CN1374518A - 生理传感器和基质定量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有高应答性、包含胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶的生理传感器。这种生理传感器具备绝缘性基板、在所述基板上形成的包含测定极和对极的电极系、组合于所述基板上并在与基板之间形成从试样供给口把试样液导入所述电极系中的试样供给路的覆盖部件、和设置于所述试样供给路内的试剂层,所述试剂层包含胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、电子传递质、和在酸性pH范围内有缓冲能力的缓冲剂。

Description

生理传感器和基质定量方法
技术领域
本发明涉及能迅速且简便地定量试样中的特定成分的生理传感器、和基质的定量方法。
背景技术
以往，作为不进行试样液的稀释或搅拌就能简易地定量试样液中的特定成分的方式，已经提出了各种生理传感器方案。作为生理传感器之一例，例如，如下的传感器是已知的(参照特开2000-39416号公报)。
这种生理传感器是在绝缘性基板上用丝网印刷等方法形成由测定极、对极和参照极组成的电极系，并在这个电极系上紧接着形成一个含有氧化酶和电子传递质的酶反应层的。
如果在这个生理传感器的酶反应层上滴下含有基质的试样液，酶反应层就会溶解而使酶和基质反应，从而使电子传递质还原。酶反应结束后，使还原的电子传递质发生电化学氧化，从此时得到的氧化电流值，就能求出试样液中的基质浓度。
这种先有技术生理传感器中，为了测定血液、血浆、或血清等试样液中的胆固醇浓度，含有能使酯型胆固醇脱酯化的胆固醇酯酶和能使游离型胆固醇氧化的胆固醇氧化酶(即cholesterol oxidase)2种酶。
然而，血液、血浆、或血清等测定试样，由于具有中性附近的pH缓冲能力，因而对于含有能使胆固醇氧化的酶和胆固醇酯酶的生理传感器来说未必是较好的pH条件。
本发明鉴于这样的问题点，查明了包含能使胆固醇氧化的酶和胆固醇酯酶的生理传感器的最佳pH和较好缓冲剂，目的在于提供具有高应答性的高性能生理传感器。
发明公开
按照本发明的生理传感器具备绝缘性的基板、在所述基板上形成的包含测定极和对极的电极系、组合于所述基板上并在与基板之间形成从试样供给口把试样液导入所述电极系中的试样供给路的覆盖部件、和设置于所述试样供给路内的试剂层，所述试剂层包含能使胆固醇氧化的酶、胆固醇酯酶、电子传递质、和在酸性pH范围内有缓冲能力的缓冲剂。
按照本发明的基质定量方法是使用具备绝缘性的基板、在所述基板上形成的包含测定极和对极的电极系、组合于所述基板上并在与基板之间形成从试样供给口把试样液导入所述电极系中的试样供给路的覆盖部件、和设置于所述试样供给路内而含有能使胆固醇氧化的酶、胆固醇酯酶、和电子传递质的试剂层的生理传感器的基质定量方法，包含使待测试样与在酸性pH范围内有缓冲能力的缓冲剂混合的前处理步骤、把用所述前处理步骤得到的溶液供给所述生理传感器的步骤、和用所述生理传感器进行所述待测试样中的基质定量的步骤。
本发明，就另一个观点而言，提供配备所述生理传感器、以及在所述生理传感器的测定极与对极之间施加电压的电压施加手段和检测在施加了电压的所述测定极与对极之间流过的电流的电流检测手段的测定系统。
附图简要说明
图1是用来证实本发明的生理传感器中缓冲剂使用效果的生理传感器斜视图。
图2是在相同生理传感器中用马来酸作为缓冲剂时的应答特性显示图。
图3是在相同生理传感器中用琥珀酸作为缓冲剂时的应答特性显示图。
图4是在相同生理传感器中使用各种缓冲剂时的应答特性显示图。
图5是本发明的一个实施例中生理传感器除去试剂层的分解斜视图。
图6是相同生理传感器的纵剖视图。
图7是本发明的另一个实施例中生理传感器的纵剖视图。
图8是本发明的又另一个实施例中生理传感器的纵剖视图。
图9是本发明的又另一个实施例中生理传感器除去试剂层的分解斜视图。
图10是相同生理传感器的纵剖视图。
图11是本发明的实施例中测定系统的回路构成示意框图。
发明最佳实施形态
按照本发明的生理传感器，其特征在于具备绝缘性的基板、在所述基板上形成的包含测定极和对极的电极系、在所述电极系上形成的亲水性高分子层、组合于所述基板上并在与基板之间形成从试样供给口把试样液导入所述电极系中的试样供给路的覆盖部件、和设置于所述试样供给路内的试剂层，所述试剂层包含能使胆固醇氧化的酶、胆固醇酯酶、电子传递质、和在酸性pH范围内有缓冲能力的缓冲剂。
本发明的生理传感器，由于试剂层含有在酸性pH范围内有缓冲能力的缓冲剂，因而，即使在待测试样液是在中性附近有缓冲能力的血液、血浆、或血清的情况下，使试剂层溶解于试样中的反应系的pH也能在酸性范围内调制。因此，既能提高酶的反应性，也能提高传感器的应答性。而且，即使反应系的基质浓度是高浓度的，也能在一定时间内得到充分的应答值，因而测定时间可以缩短。进而，伴随着传感器应答性的提高，S/N比也提高了，即测定精度提高了。此外，如果试剂层含有缓冲剂，则溶液的展开和干燥所形成的试剂层就会平滑化。当试剂层是通过从其试剂的水溶液的干燥形成的时，试剂结晶的粗大化等会使试剂层变得有凹凸。尤其当含有电子传递质铁氰化钾时更为显著。若试剂层含有缓冲剂，就没有这样的凹凸，也就能得到平滑的试剂层。其理由尽管不一定是喜欢拘泥于这里所述的理论，但可以认为是由于缓冲剂使通过其溶液的干燥而生成的结晶更细的缘故。
向传感器供给试样液而使试剂层溶解于试样液中时，如果试剂层有凹凸，则在试样液与试剂层的凹凸部之间有空气存在，因而在溶解了试剂层的试样液中会产生气泡。如果在试样液中有气泡产生，就不能使试样液顺利地在试样供给路中移动，从而给测定带来障碍。通过使试剂层平滑化，如上所述的不如意就能消解、进而，由于使试剂层平滑化，因而可以减少试样供给路内的体积或高度，从而实现试样液的微量化。
在此，缓冲剂较好选自下列组成的一组：琥珀酸，琥珀酸盐，D-酒石酸，柠檬酸，柠檬酸盐，酞酸，酞酸盐，反式海葵素酸，甲酸，3，3-二甲基戊二酸，苯乙酸钠，乙酸，乙酸盐，二甲胂酸钠，马来酸，马来酸盐，磷酸，磷酸盐，咪唑，2，4，6-三甲基吡啶，三乙醇胺，三(羟甲基)氨基甲烷(以下用Tris表示)，2-吗啉代乙磺酸(以下用MES表示)，N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酰乙酸(以下用ADA表示)，哌嗪-N，N′-二(2-乙磺酸)(以下用PIPES表示)，N-2-(乙酰胺基)-2-氨基乙醇磺酸(以下用ACES表示)，N，N-二(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(以下用BES表示)，3-吗啉代丙磺酸(以下用MOPS表示)，N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(以下用TES表示)，N-2-羟基乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(以下用HEPES表示)，和氯乙酸。
这些当中，从溶解性充分高这样的观点来看，较好的是琥珀酸钾、琥珀酸钠等琥珀酸盐，磷酸一氢二钾、磷酸二氢一钾、磷酸一氢二钠，磷酸二氢一钠等磷酸盐，乙酸钾、乙酸钠等乙酸盐，酞酸氢钾、酞酸钠，酞酸钾等酞酸盐，马来酸氢钠、马来酸钾、马来酸钠等马来酸盐。如果使用这些琥珀酸、琥珀酸盐、磷酸、磷酸盐、马来酸、马来酸盐、酞酸、酞酸盐，则应答值的提高特别显著，可以得到应答线性优异的生理传感器。就能得到良好生理传感器保存特性这一点而言，更好的琥珀酸。
上述缓冲剂由于易溶于水中，因而添加试样液时含有缓冲剂的层立即溶解于试样液中，可以顺利地进行酶反应和电极反应。
上述缓冲剂必要时也可以用盐酸、乙酸等酸或NaOH、KOH等碱调制得在预定pH范围内有缓冲能力，再添加到生理传感器的试样供给路内。
从应答线性的提高和在一定时间内得到足够高的应答值这样的观点来看，较好的pH是4～6.5，更好的pH是4～5.5。
由于有时待测试样也有缓冲作用，因而也可以向生理传感器中添加2种以上的缓冲剂。作为缓冲剂的组合，较好的是琥珀酸与马来酸的混合物，琥珀酸与磷酸的混合物，马来酸与Tris的混合物等。
上述缓冲剂的添加量，对于以作为试样液的血液0.04～20μl为测定对象的一次性类型的传感器来说，从缓冲剂含有层的有效平滑化和降低空白值这样的观点来看，较好在每一个传感器5～1000nmol的范围内。这里所谓空白值系指对基质浓度为0的待测试样例如水的应答值。进而，从提高含有缓冲剂的试剂层的溶解性和降低空白值这样的观点来看，更好的是每一个传感器20～500nmol。为了提高测定速度，使从向传感器供给试样到得到应答值的测定所需时间短于4分钟左右的较好酶量是每一个传感器胆固醇酯酶0.1～10U、胆固醇氧化酶0.03～3U。
在本发明的较好实施方案中，所述胆固醇氧化酶和所述胆固醇酯酶是与所述电子传递质彼此分开担持的。按照这种实施方案，可以得到空白值低的生理传感器。进而，能防止保存引起的应答值增加，因而可以得到保存特性优异的生理传感器。
在本发明的另一个较好实施方案中，所述缓冲剂是与所述胆固醇氧化酶或胆固醇酯酶混合担持的。按照这种实施方案，能使胆固醇氧化酶或胆固醇酯酶含有层平滑化，因而向传感器供给待测试样时可以防止气泡混入。
在本发明的又一个较好实施方案中，所述缓冲剂是与所述电子传递质混合担持的。按照这种实施方案，能使电子传递质含有层平滑化，因而可以防止待测试样供给时气泡混入。
在本发明的较好实施方案中，所述缓冲剂是与所述胆固醇氧化酶、所述胆固醇酯酶和所述电子传递质分开担持的，而且在所述试样供给路内，也担持在比所述胆固醇氧化酶、所述胆固醇酯酶和所述电子传递质更靠近所述试样供给口的位置。按照这种实施方案，供给生理传感器中的待测试样首先使缓冲剂溶解，从而有使待测试样的pH迅速调到酸性侧这样的效果。
在本发明的另一个较好实施方案中，在所述试样供给路内还有过滤器。用血液作为试样时，这种过滤器可以过滤血球成分，从而防止血球成分对电极产生的影响。所述过滤器在试样供给路内如果处在靠近试样供给口的位置，则能有效地除去试样中的血球成分，因而更好。
所述过滤器若设定于试样供给路内靠近试样供给口的位置，则当用血液作为试样时，可以更有效地防止酶或电子传递质等试剂或电极与血球成分接触。
作为过滤器，可以使用玻璃过滤器、滤纸、纤维素纤维等。
作为本发明的生理传感器要测定的对象，可以列举体液。作为体液，可以列举血液、血浆、血清、淋巴液、细胞间质液、汗中任何一种。具体地说，血液、血浆、和血清中所含胆固醇的一部分是作为结合了脂肪酸的胆固醇酯存在的。本发明的生理传感器含有胆固醇酯酶，借助于其酶作用，使胆固醇酯转化成游离的胆固醇，而胆固醇氧化酶等又会使其氧化。
本发明，就另一种观点而言，提供一种配备所述生理传感器、以及在所述生理传感器的测定极与对极之间施加电压的电压施加手段和检测施压了电压的所述测定极与对极之间流过的电流的电流检测手段的测定系统。
本发明的较好测定系统进一步具有能显示所述电流检测手段检测的电流或将所述电流转换成诸如胆固醇值的显示部。
本发明进一步提供一种基质定量方法，即一种用具备绝缘性的基板、在所述基板上形成的包含测定极和对极的电极系、在所述电极系上形成的亲水性高分子层、组合于所述基板上并在与基板之间形成从试样供给口把试样液导入所述电极系中的试样供给路的覆盖部件、和设置于所述试样供给路内的试剂层、所述试剂层包含能使胆固醇氧化的酶、胆固醇酯酶、和电子传递质的生理传感器的基质定量方法，包含使在酸性pH范围内有缓冲能力的缓冲剂与待测试样混合的前处理步骤、将所述前处理步骤得到的溶液供给所述生理传感器的步骤，和用所述生理传感器进行所述待测试样中的基质定量的步骤。
如果采用这种方法，用前处理步骤就能将待测试样的pH迅速调整到酸性范围，因而提高了酶的反应性，从而提高传感器的应答性。
本发明提供一种酶试剂，包含在酸性pH范围内有缓冲能力的缓冲剂和酶，所述酶是至少能使胆固醇氧化的酶和胆固醇酯酶。只要将这种酶试剂添加到生理传感器中，就能得到应答性提高了的生理传感器。
本发明中，作为能使胆固醇氧化的醇，可以列举胆固醇氧化酶和胆固醇脱氢酶。
作为电子传递质，可以使用铁氰化钾、对苯醌及其衍生物、吩嗪硫酸二甲酯、亚甲基蓝、二茂铁及其衍生物等。这些当中较好的是在空气能进行稳定的氧化还原的铁氰化钾。
亲水性高分子可以防止含有能使胆固醇氧化的酶、胆固醇酯酶、电子传递质、缓冲剂等试剂的试剂层从电极系表面或基板表面上剥离。进而，亲水性高分子还具有能防止所述试剂层表面开裂的效果，从而有效提高了生理传感器的可靠性。作为这样的亲水性高分子，可以列举羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、羧甲基乙基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚赖氨酸等聚氨基酸、聚苯乙烯磺酸、明胶及其衍生物、丙烯酸及其盐的聚合物、甲基丙烯酸及其盐的聚合物、淀粉及其衍生物、无水马来酸或其盐的聚合物、琼脂糖凝胶及其衍生物。尤其，从能达到充分的粘度的观点来看，较好的是羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、和聚乙烯基吡咯烷酮。
本发明也意图提供能以微量试样量得到高精度测定值的生理传感器。为了这样的目的，采用了如下所述结构的传感器。具体地说，较好的是从试样供给口到空气孔的试样供给路的尺寸为宽0.4～4mm、高0.05～0.5mm、长2～10mm。更好的传感器是试样供给路的尺寸为宽0.5～2mm、高0.05～0.2mm、长3～5mm，试样量为0.075～2μl。
以下用实施例说明本发明，但本发明并非只限定于这些。
实施例1
图1显示用来证实在本发明的生理传感器中使用能给出酸性溶液的缓冲剂的效果的生理传感器的斜视图。在由聚对苯二甲酸乙二醇酯组成的电绝缘性基板1上，用丝网印刷法印刷银糊状物，形成引线2和3。随后在基板1上印刷含有树脂粘结剂的导电性碳糊状物，形成测定极4。这个测定极4与引线2接触。进而，在这个基板上印刷绝缘性糊状物，形成绝缘层6。绝缘层6覆盖测定极4的外周部，借此使测定极4的露出部分的面积保持恒定。然后，在基板1上印刷含有树脂粘结剂的导电性碳糊状物，使之与引线3接触，形成环状的对极5。测定极4和对极5形成了电极系。
为了确定使用了能使胆固醇氧化的酶和胆固醇酯酶的生理传感器的最佳pH和较好缓冲剂，用所述传感器进行了以下实验。
首先配制含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、和一种缓冲剂的水溶液。然后，配制含有铁氰化钾、和Triton X-100的水溶液。用人血清作为测定试样。缓冲剂是从琥珀酸、马来酸、磷酸、和Tris中选择一种。为了得到对应于胆固醇浓度0mg/ml的应答值，用水代替人血清。
上述3种溶液在试管内搅拌、混合。所得到的混合溶液中各种试剂和测定对象胆固醇的浓度如下：
胆固醇酯酶：200单位(U)/ml
胆固醇氧化酶：1000U/ml
缓冲剂：100mM
铁氰化钾：300mM
Triton X-100：2％(重量)
胆固醇：0～116mg/dl
在上述混合溶液中，血清中所含酯型胆固醇借助于胆固醇酯酶进行脱酯化。这种脱酯化的胆固醇和从一开始血清中就含有的胆固醇，借助于胆固醇氧化酶进行氧化。同时，溶液中的铁氰化钾被还原成亚铁氰化钾。
其次，向图1中所示电极系上滴加10μl(微升)上述混合液。从3种溶液混合起20秒后，以对极为基准在测定极上施加500mV电压。此时，溶液中所含的亚铁氰酸根离子被氧化，在测定极与对极之间有电流流过。施加电压5秒后测定在测定极与对极之间流过的电流值。最后，由于血清有缓冲能力，因而实测了混合溶液的pH。
用马来酸作为缓冲剂之一例，测定以各种总胆固醇浓度配制的混合溶液的应答电流值。以混合溶液的总胆固醇浓度为横座标、以应答电流值为纵座标作图，制作了传感器的应答特性图。将其显示在图2中。其结果，在溶液的pH处于酸性范围内的情况下，得到了应答值越高、应答越好的直线性。而且，在pH处于酸性范围内的情况下，可以在一定时间内得到应答的直线性，因而，通过酸性缓冲剂的添加，可以实现测定时间的缩短。
然后，把用琥珀酸作为缓冲剂时传感器的应答特性图表示在图3中。其结果，在pH 4或5的任何一种情况下应答值都高，都能得到应答更好的直线性。而且，应答直线的斜率提高引起的S/N比提高即测定精度提高，也是所希望的。
琥珀酸、马来酸、磷酸、和Tris分别用于缓冲剂时的结果显示在图4中。从此图清楚地看出传感器的pH依赖性。在混合液的pH调整到酸性范围内的情况下，可以看出能得到更高的应答值。另一方面，在混合液的pH高于8的情况下，可以看出空白应答(对应于胆固醇为0mg/dl的电流应答值)较高，是不适合的。最佳pH是4～6.5、更好的是4～5.5。
本实验中使用的酶的较好pH是胆固醇酯酶在pH 6.5以下、胆固醇氧化酶在pH 7附近。因此，这些结果表明，把试样液的pH调节到更靠近胆固醇酯酶的较好pH的pH，就能得到更高的应答值。
实施例2
用图5和图6说明本实施例。图5是本实施例中的生理传感器除去了试剂层的分解斜视图，图6是其纵剖视图。基板1有与图1同样的电极系。组合于此基板上的覆盖部件由有狭缝8的隔板7和有空气孔10的盖板9组成。在如后所述那样形成各试剂层后，具有如图5的点划线所示那样的位置关系、通过在基板1上连接隔板7和盖板9，便装配成生理传感器。这种生理传感器在隔板7的狭缝8部分形成了试样供给路。在传感器端部的狭缝8的开放端部8a成为进入试样供给路的试样供给口。这里使用的基板1的尺寸是宽6mm、长30mm。从试样供给口到空气孔的试样供给路的内容积尺寸是宽2.0mm、高0.1mm、长5.0mm。
在形成了电极系的基板上，滴加亲水性高分子之一的羧甲基纤维素(以下用CMC表示)的0.5％(重量)水溶液4μl，在50℃干燥15分钟，形成了CMC层11。然后，在这个CMC层11上形成包含缓冲剂之一的琥珀酸和电子传递质之一的铁氰化钾的电子传递质·缓冲剂层12。电子传递质·pH缓冲剂层12的制作方法如下。首先，向调整到pH 5的琥珀酸浓度20mM的缓冲液中添加、溶解铁氰化钾，使其达到75mM。然后，这种含铁氰化钾的琥珀酸缓冲液4μl滴加到CMC层11上之后，在50℃干燥15分钟。
另一方面，在装配了隔板7和盖板9的盖板部件中，在成为试样供给路的狭缝8中面对盖板9的一侧上滴加含有胆固醇酯酶900U/ml、胆固醇氧化酶400U/ml、以及作为表面活性剂的Triton X-100 1.6％(重量)和胆酸钠30mM的水溶液0.5μl，冷冻干燥，形成了酶·表面活性剂层13。把形成了酶·表面活性剂层13的盖板部件，和形成了CMC层11与电子传递质·缓冲剂层12的基板1装配在一起，就完成了生理传感器。
若将待测试样导入传感器内，就会使电子传递质·pH缓冲剂层12中所含的琥珀酸溶解，并将传感器内溶液的pH调整到酸性范围。因此，酶的活性提高了，达到了提高传感器应答性的效果。而且，由于能在一定时间内得到充分的应答，因而能达到缩短测定时间这样的效果。又，由于电子传递质·pH缓冲剂层12中所含的琥珀酸使层12本身变得平滑，因而能达到防止气泡混入到电极系上这样的效果。进而，由于酶和电子传递质是彼此分开担持的，因而能得到空白值低的生理传感器。由于酶和电子传递质是彼此分开担持的，因而能得到保存特性优异的生理传感器。即，保存后的生理传感器也显示出与刚制作后的生理传感器同等的应答值，而且空白值增加及其它因素引起的保存后的应答值不当增加受到了抑制。
生理传感器内的酶或铁氰化钾，只要无损于本发明的效果，就可以配置在各种位置上。例如，铁氰化钾也可以配置在试样供给路内的CMC层上以外的场所。
本实施例中，使用Triton X-100和胆酸钠作为表面活性剂，但也可以使用其它辛基硫葡糖苷、Lubrol、胆酸、脱氧胆酸钠、毛地黄皂苷、十二烷基麦芽糖苷、蔗糖-月桂酸酯、牛磺脱氧胆酸钠、聚氧亚乙基-对叔辛基苯基醚等表面活性剂。
作为使伴随酶反应而还原的电子传递质氧化的电流的测定方法，可以有两种方式，即仅测定极与对极的二极方式，和再加一个参照极的三极方式。
实施例3
本实施例的生理传感器显示于图7中。首先，在基板1上，同实施例2一样进行，形成了CMC层11。其次，向调整到pH 5的马来酸缓冲液中添加胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、铁氰化钾、Triton X-100、和胆酸钠，制成一种水溶液。此水溶液中各试剂的浓度是：马来酸，200mM；胆固醇酯酶，900U/ml；胆固醇氧化酶，400U/ml；铁氰化钾，600mM；Triton X-100，1.6％(重量)；胆酸钠，30mM。这种水溶液0.5μl滴加到CMC层11上、冷冻干燥，形成了酶·表面活性剂·电子传递质·缓冲剂层14。
本实施例中，CMC以外的全部试剂是一次滴加、干燥的，因而有制作方法最容易这样的优点。而且，若将待测样品导入传感器内，则酶·表面活性剂·电子传递质·缓冲剂层14中所含的马来酸就会溶解，并将传感器内溶液的pH调整到酸性范围。因此，酶的活性提高了，从而达到了提高传感器应答性的效果。
实施例4
本实施例的生理传感器显示在图8中。在形成了电极系的基板1上，同实施例2一样进行，形成了CMC层11。然后在CMC层11上，滴加含有Triton X-100 0.16％(重量)、胆酸钠3mM、和铁氰化钾75mM的水溶液5μl后，在50℃干燥15分钟，形成了表面活性剂·电子传递质层15。
另一方面，在试样供给路内的盖板9一侧，滴加含有胆固醇酯酶900U/ml、胆固醇氧化酶400U/ml、和缓冲剂之一的磷酸20mM的水溶液0.5μl后冷冻干燥，形成了酶·缓冲剂层16。
如果把待测试样导入传感器内，则酶·缓冲剂层16中所含的磷酸就会溶解，并使传感器内溶液的pH调整到酸性范围。因此，酶的活性提高了，从而达到了提高传感器的应答性的效果。而且，酶·缓冲剂层16中所含的磷酸使层16本身变得平滑，因而达到了防止气泡混入到电极系上这样的效果。进而，酶和电子传递质是彼此分开担持的，因而空白值低、能防止保存引起的应答值增加，从而得到了保持特性优异的生理传感器。
实施例5
用图9和图10说明本实施例。图9是本实施例中生理传感器除去试剂层的分解斜视图，图10是该生理传感器的纵剖视图。
基板21同实施例1一样进行，使之具有与引线22连接的测定极24、与引线23连接的对极25和绝缘层26。在基板21上，同实施例2一样进行，以能覆盖电极系的方式形成CMC层32。然后，在CMC层32上滴加铁氰化钾75mM水溶液5μl后，在50℃干燥15分钟，形成了电子传递质层33。
另一方面，在装配了隔板27和盖板29的覆盖部件一侧，在试样供给路内的盖板29上滴加含有胆固醇酯酶900U/ml、胆固醇氧化酶400U/ml、以及作为表面活性剂的Triton X-100，1.6％(重量)和胆酸钠30mM的水溶液0.5μl之后冷冻干燥，形成了酶·表面活性剂层34。进而，在试样供给路内，在酶·表面活性剂层34的上游设置用于过滤待测试样中所含固体成分的过滤器31。
过滤器31在诸如待测试样为血液的情况下起到将血球过滤和防止血球成分对电极产生的影响的作用。如图10中所示，在试样供给路中，如果过滤器31在靠近试样供给口的位置，则能更有效地除去试样中的血球成分，因而较好。过滤器31若设定于试样供给路内靠近试样供给口的位置，则用血液作为试样时，能更有效地防止血球成分对电子传递质层33、酶·表面活性剂层34或电极的接触。作为过滤器，可以使用玻璃过滤器、滤纸、纤维素纤维等三维连接的多孔体。这种多孔体借助于毛细管作用使血液向电极系一侧移动，由于血浆与血球的流动阻力差异而具有过滤血球的作用。
按照点划线所示位置关系连接基板21、隔板27、和盖板29时，过滤器31连接在基板21表面与31′的部分。基板21上的传感器端部21a成分通向试样供给路的试样供给口。在此供给的试样吸收于过滤器31中，借助于毛细管作用向电极系移动。缓冲剂琥珀酸包含在位于酶·表面活性剂层34和电子传递质层33的上一侧的过滤器31内。作为琥珀酸的含有方法，采用的是把过滤器31配置在预定位置之后，向过滤器31中滴加琥珀酸水溶液、再冷冻干燥的方法。
本实施例中，由于在试样供给路内琥珀酸位于酶和铁氰化钾的上游，因而待测试样首先使琥珀酸溶解，从而将待测试样的pH迅速调整到酸性范围。因此，生理传感器内酶的活性提高了，从而达到了提高传感器应答性的效果。
实施例6
图11是显示本发明的一个实施例中测定系统的回路构成的框图。测定装置40有通过生理传感器41的测定极引线42和对极引线43在两电极间施加受控电压的电压施加装置44，和测定在传感器的测定极与对极间流过的电流的电流测定器45。测定的电流值在显示部46上显示。显示部46也能把测定的电流值换算成诸如胆固醇再显示。
产业上利用的可能性
按照如上所述的本发明，添加缓冲剂使生理传感器内反应系的pH调整到酸性范围，可以提高生理传感器的应答值，并得到更加良好的应答直线性。而且，可以在一定时间内得到足够高的应答值，因而能实现测定时间的缩短。进而，缓冲剂能使含有缓冲剂的试剂层变得平滑，因而供给待测试样时可以防止气泡混入。

Claims (20)

1.一种生理传感器，其特征在于具备绝缘性的基板、在所述基板上形成的包含测定极和对极的电极系、组合于所述基板上并在与基板之间形成从试样供给口把试样液导入所述电极系中的试样供给路的覆盖部件、和设置于所述试样供给路内的试剂层，所述试剂层包含能使胆固醇氧化的酶、胆固醇酯酶、电子传递质、和在酸性pH范围内有缓冲能力的缓冲剂。
2.权利要求1记载的生理传感器，其中，所述缓冲剂选自下列组成的一组：琥珀酸、琥珀酸盐、柠檬酸、柠檬酸盐、酞酸、酞酸盐、马来酸、马来酸盐、磷酸、和磷酸盐。
3.权利要求2记载的生理传感器，其中，所述缓冲剂在pH4～6.5的范围内有缓冲能力。
4.权利要求3记载的生理传感器，其中，所述缓冲剂的量是每一个传感器5～1000nmol。
5.权利要求4记载的生理传感器，其中，所述缓冲剂的量是每一个传感器20～500nmol。
6.权利要求1记载的生理传感器，其中，所述能使胆固醇氧化的酶和胆固醇酯酶是与所述电子传递质彼此分开担持于所述试样供给路内的。
7.权利要求1记载的生理传感器，其中，所述缓冲剂是与所述能使胆固醇氧化的酶或胆固醇酯酶混合担持的。
8.权利要求1记载的生理传感器，其中，所述缓冲剂是与所述电子传递质混合担持的。
9.权利要求1记载的生理传感器，其中，所述缓冲剂是与所述能使胆固醇氧化的酶、所述胆固醇酯酶和所述电子传递质分开担持的，而且在所述试样供给路内担持于比所述能使胆固醇氧化的酶、所述胆固醇酯酶和所述电子传递质更靠近试样供给口的位置。
10.权利要求1记载的生理传感器，在所述试样供给路内还有过滤器。
11.权利要求10记载的生理传感器，其中，所述过滤器就在靠近试样供给口的位置。
12.权利要求10记载的生理传感器，其中，所述过滤器担持了所述缓冲剂。
13.权利要求1记载的生理传感器，其中，所述能使胆固醇氧化的酶是胆固醇氧化酶。
14.权利要求1记载的生理传感器，其中，测定对象是体液。
15.权利要求14记载的生理传感器，其中，所述体液是血液、血浆、淋巴液、或细胞间质液。
16.一种测定系统，其中配备一个具备绝缘性的基板、在所述基板上形成的包含测定极和对极的电极系、组合于所述基板上并在与基板之间形成从试样供给口把试样液导入所述电极系中的试样供给路的覆盖部件、和设置于所述试样供给路内的试剂层，所述试剂层包含能使胆固醇氧化的酶、胆固醇酯酶、电子传递质、和在酸性pH范围内有缓冲能力的缓冲剂的生理传感器，以及在所述测定极与对极之间施加电压的电压施加手段和检测在施加了电压的所述测定极与对极之间流过的电流的电流检测手段。
17.权利要求16记载的测定系统，还有一个显示部，以显示所述电流检测手段检测的电流或使所述电流变换的值。
18.一种基质定量方法，即一种使用一个具备绝缘性的基板、在所述基板上形成的包含测定极和对极的电极系、组合于所述基板上并在与基板之间形成从试样供给口把试样液导入所述电极系中的试样供给路的覆盖部件、和设置于所述试样供给路内的试剂层，所述试剂层包含能使胆固醇氧化的酶、胆固醇酯酶、电子传递质、和在酸性pH范围内有缓冲能力的缓冲剂的生理传感器的基质定量方法，包含使在酸性pH范围内有缓冲能力的缓冲剂与待测试样混合的前处理步骤、将所述前处理步骤得到的溶液供给所述生理传感器的步骤，和用所述生理传感器进行所述待测试样中的基质定量的步骤。
19.一种酶试剂，包含在酸性pH范围内有缓冲能力的缓冲剂和酶，且所述酶至少是能使胆固醇氧化的酶和胆固醇酯酶。
20.权利要求19记载的酶试剂，其中，所述缓冲剂选自下列组成的一组：琥珀酸、琥珀酸盐、柠檬酸、柠檬酸盐、酞酸、酞酸盐、马来酸、马来酸盐、磷酸、和磷酸盐。
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