JP2001343348A

JP2001343348A - コレステロール測定用センサ

Info

Publication number: JP2001343348A
Application number: JP2000162370A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Kamimura; 武司上村; Yoshisuke Sakai; 義介酒井; Hiroki Yamazaki; 浩樹山崎; Masuo Aizawa; 益男相澤
Original assignee: Techno Medica Co Ltd
Current assignee: Techno Medica Co Ltd
Priority date: 2000-05-31
Filing date: 2000-05-31
Publication date: 2001-12-14
Anticipated expiration: 2020-05-31
Also published as: JP4653870B2

Abstract

(57)【要約】【課題】従来の問題点を解決し、測定精度を落とすこ
となく、安価に簡単に製造することができ、かつ、品質
のバラツキが極めて少ないコレステロール測定用センサ
を提供すること。【解決手段】本発明に係るコレステロール測定用セン
サは、絶縁性基板上に少なくとも測定極と対極とを有す
る電極系を形成し、酵素、電子受容体及び試料液の反応
時の物質濃度変化を電気化学的に前記電極系で検知し前
記試料液の基質濃度を測定するセンサにおいて、前記測
定極上に、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエ
ステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び界面活性
剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置し
て第１層を形成し、前記対極上に、界面活性剤を保持
し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置して第２層
を形成したことを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、全血、血漿、血
清、又は標準液等の試料液中のコレステロール成分を測
定するためのセンサに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、基板上に測定極と対極とから
なる電極系を形成し、この電極系の上に、酵素と電子受
容体とを担持した多孔体から成る酵素反応層を設け、そ
れらを適当なカバーで一体化したバイオセンサが提案さ
れている。このバイオセンサは、血液等の試料液を酵素
反応層に滴下して酵素と電子受容体とを試料液中に溶解
させ、酵素及び電子受容体と試料液中の特定の基質との
間で酵素反応を進行させて電子受容体を還元した後、還
元された電子受容体を電気化学的に酸化させて、このと
きに得られる酸化電流値から試料液中の特定の基質の濃
度を求める。しかし、上記した構成では、電極系を含む
基板面の濡れが必ずしも一様とならないため、多孔体と
基板との間に気泡が残り、応答電流に影響を与えたり反
応速度が低下するという問題があった。上記した従来の
問題点を解決する方法として、測定極と対極とからなる
電極系の上に、親水性高分子と酵素とから成る酵素反応
層を設けることが登録第２５０２６６５号にて提案され
ている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記し
たように親水性高分子を用いて酵素反応層と電極との間
の気泡の残存を防ぐ方法は、親水性高分子を含む層と電
極系とを隙間なく一体化する必要があるため、始めに、
親水性高分子を溶液にして電極上に塗布した後に乾燥さ
せて親水性高分子層を形成した後に、親水性高分子層の
上に酵素を含む酵素層を形成しなければならないという
製造上の制限があるという問題があった。このような製
造方法は、親水性高分子層を形成した後でなければ、酵
素層の形成を開始することができないので製造に時間が
かかるという問題がある。また、塗布・乾燥工程を用い
た製造方法は、塗布時に塗布すべき溶液の量にバラツキ
が出やすいため、複数のセンサを製造する場合、各セン
サで親水性高分子や酵素の濃度にバラツキが生じる可能
性が高いという問題もある。また、上記した従来のバイ
オセンサは、本来、対極上には酵素反応層を設ける必要
がないにも拘わらず、測定極と対極との両方に跨って酵
素反応層を設けているため、製造コストが高くなるとい
う問題もある。酵素には、高価なものも、安価なものも
あるため、上記した問題の大きさは、測定すべき基質の
種類、即ち、酵素の種類に依存する問題ではあるが、コ
レステロールを測定する場合には、コレステロールの測
定に有効な酵素であるリポプロテインリパーゼ、コレス
テロールエステラーゼ、及びコレステロールオキシダー
ゼが高価であり、特に、コレステロールオキシダーゼと
電子受容体との反応速度が非常に遅いので、コレステロ
ールを測定するためには、大量のコレステロールオキシ
ダーゼを必要とするため大きな問題となる。この製造コ
スト上の問題を解決するためには、測定極上のみに酵素
反応層を設ける必要があるが、従来のバイオセンサは、
上記したように、始めに、親水性高分子を溶液にして塗
布し乾燥させなければならないという製造上の制限があ
り、そのため、測定極上のみに酵素反応層を設けようと
すると、始めに、親水性高分子を測定極と対極との両方
に別々に塗布・乾燥させて各々に親水性高分子層を形成
しなければならないので、塗布・乾燥工程が増えてしま
い、結局、製造コストが高くなってしまうという問題が
ある。親水性高分子層は測定極上及び対極上の両方に設
けることが望ましいので、塗布・乾燥工程を増やさない
ために、親水性高分子層だけは電極全面に形成し、酵素
を含む酵素層だけを測定極上のみに設けるという考え方
もあるが、親水性高分子層を塗布・乾燥した後に、測定
極上のみに酵素が溶解した試料液を塗布・乾燥させて酵
素層を測定極上に局在するように形成するのは極めて困
難であり、このような製造方法を採るとセンサ一個体ご
とにバラツキが生じることは避けられないので現実的で
はない。さらに、上記した従来のバイオセンサのよう
に、測定極と対極との両方に渡って酵素反応層を設ける
という従来の構造は、上記したコスト面に関する問題の
他にも、対極が試料液中の基質と酵素との反応生成物と
相互作用を起こし易く、測定結果に影響を及ぼす可能性
があるという根本的な問題点もある。本発明は、上記し
た従来の問題点を解決し、測定精度を落とすことなく、
安価に簡単に製造することができ、かつ、品質のバラツ
キが極めて少ないコレステロール測定用センサを提供す
ることを目的としている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記した目的を達成する
ために本発明に係るコレステロール測定用センサは、絶
縁性基板上に少なくとも測定極と対極とを有する電極系
を形成し、酵素、電子受容体及び試料液の反応時の物質
濃度変化を電気化学的に前記電極系で検知し前記試料液
の基質濃度を測定するセンサにおいて、前記測定極上
に、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラ
ーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び界面活性剤を保
持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置して第１
層を形成し、前記対極上に、界面活性剤を保持し、か
つ、試料液が通過可能な保持体を載置して第２層を形成
したことを特徴とするものである。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下、添付図面に示した幾つかの
実施例を参照して本発明に係るコレステロール測定用セ
ンサの実施の形態について説明する。始めに、図１〜図
５を参照して本発明に係るコレステロール測定用センサ
の第１の実施例について説明していく。図１は、本発明
に係るコレステロール測定用センサの一実施例の展開
図、図２は、図１に示したコレステロール測定用センサ
の組立完成品の部分断面図、図３は、図１に示したコレ
ステロール測定用センサの中央断面図を各々示してい
る。図中符号１は、絶縁性基板を示している。この絶縁
性基板１の上には、カーボンペーストをスクリーン印刷
した後、加熱乾燥することにより第１測定極２及び第２
測定極３が形成されており、また、銀／塩化銀ペースト
をスクリーン印刷した後、加熱乾燥することにより対極
４が形成されている。前記測定極２と第２測定極３と
は、対極４を中心として左右対称となる位置に形成され
ている。また、前記測定極２、第２測定極３、及び対極
４は、測定部分２ａ、３ａ、４ａ及び端子部分２ｂ、３
ｂ、４ｂ以外は絶縁層５で覆われる。図中符号６は、絶
縁性材料で形成された保持枠を示している。この保持枠
６は、図２に示すように前記端子部分２ｂ、３ｂ、４ｂ
を残して絶縁性基板１の上面を覆える寸法に形成されて
おり、また、前記測定部分２ａ、３ａ、４ａと対応する
位置には、後述する酵素反応層７、８及び界面活性剤保
持層９を保持する孔６ａ、６ｂ、６ｃが形成されてい
る。酵素反応層７は、第１測定極２の測定部分２ａの上
に載置されるよう前記保持枠６により保持される処理層
であり、リポプロテインを分解するためのリポプロテイ
ンリパーゼ、コレステロールエステルを加水分解するた
めのコレステロールエステラーゼ、コレステロールを酸
化すると共に、後述する電子受容体としてのフェリシア
ンイオンを還元してフェロシアンイオンを生成するため
のコレステロールオキシダーゼを保持させたろ紙で形成
されている。前記ろ紙としては、例えば、ポリエステル
繊維から成るろ紙を用いることができ、好ましくは、コ
ンジュゲートリリースパッドが用いられ得る。このコン
ジュゲートリリースパッドは、イムノクロマトグラフィ
ー用センサーデバイスの構成要素として開発されたろ紙
であり、ガラス繊維や高分子繊維などの表面に、必要に
応じ特殊なコーティングを施したものを材料とする。こ
のろ紙は、たんぱく質等の吸着量が低いという特徴を有
し、これを酵素反応層の保持体として適用すると、酵素
反応層に試料液が導入された際、試薬を速やかに遊離
し、反応終了までの時間が大幅に短縮するという効果を
奏する。また、繊維の微細なコンジュゲートリリースパ
ッド用いることにより、より多くの酵素を保持させるこ
とができ、それにより、さらに反応速度が短縮するとい
う効果を奏する。酵素反応層８は、第２測定極３の測定
部分３ａの上に載置されるよう前記保持枠６により保持
される処理層であり、コレステロールオキシダーゼを含
んでいないこと以外は、全て、酵素反応層７と同一の条
件、即ち、リポプロテインリパーゼ及びコレステロール
エステラーゼを保持させたろ紙で形成されている。前記
ろ紙としては、例えば、ポリエステル繊維から成るろ紙
を用いることができ、好ましくは、前記コンジュゲート
リリースパッドが用いられ得る。界面活性剤保持層９
は、対極４の測定部分４ａの上に載置されるよう前記保
持枠６により保持される処理層であり、界面活性剤を保
持させたろ紙、例えば、ポリエステル繊維ろ紙で形成さ
れている。前記界面活性剤としては、例えば、トリトン
Ｘ−１００（製品名）等）を用いることができる。図
中、符号１０は、界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１
００（製品名））及び電子受容体としてのフェリシアン
イオンを保持させたろ紙（例えば、ポリエステル繊維ろ
紙）から成る界面活性剤及び電子受容体保持層を示して
いる。この界面活性剤及び電子受容体保持層１０は、前
記酵素反応層７、８及び界面活性剤保持層９の上面に、
これらを覆うように載置される処理層であり、その中心
軸に対して左右対称の形状を持ち、前記界面活性剤保持
層９の同軸上に配置された時に、前記酵素反応層７及び
８を覆うことができるよう寸法決めされている。図中、
符号１２は、カバーを示している。図４は、カバー１２
を底面から見た斜視図である。図４に示すように、この
カバー１２は、絶縁性材料、例えば、適当な樹脂で形成
された底面が開口した箱体から成る。カバー１２は、そ
の上壁１２ａの内面１２ｂに、前記界面活性剤及び電子
受容体保持層１０を嵌め込むことができる凹部１２ｃが
形成されている。前記凹部１２ｃの深さの寸法は、前記
界面活性剤及び電子受容体保持層１０の厚みに合わせら
れ、組み立てた時に、上壁１２ａの内面１２ｂと、前記
保持枠６の上面とが当たるようにされており、また、そ
の形状は、前記界面活性剤及び電子受容体保持層１０を
位置決めできるように、保持層１０の形状に合わせられ
ている（図２及び図３参照）。また、カバー１２の上壁
１２ａには、試料液を導入するための開口１２ｄが設け
られている。この開口１２ｄの位置及び大きさは、試料
液の導入位置を制限して、試料液を保持層１０の中心に
導入できるように決められ、これにより、前記第１測定
極２と第２測定極３との中間位置に試料液が導入できる
ようになる（図３参照）。さらに、カバー１２の前壁１
２ｅには、切り欠き１２ｆが形成されており（図４参
照）、組み立てた時に、基板１の上の端子部分２ｂ、３
ｂ、４ｂが、この切り欠き１２ｆから突出するようにさ
れている（図２参照）。

【０００６】上記したコレステロール測定用センサは、
基板１上に、酵素反応層７，８及び界面活性剤保持層９
を保持した保持枠６を載置し、保持枠６の上に、界面活
性剤及び電子受容体保持層１０を積層し、さらに、カバ
ー１２を被せて、カバー１２と基板１とを適当な方法で
固定することにより、基板１とカバー１２との間に、酵
素反応層７，８及び界面活性剤保持層９を保持した保持
枠６と、界面活性剤及び電子受容体保持層１０とを挟み
込んで固定することで組み立てられる。尚、組み立て順
序及び方法は前記の方法に限定されるものではなく、任
意の方法でよく、例えば、カバー１２側から組み立てて
もよいことは勿論である。基板１とカバー１２とを固定
する方法は、任意の方法でよく、例えば、保持枠６の上
面及び下面に接着剤を塗布して保持枠６を介して基板１
とカバー１２とを固定してもよく、また、基板１及び／
又はカバー１２に適当な係止部材を設けて固定してもよ
く、さらにまた、カバー１２に基板１をスライド嵌合可
能な溝を設けて固定してもよい。

【０００７】以上説明したように構成されたコレステロ
ール測定用センサの開口１２ｄから試料液を滴下する
と、試料液が界面活性剤及び電子受容体保持層１０を通
過する際に試料液中に界面活性剤及び電子受容体として
のフェリシアン塩が溶解する。次いで、酵素反応層７を
通過する試料液には、リポプロテインリパーゼ、コレス
テロールエステラーゼ、及びコレステロールオキシダー
ゼが溶解し、これらの酵素が試料液中のコレステロール
エステルを加水分解してコレステロールを生成し、さら
に、コレステロールオキシダーゼがコレステロールを酸
化し、試料液中に溶解したフェリシアンイオンを還元し
てコレステ−４-エン−３−オン及びフェロシアンイオ
ンを生成する。一方、酵素反応層８を通過する試料液
は、リポプロテインリパーゼ及びコレステロールエステ
ラーゼが溶解してコレステロールエステルからコレステ
ロールが生成される。しかし、酵素反応層８には、コレ
ステロールオキシダーゼは保持されていないので、フェ
ロシアンイオンは生成されない。次いで、第１測定極２
及び第２測定極３と、対極４との間に、適当な電圧を印
加し、その時に、第１測定極２と対極４との間に流れる
電極応答電流の値Ａと、第２測定極３と対極４との間に
流れる電極応答電流の値Ｂとを測定し、電流値Ａから電
流値Ｂを引いた値からコレステロール成分の濃度を算出
する。第１測定極２に達する試料液中にはコレステロー
ルの酸化反応によって生じたフェロシアンイオンが含ま
れているため、対極４との間には、フェロシアンイオン
が電気化学的に酸化する時に生じる酸化電流が流れる
が、第２測定極３に達する血液中にはコレステロールの
酸化反応によって生じたフェロシアンイオンが含まれて
いないので、フェロシアンイオンが電気化学的に酸化す
る時に生じる酸化電流は流れない。しかし、第１測定極
２と第２測定極３とは、酵素反応層８にコレステロール
オキシダーゼが保持されていないこと以外の条件は同一
である。従って、上記したように、電極応答電流値Ａか
ら電極応答電流値Ｂを引くと、フェロシアンイオンの酸
化時に生じる酸化電流値のみが残るので、その値からコ
レステロール成分の濃度を算出することが可能になる。
尚、上記したように、酵素反応層７，８及び界面活性剤
保持層９は、それぞれ、第１測定極２、第２測定極３、
及び対極４上に載置された後、基板１とカバー１２とで
挟まれて固定されているだけなので、各層７，８，９と
各極２，３，４とは、完全に一体化しているわけではな
い。従って、層７，８，９と各極２，３，４との間に
は、必ず、微小な隙間が生じてしまい、その隙間に空気
が残存してしまうが、第１測定極２、第２測定極３及び
対極４に達する試料液中には、界面活性剤が溶解してい
るので、この界面活性剤が、疎水性の第１測定極２、第
２測定極３、及び対極４と、試料液との界面に顕著な吸
着を生じさせるので、各極２，３，４と、血液との間に
気泡の残存はなくなり、各極２，３，４の濡れが一様に
なり、測定値が安定する。

【０００８】各層を下記の条件で構成し、鶏卵黄を、ウ
シ血清アルブミン７％、リン酸緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ
７．５）、塩化ナトリウム１５０ｍＭの組成の水溶液に
て希釈し、コレステロール濃度を適当に調整した４つの
試料液ａ〜ｄを開口１２ｄより滴下したときの測定結果
を図５に示す。・電子受容体・界面活性剤保持層１０フェリシアン化カリウム１．３３ｍｇトリトンＸ−１０００．０３ｍｇポリエステル繊維ろ紙直径６．８ｍｍ・酵素反応層７リポプロテインリパーゼ０．５４ユニットコレステロールエステラーゼ１．０９ユニットコレステロールオキシダーゼ０．５４ユニットコンジュゲートリリースパッド直径１．５ｍｍ・酵素反応層８リポプロテインリパーゼ０．５４ユニットコレステロールエステラーゼ１．０９ユニットコンジュゲートリリースパッド直径１．５ｍｍ・界面活性剤保持層９トリトンＸ−１００５μｇポリエステル繊維ろ紙直径２ｍｍ図５の測定結果に示すように試料液ａ〜ｄの測定結果
は、１直線上に乗っており、安定したコレステロール濃
度が測定できることが分かる。

【０００９】次に、図６を参照して本発明に係るコレス
テロール測定用センサの第２の実施例を説明する。図６
は、上記した第１実施例のコレステロール測定用センサ
に、さらに、中性脂肪測定機能を加え、かつ全血測定を
も可能としたコレステロール及び中性脂肪測定用センサ
の展開図を示している。図中、符号１は絶縁性基板を、
符号２はコレステロール用第１測定極、符号３はコレス
テロール用第２測定極、符号４は対極、符号５は絶縁
層、符号６は保持枠、符号７及び８は酵素反応層、符号
９は界面活性剤保持層、符号１０は界面活性剤、塩化マ
グネシウム及び電子受容体を保持する保持層、及び符号
１２はカバーを各々示している。前記第１測定極２及び
第２測定極３は、対極４を中心として左右対称に配置さ
れ、酵素反応層７、８及び界面活性剤保持層９は、組立
時に保持枠６により第１測定極、第２測定極３及び対極
４上の保持される。これらの構成部材は、基本的に上記
した第１の実施例と同じ構成なので、重複する説明はこ
こでは省略する。

【００１０】前記絶縁性基板１には、中性脂肪測定用の
第３測定極２０及び第４測定極２１が、前記対極４を中
心として左右対称となる位置に形成されている。これら
の中性脂肪測定用の測定極２０及び２１は、コレステロ
ール測定用の測定極と同様、カーボンペーストをスクリ
ーン印刷した後、加熱乾燥することにより形成されてお
り、また、その測定部分２０ａ及び２１ａ並びに端子部
分２０ｂ及び２１ｂ以外の部分は絶縁層５で覆われてい
る。前記保持枠６は、端子部分２ｂ，３ｂ，４ｂ，２０
ｂ，２１ｂを残して絶縁性基板１の上面を覆える寸法に
形成されており、また、孔６ａ〜６ｃに加えて、前記中
性脂肪測定用の測定極２０及び２１と対応する位置に、
後述する酵素反応層２２及び２３を保持する孔６ｄ，６
ｅが形成されている。酵素反応層２２は、第３測定極２
０の測定部分２０ａの上に載置されるよう前記保持枠６
により保持される処理層であり、リポタンパク中の中性
脂肪を分解し、中性脂肪由来のグリセロールを生成する
ためのリポプロテインリパーゼ、グリセロールをリン酸
化するためのグリセロールキナーゼ、グリセロール−３
−リン酸を酸化すると共に、後述する電子受容体として
のフェリシアンイオンを還元してフェロシアンイオンを
生成するためのグリセロリン酸オキシダーゼを保持させ
たろ紙で形成されている。前記ろ紙としては、例えば、
ポリエステル繊維から成るろ紙を用いることができ、好
ましくは、前記コンジュゲートリリースパッドが用いら
れ得る。酵素反応層２３は、第４測定極２１の測定部分
２１ａの上に載置されるよう前記保持枠６により保持さ
れる処理層であり、リポプロテインリパーゼを含んでい
ないこと以外は、全て、酵素反応層２２と同一の条件、
即ち、グリセロールキナーゼ及びグリセロリン酸オキシ
ダーゼを保持させたろ紙で形成されている。前記ろ紙と
しては、例えば、ポリエステル繊維から成るろ紙を用い
ることができ、好ましくは、前記コンジュゲートリリー
スパッドが用いられ得る。図中、符号２４は、血球分離
膜を示している。この血球分離膜２４は、グリセロール
キナーゼの補酵素としてのアデノシン３リン酸（以下、
ＡＴＰと称します。）を保持させたろ紙（例えば、ガラ
ス繊維ろ紙）から成り、前記保持層１０と同様、その中
心軸に対して左右対称の形状を持ち、前記界面活性剤保
持層９の同軸上に配置され時に、前記保持層１０を覆う
ことができるよう寸法決めされている。カバー１２は、
その上壁の内面に設けられた凹部１２ｃ（図４参照）の
深さが、前記保持層１０及び血球分離膜２４を重ねて嵌
め込むことができる寸法にされていること以外は第１実
施例におけるカバー１２と同じように構成されている。

【００１１】上記したコレステロール及び中性脂肪測定
用センサは、前記第１実施例に挙げたコレステロール測
定用センサと同様に組み立てられる。

【００１２】以上説明したように構成されたコレステロ
ール及び中性脂肪測定用センサの作用について説明す
る。開口１２ｄから試料液を滴下すると、試料液が血球
分離膜２４、前記保持層１０を通過する際に試料液中に
ＡＴＰ、塩化マグネシウム、界面活性剤及び電子受容体
としてのフェリシアンイオンが溶解する。前記した処理
層２４及び１０を通過した試料液は、酵素反応層７及び
８を通過し、第１測定極２、第２測定極３、及び対極４
に至り、これらの電極間に適当な電圧をかけることによ
り、その時の電極応答電流の値からコレステロール成分
の濃度が算出され得る。酵素反応層７及び８における反
応は、先に説明した第１実施例と同じなのでここでは、
その説明は省略する。一方、酵素反応層２２を通過する
試料液には、リポプロテインリパーゼが溶解し、この酵
素により試料液のリポたんぱく中の中性脂肪が分解さ
れ、グリセロール及び脂肪酸が生成される。さらに、酵
素反応層２２において、試料液中にグリセロールキナー
ゼが溶解し、この酵素とＡＴＰとによりグリセロール−
３−リン酸及びＡＤＰが生成される。さらに、グリセロ
リン酸オキシダーゼが、グリセロール−３−リン酸を酸
化すると共に、試料液中に溶解したフェリシアンイオン
を還元してジヒドロキシアセトン−３−リン酸及びフェ
ロシアンイオンを生成する。この酵素反応層２２では、
前記したようにリポプロテインリパーゼによりリポ蛋白
中の中性脂肪から生成されたグリセロールが含まれてい
るので、ここで生成されるフェロシアンイオンの値は、
遊離グリセロールと中性脂肪由来のグリセロールとの両
方から得られた値になる。他方、酵素反応層２３を通過
する試料液には、グリセロールキナーゼ及びグリセロリ
ン酸オキシダーゼが溶解し、これらの酵素によりフェロ
シアンイオンが生成されるが、この酵素反応層２３に
は、リポプロテインリパーゼが含まれていないので、中
性脂肪由来のグリセロールは生成されず、従って、この
酵素反応層２３で生成するフェロシアンイオンの量は、
遊離グリセロールの量に相当する量となる。次いで、第
３測定極２０及び第４測定極２１と、対極４との間に、
適当な電圧をかけ、その時に、第３測定極２０と対極４
との間に流れる電極応答電流の値から中性脂肪由来のグ
リセロール及び遊離グリセロールの合計の濃度が算出さ
れ、第４測定極２１と対極４との間に流れる電極応答電
流の値から遊離グリセロールの濃度が算出され、これら
の差をとり適当な演算処理を施すことにより、中性脂肪
濃度を算出することができる。尚、各酵素反応層７，
８，２２，２３、界面活性剤保持層９は、それぞれ、各
測定極２，３，２０，２１及び対極４上に載置された
後、基板１とカバー１２とで挟まれて固定されているだ
けなので、各層７，８，２２，２３，９と各極２，３，
２０，２１，４とは、完全に一体化しているわけではな
いが、各極２，３，２０，２１，４に達する試料液中に
は、界面活性剤が溶解しているので、この界面活性剤
が、疎水性の各極２，３，２０，２１，４と試料液との
界面に顕著な吸着を生じさせるので、各極２，３，２
０，２１，４と、血液との間に気泡の残存はなくなり、
各極２，３，２０，２１，４の濡れが一様になり、測定
値が安定する。

【００１３】各層を下記の条件で構成し、下記の人血清
１〜６を開口１２ｄより滴下したときのコレステロール
並びに中性脂肪の測定結果を図７（ａ）及び（ｂ）に各
々示す。（各層の構成）・血球分離膜２４アデノシン３リン酸・２ナトリウム塩０．１３ｍｇガラス繊維ろ紙直径６．８ｍｍ・電子受容体・塩化マグネシウム及び界面活性剤保持層１０フェリシアン化カリウム１．３３ｍｇ塩化マグネシウム０．２ｍｇトリトンＸ−１０００．０３ｍｇポリエステル繊維ろ紙直径６．８ｍｍ・酵素反応層７リポプロテインリパーゼ０．５４ユニットコレステロールエステラーゼ１．０９ユニットコレステロールオキシダーゼ０．５４ユニットコンジュゲートリリースパッド直径１．５ｍｍ・酵素反応層８リポプロテインリパーゼ０．５４ユニットコレステロールエステラーゼ１．０９ユニットコンジュゲートリリースパッド直径１．５ｍｍ・酵素反応層２０リポプロテインリパーゼ１．１３ユニットグリセロールキナーゼ０．２８ユニットグリセロリン酸オキシダーゼ０．２８ユニットコンジュゲートリリースパッド直径１．５ｍｍ・酵素反応層２１グリセロールキナーゼ０．２８ユニットグリセロリン酸オキシダーゼ０．２８ユニットコンジュゲートリリースパッド直径１．５ｍｍ・界面活性剤保持層９トリトンＸ−１００５μｇポリエステル繊維ろ紙直径２ｍｍ（人血清）試料番号総コレステロール濃度（mg/dL) トリク゛リセリト゛濃度(mg/dL) １５１６０２２７４４３３１９２２０７４１２２２４５１４２１４８６１７５１０２図７の測定結果に示すように試料液１〜６の測定結果
は、好適な値を示しており、安定したコレステロール濃
度並びに中性脂肪濃度の測定を同時に行うことができる
ことが分かる。一般的に、健康診断では患者の血液から
コレステロール濃度と中性脂肪濃度との両方を測定する
ことが多く、このように、コレステロールと中性脂肪と
を同時に測定できるように構成することにより、２度測
定する必要がなくなるので診療の効率化を図ることがで
き、また、検体の量を減らすことができるので患者に与
える負担を軽減させることができるようになる。

【００１４】以上説明したコレステロール測定用センサ
は、第１実施例及び第２実施例共に、第１測定極２及び
第２測定極３を対極４を中心として対称に配置し、さら
に、試料液を、第１測定極２と第２測定極３との中間位
置に導入できるようにカバー１２の開口１２ｄを形成し
ているので、第１測定極２と第２測定極３とに到達する
試料液を均等にすることができ、これにより、第１測定
極２及び第２測定極３の条件を、コレステロールオキシ
ダーゼ以外の部分で同一にすることができるようにな
り、第１測定極２の値を第２測定極３の値で補正するこ
とによる測定の精度をより上げることが可能になる。ま
た、以上説明したコレステロール測定用センサは、界面
活性剤を用いることにより、各処理層を基板と別体に構
成することを可能にしており、その結果、各処理層をろ
紙で形成できるようにしている。ろ紙で各処理層を形成
する場合、一つのろ紙に必要な試薬を保持させた後、そ
こから、複数個の処理層を切り出して、複数のセンサの
製造に用いることができる。このように製造すること
で、各処理層の条件を合わせやすくなるので、処理層を
塗布・乾燥して製造する場合に比べて、センサの性能の
バラツキを小さくすることができる。また、このように
製造することで、処理層の製造工程と、センサの組み立
て工程とを分離することができるので、センサを効率的
に製造することができるようになる。さらに、このよう
に各処理層をろ紙で製造することにより、対極上の処理
層と測定極上の処理層を分けることができるようにな
り、その結果、高価なコレステロールオキシダーゼを、
必要もないのに対極上に設ける必要がなくなるので、製
造コストを安価にすることができる。特に、コレステロ
ールオキシダーゼを媒体としたコレステロールの酸化反
応及びフェリシアンイオンの還元反応は遅く、その結
果、電気的に、コレステロール濃度を測定するには比較
的多くのコレステロールオキシダーゼが必要になるの
で、上記した効果は、コレステロール測定用センサにお
いて顕著に現れる。また、酵素の保持体としてコンジュ
ゲートリリースパッドを用いることにより、酵素量あた
りの反応速度は更に向上する。このことは、測定時間の
短縮、または測定時間を変化させることなく酵素の使用
量を節減することによるコストダウンの手段として有効
である。さらにまた、親水性高分子を用いて各処理層
を、塗布・乾燥して形成する場合、製造コストの高騰を
防ぐために、測定極と対極とに跨って親水性高分子層を
形成する必要があるので、上記した実施例のように、測
定極を二つ設け、一方の測定極（即ち、第１測定極）に
コレステロールオキシダーゼを含む酵素反応層を形成
し、他方の測定極（即ち、第２測定極）にコレステロー
ルオキシダーゼを含まない酵素反応層を形成し、二つの
測定極間に生じる電流値の差に基づいてコレステロール
濃度を測定するように構成するセンサを塗布・乾燥が必
要な親水性高分子層を用いて製造する場合には、親水性
高分子層を介して一方の測定極上の酵素反応層から、他
方の測定極に酵素が混入しないように、二つの測定極上
の親水性高分子層を完全に分離する必要がある。そのた
め、対極と測定極とからなる電極を二つ形成し、その各
々に別個に親水性高分子層を形成する必要があるので、
上記したコレステロール測定用センサに比べて対極が一
つ多くなり、材料費や製造工程が増え、製造コストが高
くなるという問題が生じると共に、二つの測定極間の条
件を合わせることが難しくなるという問題がある。この
ような観点からみると、本発明に係るコレステロール測
定用センサは、測定極を二つ設けて、各測定極間に生じ
る電流値の差に基づいて基質濃度を測定するセンサを、
従来のバイオセンサに比べて、より、安価に、かつ、精
度よく製造することができるよういう効果も奏する。ま
た、以上説明したセンサは、酵素反応層を測定極上のみ
に設けることができるように構成し、かつ、酵素反応層
の保持体としてコンジュゲートリリースパッドを用いて
いるので、無駄に酵素を使用することなく酵素濃度を高
めることができるという効果を奏し、酵素濃度を高める
ことにより、反応速度をより高めることができるように
なるという効果を奏する。

【００１５】本発明に係るコレステロール測定用センサ
の構成は上記した実施例に限定されるものではなく、特
許請求の範囲に記載された発明の概念内で任意に変更す
ることができる。具体的には、上記した第１の実施例で
は、電子受容体、界面活性剤及び酵素を各処理層に分離
しているが、これらは、一つのろ紙に保持させて構成し
てもよく、また、図８〜図１０に示すようにろ紙に保持
される試薬の組合せも任意に決めることができ、さら
に、積層順序も任意に変更することができる。さらに、
第１実施例及び第２実施例における第２測定極３上の保
持層に、第１測定極２のコレステロールオキシダーゼに
相当する量のたんぱく質を保持させることにより、ま
た、第２実施例における第４測定極２１上に、第３測定
極２０のリポプロテインリパーゼに相当する量のたんぱ
く質を保持させることにより、第２測定極３上の保持層
にコレステロールオキシダーゼがないことによる第１測
定極２との試料反応時の粘性の違いや、第４測定極２０
上にリポプロテインリパーゼがないことによる第３測定
極２０との試料反応時の粘性の違いを補完してもよく、
このように構成することにより測定精度はさらに高ま
る。

【００１６】

【発明の効果】以上説明したように、本発明に係るコレ
ステロール測定用センサは、絶縁性基板上に少なくとも
測定極と対極とを有する電極系を形成し、酵素、電子受
容体及び試料液の反応時の物質濃度変化を電気化学的に
前記電極系で検知し前記試料液の基質濃度を測定するセ
ンサにおいて、前記測定極上に、リポプロテインリパー
ゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキ
シダーゼ及び界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過
可能な保持体を載置して第１層を形成し、前記対極上
に、界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保
持体を載置して第２層を形成しているので、測定精度を
落とすことなく、安価に簡単に製造することができ、か
つ、品質のバラツキが極めて少ないコレステロール測定
用センサを提供することが可能になるという効果を奏す
る。また、前記第１層にリポプロテインリパーゼ、コレ
ステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ
を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成され
た酵素反応層と、界面活性剤を保持し、かつ、試料液が
通過可能な保持体で形成された界面活性剤保持層とで形
成することにより、測定極と対極とに共通に必要な界面
活性剤を保持する処理層を一体化することが可能にな
り、製造及び組み立て工程をより簡略化することができ
るようになるという効果を奏する。さらに、前記酵素反
応層に、コンジュゲートリリースパッドを用いることに
より、酵素反応層に試料液が導入された際、試薬を速や
かに遊離し、反応終了までの時間が大幅に短縮するとい
う効果を奏する。また、絶縁性基板上の前記対極を挟ん
で前記測定極と対応する位置に第２測定極を設け、前記
第２測定上に、コレステロールオキシダーゼを含有して
いないこと以外は、前記測定極と同一の条件の層を、前
記測定極と同一条件で設けることで、コレステロール濃
度に依存する目的の電流のみを正確に測定することが可
能になり、より測定精度を向上させることができるよう
になるという効果を奏する。さらに、試料液を前記測定
極と前記第２測定極との中間位置に導入できるように、
試料液の滴下位置を制限可能な案内手段を設けること
で、使用者が試料液の滴下位置を意識する必要がなくな
るので、測定が簡単に行えるようになるという効果を奏
する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係るコレステロール測定用センサの
第一実施例の展開図

【図２】図１に示したコレステロール測定用センサの
組立完成品の部分断面図

【図３】図１に示したコレステロール測定用センサの
中央横断面図

【図４】カバー１２を底面から見た斜視図

【図５】図１〜図４に示したコレステロール測定用セ
ンサを用いたコレステロール濃度の測定結果を示すグラ
フである。

【図６】本発明に係るコレステロール測定用センサの
構造を適用したコレステロール及び中性脂肪測定用セン
サの展開図である。

【図７】（ａ）は図６に示したコレステロール測定用
センサを用いたコレステロール濃度の測定結果を示すグ
ラフであり、（ｂ）は同センサを用いた中性脂肪濃度の
測定結果を示すグラフである。

【図８】本発明に係るコレステロール測定用センサの
各処理層の組合せの別の実施例を示す概略図

【図９】本発明に係るコレステロール測定用センサの
各処理層の組合せの別の実施例を示す概略図

【図１０】本発明に係るコレステロール測定用センサ
の各処理層の組合せの別の実施例を示す概略図

【符号の説明】

１絶縁性基板２第１測定極（コレステロール測定用）２ａ測定部分２ｂ端子部分３第２測定極（コレステロール測定用）３ａ測定部分３ｂ端子部分４対極４ａ測定部分４ｂ端子部分５絶縁層６保持枠６ａ保持孔（酵素反応層７の保持用）６ｂ保持孔（酵素反応層８の保持用）６ｃ保持孔（界面活性剤保持層９の保持用）（６ｄ保持孔（酵素反応層２２の保持用））（６ｅ保持孔（酵素反応層２３の保持用））７酵素反応層（コレステロール測定用の第１測定極
用）８酵素反応層（コレステロール測定用の第２測定極
用）９界面活性剤保持層１０界面活性剤及び電子受容体保持層１２カバー１２ａ上壁１２ｂ上壁の内面１２ｃ凹部１２ｄ開口（試料液滴下用）１２ｅ前壁１２ｆ切り欠き２０第３測定極（中性脂肪測定用）２０ａ測定部分２０ｂ端子部分２１第４測定極（中性脂肪測定用）２１ａ測定部分２１ｂ端子部分２２酵素反応層（中性脂肪測定用）２３酵素反応層（中性脂肪測定用）２４血球分離膜

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/44 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ 1/48 Ｇ０１Ｎ 33/92 ＢＧ０１Ｎ 33/92 27/30 ３５３Ｕ３５３Ｂ３５３Ｒ (72)発明者山崎浩樹神奈川県横浜市都筑区仲町台５丁目５番１号株式会社テクノメデイカ内 (72)発明者相澤益男東京都小金井市梶野町５丁目12番５号Ｆターム(参考） 2G045 AA13 BB29 CA25 CA26 DA69 FB01 FB05 HA02 HA09 4B029 AA07 FA12 4B033 NA02 NA22 NA23 NA26 NA27 NA45 NB12 NB63 NB70 NC04 ND05 ND12 ND16 4B063 QA01 QQ03 QQ70 QQ76 QR41 QR52 QS39 QX05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】絶縁性基板上に少なくとも測定極と対極
とを有する電極系を形成し、酵素、電子受容体及び試料
液の反応時の物質濃度変化を電気化学的に前記電極系で
検知し前記試料液の基質濃度を測定するセンサにおい
て、前記測定極上に、リポプロテインリパーゼ、コレステロ
ールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び界
面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を
載置して第１層を形成し、前記対極上に、界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通
過可能な保持体を載置して第２層を形成したことを特徴
とするコレステロール測定用センサ。
【請求項２】前記第１層が、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラー
ゼ、コレステロールオキシダーゼを保持し、かつ、試料
液が通過可能な保持体で形成された酵素反応層と、界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体
で形成された界面活性剤保持層とから形成されているこ
とを特徴とする請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】前記酵素反応層を構成する保持体をコン
ジュゲートリリースパッドで形成したことを特徴とする
請求項２に記載のセンサ。
【請求項４】測定極上に前記酵素反応層を、前記酵素
反応層上に前記界面活性剤保持層を順次積層してなるこ
とを特徴とする請求項２又は３に記載のセンサ。
【請求項５】前記界面活性剤保持層と前記第２層とが
一つの保持体で形成されていることを特徴とする請求項
４に記載のセンサ。
【請求項６】前記第１層を構成する界面活性剤層が、
コレステロールオキシダーゼを触媒としてコレステロー
ルと反応する電子受容体を保持していることを特徴とす
る請求項１〜５の何れか一項に記載のセンサ。
【請求項７】前記電子受容体保持層が、前記第１層と
第２層とに跨って載置されることを特徴とする請求項６
に記載のセンサ。
【請求項８】前記電子受容体が、フェリシアンイオン
であることを特徴とする請求項６又は７に記載のセン
サ。
【請求項９】絶縁性基板上の前記対極を挟んで前記測
定極と対応する位置に第２測定極を設け、前記第２測定上に、コレステロールオキシダーゼを含有
していないこと以外は、前記測定極と同一の条件の層
を、前記測定極と同一条件で設けたことを特徴とする請
求項１〜８の何れか一項に記載のセンサ。
【請求項１０】試料液を前記測定極と前記第２測定極
との中間位置に導入できるように、試料液の滴下位置を
制限可能な案内手段を設けたことを特徴とする請求項９
に記載のセンサ。