JP4653870B2 - コレステロール測定用センサ - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、全血、血漿、血清、又は標準液等の試料液中のコレステロール成分を測定するためのセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、基板上に測定極と対極とからなる電極系を形成し、この電極系の上に、酵素と電子受容体とを担持した多孔体から成る酵素反応層を設け、それらを適当なカバーで一体化したバイオセンサが提案されている。
このバイオセンサは、血液等の試料液を酵素反応層に滴下して酵素と電子受容体とを試料液中に溶解させ、酵素及び電子受容体と試料液中の特定の基質との間で酵素反応を進行させて電子受容体を還元した後、還元された電子受容体を電気化学的に酸化させて、このときに得られる酸化電流値から試料液中の特定の基質の濃度を求める。
しかし、上記した構成では、電極系を含む基板面の濡れが必ずしも一様とならないため、多孔体と基板との間に気泡が残り、応答電流に影響を与えたり反応速度が低下するという問題があった。
上記した従来の問題点を解決する方法として、測定極と対極とからなる電極系の上に、親水性高分子と酵素とから成る酵素反応層を設けることが登録第２５０２６６５号にて提案されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記したように親水性高分子を用いて酵素反応層と電極との間の気泡の残存を防ぐ方法は、親水性高分子を含む層と電極系とを隙間なく一体化する必要があるため、始めに、親水性高分子を溶液にして電極上に塗布した後に乾燥させて親水性高分子層を形成した後に、親水性高分子層の上に酵素を含む酵素層を形成しなければならないという製造上の制限があるという問題があった。
このような製造方法は、親水性高分子層を形成した後でなければ、酵素層の形成を開始することができないので製造に時間がかかるという問題がある。また、塗布・乾燥工程を用いた製造方法は、塗布時に塗布すべき溶液の量にバラツキが出やすいため、複数のセンサを製造する場合、各センサで親水性高分子や酵素の濃度にバラツキが生じる可能性が高いという問題もある。
また、上記した従来のバイオセンサは、本来、対極上には酵素反応層を設ける必要がないにも拘わらず、測定極と対極との両方に跨って酵素反応層を設けているため、製造コストが高くなるという問題もある。
酵素には、高価なものも、安価なものもあるため、上記した問題の大きさは、測定すべき基質の種類、即ち、酵素の種類に依存する問題ではあるが、コレステロールを測定する場合には、コレステロールの測定に有効な酵素であるリポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、及びコレステロールオキシダーゼが高価であり、特に、コレステロールオキシダーゼと電子受容体との反応速度が非常に遅いので、コレステロールを測定するためには、大量のコレステロールオキシダーゼを必要とするため大きな問題となる。
この製造コスト上の問題を解決するためには、測定極上のみに酵素反応層を設ける必要があるが、従来のバイオセンサは、上記したように、始めに、親水性高分子を溶液にして塗布し乾燥させなければならないという製造上の制限があり、そのため、測定極上のみに酵素反応層を設けようとすると、始めに、親水性高分子を測定極と対極との両方に別々に塗布・乾燥させて各々に親水性高分子層を形成しなければならないので、塗布・乾燥工程が増えてしまい、結局、製造コストが高くなってしまうという問題がある。親水性高分子層は測定極上及び対極上の両方に設けることが望ましいので、塗布・乾燥工程を増やさないために、親水性高分子層だけは電極全面に形成し、酵素を含む酵素層だけを測定極上のみに設けるという考え方もあるが、親水性高分子層を塗布・乾燥した後に、測定極上のみに酵素が溶解した試料液を塗布・乾燥させて酵素層を測定極上に局在するように形成するのは極めて困難であり、このような製造方法を採るとセンサ一個体ごとにバラツキが生じることは避けられないので現実的ではない。
さらに、上記した従来のバイオセンサのように、測定極と対極との両方に渡って酵素反応層を設けるという従来の構造は、上記したコスト面に関する問題の他にも、対極が試料液中の基質と酵素との反応生成物と相互作用を起こし易く、測定結果に影響を及ぼす可能性があるという根本的な問題点もある。
本発明は、上記した従来の問題点を解決し、測定精度を落とすことなく、安価に簡単に製造することができ、かつ、品質のバラツキが極めて少ないコレステロール測定用センサを提供することを目的としている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記した目的を達成するために本発明に係るコレステロール測定用センサは、絶縁性基板上に少なくとも測定極と対極とを有する電極系を形成し、酵素、電子受容体及び試料液の反応時の物質濃度変化を電気化学的に前記電極系で検知し前記試料液の基質濃度を測定するセンサにおいて、前記測定極上に、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、界面活性剤及び電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置して第１層を形成し、前記対極上に、界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置して第２層を形成したことを特徴とするものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面に示した幾つかの実施例を参照して本発明に係るコレステロール測定用センサの実施の形態について説明する。
始めに、図１〜図５を参照して本発明に係るコレステロール測定用センサの第１の実施例について説明していく。
図１は、本発明に係るコレステロール測定用センサの一実施例の展開図、図２は、図１に示したコレステロール測定用センサの組立完成品の部分断面図、図３は、図１に示したコレステロール測定用センサの中央断面図を各々示している。
図中符号１は、絶縁性基板を示している。この絶縁性基板１の上には、カーボンペーストをスクリーン印刷した後、加熱乾燥することにより第１測定極２及び第２測定極３が形成されており、また、銀／塩化銀ペーストをスクリーン印刷した後、加熱乾燥することにより対極４が形成されている。前記測定極２と第２測定極３とは、対極４を中心として左右対称となる位置に形成されている。また、前記測定極２、第２測定極３、及び対極４は、測定部分２ａ、３ａ、４ａ及び端子部分２ｂ、３ｂ、４ｂ以外は絶縁層５で覆われる。
図中符号６は、絶縁性材料で形成された保持枠を示している。この保持枠６は、図２に示すように前記端子部分２ｂ、３ｂ、４ｂを残して絶縁性基板１の上面を覆える寸法に形成されており、また、前記測定部分２ａ、３ａ、４ａと対応する位置には、後述する酵素反応層７、８及び界面活性剤保持層９を保持する孔６ａ、６ｂ、６ｃが形成されている。
酵素反応層７は、第１測定極２の測定部分２ａの上に載置されるよう前記保持枠６により保持される処理層であり、リポプロテインを分解するためのリポプロテインリパーゼ、コレステロールエステルを加水分解するためのコレステロールエステラーゼ、コレステロールを酸化すると共に、後述する電子受容体としてのフェリシアンイオンを還元してフェロシアンイオンを生成するためのコレステロールオキシダーゼを保持させたろ紙で形成されている。前記ろ紙としては、例えば、ポリエステル繊維から成るろ紙を用いることができ、好ましくは、コンジュゲートリリースパッドが用いられ得る。このコンジュゲートリリースパッドは、イムノクロマトグラフィー用センサーデバイスの構成要素として開発されたろ紙であり、ガラス繊維や高分子繊維などの表面に、必要に応じ特殊なコーティングを施したものを材料とする。このろ紙は、たんぱく質等の吸着量が低いという特徴を有し、これを酵素反応層の保持体として適用すると、酵素反応層に試料液が導入された際、試薬を速やかに遊離し、反応終了までの時間が大幅に短縮するという効果を奏する。また、繊維の微細なコンジュゲートリリースパッド用いることにより、より多くの酵素を保持させることができ、それにより、さらに反応速度が短縮するという効果を奏する。
酵素反応層８は、第２測定極３の測定部分３ａの上に載置されるよう前記保持枠６により保持される処理層であり、コレステロールオキシダーゼを含んでいないこと以外は、全て、酵素反応層７と同一の条件、即ち、リポプロテインリパーゼ及びコレステロールエステラーゼを保持させたろ紙で形成されている。前記ろ紙としては、例えば、ポリエステル繊維から成るろ紙を用いることができ、好ましくは、前記コンジュゲートリリースパッドが用いられ得る。
界面活性剤保持層９は、対極４の測定部分４ａの上に載置されるよう前記保持枠６により保持される処理層であり、界面活性剤を保持させたろ紙、例えば、ポリエステル繊維ろ紙で形成されている。前記界面活性剤としては、例えば、トリトンＸ−１００（製品名）等）を用いることができる。
図中、符号１０は、界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００（製品名））及び電子受容体としてのフェリシアンイオンを保持させたろ紙（例えば、ポリエステル繊維ろ紙）から成る界面活性剤及び電子受容体保持層を示している。この界面活性剤及び電子受容体保持層１０は、前記酵素反応層７、８及び界面活性剤保持層９の上面に、これらを覆うように載置される処理層であり、その中心軸に対して左右対称の形状を持ち、前記界面活性剤保持層９の同軸上に配置された時に、前記酵素反応層７及び８を覆うことができるよう寸法決めされている。
図中、符号１２は、カバーを示している。図４は、カバー１２を底面から見た斜視図である。図４に示すように、このカバー１２は、絶縁性材料、例えば、適当な樹脂で形成された底面が開口した箱体から成る。カバー１２は、その上壁１２ａの内面１２ｂに、前記界面活性剤及び電子受容体保持層１０を嵌め込むことができる凹部１２ｃが形成されている。前記凹部１２ｃの深さの寸法は、前記界面活性剤及び電子受容体保持層１０の厚みに合わせられ、組み立てた時に、上壁１２ａの内面１２ｂと、前記保持枠６の上面とが当たるようにされており、また、その形状は、前記界面活性剤及び電子受容体保持層１０を位置決めできるように、保持層１０の形状に合わせられている（図２及び図３参照）。
また、カバー１２の上壁１２ａには、試料液を導入するための開口１２ｄが設けられている。この開口１２ｄの位置及び大きさは、試料液の導入位置を制限して、試料液を保持層１０の中心に導入できるように決められ、これにより、前記第１測定極２と第２測定極３との中間位置に試料液が導入できるようになる（図３参照）。
さらに、カバー１２の前壁１２ｅには、切り欠き１２ｆが形成されており（図４参照）、組み立てた時に、基板１の上の端子部分２ｂ、３ｂ、４ｂが、この切り欠き１２ｆから突出するようにされている（図２参照）。
【０００６】
上記したコレステロール測定用センサは、基板１上に、酵素反応層７，８及び界面活性剤保持層９を保持した保持枠６を載置し、保持枠６の上に、界面活性剤及び電子受容体保持層１０を積層し、さらに、カバー１２を被せて、カバー１２と基板１とを適当な方法で固定することにより、基板１とカバー１２との間に、酵素反応層７，８及び界面活性剤保持層９を保持した保持枠６と、界面活性剤及び電子受容体保持層１０とを挟み込んで固定することで組み立てられる。尚、組み立て順序及び方法は前記の方法に限定されるものではなく、任意の方法でよく、例えば、カバー１２側から組み立ててもよいことは勿論である。
基板１とカバー１２とを固定する方法は、任意の方法でよく、例えば、保持枠６の上面及び下面に接着剤を塗布して保持枠６を介して基板１とカバー１２とを固定してもよく、また、基板１及び／又はカバー１２に適当な係止部材を設けて固定してもよく、さらにまた、カバー１２に基板１をスライド嵌合可能な溝を設けて固定してもよい。
【０００７】
以上説明したように構成されたコレステロール測定用センサの開口１２ｄから試料液を滴下すると、試料液が界面活性剤及び電子受容体保持層１０を通過する際に試料液中に界面活性剤及び電子受容体としてのフェリシアン塩が溶解する。
次いで、酵素反応層７を通過する試料液には、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、及びコレステロールオキシダーゼが溶解し、これらの酵素が試料液中のコレステロールエステルを加水分解してコレステロールを生成し、さらに、コレステロールオキシダーゼがコレステロールを酸化し、試料液中に溶解したフェリシアンイオンを還元してコレステ−４-エン−３−オン及びフェロシアンイオンを生成する。
一方、酵素反応層８を通過する試料液は、リポプロテインリパーゼ及びコレステロールエステラーゼが溶解してコレステロールエステルからコレステロールが生成される。しかし、酵素反応層８には、コレステロールオキシダーゼは保持されていないので、フェロシアンイオンは生成されない。
次いで、第１測定極２及び第２測定極３と、対極４との間に、適当な電圧を印加し、その時に、第１測定極２と対極４との間に流れる電極応答電流の値Ａと、第２測定極３と対極４との間に流れる電極応答電流の値Ｂとを測定し、電流値Ａから電流値Ｂを引いた値からコレステロール成分の濃度を算出する。
第１測定極２に達する試料液中にはコレステロールの酸化反応によって生じたフェロシアンイオンが含まれているため、対極４との間には、フェロシアンイオンが電気化学的に酸化する時に生じる酸化電流が流れるが、第２測定極３に達する血液中にはコレステロールの酸化反応によって生じたフェロシアンイオンが含まれていないので、フェロシアンイオンが電気化学的に酸化する時に生じる酸化電流は流れない。しかし、第１測定極２と第２測定極３とは、酵素反応層８にコレステロールオキシダーゼが保持されていないこと以外の条件は同一である。従って、上記したように、電極応答電流値Ａから電極応答電流値Ｂを引くと、フェロシアンイオンの酸化時に生じる酸化電流値のみが残るので、その値からコレステロール成分の濃度を算出することが可能になる。
尚、上記したように、酵素反応層７，８及び界面活性剤保持層９は、それぞれ、第１測定極２、第２測定極３、及び対極４上に載置された後、基板１とカバー１２とで挟まれて固定されているだけなので、各層７，８，９と各極２，３，４とは、完全に一体化しているわけではない。従って、層７，８，９と各極２，３，４との間には、必ず、微小な隙間が生じてしまい、その隙間に空気が残存してしまうが、第１測定極２、第２測定極３及び対極４に達する試料液中には、界面活性剤が溶解しているので、この界面活性剤が、疎水性の第１測定極２、第２測定極３、及び対極４と、試料液との界面に顕著な吸着を生じさせるので、各極２，３，４と、血液との間に気泡の残存はなくなり、各極２，３，４の濡れが一様になり、測定値が安定する。
【０００８】
各層を下記の条件で構成し、鶏卵黄を、ウシ血清アルブミン７％、リン酸緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ７．５）、塩化ナトリウム１５０ｍＭの組成の水溶液にて希釈し、コレステロール濃度を適当に調整した４つの試料液ａ〜ｄを開口１２ｄより滴下したときの測定結果を図５に示す。

図５の測定結果に示すように試料液ａ〜ｄの測定結果は、１直線上に乗っており、安定したコレステロール濃度が測定できることが分かる。
【０００９】
次に、図６を参照して本発明に係るコレステロール測定用センサの第２の実施例を説明する。
図６は、上記した第１実施例のコレステロール測定用センサに、さらに、中性脂肪測定機能を加え、かつ全血測定をも可能としたコレステロール及び中性脂肪測定用センサの展開図を示している。
図中、符号１は絶縁性基板を、符号２はコレステロール用第１測定極、符号３はコレステロール用第２測定極、符号４は対極、符号５は絶縁層、符号６は保持枠、符号７及び８は酵素反応層、符号９は界面活性剤保持層、符号１０は界面活性剤、塩化マグネシウム及び電子受容体を保持する保持層、及び符号１２はカバーを各々示している。前記第１測定極２及び第２測定極３は、対極４を中心として左右対称に配置され、酵素反応層７、８及び界面活性剤保持層９は、組立時に保持枠６により第１測定極、第２測定極３及び対極４上の保持される。これらの構成部材は、基本的に上記した第１の実施例と同じ構成なので、重複する説明はここでは省略する。
【００１０】
前記絶縁性基板１には、中性脂肪測定用の第３測定極２０及び第４測定極２１が、前記対極４を中心として左右対称となる位置に形成されている。これらの中性脂肪測定用の測定極２０及び２１は、コレステロール測定用の測定極と同様、カーボンペーストをスクリーン印刷した後、加熱乾燥することにより形成されており、また、その測定部分２０ａ及び２１ａ並びに端子部分２０ｂ及び２１ｂ以外の部分は絶縁層５で覆われている。
前記保持枠６は、端子部分２ｂ，３ｂ，４ｂ，２０ｂ，２１ｂを残して絶縁性基板１の上面を覆える寸法に形成されており、また、孔６ａ〜６ｃに加えて、前記中性脂肪測定用の測定極２０及び２１と対応する位置に、後述する酵素反応層２２及び２３を保持する孔６ｄ，６ｅが形成されている。
酵素反応層２２は、第３測定極２０の測定部分２０ａの上に載置されるよう前記保持枠６により保持される処理層であり、リポタンパク中の中性脂肪を分解し、中性脂肪由来のグリセロールを生成するためのリポプロテインリパーゼ、グリセロールをリン酸化するためのグリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸を酸化すると共に、後述する電子受容体としてのフェリシアンイオンを還元してフェロシアンイオンを生成するためのグリセロリン酸オキシダーゼを保持させたろ紙で形成されている。前記ろ紙としては、例えば、ポリエステル繊維から成るろ紙を用いることができ、好ましくは、前記コンジュゲートリリースパッドが用いられ得る。
酵素反応層２３は、第４測定極２１の測定部分２１ａの上に載置されるよう前記保持枠６により保持される処理層であり、リポプロテインリパーゼを含んでいないこと以外は、全て、酵素反応層２２と同一の条件、即ち、グリセロールキナーゼ及びグリセロリン酸オキシダーゼを保持させたろ紙で形成されている。前記ろ紙としては、例えば、ポリエステル繊維から成るろ紙を用いることができ、好ましくは、前記コンジュゲートリリースパッドが用いられ得る。
図中、符号２４は、血球分離膜を示している。この血球分離膜２４は、グリセロールキナーゼの補酵素としてのアデノシン３リン酸（以下、ＡＴＰと称します。）を保持させたろ紙（例えば、ガラス繊維ろ紙）から成り、前記保持層１０と同様、その中心軸に対して左右対称の形状を持ち、前記界面活性剤保持層９の同軸上に配置され時に、前記保持層１０を覆うことができるよう寸法決めされている。
カバー１２は、その上壁の内面に設けられた凹部１２ｃ（図４参照）の深さが、前記保持層１０及び血球分離膜２４を重ねて嵌め込むことができる寸法にされていること以外は第１実施例におけるカバー１２と同じように構成されている。
【００１１】
上記したコレステロール及び中性脂肪測定用センサは、前記第１実施例に挙げたコレステロール測定用センサと同様に組み立てられる。
【００１２】
以上説明したように構成されたコレステロール及び中性脂肪測定用センサの作用について説明する。
開口１２ｄから試料液を滴下すると、試料液が血球分離膜２４、前記保持層１０を通過する際に試料液中にＡＴＰ、塩化マグネシウム、界面活性剤及び電子受容体としてのフェリシアンイオンが溶解する。
前記した処理層２４及び１０を通過した試料液は、酵素反応層７及び８を通過し、第１測定極２、第２測定極３、及び対極４に至り、これらの電極間に適当な電圧をかけることにより、その時の電極応答電流の値からコレステロール成分の濃度が算出され得る。酵素反応層７及び８における反応は、先に説明した第１実施例と同じなのでここでは、その説明は省略する。
一方、酵素反応層２２を通過する試料液には、リポプロテインリパーゼが溶解し、この酵素により試料液のリポたんぱく中の中性脂肪が分解され、グリセロール及び脂肪酸が生成される。さらに、酵素反応層２２において、試料液中にグリセロールキナーゼが溶解し、この酵素とＡＴＰとによりグリセロール−３−リン酸及びＡＤＰが生成される。さらに、グリセロリン酸オキシダーゼが、グリセロール−３−リン酸を酸化すると共に、試料液中に溶解したフェリシアンイオンを還元してジヒドロキシアセトン−３−リン酸及びフェロシアンイオンを生成する。この酵素反応層２２では、前記したようにリポプロテインリパーゼによりリポ蛋白中の中性脂肪から生成されたグリセロールが含まれているので、ここで生成されるフェロシアンイオンの値は、遊離グリセロールと中性脂肪由来のグリセロールとの両方から得られた値になる。
他方、酵素反応層２３を通過する試料液には、グリセロールキナーゼ及びグリセロリン酸オキシダーゼが溶解し、これらの酵素によりフェロシアンイオンが生成されるが、この酵素反応層２３には、リポプロテインリパーゼが含まれていないので、中性脂肪由来のグリセロールは生成されず、従って、この酵素反応層２３で生成するフェロシアンイオンの量は、遊離グリセロールの量に相当する量となる。
次いで、第３測定極２０及び第４測定極２１と、対極４との間に、適当な電圧をかけ、その時に、第３測定極２０と対極４との間に流れる電極応答電流の値から中性脂肪由来のグリセロール及び遊離グリセロールの合計の濃度が算出され、第４測定極２１と対極４との間に流れる電極応答電流の値から遊離グリセロールの濃度が算出され、これらの差をとり適当な演算処理を施すことにより、中性脂肪濃度を算出することができる。
尚、各酵素反応層７，８，２２，２３、界面活性剤保持層９は、それぞれ、各測定極２，３，２０，２１及び対極４上に載置された後、基板１とカバー１２とで挟まれて固定されているだけなので、各層７，８，２２，２３，９と各極２，３，２０，２１，４とは、完全に一体化しているわけではないが、各極２，３，２０，２１，４に達する試料液中には、界面活性剤が溶解しているので、この界面活性剤が、疎水性の各極２，３，２０，２１，４と試料液との界面に顕著な吸着を生じさせるので、各極２，３，２０，２１，４と、血液との間に気泡の残存はなくなり、各極２，３，２０，２１，４の濡れが一様になり、測定値が安定する。
【００１３】
各層を下記の条件で構成し、下記の人血清１〜６を開口１２ｄより滴下したときのコレステロール並びに中性脂肪の測定結果を図７（ａ）及び（ｂ）に各々示す。

図７の測定結果に示すように試料液１〜６の測定結果は、好適な値を示しており、安定したコレステロール濃度並びに中性脂肪濃度の測定を同時に行うことができることが分かる。
一般的に、健康診断では患者の血液からコレステロール濃度と中性脂肪濃度との両方を測定することが多く、このように、コレステロールと中性脂肪とを同時に測定できるように構成することにより、２度測定する必要がなくなるので診療の効率化を図ることができ、また、検体の量を減らすことができるので患者に与える負担を軽減させることができるようになる。
【００１４】
以上説明したコレステロール測定用センサは、第１実施例及び第２実施例共に、第１測定極２及び第２測定極３を対極４を中心として対称に配置し、さらに、試料液を、第１測定極２と第２測定極３との中間位置に導入できるようにカバー１２の開口１２ｄを形成しているので、第１測定極２と第２測定極３とに到達する試料液を均等にすることができ、これにより、第１測定極２及び第２測定極３の条件を、コレステロールオキシダーゼ以外の部分で同一にすることができるようになり、第１測定極２の値を第２測定極３の値で補正することによる測定の精度をより上げることが可能になる。
また、以上説明したコレステロール測定用センサは、界面活性剤を用いることにより、各処理層を基板と別体に構成することを可能にしており、その結果、各処理層をろ紙で形成できるようにしている。ろ紙で各処理層を形成する場合、一つのろ紙に必要な試薬を保持させた後、そこから、複数個の処理層を切り出して、複数のセンサの製造に用いることができる。このように製造することで、各処理層の条件を合わせやすくなるので、処理層を塗布・乾燥して製造する場合に比べて、センサの性能のバラツキを小さくすることができる。また、このように製造することで、処理層の製造工程と、センサの組み立て工程とを分離することができるので、センサを効率的に製造することができるようになる。さらに、このように各処理層をろ紙で製造することにより、対極上の処理層と測定極上の処理層を分けることができるようになり、その結果、高価なコレステロールオキシダーゼを、必要もないのに対極上に設ける必要がなくなるので、製造コストを安価にすることができる。特に、コレステロールオキシダーゼを媒体としたコレステロールの酸化反応及びフェリシアンイオンの還元反応は遅く、その結果、電気的に、コレステロール濃度を測定するには比較的多くのコレステロールオキシダーゼが必要になるので、上記した効果は、コレステロール測定用センサにおいて顕著に現れる。また、酵素の保持体としてコンジュゲートリリースパッドを用いることにより、酵素量あたりの反応速度は更に向上する。このことは、測定時間の短縮、または測定時間を変化させることなく酵素の使用量を節減することによるコストダウンの手段として有効である。さらにまた、親水性高分子を用いて各処理層を、塗布・乾燥して形成する場合、製造コストの高騰を防ぐために、測定極と対極とに跨って親水性高分子層を形成する必要があるので、上記した実施例のように、測定極を二つ設け、一方の測定極（即ち、第１測定極）にコレステロールオキシダーゼを含む酵素反応層を形成し、他方の測定極（即ち、第２測定極）にコレステロールオキシダーゼを含まない酵素反応層を形成し、二つの測定極間に生じる電流値の差に基づいてコレステロール濃度を測定するように構成するセンサを塗布・乾燥が必要な親水性高分子層を用いて製造する場合には、親水性高分子層を介して一方の測定極上の酵素反応層から、他方の測定極に酵素が混入しないように、二つの測定極上の親水性高分子層を完全に分離する必要がある。そのため、対極と測定極とからなる電極を二つ形成し、その各々に別個に親水性高分子層を形成する必要があるので、上記したコレステロール測定用センサに比べて対極が一つ多くなり、材料費や製造工程が増え、製造コストが高くなるという問題が生じると共に、二つの測定極間の条件を合わせることが難しくなるという問題がある。このような観点からみると、本発明に係るコレステロール測定用センサは、測定極を二つ設けて、各測定極間に生じる電流値の差に基づいて基質濃度を測定するセンサを、従来のバイオセンサに比べて、より、安価に、かつ、精度よく製造することができるよういう効果も奏する。
また、以上説明したセンサは、酵素反応層を測定極上のみに設けることができるように構成し、かつ、酵素反応層の保持体としてコンジュゲートリリースパッドを用いているので、無駄に酵素を使用することなく酵素濃度を高めることができるという効果を奏し、酵素濃度を高めることにより、反応速度をより高めることができるようになるという効果を奏する。
【００１５】
本発明に係るコレステロール測定用センサの構成は上記した実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の概念内で任意に変更することができる。具体的には、上記した第１の実施例では、電子受容体、界面活性剤及び酵素を各処理層に分離しているが、これらは、一つのろ紙に保持させて構成してもよく、また、図８〜図１０に示すようにろ紙に保持される試薬の組合せも任意に決めることができ、さらに、積層順序も任意に変更することができる。
さらに、第１実施例及び第２実施例における第２測定極３上の保持層に、第１測定極２のコレステロールオキシダーゼに相当する量のたんぱく質を保持させることにより、また、第２実施例における第４測定極２１上に、第３測定極２０のリポプロテインリパーゼに相当する量のたんぱく質を保持させることにより、第２測定極３上の保持層にコレステロールオキシダーゼがないことによる第１測定極２との試料反応時の粘性の違いや、第４測定極２０上にリポプロテインリパーゼがないことによる第３測定極２０との試料反応時の粘性の違いを補完してもよく、このように構成することにより測定精度はさらに高まる。
【００１６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明に係るコレステロール測定用センサは、絶縁性基板上に少なくとも測定極と対極とを有する電極系を形成し、酵素、電子受容体及び試料液の反応時の物質濃度変化を電気化学的に前記電極系で検知し前記試料液の基質濃度を測定するセンサにおいて、前記測定極上に、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、界面活性剤及び電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置して第１層を形成し、前記対極上に、界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置して第２層を形成しているので、測定精度を落とすことなく、安価に簡単に製造することができ、かつ、品質のバラツキが極めて少ないコレステロール測定用センサを提供することが可能になるという効果を奏する。
また、前記第１層を、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼを保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された酵素反応層と、界面活性剤及び電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された界面活性剤及び電子受容体保持層とで形成することにより、測定極と対極とに共通に必要な界面活性剤を保持する処理層を一体化することが可能になり、製造及び組み立て工程をより簡略化することができるようになるという効果を奏する。
さらに、前記酵素反応層に、コンジュゲートリリースパッドを用いることにより、酵素反応層に試料液が導入された際、試薬を速やかに遊離し、反応終了までの時間が大幅に短縮するという効果を奏する。
また、絶縁性基板上の前記対極を挟んで前記測定極と対応する位置に第２測定極を設け、前記第２測定上に、コレステロールオキシダーゼを含有していないこと以外は、前記測定極と同一の条件の層、即ち、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、界面活性剤及び電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された層を、前記測定極と同一条件で設けることで、コレステロール濃度に依存する目的の電流のみを正確に測定することが可能になり、より測定精度を向上させることができるようになるという効果を奏する。
さらに、試料液を前記測定極と前記第２測定極との中間位置に導入できるように、試料液の滴下位置を制限可能な案内手段を設けることで、使用者が試料液の滴下位置を意識する必要がなくなるので、測定が簡単に行えるようになるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明に係るコレステロール測定用センサの第一実施例の展開図
【図２】 図１に示したコレステロール測定用センサの組立完成品の部分断面図
【図３】 図１に示したコレステロール測定用センサの中央横断面図
【図４】 カバー１２を底面から見た斜視図
【図５】 図１〜図４に示したコレステロール測定用センサを用いたコレステロール濃度の測定結果を示すグラフである。
【図６】 本発明に係るコレステロール測定用センサの構造を適用したコレステロール及び中性脂肪測定用センサの展開図である。
【図７】 （ａ）は図６に示したコレステロール測定用センサを用いたコレステロール濃度の測定結果を示すグラフであり、（ｂ）は同センサを用いた中性脂肪濃度の測定結果を示すグラフである。
【図８】 本発明に係るコレステロール測定用センサの各処理層の組合せの別の実施例を示す概略図
【図９】 本発明に係るコレステロール測定用センサの各処理層の組合せの別の実施例を示す概略図
【図１０】 本発明に係るコレステロール測定用センサの各処理層の組合せの別の実施例を示す概略図
【符号の説明】
１ 絶縁性基板
２ 第１測定極（コレステロール測定用）
２ａ 測定部分
２ｂ 端子部分
３ 第２測定極（コレステロール測定用）
３ａ 測定部分
３ｂ 端子部分
４ 対極
４ａ 測定部分
４ｂ 端子部分
５ 絶縁層
６ 保持枠
６ａ 保持孔（酵素反応層７の保持用）
６ｂ 保持孔（酵素反応層８の保持用）
６ｃ 保持孔（界面活性剤保持層９の保持用）
（６ｄ 保持孔（酵素反応層２２の保持用））
（６ｅ 保持孔（酵素反応層２３の保持用））
７ 酵素反応層（コレステロール測定用の第１測定極用）
８ 酵素反応層（コレステロール測定用の第２測定極用）
９ 界面活性剤保持層
１０ 界面活性剤及び電子受容体保持層
１２ カバー
１２ａ 上壁
１２ｂ 上壁の内面
１２ｃ 凹部
１２ｄ 開口（試料液滴下用）
１２ｅ 前壁
１２ｆ 切り欠き
２０ 第３測定極（中性脂肪測定用）
２０ａ 測定部分
２０ｂ 端子部分
２１ 第４測定極（中性脂肪測定用）
２１ａ 測定部分
２１ｂ 端子部分
２２ 酵素反応層（中性脂肪測定用）
２３ 酵素反応層（中性脂肪測定用）
２４ 血球分離膜

Claims (10)

1. 絶縁性基板上に少なくとも測定極と対極とを有する電極系を形成し、
   酵素、電子受容体及び試料液の反応時の物質濃度変化を電気化学的に前記電極系で検知し前記試料液の基質濃度を測定するセンサにおいて、
   前記測定極上に、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、界面活性剤及び電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置して第１層を形成し、
   前記対極上に、界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置して第２層を形成した
   ことを特徴とするコレステロール測定用センサ。
2. 前記第１層が、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼを保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された酵素反応層と、界面活性剤及び電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された界面活性剤及び電子受容体保持層とから形成されている
   ことを特徴とする請求項１に記載のセンサ。
3. 前記酵素反応層を構成する保持体をコンジュゲートリリースパッドで形成した
   ことを特徴とする請求項２に記載のセンサ。
4. 測定極上に前記酵素反応層を、前記酵素反応層上に前記界面活性剤及び電子受容体保持層を順次積層してなる
   ことを特徴とする請求項２又は３に記載のセンサ。
5. 前記界面活性剤及び電子受容体保持層と前記第２層とが一つの保持体で形成されている
   ことを特徴とする請求項４に記載のセンサ。
6. 前記第１層が、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された酵素及び界面活性剤保持層と、電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された電子受容体保持層とから形成されている
   ことを特徴とする請求項１に記載のセンサ。
7. 前記第１層が、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼを保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された酵素反応層と、
   界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された界面活性剤保持層と、
   電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された電子受容体保持層とから形成されている
   ことを特徴とする請求項１に記載のセンサ。
8. 前記電子受容体が、フェリシアンイオンである
   ことを特徴とする請求項１〜７の何れか一項に記載のセンサ。
9. 絶縁性基板上の前記対極を挟んで前記測定極と対応する位置に第２測定極を設け、
   前記第２測定上に、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、界面活性剤及び電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された層を設けた
   ことを特徴とする請求項１〜８の何れか一項に記載のセンサ。
10. 試料液を前記測定極と前記第２測定極との中間位置に導入できるように、試料液の滴下位置を制限可能な案内手段を設けた
    ことを特徴とする請求項９に記載のセンサ。

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