CN1226615C - 生物传感器 - Google Patents

Abstract

本发明提供了生物传感器，该传感器具备绝缘性基板，包含设在上述基板上的测定极和配极的电极系统，结合于上述基板上、和基板之间形成将试样溶液供给到上述电极系统的试样溶液供给通道的罩盖构件，配置于上述试样溶液供给通道内、至少含有氧化还原酶及电子传导体的试剂系统；上述电子传导体设在上述基板一侧，上述氧化还原酶设在上述罩盖构件一侧，各自互不接触。

Description

生物传感器

技术领域

本发明涉及对血液、血浆、血清等试样中的底物进行定量的生物传感器。

背景技术

作为对血液等试样中的特定成分进行定量的生物传感器，曾有各种提案，例如，以下所述的传感器已为大家所知(参照日本专利特开昭63-317096号公报)。

该生物传感器是在绝缘性基板上用丝网印刷等方法形成由工作极、配极以及参考极构成的电极系统，并形成连接于该电极系统上的含有氧化还原酶和电子传导体的反应层。

在以上制得的生物传感器反应层上若滴下含有底物的试样，则反应层溶解，氧化还原酶和底物反应，由此电子传导体被还原。经规定时间后，被还原的电子传导体通过电极系统进行电化学氧化，从此时得到的氧化电流值能对试样溶液中的底物进行定量。

在具有上述结构的生物传感器中，氧化还原酶及电子传导体一般以相互混合的状态载持于电极系统上。其目的是节省试样混合或搅拌的时间，有效进行氧化还原酶和电子传导体的反应，在短时间内对底物进行定量。

但是，如果生物传感器内的氧化还原酶和电子传导体在混合状态或相互接触的状态下载持，则会产生如下问题。即，对应于底物浓度为0mg/dl的试样溶液的应答值(以下称为空白值)不是0，而是显示出0以上的高值。而且，还存在着和生物传感器刚制作完成后(以下称为初期)的应答值相比较，空白值及对应于含有相同浓度的底物的试样溶液的各自的应答值随着保存期间的变长而增加的问题。由于保存而使应答值发生变化，则导致可靠性降低。

本发明是鉴于上述问题完成的发明，其目的是提供一种空白值低、因保存而出现的应答值变化少、特别是空白值变化少、且结构简易的生物传感器。

本发明的另一目的是提供一种特别适用于胆甾醇定量的生物传感器。

发明的揭示

本发明提供一种生物传感器，该生物传感器具备绝缘性基板，包含设在上述基板上的测定极和配极的电极系统，结合于上述基板上、和基板之间形成将试样溶液供给到上述电极系统的试样溶液供给通道的罩盖构件，配置于上述试样溶液供给通道内、至少含有氧化还原酶及电子传导体的试剂系统；而且，上述电子传导体设在上述基板一侧，上述氧化还原酶设在上述罩盖构件一侧，各自互不接触。

上述氧化还原酶的存在位置最好是将其投影到上述基板上时，和上述电子传导体的存在位置不重叠的位置。

本发明还提供测定系统，该系统具备上述生物传感器、在上述测定极和配极之间施加电压的电压施加装置、以及检测上述施加了电压的测定极和配极之间的电信号的信号检测装置。

测定系统最好还具备显示上述信号检测装置检测到的信号的显示装置。

附图的简单说明

图1是本发明一实施例的生物传感器的分解立体图。

图2是同一生物传感器的截面图。

图3是本发明另一实施例的生物传感器的分解立体图。

图4是同一生物传感器的截面图。

图5是表示本发明一实施例的测定系统电路结构的方框图。

实施发明的最佳方式

本发明的生物传感器具备绝缘性基板，包含设在上述基板上的测定极和配极的电极系统，结合于上述基板上、和基板之间形成将试样溶液供给到上述电极系统的试样溶液供给通道的罩盖构件，配置于上述试样溶液供给通道内、至少含有氧化还原酶及电子传导体的试剂系统；而且，上述电子传导体设在上述基板一侧，上述氧化还原酶设在上述罩盖构件一侧，各自互不接触。

本发明采用简易的结构就能使电子传导体和氧化还原酶互不接触。因此，生物传感器制作完成后，在生物传感器内氧化还原酶和电子传导体并不反应，所以可使空白值下降，而且能抑制因保存而引起的应答值的变化。

本发明的理想实施方式是上述氧化还原酶的存在位置是将其投影到上述基板上时，和上述电子传导体的存在位置不重叠的位置。

这样，既能维持氧化还原酶和电子传导体的分离状态，又可减少试样溶液供给通道的体积。

本发明的另一理想实施方式是上述试剂系统还包含设在上述罩盖构件一侧的表面活性剂。这种情况下，表面活性剂最好和上述氧化还原酶混合。

本发明的理想的生物传感器是对作为诊断指南的血清胆甾醇值进行定量的生物传感器，试剂系统包括胆甾醇氧化酶及胆甾醇脱氢酶中的至少一种、对胆甾醇酯变化为胆甾醇的过程进行催化的胆甾醇酯酶及表面活性剂。

血液或血清中的胆甾醇包含在具有胶束结构的脂蛋白中。试剂系统若包含适当的表面活性剂，则采用胆甾醇氧化酶及胆甾醇脱氢酶中的至少一种或胆甾醇酯酶，可提高脂蛋白中的转变为胆甾醇的反应的反应性。

用于上述目的的表面活性剂可以是离子型表面活性剂及非离子型表面活性剂中的任一种。例如，聚氧乙烯辛基苯基醚、胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐、脂肪酸盐、烷基硫酸酯盐、聚氧乙烯烷基醚硫酸酯盐、烷基苯磺酸盐、烷基萘磺酸盐、烷基磺基琥珀酸盐、烷基二苯醚二磺酸盐、烷基磷酸盐、萘磺酸甲醛缩合物、聚羧酸型高分子表面活性剂、聚氧乙烯烷基醚、聚氧烯烃烷基醚、聚氧乙烯衍生物、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯烷胺、烷基烷醇酰胺、烷基胺盐、季铵盐、烷基甜菜碱及氧化胺等。其中，最好使用聚氧乙烯辛基苯基醚。

采用表面活性剂使脂蛋白增溶的作用随表面活性剂的种类而各不相同，所以最好同时使用2种以上的上述表面活性剂。

本发明的另一理想实施方式是电子传导体及氧化还原酶中的至少一方经其水溶液冷冻干燥后形成。

通过冷冻干燥形成的电子传导体及/或氧化还原酶的层的溶解性有所提高，可缩短整个测定所花费的时间。特别是氧化还原酶的反应是得到应答值的第一步骤，若是经冷冻干燥形成氧化还原酶层，则在供给试样溶液时可使氧化还原酶迅速溶解。

本发明的另一理想实施方式是电子传导体及氧化还原酶中的至少一方载持于载体上。

本发明所用的载体只要能将试剂载持于载体内部或载体表面即可，例如可采用滤纸、玻璃过滤器、纤维素纤维、纸张及软木。采用滤纸时，试剂主要载持于滤纸内部，采用纸张时，试剂载持于纸张的表面，这是两者的不同之处。上述载体中，由于氧化还原酶对玻璃过滤器或纤维素纤维这两种载体的的非特异性吸附量较少，所以比较理想。

对本发明的生物传感器中可以采用的电子传导体并无特殊限定，可采用铁氰化钾、对苯醌及对苯醌衍生物、吩嗪甲基硫酸酯、亚甲蓝、二茂铁及二茂铁衍生物。其中，铁氰化钾在氧气存在下也稳定，比较理想。

氧化还原酶可以根据作为测定对象的底物进行适当选择，例如，葡糖氧化酶、葡糖脱氢酶、胆甾醇氧化酶、胆甾醇脱氢酶等。

绝缘性基板及罩盖构件只要是具有电绝缘性、具有一定程度的刚性的材料即可。可选用聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺、饱和聚酯等热塑性树脂，尿素树脂、三聚氰胺树脂、酚醛树脂、环氧树脂、不饱和聚酯树脂等热固性树脂。

本发明的理想的生物传感器是在设置于基板上的电极系统的上形成电子传导体层。为了防止电子传导体和电极系统之间的直接接触，同时使电子传导体层的载持更可靠，也可在电极系统上形成亲水性高分子层，在该高分子层上面再形成电子传导体层。

当电极系统由银糊基底和在上面形成的碳糊构成时，由于溶解于试样中的试剂系统的表面活性剂的作用，使试样溶液浸透到作为电极基底的银层。因此，在测定传感器的应答电流时，如果在电极上施加电位，则银层发生电化学反应，其结果是应答电流值增加。若用亲水性高分子层覆盖电极系统，则可缓和表面活性剂向银层的浸透。

构成上述亲水性高分子层的亲水性高分子只要其水溶液具有粘性即可，例如，羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素及羧乙基纤维素等纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇及聚赖氨酸等聚氨基酸，聚苯乙烯磺酸，明胶及其衍生物，丙烯酸及其盐的聚合物，甲基丙烯酸及其盐的聚合物，淀粉及其衍生物，马来酸酐及其盐的聚合物，琼脂糖凝胶及其衍生物等。

测定极及配极的材料只要具有导电性即可，例如，碳、金、钯及铂等。

包含设置于绝缘性基板上的测定极和配极的电极系统最好还包括参考极。

用本发明的生物传感器进行测定的试样为体液。体液可以是血液、血浆、淋巴液、细胞间质液、汗水等中的任一种。各种体液中所含的胆甾醇、葡萄糖等为测定对象。

下面参照附图对本发明的生物传感器的结构加以说明。为了便于理解，本发明所用的结构图中的各要素的相对尺寸或位置关系未必一定正确。

实施方式1

图1是本实施方式的生物传感器的分解立体图，图2是同一生物传感器的纵向截面图。

采用丝网印刷法在绝缘性基板2上印刷银糊，通过加热干燥后形成测定极导线13和配极导线14及后述的电极系统基底。接着，采用丝网印刷法进行导电性碳糊的印刷，经加热干燥后形成由测定极3和配极4构成的电极系统。然后，采用丝网印刷法进行绝缘性浆料的印刷，使电极系统的一部分被覆盖，经加热干燥后形成绝缘层6。接着，滴下作为亲水性高分子的羧甲基纤维素(以下称为CMC)水溶液，经加热干燥后形成CMC层7，将测定极3和配极4构成的电极系统覆盖。然后，滴下作为电子传导体的铁氰化钾水溶液，经加热干燥后形成电子传导体层8，将CMC层7覆盖。在图中，CMC层7和电子传导体层8相互独立不接触，但实际上有部分互相混合。

接着，将上罩盖16及中罩盖15接合，组装成罩盖构件。中罩盖15由两块柱状零件15a和在后部将两者连接的背部稍低的零件15b所构成。罩盖构件中，在上罩盖16的下面形成由零件15a及15b所合围的凹部。将罩盖构件倒置，在上述凹部内滴下含有胆甾醇酯酶、作为氧化还原酶的胆甾醇氧化酶及/或胆甾醇脱氢酶和表面活性剂的混合水溶液，将其冷冻干燥后形成酶层10。该酶层10形成时要使其收纳在上罩盖16、中罩盖15以及绝缘性基板2三者闭合时所构成的试样溶液供给通道17内。最后，按照图1中的点划线所示的位置关系，将绝缘性基板2和罩盖构件闭合，制得生物传感器1。

在生物传感器1中，由绝缘性基板2、中罩盖15及上罩盖16在绝缘性基板2和上罩盖16之间形成将试样溶液供给到电极系统的试样溶液供给通道17。对于生物传感器1，血液等试样是从试样供给口11供给的。空气孔12是供给试样时空气的出口，起到使试样供给顺利平稳的作用。

在上述构成的传感器中，试样溶液供给通道17的尺寸较好为宽0.4～4mm、高0.05～0.5mm、长2～10mm。该传感器中的试样量为0.04～20μl。更好的试样溶液供给通道17的尺寸为宽0.5～2mm、高0.05～0.2mm、长3～5mm，试样量为0.075～2.0μl。

实施方式2

图3是本实施方式的生物传感器的分解立体图，图4是同一生物传感器的纵向截面图。

本实施方式的生物传感器和实施方式1的生物传感器的不同点在于酶层的形成方法及其形成位置。本实施方式的酶层10a是将含有氧化还原酶、胆甾醇酯酶及表面活性剂的混合液在上罩盖16的下面经丝网印刷法印刷和干燥后形成的。酶层10a的位置设定在将其投影到基板2上时，不和电子传导体层8重叠并包围层8的位置。

本实施方式的生物传感器，由于罩盖构件的酶层10a投影到基板2上时，不和电子传导体层8重叠并包围层8，所以氧化还原酶和电子传导体保持为分离状态的同时试样溶液供给通道的厚度变小，可使试样溶液供给通道的体积有所减小，因此，能够减少测定所需的试样量。

此外，由于氧化还原酶和电子传导体可以更近的距离载持，所以试样供给后氧化还原酶和电子传导体迅速混合，这样可以缩短反应时间。

实施方式3

图5是表示采用了上述生物传感器的测定系统的结构的方框图。电压施加装置21从传感器1的导线13及14在测定极3和配极4之间施加电压。插入于电压施加装置21及导线14之间的电流检测装置22检测出流经测定极3和配极4之间的电流。连接于电流检测装置22的显示装置23显示出电流检测装置22检测到的电流值或是将该电流变换为电压的值。

下面通过实施例进一步详细说明本发明。作为生物传感器的一例，对胆甾醇传感器加以说明，但本发明并不仅限于下列实施例。

实施例1

实施方式1中，滴下4μl的CMC的0.5wt％水溶液，在50℃下干燥15分钟形成CMC层7，覆盖电极系统。再滴下4μl的铁氰化钾的75mM水溶液，在50℃下干燥15分钟形成电子传导体层8，覆盖该CMC层7。另一方面，将含有400单位(U)/m1的胆甾醇氧化酶、900(U)/ml的胆甾醇酯酶及1.6wt％的作为表面活性剂的聚氧乙烯辛基苯基醚的一种的Triton-X 100的混合水溶液0.5μl滴在罩盖构件的规定位置，将其冷冻干燥后形成酶层10。试样溶液供给通道17的尺寸为宽2.0mm、高0.1mm、长约5.0mm，测定极3的面积约为1.0mm²。

比较例1

除了将胆甾醇酯酶和胆甾醇氧化酶混合于电子传导体层之外，其余和实施例1同样操作，制得比较例1的生物传感器。

接着，采用实施例1及比较例1的生物传感器，对不含胆甾醇(胆甾醇浓度为0mg/dl)的PBS(磷酸缓冲生理食盐水)缓冲溶液以及胆甾醇浓度为105mg/dl的人血清进行胆甾醇浓度的测定。使试样溶液与试样供给口11接触，供给到试样溶液供给通道17，3分钟后，以配极4为基准在测定极3上施加500mV的电压，5秒钟后，测定在测定极3和配极4之间流过的电流值(应答值)。

对应于胆甾醇浓度0mg/dl的PBS缓冲溶液的应答值的变化如表1所示，对应于胆甾醇浓度105mg/dl的人血清的应答值的变化如表2所示。对于各试样溶液，进行生物传感器初期的应答值和同一生物传感器在30℃下保存4周后的应答值的比较。

表1

	初期	保存后
			实施例1	0.19μA	0.22μA
比较例1	0.56μA	0.89μA

表2

	初期	保存后
			实施例1	1.53μA	1.58μA
比较例1	2.12μA	2.64μA

从表1可知，实施例1的生物传感器的对应于胆甾醇浓度0mg/dl的应答值，在初期为0.19μA，与比较例的生物传感器相比，得到低0.37μA的值。因此，采用实施例1的生物传感器，可以得到对应于胆甾醇浓度0mg/dl的应答值、即空白值下降的效果。

此外，从表1可知，比较例中，对应于胆甾醇浓度0mg/dl的应答值在试样溶液于30℃下保存4周后，从0.56μA升至0.89μA，增加了0.33μA。另一方面，实施例1中，对应于胆甾醇浓度0mg/dl的应答值，在同样保存条件下，从0.19μA升至0.22μA，仅增加了0.03μA，这说明抑制了由于保存引起的空白值上升。

此外，从表2可知，比较例中，对应于胆甾醇浓度105mg/dl的应答值，在试样溶液于30℃下保存4周后，从2.12μA升至2.64μA，增加了0.52μA。另一方面，实施例1中，对应于胆甾醇浓度105mg/dl的应答值，在同样保存条件下，从1.53μA升至1.58μA，仅增加了0.05μA，这说明抑制了由于保存引起的应答值上升。

实施例2

实施方式2中，用于印刷酶层10a的油墨采用含有胆甾醇氧化酶、胆甾醇酯酶及Triton-X 100的混合水溶液。所得到的酶层10a含有胆甾醇氧化酶1.0单位(U)、胆甾醇酯酶2.25(U)、Triton-X100 8.0μg。酶层10a的厚度约为0.7mm、中央孔的直径比配极4的外形(直径3.0mm的圆形)稍大。另一方面，CMC层7及电子传导体层8和实施例1同样形成，其外形和配极4的外形大致相同。

采用该生物传感器，按照和实施例1同样的顺序，进行试样溶液中的胆甾醇浓度的测定，得到和实施例1同样的结果。

在实施例1和2中，CMC层7及电子传导体层8的形状为圆形，但也可以是方形、长方形或椭圆形。酶层10或10a的形状只要氧化还原酶和电子传导体不接触，任何形状都可以。

作为电子传导体采用了铁氰化钾，但是也可以采用对苯醌及其衍生物、吩嗪甲基硫酸酯、亚甲蓝、二茂铁及其衍生物中的任一种。

为了测定血液等的总胆甾醇值，对含有胆甾醇酯酶、胆甾醇氧化酶及表面活性剂的试剂系统已作了说明。但是在测定葡萄糖量的系统中，作为氧化还原酶也可以采用葡糖氧化酶或葡糖脱氢酶等。

在上述实施例中，含有电子传导体的层是将电子传导体的水溶液滴在形成该层的位置上后，采用加热干燥的方法使之形成的。但是，也可以将电子传导体的水溶液滴在规定位置上后，采用冷冻干燥方法使之形成。此外，也可以采用将含有电子传导体的水溶液进行丝网印刷的方法，或是在设置于试样溶液供给通道内的载体上浸渍含有电子传导体的水溶液，然后在30～70℃下加热干燥或冷冻干燥使之形成含有电子传导体的层。

含有氧化还原酶的层是将其水溶液滴在规定位置上后，采用冷冻干燥方法或采用将含有氧化还原酶的水溶液进行丝网印刷的方法而形成的。但是也可以采用其他方法形成。例如，采用将含有氧化还原酶的水溶液滴在规定位置后，在30～70℃下进行加热干燥的方法，或是将含有氧化还原酶的水溶液滴到设置于试样溶液供给通道内的载体上使之浸渍，然后在30～70℃下采用加热干燥或冷冻干燥的方法。

产生上利用的可能性

如上所述，本发明可以提供一种空白值低、由于保存而引起的应答值变化小、特别是空白值变化小、且结构简易的生物传感器。而且，由于氧化还原酶和电子传导体为互不接触的形状，所以可减少试样溶液供给通道的厚度，并能减低血液等的必需试样量。再者，由于氧化还原酶和电子传导体能够相互在更近距离载持，因此试样供给后，氧化还原酶和电子传导体能迅速混合，可缩短反应时间。

Claims (12)

1.生物传感器，其特征在于，具备绝缘性基板，包含设在上述基板上的测定极和配极的电极系统，结合于上述基板上、和基板之间形成将试样溶液供给到上述电极系统的试样溶液供给通道的罩盖构件，配置于上述试样溶液供给通道内、至少含有胆甾醇氧化酶、胆甾醇酯酶、表面活性剂及电子传导体的试剂系统；上述电子传导体设在上述基板一侧，上述胆甾醇氧化酶及表面活性剂设在上述罩盖构件一侧，与上述电子传导体不接触，并且上述胆甾醇氧化酶的存在位置是将其投影到上述基板上时，和上述电子传导体的存在位置不重叠的位置。

2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，表面活性剂和上述胆甾醇氧化酶混合。

3.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，电子传导体及胆甾醇氧化酶的至少一方是其水溶液经冷冻干燥后形成的。

4.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，电子传导体及胆甾醇氧化酶的至少一方载持于载体上。

5.如权利要求4所述的生物传感器，其特征还在于，载体选自滤纸、玻璃过滤器、纤维素纤维、纸及软木。

6.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，上述胆甾醇酯酶设在上述罩盖构件一侧。

7.如权利要求6所述的生物传感器，其特征还在于，上述电子传导体隔着亲水性高分子层设在上述电极系统上。

8.如权利要求6所述的生物传感器，其特征还在于，电子传导体选自铁氰化钾、对苯醌及对苯醌的衍生物、吩嗪甲基硫酸酯、亚甲蓝、二茂铁及二茂铁的衍生物。

9.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，测定对象为体液。

10.如权利要求9所述的生物传感器，其特征还在于，上述体液为血液、血浆、淋巴液或细胞间质液。

11.测定系统，其特征在于，具备生物传感器，所述的生物传感器具备绝缘性基板，包含设在上述基板上的测定极和配极的电极系统，结合于上述基板上、和基板之间形成将试样溶液供给到上述电极系统的试样溶液供给通道的罩盖构件，配置于上述试样溶液供给通道内、至少含有胆甾醇氧化酶、胆甾醇酯酶、表面活性剂及电子传导体的试剂系统；上述电子传导体设在上述基板一侧，上述胆甾醇氧化酶及表面活性剂设在上述罩盖构件一侧，与上述电子传导体不接触，上述胆甾醇氧化酶的存在位置是将其投影到上述基板上时，和上述电子传导体的存在位置不重叠的位置，

还具备在上述测定极和配极之间施加电压的电压施加装置、

以及具备检测上述施加了电压的测定极和配极之间的电信号的信号检测装置。

12.如权利要求11所述的测定系统，其特征还在于，还具备显示上述信号检测装置检测到的信号的显示装置。

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