。过滤后，冻干滤液。产量：2.13g无色固体。FAB-MS(M+H6):456。
按照实施例1的类似方式，制备下列化合物：2．N-(羟基羰基亚甲基)-(D)-环己基甘氨酰-3,4-脱氢脯氨酰(4-脒基)苄基酰胺：
FAB-MS(M+H+):4423．N(羟基羰基亚甲基)-(D,L)-环庚基丙氨酰-3,4-脱氢脯氨酰(4-脒基)苄基酰胺：
FAB-MS(M+H+):4704．N-(羟基羰基亚甲基)-(D)-叔丁基丙氨酰-3,4-脱氢脯氨酰(4-脒基)苄基酰胺：
FAB-MS(M+H+):4305．N-(羟基羰基亚甲基)-(D)-环己基丙氨酰-4,5-脱氢脯氨酰-2-甲基-哌啶基(4-脒基)苄基酰胺：
FAB-MS(M+H+):470
本发明新化合物的抗血栓形成作用用大鼠动静脉分路实试验说明。在这一试验中，动静脉分路中的玻璃毛细管起着人造血栓形成表面的作用并诱导血栓形成。将麻醉(25％乌拉坦(Urethan),2×8mg/kg i.p.)大鼠仰卧位固定在恒温(37℃)载物台上。分离出右颈动脉和颈静脉，在它们之中插入聚乙烯短套管(Portex,PE 50)，注入生理盐水溶液并夹紧。这两根套管的游离端通过长20.0mm、内径1.0mm的玻璃毛细管连接，该玻璃毛细管用作血栓形成表面。i.v.,s.c.,口服或输注给用受试物质。在与受试物质或溶剂(对照物)一起培养到所需时间后，除去夹子，打开分路。流过分路的血流导致其温度迅速增高(在玻璃毛细管的中央部位测量)，从室温增加到体温说明分路是开放的。连续记录温度直至分路闭合。此外，当分路开放和试验结束时，取出血样，测定在血浆中的抗-FIIa活性。在狗体内的药物动力学和凝血参数
将受试化合物溶于等渗生理盐水内，然后立刻施于有意识的mongrel狗。静脉药团注射的给药体积为0.1ml/kg，而对于管饲法经口给药，则为1ml/kg。在静脉给药1.0mg/kg之前或之后的5、10、20、30、45、60、90、120、180、240、300和360分钟(如果需要的话还可以在给药后的420、480分钟和24小时)时刻，或者在口服给药4.64mg/kg之前或之后的10、20、30、60、120、180、240、300、360、480分钟时刻，取2ml静脉血样放入到柠檬酸化管内。取样后立刻测定全血的ecarin时间(ECT=ecarin凝块时间)。离心制备血浆后，采用凝固仪测定血浆凝血酶时间和活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)。
同样还可以测定抗-FIIa活性(ATU/ml)，并且通过生色(S-2238)凝血酶测定法，根据受试化合物的抗-FIIa活性，利用γ水蛭素和受试化合物的校准曲线还可以测定受试化合物在血浆中的浓度。
试验化合物的血浆浓度是计算药物动力学参数的基础，这些参数包括：最大血浆浓度时间(T max)，最大血浆浓度；血浆半衰期T0.5；曲线下面积(AUC)；受试化合物的吸收部分(F)。凝固参数：ecarin时间(ECT=ecarin凝块时间)：将100μl柠檬酸处理过的血液在凝固仪(CL8，球型，Bender & Hobein,Mnich,FRG)内于37℃温育2分钟。加入100μl预热(37℃)ecarin试剂(Pentapharm)，测定形成血纤蛋白凝块的时间。活化促凝血酶原激酶时间(APTT)：混合50μl柠檬酸处理过的血浆和50μl PTT试剂(Pathrombin,Behring)，并在凝固仪(CL 8，球型，Bender & Hobein,Munich,FRG)内于37℃温育2分钟。加入50μl预热(37℃)氯化钙后，测定形成血纤蛋白凝块的时间。凝血酶时间(TT)：将100μl柠檬酸处理过的血浆在凝固仪(CL 8，球型，Bender & Hobein,Munich,FRG)内于37℃温育2分钟。加入100μl预热(37℃)凝血酶试剂(Boehringer Mannheim)，测定形成血纤蛋白凝块的时间。
本发明新化合物在这些试验中显示出良好活性。

Claims (8)

1．式Ⅰ化合物及其与生理上所耐受的酸成的盐：
Figure A9719872100021
其中R,R1,R2,R3,R4,R5和R6，以及l,m和n的定义如下：l代表0或1,m代表0,1或2,n代表0,1或2,R代表H或C1-4-烷基-,R1代表HOOC-,C1-6-烷基-OOC-，苄基-OOC-或-OH,R2代表H-,C1-4-烷基-或R1-(CH2)m-,R3代表H-或C1-4-烷基-，该烷基可被-OH或-COOH取代，R4代表H-,C14-烷基-,HOOC-C1-4-亚烷基-,R5代表C1-8-烷基-，环烷基-(CR8R9)n-,(r=0或1,R8,R9=H-,环烷基-或C1-4-烷基-)，其中环烷基中多至4个CH2基团可彼此独立地被CR10R11(R10=H-或C1-4-烷基-,R11=C1-4烷基-)置换，和/或环烷基基团中与CR8R9键连的CH基团可以被CR12(R12=C1-4-烷基-)置换，和/或环中的一个或两个C-C单键可以被C=C双键置换，R6代表H-,C1-4-烷基-，或者R4与R5一起代表-CH2-CH2-CH(R7)-,(R7=H-，苯基-或环己基-)R2与R5一起代表-CH2-CH2-或-CH2-CH2-CH2-，其中一个氢原子可以被C1-4-烷基-，苯基-或环烷基-置换。
2．用于防治疾病的权利要求1所述的式Ⅰ化合物。
3．权利要求1所述的式Ⅰ化合物在生产具有下述用途的药物中的应用：
·治疗其发病机理直接或间接由凝血酶的蛋白酶解作用所致的疾病，
·治疗其发病机理由受体的凝血酶依赖性活化和信号转导所致的疾病，
·治疗与体细胞中基因表达的刺激或抑制有关的疾病，
·治疗由凝血酶的促有丝分裂作用所致的疾病，
·治疗上皮细胞的收缩性和通透性的凝血酶依赖性变化所致的疾病，
·治疗凝血酶依赖性血栓栓塞情况，
·治疗弥散性血管内凝血，
·治疗再闭塞，以及与溶栓剂联合用于缩短再灌注时间，
·治疗PTCA后的早期再闭塞和晚期再狭窄的发生，
·治疗平滑肌细胞的凝血酶依赖性增殖，
·治疗活性凝血酶在CNS中的聚集，
·治疗肿瘤生长，以及用于预防肿瘤细胞的粘连和转移。
4．用于涂布表面的权利要求1中所述的式Ⅰ化合物。
5．权利要求1所述的式Ⅰ化合物在生产用于治疗下述疾病的药物中的应用：
·其发病机理直接或间接由激肽原酶，特别是激肽释放酶，的蛋白酶解作用所致的疾病，
·炎症性疾病如哮喘，胰腺炎，鼻炎，关节炎，荨麻疹和其它与激肽释放酶有关的内部疾病。
6．包含下式结构片段的化合物：
Figure A9719872100031
其中l代表0或1，且R代表H-或C1-4-烷基-。
7．下式化合物：
Figure A9719872100041
上，其中R,R1,R2,R3,R4,R5和R6，以及1,m和n的定义同权利要求1。
8．下式化合物：其中l和R的定义同权利要求1，且Y则代表N保护基，N-端被护或未保护的氨基酸或H-。
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