WO2002057767A1 - Biocapteur - Google Patents

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WO2002057767A1
WO2002057767A1 PCT/JP2002/000108 JP0200108W WO02057767A1 WO 2002057767 A1 WO2002057767 A1 WO 2002057767A1 JP 0200108 W JP0200108 W JP 0200108W WO 02057767 A1 WO02057767 A1 WO 02057767A1
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substrate
biosensor according
biosensor
electrode
electron mediator
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PCT/JP2002/000108
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English (en)
French (fr)
Inventor
Motokazu Watanabe
Tomohiro Yamamoto
Miwa Hasegawa
Shin Ikeda
Shiro Nankai
Original Assignee
Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted

Definitions

  • the present invention relates to a biosensor for quantifying a substrate in a sample such as blood, plasma, and serum.
  • biosensors have been proposed as a biosensor for quantifying a specific component in a sample such as blood, and the following sensor is known as an example (JP-A-63-317). 096 publication).
  • an electrode system consisting of a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode is formed on an insulating substrate by a method such as screen printing, and a reaction including an oxidoreductase and an electron mediator is brought into contact with the electrode system.
  • a reaction including an oxidoreductase and an electron mediator is brought into contact with the electrode system.
  • the reaction layer dissolves and the oxidoreductase reacts with the substrate. Medei overnight is returned.
  • the reduced electron mediator is electrochemically oxidized by the electrode system, and the substrate in the sample solution is quantified from the resulting oxidation current.
  • the oxidoreductase and the electron media are usually supported on the electrode system in a mixed state.
  • the purpose is to eliminate the need to mix or stir the sample, to make the reaction of oxidoreductase and electron media more efficient, and to quantify the substrate in a short time.
  • the response value (hereinafter referred to as the blank value) for a sample solution with a substrate concentration of O mg Zd1 is not 0 but a high value of 0 or more.
  • the response values for the blank value and the sample solution containing the same concentration of the substrate increase as the storage period becomes longer. There was a problem.
  • the fact that the response value changes with storage is a problem in that reliability is low.
  • an object of the present invention is to provide a biosensor having a simple configuration in which a blank value is low and a response value upon storage, particularly a change in the blank value, is small.
  • Another object of the present invention is to provide a biosensor particularly suitable for the determination of cholesterol. Disclosure of the invention
  • the present invention provides an insulating substrate, an electrode system including a measurement electrode and a counter electrode provided on the substrate, and a sample liquid supply path coupled to the substrate and supplying a sample liquid to the electrode system between the substrate and the substrate.
  • a cover member for forming the sample a reagent system including at least an acid tuner reductase and an electron mediator arranged in the sample liquid supply path, wherein the electron mediator is on the substrate side, and the oxidoreductase is A biosensor provided on a cover member side without being in contact with each other.
  • the position where the oxidoreductase is present does not overlap with the position where the electron mediator is present when the position is projected onto the substrate.
  • the present invention also provides the biosensor, voltage applying means for applying a voltage between the measuring electrode and the counter electrode, and a measuring electrode and the counter electrode to which the voltage is applied.
  • a signal detection means for detecting an electric signal during the measurement.
  • the measurement system further includes a display means for displaying a signal detected by the signal detection means.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view of a biosensor according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the biosensor.
  • FIG. 3 is an exploded perspective view of a biosensor according to another embodiment of the present invention ( FIG. 4 is a cross-sectional view of the biosensor).
  • FIG. 5 is a block diagram showing a circuit configuration of the measurement system according to one embodiment of the present invention.
  • the present invention provides an insulating substrate, an electrode system including a measurement electrode and a counter electrode provided on the substrate, and a sample liquid supply path coupled to the substrate and supplying a sample liquid to the electrode system between the substrate and the substrate. And a reagent system including at least an oxidoreductase and an electron mediator disposed in the sample liquid supply path, wherein the electron mediator is on the substrate side and the oxidoreductase is
  • the present invention relates to a biosensor provided on a cover member side without being in contact with each other.
  • the electron mediator and the oxidoreductase do not come into contact with each other. For this reason, after the biosensor is manufactured, the oxidoreductase and the electron mediator do not react in the biosensor, so that the blank value can be kept low and the response value change due to storage is suppressed. can do.
  • the position where the oxidoreductase is present does not overlap with the position where the electron mediator is present when projected on the substrate.
  • the volume of the sample liquid supply path can be reduced while maintaining the state where the oxidoreductase and the electron mediator are separated.
  • the reagent system further includes a surfactant provided on the force bar member side.
  • a surfactant is mixed with the oxidoreductase.
  • a preferred biosensor of the present invention is for quantifying serum cholesterol level as a diagnostic guide, and the reagent system catalyzes at least one of cholesterol oxidase and cholesterol dehydrogenase, a process of converting cholesterol ester to cholesterol. Cholesterol esterase, and a surfactant.
  • Cholesterol in blood or serum is contained in lipoproteins having a micelle structure.
  • the reagent system contains a suitable detergent, the reactivity of at least one of cholesterol oxidase and cholesterol dehydrogenase or cholesterol esterase to cholesterol in lipoproteins is increased.
  • the surfactant used for the above purpose may be any one of an ionic surfactant and a nonionic surfactant.
  • an ionic surfactant polyoxyethylene octyl phenyl ether, cholic acid or a salt thereof, deoxycholic acid or a salt thereof, a fatty acid salt, an alkyl sulfate ester salt, a polyoxyethylene alkyl ester sulfate ester salt, an alkyl benzene sulfonate salt, an alkyl naphthene sulfonate salt, an alkyl sulfosuccinic acid salt Salt, alkyl diphenyl ether disulfonate, alkyl phosphate, naphthalene sulfonate formalin condensate, polycarboxylic acid type polymer interface Activator, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, polyoxyethylene derivative, sorbitan fatty acid este
  • polyoxyethylene octyl phenyl ether is particularly preferred. Since the action of solubilizing the lipoprotein by the surfactant differs depending on the type of the surfactant, two or more of the above surfactants may be used at the same time.
  • At least one of the electron mediator and the redox enzyme is formed by freeze-drying the aqueous solution.
  • the layer of electron mediator and Z or redox enzyme formed by lyophilization improves the solubility and can reduce the overall measurement time.
  • the reaction by the oxidoreductase is the first step to obtain a response value
  • the oxidoreductase layer is formed by freeze-drying, the oxidoreductase can be rapidly dissolved when the sample solution is supplied. Is preferred.
  • At least one of the electron mediator and the oxidoreductase is supported on a carrier.
  • the carrier used here may be any carrier that can carry the reagent inside the carrier or on the carrier surface, and examples thereof include filter paper, glass filter, cellulose fiber, paper, and cork.
  • filter paper when filter paper is used, the reagent is mainly supported inside the filter paper, and when paper is used, the reagent is supported on the surface of the paper. There is a difference.
  • a glass filter or a cellulose fiber is preferable because the non-specific adsorption amount of the oxidoreductase to the carrier is small.
  • Examples of the electron mediator that can be used in the biosensor of the present invention are not particularly limited. And derivatives of sen and humic acid. Among these, potassium ferricyanide is preferable because it is stable even in the presence of oxygen.
  • the oxidoreductase is appropriately selected depending on the substrate to be measured, such as glucose oxidase, darcos dehydrogenase, cholesterol oxidase, and cholesterol dehydrogenase.
  • the insulating substrate and the cover member have electric insulation and some rigidity.
  • thermoplastic resins such as polyethylene, polyethylene terephthalate, polystyrene, polyvinyl chloride, polyamide, and saturated polyester, and thermosetting resins such as urea resin, melamine resin, phenol resin, epoxy resin, and unsaturated polyester resin Is mentioned.
  • an electron mediator layer is formed on an electrode system provided on a substrate.
  • a hydrophilic polymer layer is formed on the electrode system, and an electron media layer is formed on the hydrophilic polymer layer. It is good to form an evening layer.
  • the solution of the sample is deposited on the silver base of the electrode base by the action of the reagent surfactant dissolved in the sample. Penetrate. For this reason, when a potential is applied to the electrode when measuring the response current of the sensor, the silver layer Response current, and as a result, the response current value may increase.
  • the electrode system is coated with the hydrophilic polymer layer, the penetration of the surfactant into the silver layer can be reduced.
  • the hydrophilic polymer constituting such a hydrophilic polymer layer may be any as long as its aqueous solution has viscosity, and examples thereof include carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, methylcellulose, and ethylcellulose.
  • Cellulose such as tylcellulose, ethylhydroxyethylcellulose, and carboxyshethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyamino acid such as polylysine, polystyrenesulfonic acid, gelatin and derivatives thereof, acrylic acid And polymers of salts thereof, polymers of methacrylic acid and its salts, starch and its derivatives, polymers of maleic anhydride and its salts, agarose gel and its derivatives, and the like.
  • the material of the measurement electrode and the counter electrode may be any material having conductivity, and examples thereof include carbon, gold, palladium, and platinum.
  • the electrode system including the measurement electrode and the counter electrode provided on the insulating substrate may further include a reference electrode.
  • Samples measured by the biosensor of the present invention include body fluids.
  • Body fluids include blood, plasma, lymph, interstitial fluid, and sweat. Cholesterol, glucose, etc. contained in each body fluid are measured.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view of the biosensor according to the present embodiment
  • FIG. 2 is a longitudinal sectional view of the biosensor.
  • a silver paste is printed on the insulating substrate 2 by screen printing, and then heated and dried to form a measurement electrode lead 13 and a counter electrode lead 14, and a base for an electrode system described later.
  • an electrode system consisting of the measurement electrode 3 and the counter electrode 4 is formed by printing a conductive carbon paste by screen printing and drying by heating.
  • an insulating paste that partially covers the electrode system is printed by screen printing, and is heated and dried to form an insulating layer 6.
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • an aqueous solution of a ferricyanide-powered rim which is a kind of electronic media, is dropped and heated and dried so as to cover the CMC layer 7, whereby the electronic media overnight layer 8 is formed.
  • the CMC layer 7 and the electron mediator layer 8 are shown as being independent from each other, but they are actually partially mixed.
  • the middle cover 15 consists of two columnar pieces 15a and a short piece 15b connecting them at their rear.
  • the cover member has a recess formed on the lower surface of the upper cover 16 surrounded by the pieces 15a and 15b.
  • the cover member is turned upside down, and a mixed aqueous solution containing cholesterol esterase, cholesterol oxidase and / or cholesterol dehydrogenase, which are oxidoreductases, and a surfactant is dropped into the concave portion, and the mixture is frozen.
  • the enzyme layer 10 is formed by drying.
  • the enzyme layer 10 is a sample liquid supply path formed when three of the upper cover 16, the middle cover 15, and the insulating substrate 2 are bonded together. Shaped to fit within 17 Is done. Finally, the biosensor 1 is manufactured by laminating the insulating substrate 2 and the cover member in a positional relationship as shown by a dashed line in FIG.
  • a sample liquid supply path for supplying a sample liquid to the electrode system between the insulating substrate 2 and the upper cover 16 by the insulating substrate 2, the middle cover 15 and the upper cover 16 17 are formed.
  • a sample such as blood is supplied to the biosensor 1 from a sample supply port 11.
  • the air holes 12 serve as escape paths for air when the sample is supplied, and have a function of facilitating the supply of the sample.
  • the size of the sample liquid supply path 17 should be 0.4 to 4 mm in width, 0.05 to 0.5 mm in height, and 2 to L Omm. preferable. With such a sensor, the sample volume can be between 0.04 and 201. The more preferable size of the sample liquid supply path 17 is 0.5 to 2 mm in width, 0.05 to 0.2 mm in height, and 3 to 5 mm in length, and the sample amount is 0.075 to 2. OI. Embodiment 2
  • FIG. 3 is an exploded perspective view of the biosensor according to the present embodiment
  • FIG. 4 is a longitudinal sectional view of the biosensor.
  • the enzyme layer 10a in the present embodiment is formed by screen-printing a mixed aqueous solution containing an oxidoreductase, cholesterol esterase, and a surfactant on the lower surface of the upper cover 16 and drying it.
  • the position of the enzyme layer 10 a is set so as not to overlap with the electron mediator layer 8 but to surround the layer 8 when projected onto the substrate 2.
  • the enzyme layer 10a of the cover member when projected on the substrate 2, does not overlap with the electronic media layer 8, but surrounds the layer 8.
  • the thickness of the sample liquid supply path can be reduced and the volume of the sample liquid supply path can be reduced while maintaining the state where the oxidoreductase and the electron mediator are separated. Therefore, the amount of sample required for measurement can be reduced.
  • FIG. 5 is a block diagram illustrating a configuration example of a measurement system using the biosensor described above.
  • the voltage applying means 21 applies a voltage between the measuring electrode 3 and the counter electrode 4 from the leads 13 and 14 of the sensor 1.
  • the current detecting means 22 inserted between the voltage applying means 21 and the lead 14 detects a current flowing between the measuring electrode 3 and the counter electrode 4.
  • the display means 23 connected to the current detection means 22 displays a current value detected by the current detection means 22 or a value obtained by converting the current into a voltage.
  • a cholesterol sensor will be described as an example of a biosensor, but the present invention is not limited to the following examples.
  • Example 1 A cholesterol sensor will be described as an example of a biosensor, but the present invention is not limited to the following examples.
  • a biosensor of Comparative Example 1 was produced in the same manner as in Example 1 except that cholesterol esterase and cholesterol oxidase were mixed in an electron media layer.
  • the cholesterol concentration of human serum at / d 1 was measured.
  • the sample liquid is supplied to the sample liquid supply path 17 by bringing the sample liquid into contact with the sample supply port 11.
  • a voltage of 50 OmV is applied to the measurement electrode 3 with reference to the counter electrode 4, and 5 seconds elapses.
  • the current value (response value) flowing between the measurement electrode 3 and the counter electrode 4 was measured later.
  • Table 1 shows the change in the response value to a PBS buffer solution with a cholesterol concentration of Omg / d1.
  • Table 2 shows the changes in the response values to the above. For each sample solution, the response value of the biosensor at the initial stage and the biosensor at 30 ° C for 4 weeks Comparison with response value after storage
  • the response value to the cholesterol concentration of 0 mg / d1 was 0.19 A in the initial stage, which was 0.37 A in comparison with the biosensor of the comparative example. ⁇ A lower values were obtained. Accordingly, the effect of reducing the response value to the cholesterol concentration of 0 mg Zd1, ie, the blank value, was obtained by the biosensor of Example 1.
  • the response value to cholesterol concentration 0 mg / d1 was changed from 0.56 / A to 0.89 A by storing at 30 ° C for 4 weeks. , 0.33 A increased.
  • the response value to the cholesterol concentration OmgZd 1 increased only from 0. 19 A to 0. 03 A under the same storage conditions, and the blank value increased due to storage. Was suppressed.
  • Example 2 the response value to a cholesterol concentration of 105 mg / d 1 was changed from 2.12 ⁇ to 2.64 A by storing at 30 ° C for 4 weeks. To, increased by 0.52 A.
  • Example 1 the response value to the cholesterol concentration of 105 mgZd1 was the same. Under the same storage conditions, the increase in the response value was only 0.55 A from 1.53 A to 1.58 A, and the increase in response value due to storage was suppressed.
  • the ink for printing the enzyme layer 10a includes cholesterol oxidase, cholesterol esterase, and
  • the obtained enzyme layer 10a contains 1.0 U of cholesterol oxidase, 2.25 U of cholesterol esterase, and 8.0 g of Triton-XI00.
  • the thickness of the enzyme layer 10a is about 0.7 mm, and the diameter of the central hole is slightly larger than the outer shape of the counter electrode 4 (a circle with a diameter of 3.0 mm).
  • the CMC layer 7 and the electron mediator layer 8 were formed in the same manner as in Example 1, and their outer shapes were almost the same as the outer shape of the counter electrode 4.
  • the cholesterol concentration in the sample solution was measured in the same procedure as in Example 1, and the same results as in Example 1 were obtained.
  • the shapes of the CMC layer 7 and the electron mediator layer 8 are circular, but may be square, rectangular, or elliptical.
  • the shape of the enzyme layer 10 or 10a may be any shape as long as the oxidoreductase does not contact the electron mediator.
  • potassium ferricyanide was used as the electron mediator, any of parabenzoquinone and its derivatives, phenazine methosulfate, methylene blue, ferrocene and its derivatives may be used.
  • a reagent system containing cholesterol esterase, cholesterol oxidase and surfactant As described above, in a system for measuring the amount of glucose, glucose oxidase or glucose dehydrogenase may be used as the oxidoreductase.
  • the layer containing the electronic media was formed by dropping the aqueous solution of the electronic media at the position where the layer was formed and then drying by heating. After dripping at the position, it may be formed by freeze-drying. Screen printing of an aqueous solution containing electronic media or impregnating the carrier installed in the sample solution supply path with an aqueous solution containing electronic media, and then heating at 30 to 70 ° C
  • the layer containing the electron mediator may be formed by a method of drying or freeze-drying.
  • the layer containing the oxidoreductase was formed by dropping the aqueous solution to a predetermined position and then freeze-drying or screen-printing the aqueous solution containing the oxidoreductase, but may be formed by other methods. Can also. For example, an aqueous solution containing an oxidoreductase is dropped into a predetermined position and then heated and dried at 30 to 70 ° C, or an aqueous solution containing an oxidoreductase is placed on a support provided in a sample liquid supply path. Is dropped and impregnated, and then heat-dried or freeze-dried at 30 to 70 ° C. Industrial applicability
  • the present invention it is possible to provide a biosensor having a simple configuration in which the blank value is low and the response value due to storage, particularly the blank value, is small. Further, by making the shape such that the oxidoreductase does not come into contact with the electron mediator, the thickness of the sample liquid supply path can be reduced, and the required amount of sample such as blood can be reduced. Furthermore, it is possible to carry the oxidoreductase and the electron mediator closer to each other. Since the oxidoreductase and the electronic media are mixed immediately after the sample is supplied, the reaction time can be reduced.

Description

バイオセンサ
技 fe分野
本発明は、 血液、 血漿、 血清等の試料中の基質を定量するためのバイ ォセンサに関する。
明 田
背景技術
従来、 血液等の試料中の特定成分を定量するバイオセンサとして、 様 々なものが提案されており、 一例として、 次のようなセンサが知られて いる （特開昭 6 3— 3 1 7 0 9 6号公報参照） 。
このバイオセンサは、 絶縁性基板上にスクリーン印刷などの方法で作 用極、 対極及び参照極からなる電極系を形成し、 この電極系上に接して 酸化還元酵素と電子メディエー夕とを含む反応層を形成したものである, このようにして作製したバイオセンサの反応層上に、 基質を含む試料 を滴下すると、 反応層が溶解して酸化還元酵素と基質が反応し、 これに ともなって電子メデイエ一夕が還元される。 一定時間後に、 還元された 電子メディエー夕を電極系によって電気化学的に酸化し、 このとき得ら れる酸化電流値から試料液中の基質を定量する。
上記のような構成のバイオセンサでは、 通常、 酸化還元酵素及び電子 メデイエ一夕は、 互いに混合された状態で、 電極系上に担持される。 そ の目的は、 試料を混合または攪拌する手間を省き、 さらに酸化還元酵素 と電子メデイエ一夕の反応を効率よく行わせ、 短時間で基質を定量する ためである。
しかし、 バイオセンサ内に、 酸化還元酵素と電子メデイエ一夕とを混 合した状態や互いに接触した状態で担持したとき、 基質の濃度が O m g Z d 1 の試料液に対する応答値 （以下、 ブランク値と呼ぶ） が 0ではな く、 0以上の高い値を示すという問題があった。 さらに、 バイオセンサ 作製直後 （以下、 初期と呼ぶ） の応答値と比較して、 ブランク値及び同 じ濃度の基質を含む試料液に対するそれぞれの応答値が、 保存期間が長 くなるにしたがって増加するという問題があつた。 保存により応答値が 変化するということは、 信頼性が低いという点で問題である。
本発明は、 上記の問題点に鑑み、 ブランク値が低く、 保存による応答 値、 特にブランク値の変化が少ない、 簡易な構成のバイオセンサを提供 することを目的とする。
本発明は、 また特にコレステロールの定量に適したバイォセンサを提 供することを目的とする。 発明の開示
本発明は、 絶縁性基板、 前記基板上に設けられた測定極と対極を含む 電極系、 前記基板上に結合されて基板との間に前記電極系に試料液を供 給する試料液供給路を形成するカバー部材、 前記試料液供給路内に配置 された少なくとも酸佗還元酵素および電子メディエー夕を含む試薬系を 具備し、 前記電子メディエー夕が前記基板側に、 前記酸化還元酵素が前 記カバ一部材側にそれぞれ互いに接触せずに設けられているバイオセン サを提供する。
前記酸化還元酵素の存在する位置は、 これを前記基板上に投影したと き前記電子メディエー夕の存在する位置と重ならないようにされている のが好ましい。
本発明は、 また上記のバイオセンサ、 前記測定極と対極との間に電圧 を印加する電圧印加手段、 および前記電圧の印加された測定極と対極と の間の電気信号を検出する信号検出手段を有する測定システムを提供す る。
測定システムは、 前記信号検出手段の検出した信号を表示する表示手 段をさらに有することが好ましい。 図面の簡単な説明
図 1は本発明の一実施例におけるバイオセンサの分解斜視図である。 図 2は同バイオセンサの断面図である。
図 3は本発明の他の実施例におけるパイォセンサの分解斜視図である ( 図 4は同バイオセンサの断面図である。
図 5は本発明の一実施例における測定システムの回路構成を示すプロ ック図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 絶縁性基板、 前記基板上に設けられた測定極と対極を含む 電極系、 前記基板上に結合されて基板との間に前記電極系に試料液を供 給する試料液供給路を形成するカバー部材、 前記試料液供給路内に配置 された少なく とも酸化還元酵素および電子メディェ一タを含む試薬系を 具備し、 前記電子メディエー夕が前記基板側に、 前記酸化還元酵素が前 記カバ一部材側にそれぞれ互いに接触せずに設けられているバイォセン サに関する。
本発明によれば、 簡易な構成により電子メディェ一夕と酸化還元酵素 とが互いに接触することがなくなる。 このため、 バイオセンサを作製し た後、 バイォセンサ内において酸化還元酵素と電子メディエー夕とが反 応することがなく、 従ってブランク値を低く抑えることができるととも に、 保存による応答値変化を抑制することができる。 本発明の好ましい態様において、 前記酸化還元酵素の存在する位置は、 これを前記基板上に投影したとき前記電子メディエー夕の存在する位置 と重ならないようにされている。
このようにすると、 酸化還元酵素と電子メディエー夕とを分離した状 態を維持しながら、 試料液供給路の体積を低減することができる。
本発明の他の好ましい態様においては、 前記試薬系が、 さらに前記力 バ一部材側に設けられた界面活性剤を含んでいる。 この場合、 界面活性 剤が、 前記酸化還元酵素と混合されていることが好ましい。
本発明の好ましいバイオセンサは、 診断指針としての血清コレステロ 一ル値を定量するもので、 試薬系は、 コレステロールォキシダーゼおよ びコレステロールデヒドロゲナーゼの少なくとも一方、 コレステロール エステルをコレステロールに変化させる過程を触媒するする酵素コレス テロールエステラーゼ、 および界面活性剤を含む。
血液または血清中のコレステロールは、 ミセル構造をとっているリポ 蛋白中に含まれる。 試薬系が適切な界面活性剤を含んでいると、 コレス テロールォキシダーゼおよびコレステロ一ルデヒドロゲナーゼの少なく とも一方、 またはコレステロールエステラーゼによる、 リポ蛋白中のコ レステロ一ルへの反応性が向上する。
上のような目的に用いる界面活性剤としては、 ィオン性界面活性剤及 び非イオン性界面活性剤のいずれでもよい。 例えば、 ポリオキシェチレ ンォクチルフエ二ルエーテル、 コール酸またはその塩、 デォキシコール 酸またはその塩、 脂肪酸塩、 アルキル硫酸エステル塩、 ポリオキシェチ レンアルキルェ一テル硫酸エステル塩、 アルキルベンゼンスルフォン酸 塩、 アルキルナフ夕レンスルフォン酸塩、 アルキルスルホコハク酸塩、 アルキルジフエ二ルエーテルジスルフォン酸塩、 アルキルリン酸塩、 ナ フタレンスルフォン酸ホルマリン縮合物、 ポリカルボン酸型高分子界面 活性剤、 ポリオキシエチレンアルキルエーテル、 ポリオキシアルキレン アルキルエーテル、 ポリオキシエチレン誘導体、 ソルビタン脂肪酸エス テル、 ポリオキシエチレンソルビ夕ン脂肪酸エステル、 ポリオキシェチ レンソルビトール脂肪酸エステル、 グリセリン脂肪酸エステル、 ポリオ キシエチレン脂肪酸エステル、 ポリオキシエチレンアルキルァミン、 ァ ルキルアルカノールアミ ド、 アルキルアミン塩、 第四級アンモニゥム塩、 アルキルべ夕イン、 及びアミンオキサイ ド等が挙げられる。 これらの中 では、 ポリォキシエチレンォクチルフエ二ルエーテルが特に好ましい。 界面活性剤によりリポ蛋白を加溶化する作用は、 界面活性剤の種類に よってそれぞれ異なるので、 上記界面活性剤のいずれかを 2種類以上同 時に使用してもよい。
本発明の他の好ましい態様においては、 電子メディエー夕及び酸化還 元酵素のうち、 少なくとも一方は、 その水溶液の凍結乾燥によって形成 されている。
凍結乾燥によって形成された電子メディエー夕および Zまたは酸化還 元酵素の層は、 溶解性が向上するので、 測定全体にかかる時間を短縮す ることができる。 特に、 酸化還元酵素による反応が応答値を得る第一ス テツプであるので、 酸化還元酵素層を凍結乾燥によって形成すると、 試 料液を供給したとき酸化還元酵素を速やかに溶解させることができるの で好ましい。
本発明のさらに好ましい他の態様においては、 電子メディエータ及び 酸化還元酵素のうち少なくとも一方は、 担体に担持されている。
ここに用いる担体としては、 担体内部または担体表面に試薬を担持で きるものであればよく、 例えば、 濾紙、 ガラスフィルター、 セルロース 繊維、 紙、 及びコルク等が挙げられる。 ここで、 濾紙を用いた場合、 試 薬は主に濾紙内部に担持され、 紙を用いた場合、 試薬は紙の表面に担持 されるという相違点がある。 これらの担体の中では、 ガラスフィルター またはセルロース繊維が、 担体に対する酸化還元酵素の非特異的な吸着 量が少ないため好ましい。
本発明のバイォセンサにおいて用いることができる電子メディエー夕 としては、 特に限定されないが、 例えば、 フェリシアン化カリウム、 パ ラベンゾキノン及びパラべンゾキノンの誘導体、 フエナジンメトサルフ ェ一ト、 メチレンブル一、 並びにフエ口セン及びフエ口センの誘導体等 が挙げられる。 これらの中では、 フェリシアン化カリウムが酸素存在下 でも安定であるので好ましい。
酸化還元酵素としては、 例えば、 グルコースォキシダーゼ、 ダルコ一 スデヒドロゲナ一ゼ、 コレステロールォキシダ一ゼ、 及びコレステロ一 ルデヒドロゲナ一ゼなど、 測定対象の基質に応じて適宜選ばれる。
絶縁性基板及びカバ一部材としては、 電気絶縁性を有し、 ある程度の 剛性を有していればよい。 例えば、 ポリエチレン、 ポリエチレンテレフ 夕レート、 ポリスチレン、 ポリ塩化ビニル、 ポリアミ ド、 飽和ポリエス テル等の熱可塑性樹脂、 尿素樹脂、 メラミン樹脂、 フエノール樹脂、 ェ ポキシ樹脂、 不飽和ポリエステル樹脂等の熱硬化性樹脂が挙げられる。 本発明の好ましいバイォセンサは、 基板上に設けられた電極系の上に 電子メディエー夕層が形成される。 電子メディエー夕と電極系との直接 的な接触を防ぐとともに電子メディェ一タ層の担持をより確実にするた めに、 電極系上に親水性高分子層を形成し、 その上に電子メデイエ一夕 層を形成するのがよい。
また、 電極系が、 銀ペーストによる下地とその上に形成したカーボン ペース卜から構成されている場合、 試料に溶解した試薬系の界面活性剤 の作用により、 試料の溶液が電極下地の銀層に浸透する。 このため、 セ ンサの応答電流測定時に電極に電位を印加すると、 銀層が電気化学的反 応に関与し、 その結果、 応答電流値が増加することがある。 電極系を親 水性高分子層で被覆していると、 界面活性剤の銀層への浸透を緩和する ことができる。
そのような親水性高分子層を構成する親水性高分子としては、 その水 溶液が粘性を有するものであればよく、 例えば、 カルボキシメチルセル ロース、 ヒドロキシェチルセルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 メチルセルロース、 ェチルセルロース、 ェチルヒドロキシェチルセル口 ース、 及びカルポキシェチルセルロース等のセルロース類、 ポリビニル ピロリ ドン、 ポリビエルアルコール、 並びにポリリジン等のポリアミノ 酸、 ポリスチレンスルホン酸、 ゼラチン及びその誘導体、 アクリル酸及 びその塩の重合体、 メタクリル酸及びその塩の重合体、 スターチ及びそ の誘導体、 無水マレイン酸及びその塩の重合体、 ァガロースゲル及びそ の誘導体等が挙げられる。
測定極及び対極の材料としては、 導電性を有するものであればよく、 例えば、 炭素、 金、 パラジウム、 及び白金等が挙げられる。
絶縁性基板上に設けられる測定極と対極を含む電極系は、 さらに参照 極を含んでいてもよい。
本発明のバイオセンサが測定する試料としては、 体液が挙げられる。 体液としては、 血液、 血漿、 リンパ液、 細胞間質液、 汗のいずれかが挙 げられる。 それぞれの体液に含まれるコレステロール、 グルコースなど が測定対象となる。
以下、 本発明のバイオセンサの構造を図面を参照して説明する。 ここ に用いられた構造図は理解を容易にするためのものであって、 各要素の 相対的大きさや位置関係は必ずしも正確ではない。 実施の形態 1 図 1は本実施の形態におけるパイォセンサの分解斜視図であり、 図 2 は同バイオセンサの縦断面図である。
絶縁性基板 2上に、 スクリーン印刷により銀ペーストを印刷し、 加熱 乾燥することにより、 測定極リード 1 3及び対極リード 1 4並びに後述 する電極系の下地が形成されている。 次に、 スクリーン印刷により導電 性カーボンペーストを印刷し、 加熱乾燥することにより、 測定極 3及び 対極 4からなる電極系が形成されている。 さらに、 電極系を部分的に覆 う絶縁性ペーストをスクリーン印刷により印刷し、 加熱乾燥して絶縁層 6が形成されている。 測定極 3及び対極 4からなる電極系を覆うように 親水性高分子の一種であるカルボキシメチルセルロース （以下 C M Cで 表す） の水溶液を滴下し、 加熱乾燥することにより C M C層 7が形成さ れている。 次に、 C M C層 7を覆うように、 電子メデイエ一夕の一種で あるフェリシアン化力リゥムの水溶液を滴下し、 加熱乾燥することによ り電子メデイエ一夕層 8が形成されている。 図では、 C M C層 7と電子 メディエー夕層 8が相互に独立した形で表されているが、 実際には部分 的に混じり合つている。
次に、 上カバー 1 6及び中カバー 1 5を接合してカバ一部材を組み立 てる。 中カバー 1 5は、 2つの柱状の部片 1 5 aとその両者をそれらの 後部で連結する背の低い部片 1 5 bからなる。 カバー部材には、 上カバ - 1 6の下面に部片 1 5 aおよび 1 5 bによって囲まれた凹部が形成さ れる。 カバー部材を逆さにし、 前記の凹部に、 コレステロールエステラ —ゼ、 酸化還元酵素であるコレステロールォキシダ一ゼおよび/または コレステロールデヒドロゲナ一ゼ、 及び界面活性剤を含む混合水溶液を 滴下し、 これを凍結乾燥することによって酵素層 1 0が形成されている, ここで酵素層 1 0は、 上カバ一 1 6、 中カバー 1 5及び絶縁性基板 2の 3つを張り合わせたときにできる試料液供給路 1 7内に収まるように形 成される。 最後に、 絶縁性基板 2、 カバ一部材を図 1中の一点鎖線で示 すような位置関係で張り合わせることにより、 バイォセンサ 1が作製さ れる。
バイオセンサ 1において、 絶縁性基板 2、 中カバー 1 5、 及び上カバ — 1 6により、 絶縁性基板 2と上カバ一 1 6との間に、 電極系に試料液 を供給する試料液供給路 1 7が形成されている。 バイオセンサ 1に対し て、 血液等の試料は試料供給口 1 1から供給される。 空気孔 1 2は、 試 料を供給したときの空気の逃げ道となり、 試料供給を円滑にする機能を 担う。
上記のような構成のセンサにおいて、 試料液供給路 1 7のサイズは、 幅 0. 4〜 4mm、 高さ 0. 0 5〜 0. 5 mm、 長さ 2〜： L Ommとす るのが好ましい。 そのようなセンサでは、 試料量を 0. 04〜 2 0 1 とすることができる。 さらに好ましい試料液供給路 1 7のサイズは、 幅 0. 5〜 2 mm、 高さ 0. 0 5〜 0. 2mm、 長さ 3〜 5mmであり、 試料量は 0. 0 7 5〜 2. O I となる。 実施の形態 2
図 3は、 本実施の形態におけるバイオセンサの分解斜視図であり、 図 4は同バイォセンサの縦断面図である。
本実施の形態のバイオセンサの実施の形態 1のそれとの相違点は、 酵 素層の形成方法とその形成位置である。 本実施の形態における酵素層 1 0 aは、 酸化還元酵素、 コレステロールエステラーゼ、 及び界面活性 剤を含む混合水溶液を上カバ一 1 6の下面にスクリーン印刷し、 乾燥す ることにより形成される。 酵素層 1 0 aの位置は、 これを基板 2上に投 影したとき、 電子メディエータ層 8と重ならず、 層 8を囲むように設定 される。 本実施の形態のバイオセンサでは、 カバー部材の酵素層 1 0 aは、 こ れを基板 2上に投影したとき、 電子メデイエ一夕層 8と重ならず、 層 8 を囲むようにしたので、 酸化還元酵素と電子メディェ一夕とを分離した 状態を維持しつつ、 試料液供給路の厚みを小さくし、 試料液供給路の体 積を低減することができる。 そのため、 測定に必要な試料量を低減する ことができる。
また、 酸化還元酵素と電子メディエー夕とを互いにより近い距離に担 持することができるので、 試料供給後、 速やかに酸化還元酵素と電子メ ディエータとが混合し、 反応時間を短縮することが可能である。 実施の形態 3
図 5は、 上記に示したバイオセンサを用いた測定システムの構成例を 示すブロック図である。 電圧印加手段 2 1は、 センサ 1のリード 1 3お よび 1 4から測定極 3と対極 4との間に電圧を印加する。 電圧印加手段 2 1 とリード 1 4との間に挿入された電流検出手段 2 2は、 測定極 3と 対極 4との間に流れる電流を検出する。 電流検出手段 2 2に接続された 表示手段 2 3は、 電流検出手段 2 2が検出した電流値またはその電流を 電圧に変換した値を表示する。 以下、 本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。 バイオセンサの 一例として、 コレステロールセンサについて説明するが、 本発明は以下 の実施例に限定されるものではない。 実施例 1
実施の形態 1において、 電極系を覆うように C M Cの 0 . 5 w t %水 溶液を 4 1滴下し、 5 0 °Cで 1 5分間乾燥することにより C M C層 7 を形成した。 この CMC層 7を覆うように、 フェリシアン化カリウムの 7 5 mM水溶液を 4 β 1滴下し、 5 0 °Cで 1 5分間乾燥することにより 電子メデイエ一タ層 8を形成した。 一方、 コレステロールォキシダ一ゼ を 4 0 0ユニッ ト （U) /m l、 コレステロールエステラーゼを 9 0 0 U/m 1、 及び界面活性剤としてのポリオキシエチレンォクチルフエ二 ルエーテルの一種である T r i t o n— X 1 0 0を 1. 6w t %含む混 合水溶液をカバ一部材の所定の位置に 0. 5 2 1滴下し、 これを凍結乾 燥することによって酵素層 1 0を形成した。 試料液供給路 1 7のサイズ は、 幅 2. 0mm、 高さ 0. 1 mm、 長さ約 5. 0 mmであり、 測定極 3の面積は約 1. 0 mm2である。 比較例 1
コレステロールエステラーゼとコレステロールォキシダーゼとを、 電 子メディエー夕層に混合した点以外は実施例 1 と同様にして、 比較例 1 のバイオセンサを作製した。
次に、 実施例 1及び比較例 1のバイオセンサを用いて、 コレステロ一 ルを含まない （コレステロール濃度 OmgZd 1 ) P B S (リン酸緩衝 化生理食塩水） 緩衝溶液、 及びコレステロール濃度が 1 0 5 mg/d 1 のヒト血清について、 コレステロール濃度の測定を行った。 試料液を試 料供給口 1 1に接触させることにより試料液供給路 1 7に供給し、 3分 経過後に対極 4を基準にして測定極 3に 5 0 OmVの電圧を印加し、 5 秒経過後に測定極 3と対極 4の間を流れる電流値 （応答値） を測定した, コレステロール濃度 Omg/d 1の P B S緩衝溶液に対する応答値の 変化を表 1に、 コレステロール濃度 l O SmgZd lのヒト血清に対す る応答値の変化を表 2にそれぞれ示す。 それぞれの試料液について、 バ ィォセンサの初期における応答値と、 同バイオセンサを 3 0 °Cで 4週間 保存した後における応答値との比較を行った
Figure imgf000014_0001
表 1からわかるように、 実施例 1のバイオセンサでは、 初期において, コレステロール濃度 0 mg/d 1に対する応答値は 0. 1 9 Aであり, 比較例のバイオセンサと比較して 0. 3 7 ^ A低い値が得られた。 よつ て、 実施例 1のバイオセンサにより、 コレステロール濃度 0 m g Z d 1 に対する応答値、 すなわちブランク値を低減する効果が得られた。
また、 表 1からわかるように、 比較例では、 コレステロール濃度 0 m g / d 1 に対する応答値は、 3 0 °Cに 4週間保存することで、 0. 5 6 / Aから 0. 8 9 Aへ、 0. 3 3 A増加した。 一方、 実施 例 1では、 コレステロール濃度 OmgZd 1 に対する応答値は、 同じ保 存条件において、 0. 1 9 Aから 0. への 0. 0 3 Aの増 加にとどまり、 保存によるブランク値の上昇が抑制された。
さらに、 表 2からわかるように、 比較例では、 コレステロール濃度 1 0 5 m g/d 1 に対する応答値は、 3 0 °Cに 4週間保存することで、 2. 1 2 Αから 2. 6 4 Aへ、 0. 5 2 A増加した。 一方、 実施 例 1では、 コレステロール濃度 1 0 5 m gZ d 1 に対する応答値は、 同 じ保存条件において、 1 . 5 3 Aから 1 . 5 8 への 0. 0 5 A の増加にとどまり、 保存による応答値上昇が抑制された。 実施例 2
実施の形態 2において、 酵素層 1 0 aを印刷するためのインクに、 コ レステロールォキシダ一ゼ、 コレステロールエステラーゼ、 及び
T r i t o n— X 1 0 0を含む混合水溶液を用いた。 得られた酵素層 1 0 aは、 コレステロールォキシダーゼを 1. 0 U、 コレステロールェ ステラ一ゼを 2. 2 5 U、 T r i t o n— X I 0 0を 8. O g含んで いる。 酵素層 1 0 aは、 その厚みは約 0. 7mmで、 中央の孔の径は、 対極 4の外形 （直径 3. 0 mmの円形） より若干大きい。 一方、 CMC 層 7および電子メディェ一タ層 8は、 実施例 1 と同様にして形成したも ので、 それらの外形は、 対極 4の外形とほぼ同じである。
このバイオセンサを用いて、 実施例 1 と同様の手順により試料液中の コレステロール濃度の測定を行ったところ、 実施例 1 と同様の結果が得 られた。 実施例 1及び 2において、 CMC層 7及び電子メディエー夕層 8の形 状は円形としたが、 四角形、 長方形、 または楕円形であってもよい。 い ずれの場合においても、 酵素層 1 0または 1 0 aの形状は、 酸化還元酵 素と電子メディェ一夕とが接触しなければ、 いずれの形状でもよい。 また、 電子メディェ一タとしてフェリシアン化カリウムを用いたが、 パラべンゾキノン及びその誘導体、 フエナジンメトサルフェート、 メチ レンブルー、 フエロセン及びその誘導体のいずれかを用いてもよい。 血液等の総コレステロール値を測定するため、 コレステロールエステ ラ一ゼ、 コレステロールォキシダ一ゼおよび界面活性剤を含む試薬系に ついて述べたが、 グルコース量を測定する系においては、 酸化還元酵素 としてグルコースォキシダ一ゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼ等を 用いればよい。
上記実施例においては、 電子メデイエ一夕を含む層は、 その層を形成 する位置に電子メディエー夕の水溶液を滴下した後、 加熱乾燥すること により形成したが、 電子メディエー夕を含む水溶液を所定の位置に滴下 した後、 凍結乾燥により形成してもよい。 また、 電子メデイエ一夕を含 む水溶液をスクリーン印刷する方法、 または試料液供給路内に設置した 担体に、 電子メデイエ一夕を含む水溶液を含浸させた後、 3 0〜 7 0 °C において加熱乾燥もしくは凍結乾燥する方法により電子メディェ一タを 含む層を形成してもよい。
酸化還元酵素を含む層は、 その水溶液を所定の位置に滴下した後、 凍 結乾燥する方法、 または酸化還元酵素を含む水溶液をスクリーン印刷す る方法により形成したが、 他の方法によって形成することもできる。 例 えば、 酸化還元酵素を含む水溶液を所定の位置に滴下した後、 3 0〜 7 0 °Cにおいて加熱乾燥する方法、 または試料液供給路内に設置した担 体に、 酸化還元酵素を含む水溶液を滴下し、 含浸させた後、 3 0〜 7 0 °Cにおいて加熱乾燥もしくは凍結乾燥する方法である。 産業上の利用の可能性
以上のように、 本発明によれば、 ブランク値が低く、 保存による応答 値、 特にブランク値の変化が少ない、 簡易な構成のバイオセンサを提供 することができる。 さらに、 酸化還元酵素と電子メディエー夕とが接触 しないような形状にすることで、 試料液供給路の厚みを小さくすること ができ、 血液等の必要な試料量を低減することができる。 さらに、 酸化 還元酵素と電子メディエー夕とを互いにより近い距離に担持することが できるので、 試料供給後、 速やかに酸化還元酵素と電子メデイエ一夕が 混合するため、 反応時間の短縮が可能である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 絶縁性基板、 前記基板上に設けられた測定極と対極を含む電極系、 前記基板上に結合されて基板との間に前記電極系に試料液を供給する試 料液供給路を形成するカバー部材、 前記試料液供給路内に配置された少 なくとも酸化還元酵素および電子メデイエ一夕を含む試薬系を具備し、 前記電子メディエー夕が前記基板側に、 前記酸化還元酵素が前記カバー 部材側にそれぞれ互いに接触せずに設けられていることを特徴とするバ ィォセンサ。
2 . 前記酸化還元酵素の存在する位置が、 これを前記基板上に投影した とき前記電子メディエー夕の存在する位置と重ならないようにされた請 求の範囲第 1項記載のバイォセンサ。
3 . 前記試薬系が、 さらに前記カバー部材側に設けられた界面活性剤を 含む請求の範囲第 1または 2項記載のバイォセンサ。
4 . 界面活性剤が、 前記酸化還元酵素と混合されている請求の範囲第 3 項記載のバイオセンサ。
5 . 電子メディェ一夕及び酸化還元酵素の少なくとも一方がその水溶液 の凍結乾燥によって形成されている請求の範囲第 1項記載のバイォセン サ。
6 . 電子メデイエ一夕及び酸化還元酵素の少なくとも一方が担体に担持 されている請求の範囲第 1項記載のバイオセンサ。
7 . 担体が、 濾紙、 ガラスフィルター、 セルロース繊維、 紙、 及びコル クからなる群から選択される請求の範囲第 6項記載のバイオセンサ。 8 . 前記試薬系が、 コレステロールォキシダ一ゼおよびコレステロール デヒドロゲナーゼの少なくとも一種、 コレステロールエステラーゼ、 界 面活性剤、 および電子メデイエ一夕を含み、 電子メデイエ一夕が前記基 板側に、 他の試薬がカバー部材側に設けられた請求の範囲第 1項または 第 2項記載のバイオセンサ。
9 . 前記電子メディエー夕が親水性高分子層を介して前記電極系上に設 けられた請求の範囲第 8項記載のバイオセンサ。
1 0 . 電子メディェ一夕が、 フェリシアン化力リウム、 パラべンゾキノ ン及びパラべンゾキノンの誘導体、 フエナジンメ トサルフェート、 メチ レンブルー、 並びにフエ口セン及びフエ口センの誘導体からなる群から 選択される請求の範囲第 8項記載のバイォセンサ。
1 1 . 測定対象が体液である請求の範囲第 1項記載のバイオセンサ。
1 2 . 前記体液が血液、 血漿、 リンパ液、 または細胞間質液である請求 の範囲第 1 1項記載のバイオセンサ。
1 3 . 請求の範囲第 1項記載のバイオセンサ、 前記測定極と対極との間 に電圧を印加する電圧印加手段、 および前記電圧の印加された測定極と 対極と間の電気信号を検出する信号検出手段を有する測定システム。
1 . 前記信号検出手段の検出した信号を表示する表示手段をさらに有 する請求の範囲第 1 3項記載の測定シ
補正書の請求の範囲
[2002年 5月 16日 （16. 05. 02) 国際事務局受理：出願当初の請求の範囲 1,2,4-6,8及び 13は補正された；他の請求の範囲は変更なし。 （2頁） ]
1 . (補正後） 絶縁性基板、 前記基板上に設けられた測定極と対極を含 む電極系、 前記基板上に結合されて基板との間に前記電極系に試料液を 供給する試料液供給路を形成するカバ一部材、 前記試料液供給路内に配 置された少なくともコレステロールォキシダ一ゼ、 コレステロールエス テラーゼ、 および電子メディエータを含む試薬系を具備し、 前記電子メ ディエー夕が前記基板側に、 前記コレステロールォキシダーゼが前記力 バ一部材側にそれぞれ互いに接触せずに設けられていることを特徴とす るバイォセンサ。
2 . (補正後） 前記コレステロールォキシダ一ゼの存在する位置が、 こ れを前記基板上に投影したとき前記電子メディエー夕の存在する位置と 重ならないようにされた請求の範囲第 1項記載のバイオセンサ。
3 . 前記試薬系が、 さらに前記カバ一部材側に設けられた界面活性剤を 含む請求の範囲第 1または 2項記載のバイオセンサ。
4 . (補正後） 界面活性剤が、 前記コレステロールォキシダーゼと混合 されている請求の範囲第 3項記載のバイォセンサ。
5 . (補正後） 電子メデイエ一夕及びコレステロールォキシダーゼの少 なくとも一方がその水溶液の凍結乾燥によって形成されている請求の範 囲第 1項記載のバイオセンサ。
6 . (補正後） 電子メデイエ一夕及びコレステロールォキシダーゼの少 なくとも一方が担体に担持されている請求の範囲第 1項記載のバイオセ ンサ。
7 . 担体が、 濾紙、 ガラスフィルター、 セルロース繊維、 紙、 及びコル クからなる群から選択される請求の範囲第 6項記載のバイオセンサ。
8 . (補正後） 前記コレステロールエステラーゼが前記カバ一部材側に 捕正された用^ (条約第 条） 設けられた請求の範囲第 1項記載のバイオセンサ。
9 . 前記電子メディエー夕が親水性高分子層を介して前記電極系上に設 けられた請求の範囲第 8項記載のバイォセンサ。
1 0 . 電子メデイエ一夕が、 フェリシアン化カリウム、 パラべンゾキノ ン及びパラべンゾキノンの誘導体、 フエナジンメ トサルフェート、 メチ レンブル一、 並びにフエ口セン及びフエ口センの誘導体からなる群から 選択される請求の範囲第 8項記載のバイオセンサ。
1 1 . 測定対象が体液である請求の範囲第 1項記載のバイオセンサ。
1 2 . 前記体液が血液、 血漿、 リンパ液、 または細胞間質液である請求 の範囲第 1 1項記載のバイオセンサ。
1 3 . (補正後） 請求の範囲第 1項記載のバイオセンサ、 前記測定極と 対極との間に電圧を印加する電圧印加手段、 および前記電圧の印加され た測定極と対極との間の電気信号を検出する信号検出手段を有する測定
1 4 . 前記信号検出手段の検出した信号を表示する表示手段をさらに有 する請求の範囲第 1 3項記載の測定
正された用紙（条約第 19条) P C T 1 9条 （ 1 ) の規定に基づく説明書 請求の範囲第 1項を補正し、 試薬系が少なくともコレステロールォキ シダーゼ、 コレステロールエステラーゼ、 および電子メデイエ一夕を含 むこと、 および、 電子メデイエ一夕が基板側に、 コレステロールォキシ ダーゼがカバー部材側にそれぞれ互いに接触せずに設けられていること を明確にした。
上記の補正に伴い請求の範囲第 2、 4、 5、 6および 8項を補正し、 さらに請求の範囲第 1 3項の不明確な記載を補正した。
Figure imgf000023_0001
f/l
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