CN117138022A - 自组装肽组合物 - Google Patents

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CN117138022A CN202310893326.0A CN202310893326A CN117138022A CN 117138022 A CN117138022 A CN 117138022A CN 202310893326 A CN202310893326 A CN 202310893326A CN 117138022 A CN117138022 A CN 117138022A
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K·吉尔伯特
M·梅赫塔
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Abstract

本申请提供了具有特定属性(例如，肽成分、肽浓度、pH、离子强度[包括盐的成分和/或浓度]等)的显示出特别有用的材料特性的肽组合物(例如，自组装肽的组合物)。本申请还提供了用于选择和/或配制用于特定环境下的特定的肽组合物的技术。在一些实施方案中，提供的肽组合物具有升高的约2.5到约3.5范围内的pH和/或高于所述相同的肽以相同浓度存在于水中形成的相应组合物的离子强度，但是低于所述肽的临界盐点(例如，使得所述组合物不混浊)。

Description

自组装肽组合物
对相关申请的交叉引用
本申请是申请号为201580024226.8、申请日为2015年3月10日、发明名称为“自组装肽组合物”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为PCT/US2015/019796的国家阶段申请，该国际申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2014年3月10日提交的美国临时申请61/950,529的优先权。所述申请的全部内容在此通过引用并入本申请。
背景技术
具有自组装成凝胶结构的能力的肽剂在治疗和研究领域具有多种多样的用途。可以从三维矩阵医药技术公司(3-D Matrix Medical Technology)的和PuraMatrix商品名下市售得到这样一种肽试剂，例如，合成的具有精氨酸、丙氨酸和天冬氨酸重复序列的具有16个氨基酸的多肽(即，RADARADARADARADA[SEQ ID NO:1]，也称为“RADA16”)，并且该肽试剂已被证实能广泛用于实验和临床应用，包括细胞培养、药物递送、加速的软骨和骨生长，以及CNS、软组织和心肌的再生，并且进一步用作能与一种或多种可检测试剂、生物活性剂、细胞和/或细胞成分相关联的基质、支架或者系链。
发明概述
除其他事项外，本申请还提供了某些肽组合物(特别是某些自组装肽剂的组合物)及其相关技术。在一些实施方案中，这样的组合物可以是或者包括溶液。在一些实施方案中，这样的组合物可以是或者包括凝胶。在一些实施方案中，这样的组合物可以是或者包括固体的(例如，干燥的/冻干的)肽。
例如，本申请证实特定的肽组合物(即，具有特定浓度、离子强度、pH、粘度和/或其它特征的肽组合物)具有有用的和/或令人惊讶的属性(例如，凝胶化或自组装动力学[例如，凝胶化速率和/或肽自组装的速率和可逆性]、刚度[例如，经由储能模量进行评估的刚度]，和/或其它机械性质)。在一些实施方案中，本申请证实某些这样的组合物在特定环境下(例如，在某些体内或体外应用中)具有特定的用途。
此外，本申请提供了允许选择、设计和/或配制特定的用于某些环境或者应用中的肽组合物的指导方针。
本申请确立了某些阳离子和阴离子与自组装肽剂相互作用的程度，以及这种相互作用如何进一步改变肽组合物的某些材料(例如，流变性的)特性(例如，提升机械刚度和/或粘度)。此外，本发明进一步确立了这样的相互作用如何影响除其他事项外凝胶化动力学，在发生变形(例如，机械性扰动或者其他干扰)后凝胶态(例如，胶凝化和/或凝胶特性恢复的时间和/或程度)的恢复。
本文描述的研究已经用某些现有的自组装肽技术明确了各种问题的来源，并且进而定义了针对肽组合物技术的特定应用特别有用的和/或必要的属性和/或特征。
在一些实施方案中，提供的组合物中所包括的肽是自组装肽。在一些实施方案中，提供的组合物中所包括的肽是两性肽。在一些实施方案中，提供的组合物中所包括的肽具有这样的氨基酸序列：其特征在于具有交替的亲水性和疏水性氨基酸的至少一个延伸结构(例如，具有至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个等氨基酸)。在一些实施方案中，提供的组合物中所包括的肽具有包括一个或多个Arg-Ala-Asp-Ala(RADA)重复的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供的组合物中所包括的肽具有包括或者由Lys-Leu-Asp-Leu(KLDL)序列的重复单元组成的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供的组合物中所包括的肽具有包括或者由Ile-Glu-Ile-Lys(IEIK)序列的重复单元组成的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽可以是IEIK13、KLD12、或者RADA16。在一些实施方案中，这些肽的组合物可以相对于具有不同的(例如，较低的)pH水平和/或离子强度的适当的参照组合物具有增强的特性。
在较温和的pH水平时，肽组合物可以具有更硬的流变性质，使得其适合更广泛的应用范围。环境pH变化到超过4.0也可以对肽组合物的凝胶动力学产生有利影响。在一些实施方案中，所述升高的pH可以是可能发生在将所述肽组合物置入体内时的生理性pH。
根据一个或多个方面，可以通过保持升高的离子强度增强某些肽组合物(包括但不限于IEIK13，KLD12和RADA16)的流变性质。在一些实施方案中，所述离子强度可以比临界离子强度低。在一些实施方案中，肽组合物可以溶解于含盐的水中而非纯水中。在一些实施方案中，所述离子强度可以比其临界离子强度低。
在一些实施方案中，升高的离子强度可以对肽组合物的刚度和/或凝胶化动力学产生有利影响，使得其适于更广泛的应用范围。在一些实施方案中，升高的离子强度可以是可能发生在将肽组合物置入体内时的生理性离子强度。
根据一个或多个方面，可以通过保持其pH水平为约3.5或更小，并且同时将其盐浓度保持为低于其临界离子强度水平(即无沉淀)，来增强某些肽组合物(包括但不限于IEIK13，KLD12和RADA16)的性质。
根据一个或多个方面，可以在包括外观、pH水平、离子强度水平、凝胶化动力学、流变性能和细胞存活力等性能方面对自组装肽(例如，IEIK13、KLD12和RADA16)进行表征，以优化肽制剂用于各种应用。在基本凝胶化性能和其他特征方面，可以将IEIK13和KLD12表征为与RADA16相似的肽组合物。
在一些实施方案中，肽可以具有约6个到约20个氨基酸范围内的长度以及疏水性氨基酸和亲水性氨基酸交替的氨基酸序列。
在一些实施方案中，肽组合物可以是溶液、凝胶、或其任意组合。
在一些实施方案中，肽组合物可以是至少0.05％的浓度。在一些实施方案中，肽组合物可以以低于3％的浓度存在。
在一些实施方案中，肽组合物可以具有约2.5到约4.0范围内的pH，或者约3.0到约4.0范围内的pH。在一些实施方案中，可以用选自下组的溶液达到肽组合物的pH：氢氧化钠或氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、乙酸钠、硫化钠、DMEM(Dulbecco氏改良的Eagle培养基)和PBS(磷酸缓冲盐)。
在一些实施方案中，肽组合物的离子强度可以是约0.0001M到约1.5M。在一些实施方案中，可以通过混合常见盐，例如，NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、CaSO4、DPBS(Dulbecco氏磷酸缓冲盐，10X)，来调整肽组合物的离子强度。在一些实施方案中，可以通过混合常见盐来调整肽组合物的离子强度，其中一种或多种常见盐由一种或多种形成盐的阳离子和一种或多种形成盐的阴离子组成，其中所述形成盐的阳离子选自下组：铵、钙、铁、镁、钾、吡啶、季铵和钠，其中所述形成盐的阴离子选自下组：乙酸、碳酸、氯、柠檬酸、氰、氟、硝酸、亚硝酸和磷酸。
在一些实施方案中，肽组合物可以具有约1到约10000Pa·S范围内的粘度。在一些实施方案中，肽组合物可以具有约50到约2500Pa范围内的储能模量。
在一些实施方案中，一种选择用于在特定的体内部位进行应用的肽组合物的方法，所述方法包括以下步骤：确定所述肽组合物的一种或多种参数，所述参数选自下组：储能模量、粘度、胶凝化时间、恢复的时间和/或程度等；将所确定的参数与用于各种应用的规格进行比较；根据所述比较选择肽组合物；以及将所选择的肽组合物施用到所述部位上。
在一些具体的实施方案中，本申请提供了液体肽组合物，所述液体肽组合物可以，例如，包括具有约6个到约20个氨基酸范围内的长度的肽以及疏水氨基酸和亲水氨基酸交替的氨基酸序列，并且可以具有以下特征：(ⅰ)其在室温下具有约1Pa·s到约500,000Pa·s范围内的粘度；(ⅱ)其在1弧度/秒的频率和1Pa的振荡压力下具有约1Pa到约5000Pa范围内的储能模量；和/或(iii)当其暴露于/维持在约2.5到约4.0范围内的pH下和/或约0.0001M到约1.5M范围内的离子强度时，在约0s到约30s的时段内形成凝胶。在一些实施方案中，这样的组合物是水性组合物。
此外，在一些具体的实施方案中，本申请提供了设计、选择和或生产特别适用于某些特定环境的肽组合物的方法。在一些这样的实施方案中，所述某些特定的环境是或者包括应用到特定的体内部位。在一些实施方案中，这种所提供的方法可以包括，例如：(i)确定一种或多种参数，所述参数选自下组：储能模量、粘度、胶凝化时间、剪切稀化特性、肽纳米纤维重组装时间；和/或本文所述的适合应用到所述特定体内部位的一种或多种参数；和(ii)根据本文提供的指导，设计、选择和或生产以这样的参数表征的肽组合物。
或者或另外，在一些具体的实施方案中，本申请提供了选择特定的肽组合物的方法，用于例如施用到某些体内部位上；示例性的这种方法可以包括以下步骤：(i)确定肽组合物的一种或多种参数，所述参数选自下组：储能模量、粘度、胶凝化时间、剪切稀化特性、肽纳米纤维重组装时间，其是本文所描述的肽组合物参数和/或一种或多种其他参数；(ii)将所确定的所述一个或多个参数与一组被确定为适合应用到所述特定体内部位的特征进行比较；(iii)根据所述比较选择所述肽组合物；以及(iv)将所选择的肽组合物施用到所述部位上。
附图简述
参照下面描述的附图和权利要求，可以更好地理解本发明的目的和特点。
图1显示了肽组合物在PBS缓冲液中示例性的凝胶形成。以0.5％、1.0％、1.5％、2.0％和2.5％等不同的浓度铺板RADA16、IEIK13和KLD12。RADA16、IEIK13和KLD在所有浓度下均凝胶化。
图2A和2B显示了RADA16的示例性流变性质。图2A描绘了在1Pa和10弧度/秒下执行的压力扫描试验。图2B显示了测得的作为RADA16的浓度函数的储能模量。RADA16组合物的储能模量可以与其浓度呈线性关系。
图3A和3B显示了IEIK13的示例性流变性质。图3A描绘了在1Pa和10弧度/秒下执行的压力扫描试验。图3B显示了测得的作为IEIK的浓度函数的储能模量。IEIK13组合物的储能模量可以与其浓度呈线性关系。
图4A和4B显示了KLD12的示例性流变性质。图4A描绘了在1Pa和10弧度/秒下执行的压力扫描试验。图4B显示了测得的作为KLD12的浓度函数的储能模量。KLD12组合物的储能模量可以与其浓度呈线性关系。
图5A和5B的柱状图显示了DMEM(Dulbecco氏改良的Eagle培养基)处理1％的肽组合物的效应。图5A描绘了在所述DMEM处理肽组合物之前或者之后的储能模量数据(在1Pa和10弧度/秒条件下执行)。图5B显示了在所述DMEM处理之后储能模量的倍数升高。
图6A是RADA16和DMEM混合物(1:1的体积比)的图片。所述混合物为流状，浑浊。图6B显示了在离心之后的所述混合物。RADA16(即，在离心管底部的半透明积累物)从混合物中沉淀了下来。
图7显示了RADA16、KLD12和IEIK13组合物在pH2-3，以及在生理pH(DMEM)条件下的纳米结构。虽然DMEM处理可能会形成较硬的组合物，但是混合DMEM会使肽沉淀下来。
图8显示了在10弧度/秒下1％的KLD12组合物在pH＝2.0和3.4时的示例性压力扫描试验。图9显示了在10弧度/秒下1％的IEIK13组合物在pH＝2.1和3.7时的示例性压力扫描试验。图10显示了在10弧度/秒下1％的RADA16组合物在pH＝2.5和3.4时的示例性压力扫描试验。肽组合物的储能模量随pH值的升高而升高。
图11A和11B显示了RADA16在1Pa时的示例性频率扫描试验。图11A是在pH 2.5和3.4时1％RADA16的测量值。图11B是在pH 2.5和3.4时2.5％RADA16的测量值。
图12是2.5％RADA16在pH3.2、3.4、3.6和4.0时的图片。所述组合物在pH值为约3.5时是澄清的，在pH＝3.6时略为浑浊。所述组合物在pH＝4.0时沉淀。
图13显示了在有或没有剪切压力的条件下，RADA16、KLD12和IEIK13在不同pH水平下的纳米结构和/或重组装。可以通过pH和剪切压力来确定主导的相互作用。
图14-16分别显示了RADA16，IEIK和KLD在选定的浓度下的细胞存活率(mMSC)。*表示细胞存活率显著低于下一左侧柱的细胞存活率(p值<0.05)。#表示细胞存活率显著高于下一左侧柱的细胞存活率(p值<0.05)。
图17A显示了IEIK13的结构。图17B显示了IEIK13在DMEM处理之前和之后的SEM图像。在DMEM处理之后的IEIK13纤维会比在DMEM处理之前的纤维更厚。
图18是储能模量的柱状图，显示了pH对2.5％RADA16的流变性质的影响。在1弧度/秒条件下测量了储能模量。
图19是储能模量的柱状图，显示了pH对1.5％IEIK13的流变性质的影响。在1弧度/秒条件下测量了储能模量。
图20A显示了1％IEIK13在pH＝2.1、3.0、3.3和3.5时的示例性流动粘度测试。图20B是在0.003升/秒的剪切速率下的示例性粘度测量的柱状图。
图21A，21B，21C和21D分别显示了在pH＝2.1、3.0、3.3和3.5时在向1％IEIK13施加高剪切压力之后的作为时间函数的储能模量的测量值。水平线指示1％IEIK13的原始储能模量。
图22A和22B的柱状图显示了在pH 2.2和3.4时的作为RADA16的浓度函数的储能模量。图22A测量于DMEM处理之前。图22B测量于DMEM处理之后。
图23A和23B的柱状图显示了在pH 2.3和3.4时作为IEIK的浓度函数的储能模量。图23A测量于DMEM处理之前。图23B测量于DMEM处理之后。
图24和25显示了作为时间函数的储能模量的测量值。图24包括了2.5％RADA16在pH 2.2、2.6、2.8、3.1和3.4时的数据。图25包括了1.5％IEIK13在pH 2.3、2.6、2.9和3.2时的数据。在1弧度/秒以及在1Pa的条件下，用20mm平板以500μm的间隙距离执行了时间扫描测试。在时间扫描测试过程中，将DMEM加入到包围所述测量板的腔室中，以在时间＝0时浸泡肽。
图26显示了在低盐条件或者高盐条件(即超过临界离子强度)下肽的纳米结构和/或重组。盐溶液的应用方法(处理或者混合)会改变所述纳米结构。用盐溶液处理肽会形成硬凝胶，而将盐溶液与肽混合会引起相分离。
图27-29显示了在1Pa条件下从1弧度/秒到10弧度/秒的示例性频率扫描测试。图27为在有或没有NaCl溶液(0.2M离子强度)时对1％KLD12的测量。图28为在有或没有NaCl溶液(0.02M离子强度)时对1％IEIK13的测量。图29为在有或没有NaCl溶液(0.7M离子强度)时对1％RADA16的测量。
图30是在1弧度/秒时的储能模量的柱状图。将1.0％RADA16暴露于NaCl，所述NaCl的离子强度在0到1.0M之间变化。
图31是在1弧度/秒时的储能模量的柱状图。将1.0％IEIK13暴露于NaCl，所述NaCl的离子强度在0到0.04M之间变化。
图32A显示了在NaCl离子强度为0、0.01和0.02M时1％IEIK13的流动粘度测试。图32B的柱状图显示了在剪切速率为0.003l/秒时的粘度。
图33A、33B和33C显示了在NaCl离子强度为0、0.01和0.02时分别向1％IEIK13施加高剪切压力后作为时间函数测量的储能模量。水平线指示每种1％IEIK13组合物的原始储能模量。
图34显示了在1Pa时1％RADA16在DMEM处理之前或者之后作为NaCl离子强度的函数的示例性储能模量。
图35显示了在1Pa时1％IEIK13在DMEM处理之前或者之后作为NaCl离子强度的函数的示例性储能模量。
图36显示了在存在选定的盐(NaCl、KCl、MgCl2和CaCl2)的条件下，1％RADA16的示例性储能模量。*表示G'显著高于对照(无盐)(P<0.05)。#表示G'显著低于NaCl离子强度为0.15M条件下的1％RADA16(P<0.05)。
图37显示了在DMEM处理之后，1％RADA16在存在选定的盐(NaCl、KCl、MgCl2和CaCl2)的条件下的示例性储能模量。*表示G'显著高于对照(无盐，在DMEM处理之后)(P<0.05)。
图38显示了在生理盐水缓冲液处理之后，1.5％IEIK13、1.5％KLD12和2.5％RADA16示例性的作为时间函数的储能模量测量值。在1弧度/秒以及在1Pa的条件下，用20mm平板以500μm的间隙距离执行了时间扫描测试。在时间扫描测试过程中，将生理盐水缓冲液加入到包围测量板的腔室中，以在时间＝0时浸泡肽。
图39显示了RADA16、KLD12和IEIK13在某些离子强度下的纳米结构和/或重组装。高剪切压力会改变所述纳米结构和/或重组装。
图40显示了2.5％RADA16在1弧度/秒时的储能模量。NaCl的加入以及pH的升高提升了2.5％RADA16的储能模量。
图41A、41B、41C和41D显示了如实施例4和7所述的用不同的盐和/或盐浓度制备肽组合物所用的步骤。普通技术人员将理解，可以利用类似的策略来例如分析具有不同的pH、肽浓度等的肽组合物。在图41A中，用玻璃小瓶放置肽粉末。在图41B中，首先将肽粉末以选定的终体积比溶于去离子水中；根据需要，利用涡旋震荡和/或超声处理来实现或者确保完全溶解。在图41C中，在顶部加入浓缩的盐溶液，其用量和浓度依赖于所用去离子水的体积。在图41D中，通过例如涡旋震荡混合所述溶液。
图42A、42B、42C、42D、42E、42F和42G分别为0.5％RADA16与0、0.005、0.05、0.125、0.250、0.500和1M CaCl2的混合液的直立图和倒置图。图42E显示了最佳的并且功能完整的凝胶。图42F显示了半功能性凝胶。图42G显示了非功能性凝胶。
图43显示了0.5％RADA16与0.125、0.250和0.500M浓度下的NaCl、KCl和CaCl2混合的储能模量测量值。
图44显示了2.5％RADA16以及与0.125M CaCl2混合的2.5％RADA16的储能模量测量值。
图45A和45B显示了与0.125、0.250和0.500MCaCl2溶液混合的RADA16在机械扰动之后的储能模量测量值。*表示对照样本与扰动样本显著不同。
图46显示了经CaCl2和CaSO4处理的2.5％RADA16作为时间函数的储能模量测量值。
图47A是IEIK13以及经靛蓝胭脂红处理的IEIK13的示例性流变数据。图47B显示了IEIK13以及经靛蓝胭脂红处理的IEIK13的刚度。图47C显示了RADA16以及经林格氏液处理的RADA16的刚度。图47D是经林格氏液处理的RADA16的倒置图。图47E是IEIK13以及经靛蓝胭脂红处理的IEIK13的倒置图。图47F是经靛蓝胭脂红处理的IEIK13置于注射器内的图片。
图48是2.5％RADA16以及经NaCl处理的2.5％RADA16的图，其显示了肺爆裂压力的升高。
发明定义
本文使用的术语“试剂”可以指化合物或者任意化学类别的实体，包括例如，多肽、核酸、糖类、脂质、小分子、金属、或其组合。在一些实施方案中，试剂是或者包括天然产物，天然产物是指发现于自然界和/或从自然界中获得。在一些实施方案中，试剂是或者包括一个或多个人造实体，其是由人工设计、改造和/或生产的和/或在自然界中未被发现。在一些实施方案中，可以以分离的或者纯化的形式使用试剂；在一些实施方案中，可以以粗品形式使用试剂。在一些实施方案中，以集合或者试剂库形式提供潜在的试剂，例如可以进行筛选以鉴定或者表征其中的活性剂的试剂。根据本发明可以使用的一些试剂的具体实施方案包括小分子、抗体、抗体片段、适体、核酸(例如，siRNA、shRNA、DNA/RNA杂交体、反义寡核苷酸、核酶)、肽、肽模拟物等。在一些实施方案中，试剂是聚合物或者包括聚合物。在一些实施方案中，试剂不是聚合物和/或基本上不含任何聚合物。在一些实施方案中，试剂包含至少一个聚合部分。在一些实施方案中，试剂缺乏或者基本上不含任何聚合部分。
本文使用的术语“氨基酸”在其最广泛的意义上是指任何可以通过例如形成一个或多个肽键并入多肽链的化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有通式结构H2N–C(H)(R)–COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指在天然存在的肽中常见的20种标准L-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的、无论是合成制备的还是从天然来源获得的任意氨基酸。在一些实施方案中，与上述通式结构相比，氨基酸(包括多肽中的羧基端和/或氨基端的氨基酸)可以含有结构修饰。例如，在一些实施方案中，相较于通式结构，可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化和/或取代来修饰氨基酸。在一些实施方案中，相较于包含相同的未修饰氨基酸的多肽，这样的修饰可以，例如，改变含有经修饰氨基酸的多肽的循环半衰期。在一些实施方案中，相较于包含相同的未修饰氨基酸的多肽，此类修饰并不显著改变包含经修饰氨基酸的多肽的相关活性。从上下文中可以清楚地看出，在一些实施方案中，术语“氨基酸”是指游离氨基酸；在一些实施方案中其是指多肽的氨基酸残基。
本文使用的术语“约”或者“大约”，当用于一个或多个目标值时是指接近于所陈述的基准值的值。在某些实施方案中，除非另有说明或者从上下文明显看出(除非其中这些数字会超过可能值的100％)，否则术语“约”或者“大约”是指以任一方向(大于或小于)落在所陈述的基准值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者更低范围内的值的范围。
本文使用的术语“关联的”是指如果一个事件或实体的存在、水平和/或形式与另一个事件或实体相关，那么所述两个事件或实体是彼此“关联的”。例如，如果特定实体(例如，多肽、基因特征、代谢物等)的存在、水平和/或形式与特定的疾病、病症或病情的发生和/或易感性(例如，在相关人群中)相关，那么认为其与所述疾病、病症或病情是关联的。在一些实施方案中，如果两个或多个实体直接或间接地相互作用使得彼此间是和/或保持物理性接近，那么其彼此是物理性“关联的”。在一些实施方案中，彼此间物理性关联的两个或多个实体彼此间共价连接；在一些实施方案中，彼此间物理性关联的两个或多个实体彼此间并非共价连接，而是通过例如氢键、范德华相互作用、疏水性相互作用、磁力、及其组合非共价关联。
本文使用的术语“相当的”用来描述两个(或多个)条件组、环境组、个人组或者群体组，其彼此足够相似使得允许对所得到的结果或者所观察到的现象进行比较。在一些实施方案中，相当的条件组、环境组、个人组或者群体组的特征在于具有多个基本相同的特点以及一个或者少数不同的特点。本领域普通技术人员将理解，当环境组、个人组或者群体组的特征在于具有足够数量和类型的基本相同的特点以保证得到合理的结论：“即在不同环境组、个人组或者群体组下或者用不同环境组、个人组或者群体组所得到的结果或者所观察到的现象的差异是由那些不同的特点的变化引起的或者指示那些不同的特点的变化”时，多组环境、个人或者群体是彼此相当的。本领域技术人员将理解，本文中所用的相对性语言(例如，增强的，活化的，减少的，抑制的等)通常是指在相当的条件下进行的比较。)
本文描述的某些方法包括“确定”的步骤。本领域普通技术人员在阅读本说明书时将理解，这种“确定”可以利用或者通过使用本领域技术人员已知的各种技术中的任一种来实现，包括例如本文中明确提到的具体技术。在一些实施方案中，确定涉及操作物理样品。在一些实施方案中，确定涉及考虑和/或处理数据或信息，例如利用计算机或者其他适合执行相关分析的处理元件。在一些实施方案中，确定涉及从来源接收相关信息和/或材料。在一些实施方案中，确定涉及将样本或实体的一个或多个特征与相当的参照物进行比较。
本文使用的术语“凝胶”是指粘弹性材料，其流变性质将其与溶液、固体等区分开来。在一些实施方案中，如果组合物的储能模量(G′)大于其模量(G″)，则认为其是凝胶。在一些实施方案中，如果溶液中有化学或物理交联网络，则认为组合物是凝胶，其与粘稠溶液中的缠结分子有区别。
本文使用的术语“体外”是指发生在人工环境中(例如，在试管或者反应器中，在细胞培养物中等)而非多细胞生物体中的事件。
本文使用的术语“体内”是指发生在多细胞生物体(例如人和非人动物)中的事件。在基于细胞的系统的背景下，所述术语可以用于表示发生在活细胞(而不是例如体外系统)中的事件。
本文使用的术语“肽”是指通常相对较短的多肽，例如具有小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸、或者小于10个氨基酸的长度。
本文使用的术语“多肽”是指氨基酸的任意聚合链。在一些实施方案中，多肽具有在自然界中存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有在自然界中不存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有被改造过的氨基酸序列，体现在其通过人工而被设计和/或生产。在一些实施方案中，多肽可以包括天然氨基酸、非天然氨基酸、或两者，或者由天然氨基酸、非天然氨基酸、或两者组成。在一些实施方案中，多肽可以仅包括或者仅由天然氨基酸或者非天然氨基酸组成。在一些实施方案中，多肽可以包括D-氨基酸、L-氨基酸、或者两者。在一些实施方案中，多肽可以仅包括D-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可以仅包括L-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可以包括一个或多个侧基或者其他修饰，例如，修饰或者连接到多肽N末端处、多肽C末端处、或其任意组合的一个或多个氨基酸侧链。在一些实施方案中，这种侧基或者修饰可以选自下组：乙酰化、酰胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等，包括其组合。在一些实施方案中，多肽可以是环状的，和/或可以包括环状部分。在一些实施方案中，多肽不是环状的和/或不包括任何环状部分。在一些实施方案中，多肽是线状的。在一些实施方案中，多肽可以是或者包括装订多肽。在一些实施方案中，可将术语“多肽”附加到参照多肽的名称、活性、或结构之后；在这种情况下，其在本文中是指共享相关活性或结构的多肽，并且因此可被认为是同一种类多肽或者是多肽同一家族的成员。对于每个这样的种类，本说明书提供了和/或本领域技术人员将意识到此种类内的氨基酸序列和/或功能已知的示例性多肽；在一些实施方案中，这样的示例性多肽是所述多肽种类或家族的参照多肽。在一些实施方案中，多肽种类或家族的成员显示与所述种类的参照多肽具有显著序列同源性或者同一性、共享常见的序列基序(例如，特征性序列元件)、和/或共享常见的活性(在一些实施方案中以相当的水平或者在指定的范围内共享)；在一些实施方案中与所述类内的所有多肽共享)。例如，在一些实施方案中，成员多肽显示与参照多肽整体上具有至少约30-40％，并且通常大于约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更高的序列同源性或同一性，和/或包括至少一个显示非常高的序列同一性(通常大于90％或者甚至95％、96％、97％、98％、或者99％)的区域(例如，在某些实施方案中可以是或者包括特征性序列元件的保守区域)。这样的保守区域通常包括至少3-4个并且常达20个或者更多个氨基酸；在一些实施方案中，保守区域包括至少一个具有至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或者更多个连续氨基酸的延伸结构。在一些实施方案中，有用的多肽可以包括或者由亲本多肽的片段组成。在一些实施方案中，有用的多肽可以包括或者由多个片段组成，所述片段来自同一亲本多肽并且相对于目的多肽彼此之间的空间排列不同(例如，在所述亲本中直接连接的片段在目的多肽中可以在空间上分离，或者反之亦然，和/或相对于亲本而言，在目的多肽中片段可以以不同的顺序存在)，使得所述目的多肽是其亲本多肽的衍生物。
本文使用的术语“参照物”描述了相对其进行比较的标准或对照物。例如，在一些实施方案中，将目的试剂、目的动物、目的个体、目的群体、目的样本、目的序列或者目的值与参照或对照的试剂、动物、个体、群体、样本、序列或者值进行比较。在一些实施方案中，基本上与目的测试或确定同时测试和/或确定参照物或对照物。在一些实施方案中，参照物或对照是历史参照物或对照，任选地，体现在有形介质中。通常，如本领域技术人员所理解的，在与待评估的那些相当的条件或情况下确定或者表征参照物或者对照。本领域技术人员将理解，当存在足够的相似性时才能证明能够依赖可能的参照物或对照和/或与其做比较。
本文使用的“自组装”用于描述某些多肽，其在合适的条件下会自发地自联成结构，使得例如，含有其的溶液(例如，水溶液)发展出凝胶的特性。在一些实施方案中，在组合物内的单一自组装多肽之间的相互作用是可逆的，使得所述组合物可以在凝胶状态和溶液状态之间可逆地转换。在一些实施方案中，自组装(和/或去组装)对一个或多个环境性触发因素(例如，在pH、温度、离子强度、容量渗透摩尔浓度、渗透压、施加的压力、施加的剪切压力等中的一个或多个的变化)产生应答。在一些实施方案中，自组装多肽的组合物的特征在于当所述多肽处于组装状态时可检测到β片层结构。
实施方案详述
根据一个或多个实施方案，本发明提供了某些肽的制剂，与相同肽的其它制剂相比，其能提供增强的应用和改进的性能。在一些实施方案中，所公开的制剂可以提供不同的或者独特的性质，所述性质可以例如，解决与各种研究和/或临床应用相关的先前未达到的要求。在一些实施方案中，通过与肽的标准制剂或者参照制剂相比提高制剂的pH水平，和/或通过与标准制剂或者参照制剂中的盐的类型和/或量相比，向制剂中添加一种或多种盐，来提供所提供的所述肽制剂的某些所需特征。在一些实施方案中，所提供制剂的特征在于更稳定的水凝胶形成物，和/或本文所述的相对于标准制剂或参照制剂的其他属性。
肽
根据一个或多个实施方案中，肽组合物可以包括具有约6个到约200个氨基酸残基的两亲性多肽。在某些实施方案中，所述多肽可以具有至少约7个氨基酸的长度。在某些实施方案中，所述多肽可具有约7个到约17个氨基酸之间的长度。在某些实施方案中，所述多肽可以具有至少8个氨基酸、至少约12个氨基酸、或者至少约16个氨基酸的长度。
在一些实施方案中，如本领域中所理解的，两亲性多肽是指这样的多肽：其序列同时包括亲水性氨基酸和疏水性氨基酸。在一些实施方案中，这样的亲水性氨基酸和疏水性氨基酸可以交替键合，使得所述肽具有亲水性和疏水性氨基酸交替的氨基酸序列。在一些实施方案中，根据本申请所使用的多肽具有包括或者由Arg-Ala-Asp-Ala(RADA)序列的重复单元组成的氨基酸序列。在一些实施方案中，根据本申请所使用的多肽具有包括或者由Lys-Leu-Asp-Leu(KLDL)序列的重复单元组成的氨基酸序列。在一些实施方案中，根据本申请所使用的多肽具有包括或者由Ile-Glu-Ile-Lys(IEIK)序列的重复单元组成的氨基酸序列。
在一些实施方案中，根据本申请所使用的多肽通常可以是自组装的，和/或在一定条件下可以在水溶液中呈现出β-片层结构。
在一些实施方案中，根据本申请所使用的多肽具有Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala氨基酸序列(即RADA16,又称为[RADA]4；SEQID NO:1)。在一些实施方案中，根据本申请所使用的多肽具有Lys-Leu-Asp-Leu-Lys-Leu-Asp-Leu-Lys-Leu-Asp-Leu氨基酸序列(即KLDL12,又称为[KLDL])3，又称为KLD12；SEQ IDNO:2)。在一些实施方案中，根据本申请所使用的多肽具有Ile-Glu-Ile-Lys-Ile-Glu-Ile-Lys-Ile-Glu-Ile-Lys-Ile氨基酸序列(即IEIK13,又称为(IEIK)3I；SEQ ID NO:3)。
本领域技术人员在阅读本申请时将理解，在本发明的实践中可以替代性地利用各种其他肽中的任一种。例如，在某些实施方案中，在已公开的美国专利申请US2009/0111734A1、已公开的美国专利申请US2008/0032934 A1、已公开的美国专利申请US2014/0038909A1、授权的美国专利US7,846891 B2、授权的美国专利US7,713923 B2、授权的美国专利US5670483 B2中所描述的一种或多种肽，其相关内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，根据本发明所使用的肽具有包括下式之一所代表的序列或者由下式之一所代表的序列组成的氨基酸序列：
((XY)l—(ZY)m)n
式(a)
((YX)l—(YZ)m)n
式(b)
((ZY)l—(XY)m)n
式(c)
((YZ)l—(YX)m)n
式(d)，
其中X代表酸性氨基酸，Y代表疏水性氨基酸以及Z代表碱性氨基酸，并且l、m和n都是整数(n(l+m)<200)，(1≤n≤100))
组合物
在一些实施方案中，根据本发明的肽组合物可以以特定的流变学和/或光学性能为特征。在一些实施方案中，这样的流变性能可以包括凝胶化动力学、可逆组装特性、储能模量、粘度等中的一个或多个。在一些实施方案中，可以测试和/或确定(例如，测量)一种或多种流变性能；在一些实施方案中，可以通过视觉观察来评估一种或多种流变性能。
在一些实施方案中，相关的光学性能可以包括透明度、光学清晰度等中的一种或多种。在一些实施方案中，可以测试和/或确定(例如，测量)一种或多种光学性能；在一些实施方案中，可以通过视觉观察来评估一种或多种光学性能。在一些实施方案中，可以用清澈、略带浑浊、或者浑浊来描述特定组合物的光学清晰度。在一些实施方案中，所提供的组合物是清澈的。
在一些实施方案中，所提供的组合物以特定水平的刚度为特征。在一些实施方案中，通过确定储能模量来评估刚度。本领域技术人员将理解，一般来说，储能模量和刚度正相关；即，更高的储能模量与更高的刚度相关。
在一些实施方案中，所提供的组合物以特定的凝胶化性能(例如，在特定的时间段内特定的凝胶化程度)为特征。在一些实施方案中，所提供的组合物的特征在于在约10秒到约48小时范围内的时间段内基本上完全凝胶化。
在一些实施方案中，所提供的组合物的特征在于凝胶化恢复的特定程度和/或其他材料和/或流变性能。例如，在一些实施方案中，当提供的已经胶凝的组合物受到破坏时，其显示在特定的时间段内(例如，在约10秒到约48小时范围内)重新胶凝的能力，并且形成机械和/或流变性能与原凝胶合理相当的凝胶。
在一些实施方案中，所提供的组合物的特征在于具有支持细胞生长和/或存活的能力。
在一些实施方案中，可以通过，例如，肽成分(例如，氨基酸序列、疏水度等)、肽浓度、pH、离子强度(例如，盐浓度)、离子成分等，及其组合来确定本文所述的和/或利用的肽组合物的一种或多种材料(例如，流变)性能。
肽浓度
根据一个或多个实施方案，可以通过选择肽浓度来控制本文所描述的肽组合物的流变性能。本申请通过选择和/或调整肽浓度，明确了允许选择和/或产生具有特定的所需特性的肽组合物的参数，例如可以特别优选用于所述组合物的特定应用或用途的参数。
例如，本申请另外还证实，对于许多肽来说，组合物刚度基本上随肽浓度线性升高。此外，如本文所述，在超过临界压力水平后，某些肽组合物表现出剪切稀化的属性。此外，本申请证实，根据肽成分的不同在特定的肽浓度下达到的流变性能也不同。例如，发现1.5％KLD12的储能模量与2.5％RADA16的储能模量类似。发现1％IEIK13的储能模量类似于2.5％KLD12的储能模量并且高于2.5％RADA16的储能模量。总体来说，在本实施例中所测试的组合物中，流变强度的排序为IEIK13>KLD12>RADA16，因此当在相同肽浓度的每种情况下时，IEIK13的组合物比KLD12的组合物表现出更强的流变强度，相应地，KLD12的组合物比RADA16的组合物表现出更强的流变强度。
在一些实施方案中，根据本发明所使用的肽组合物的肽浓度是至少0.05％、至少0.25％、至少0.5％、至少0.75％、至少1.0％或者更高。在一些实施方案中，根据本发明所使用的肽组合物的肽浓度小于5％，小于4.5％，小于4％，小于3.5％，小于3％，或者更小。在一些实施方案中，根据本发明所使用的肽组合物的肽浓度在约0.5％到约3％之间的范围内。在一些实施方案中，根据本发明所使用的肽组合物的肽浓度在约0.5％到约2.5％之间的范围内。在一些实施方案中，根据本发明所使用的肽组合物的肽浓度在约1％到约3％之间的范围内。在一些实施方案中，根据本发明所使用的肽组合物的肽浓度在约1％到约2.5％之间的范围内。在一些实施方案中，根据本发明所使用的肽组合物的肽浓度是约0.5％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％或者更高。在一些具体的实施方案中，其中所述肽是RADA16，本发明所述肽组合物中的肽浓度在约0.05％到约10％之间的范围内。
在一些具体的实施方案中，其中所述肽是KLD12，本发明所述肽组合物中的肽浓度在约0.05％到约10％之间的范围内。
在一些具体的实施方案中，其中所述肽是IEIK13，本发明所述肽组合物中的肽浓度在约0.05％到约10％之间的范围内。
pH
本申请另外还证实，pH可以影响肽组合物的性能。如本文所述，优化肽组合物的pH可以提高机械强度，使得肽组合物可用于各种临床应用。本申请的实施例3示出了某些具体实施方案的细节。
根据一个或多个实施方案，所提供的肽组合物可以具有高于(例如，显著高于)相关肽的pI的和/或高于在所述肽溶于水中所得到的pI的pH。在一些实施方案中，可以用pH值来控制肽组合物的性能。例如，在一些实施方案中，在约2.5到约4.0范围内的pH条件下，肽组合物的刚度和/或粘度可以相对于适当的基准组合物(例如，相同的肽以相同的浓度存在于水中时)的刚度和/或粘度有所升高。
在一些实施方案中，肽组合物可以包括肽和溶剂，一般为水溶剂，并且可以通过pH调节剂如碱或酸来调节pH。在一些实施方案中，肽组合物包括肽和缓冲液。
在一些实施方案中，经pH调节的肽组合物可以包括以下一种或多种：氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、乙酸钠、硫化钠、DMEM和/或PBS。
在一些实施方案中，可以使用自动化滴定装置来调节pH。
在一些实施方案中，提供的组合物具有高于(例如，显著高于)相关肽的pI的pH和/或保持在所述pH条件下。在一些实施方案中，提供的组合物具有的pH高于(例如，显著高于)相同浓度下所述相同肽的水溶液的pH和/或保持在该pH条件下。在一些实施方案中，提供的组合物具有的pH低于所述组合物浑浊或者变得浑浊时的pH和/或保持在该pH条件下。
在一些实施方案中，提供的组合物的特征在于pH是或者高于约2.5-4.0；在一些实施方案中，提供的组合物的特征在于pH更接近生理pH。在一些实施方案中，提供的组合物具有约3.0-4.0范围内的pH。在一些实施方案中，提供的组合物具有这样的pH：其是或者高于约2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5或者更高。在一些实施方案中，提供的组合物具有这样的pH：其是或者低于约4.3、约4.2、约4.1、约4.0、约3.9、约3.7、约3.6、约3.5、约3.4、或者更低。
在一些实施方案中，本文所描述的pH升高的组合物(即，pH值是或者高于约2.5的组合物)的特征在于与合适的参照组合物(例如，在相同浓度下相当的相同肽的组合物，并且任选地在不同的pH条件下经相同的盐处理)相比，其具有较大的流变刚度和/或提高的凝胶化性能。在一些实施方案中，pH升高的组合物比相应的具有较低pH的参照组合物具有更广阔的应用范围。
在一些实施方案中，本申请具体表明，在升高的pH 3.5或以下的条件下，IEIK13组合物的刚度会显著升高，而RADA16和KLD12组合物的刚度不会显著升高。在不希望受任何特定理论的束缚的前提下，本申请提出，所述肽组合物在pH为3.5或以下的条件下的不同表现有可能与RADA16和KLD12中天冬氨酸(D)的pKa(pKa＝3.71)以及IEIK13中谷氨酸(E)的pKa(pKa＝4.15)相关。
当pH高于天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)的pKa值时，肽链中的酸性基团大多带负电荷。带负电荷的基团诱导与肽链内带正电荷的基团(即，RADA16中的精氨酸(R)以及IEIK13和KLD12中的赖氨酸(K))产生分子内或者分子间的电荷-电荷吸引性相互作用，以形成更大的聚集体而不形成纳米纤维(即透明粘稠组合物)，所述聚集体为半透明或不透明状(即，高于其浊点)并且提供了可能的相分离。
当pH低于但接近天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)的pKa值时，更为聚集的带负电荷的基团会诱发与带正电荷的基团产生更为强烈的电荷-电荷吸引性相互作用。所述组合物会保持纳米纤维的形成，从而使刚度升高。
具有约3.5的pH的某些特定的示例性肽组合物列于表2中。在本文中被认为是“pH升高的组合物”的这些组合物可以在各种应用中提供改进的性能(例如，相对于pH较低的其他相当的组合物，例如在本文包括在实施例中所描述的相关参照组合物)。可以用升高的pH来增强肽组合物的机械强度和通用性。
Table 2选定的肽组合物在约pH 3.5条件下的代表性配方
根据一个或多个实施方案，pH可能会影响胶凝化动力学(例如，对开始凝胶化的响应时间)。如本文所述，可以评价pH对凝胶化动力学的效应来确定肽组合物的最佳pH。
在一些实施方案中，肽组合物可能在较高的pH条件下更快地胶凝。例如，如本文所述，未经过pH调节的IEIK13组合物显示储能模量瞬时升高，而未经过pH调节的RADA16组合物(pH为2.2)在最初的13秒内不显示储能模量的升高。如图24和25所示，经pH调节，由于快速的凝胶化，IEIK13和RADA16都显示储能模量瞬时升高。
离子强度
本申请表明，离子强度可以改变肽组合物的流变性能。提升肽组合物的离子强度通常可以提高针对各种临床应用的机械性能。例如，如本文所述，可以评估离子强度对肽组合物的性能的效应，来确定本文所述肽组合物的最优离子强度。
在一些实施方案中，在约0.0001M到约1.5M范围内的离子强度下，肽组合物的刚度、粘度和/或凝胶化动力学可能会升高。在一些实施方案中，可以用离子强度来控制肽组合物。
根据一个或多个实施方案，可以用一种或多种常见盐调节肽组合物的离子强度，所述常见盐包括但不限于NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2和CaSO4。常见盐由阳离子和阴离子组成。在一些实施方案中，阳离子可以选自包含以下的组：铵、钙、铁、镁、钾、吡啶盐、季铵和钠。在一些实施方案中，阴离子可以选自包含以下的组：乙酸、碳酸、氯、柠檬酸、氰、氟、硝酸和磷酸。
根据一个或多个实施方案，当离子强度接近于最佳水平(例如，最高刚度)时，需要小心调节一种或多种盐或盐溶液的添加。在一些实施方案中，如果离子强度高于所需离子强度，则可以添加纯水。根据其应用，可以对一种或多种盐或盐溶液的添加进行调节，以将其渗透压调整为低渗、等渗或者高渗。
在一些实施方案中，可以通过例如添加某些盐缓冲溶液调整某些肽组合物的离子强度，例如可以添加NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2和DPBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水，10X)。
在一些实施方案中，提供的组合物包括一种或多种盐，其成分和/或浓度将所述组合物维持在临界离子强度之下，在所述临界离子强度时能观察到肽的物质沉淀。在一些实施方案中，当液体组合物浑浊时(例如，通过目测进行评估)，认为已经发生了物质沉淀。因此，在一些实施方案中，提供的组合物不浑浊，并且具有比浑浊的其他方面相当的组合物(例如，相同肽在相同浓度下组成的组合物)更低的离子强度。
在一些实施方案中，提供的组合物的特征在于相对于适当的参照组合物(例如，相同肽在相同浓度和pH以及不同盐或者相同盐的不同浓度条件下的组合物)具有升高的离子强度。在一些实施方案中，提供的组合物的特征在于具有接近于生理强度的离子强度或者离子强度等于生理强度。在一些实施方案中，本文所描述的组合物的特征在于与具有不同离子强度的适当参照组合物相比具有更强的流变刚度和/或改进的凝胶化性能。在一些实施方案中，提供的组合物比相应的具有不同(例如，更低的)离子强度的参照组合物适用于更广的应用范围。
根据某些具体的实施方案，提供了在盐溶液中的肽组合物，包括IEIK13、KLD12或RADA16，所述组合物具有与溶于水的相关肽的参照组合物不同的离子强度，并且相对于所述参照组合物显示出一个或多个改进的材料(例如，流变)性能。在一些实施方案中，所提供的组合物比参照组合物更硬。在一些实施方案中，所提供的组合物相对于参照组合物具有升高的离子强度，但仍然具有低于其临界盐点的离子强度。
表10.在存在选定的盐的条件下对某些自组装肽组合物的溶解度的目测观察
在不希望受到任何特定理论束缚的前提下，本发明提出，具有升高的离子强度的肽组合物的性能可能与肽的溶解度相关。自组装肽在pH水平为约2到4时的溶解度大多足够高以使肽组合物清澈和均一。肽链周围升高的离子强度降低肽的溶解度。当肽的溶解度低得能使组合物变得浑浊，则将此状态称为临界点。当升高的离子强度低于其临界点但接近其临界点时，肽可以诱导更强的疏水性相互作用从而提升刚度。当肽溶解度降低到低于其临界点(即高离子强度)时，肽组合物可以是半透明的或者不透明的(即，在其浊点以上)，并且可以沉淀(即相分离)。肽可能不会形成产生清澈且粘稠液体的纳米纤维。随机的疏水性相互作用可能超过了在高离子强度时由于盐析效应而产生自组装纳米纤维的疏水性相互作用。随机的分子内和/或分子间的聚集体可能会导致相分离。
根据一个或多个实施方案，临界离子强度可以根据盐和肽的成分而变化。可以用如下的Cohen等式表达溶解度和盐浓度之间的关系：
log S＝B–KI
其中S是肽的溶解度，B是肽特异性常数，K是盐特异性常数，以及I是盐的离子强度。B与pH和温度相关，并且K与pH相关。
在一些实施方案中，当温度和pH恒定(即，B为常数)时，肽的溶解度取决于盐析常数K和离子强度I。较高的K和I导致产生较低的肽溶解度。在恒定的pH和温度条件下，K由盐中的离子成分决定。总的来说，常数K在四种盐中的排列为NaCl>KCl>MgCl2＝CaCl2。
根据一个或多个实施方案，可以通过氨基酸序列(例如，通过在肽中亲水性和疏水性氨基酸残基的组合)确定肽的溶解度。具有相对较高的疏水性氨基酸含量的肽(例如IEIK13)通常在水性溶剂中具有较低的溶解度。这种肽的特征通常在于在自组装肽链之间具有强疏水性相互作用，从而导致较高的刚度。如本文所表明的，这种肽的组合物可以随少量盐的添加而显示出刚度的剧烈升高。相反地，具有相对较低的疏水性氨基酸含量的肽(例如RADA16)通常在水性溶剂中具有较高的溶解度。这些肽通常在自组装肽之间具有较弱的疏水性相互作用，从而导致较低的刚度。这种肽的组合物的刚度甚至不随大量盐的添加而显著提升。与该模型一致的是，本申请证实了在三种特定的示例性肽中的临界离子强度(例如，当组合物变得浑浊时)的排序与其相对疏水性排序一致：RADA16(0.9～1.2M)>KLD12(0.3～0.4M)>IEIK13(0.03～0.04M)。
根据一个或多个实施方案，肽组合物的离子强度可能会影响其凝胶化动力学。在一些实施方案中，升高的离子强度会加速肽组合物的凝胶化。凝胶化所需的离子强度可取决于盐和/或肽成分。例如，当RADA16、KLD12和IEIK13肽暴露于盐缓冲液(即，与等渗体液相当的0.15M NaCl)时，仅引发了IEIK13的凝胶化。RADA16和KLD12没有表现出凝胶化或者表现出可忽略不计的凝胶化。这些发现可能反映随着离子强度的升高肽的溶解度下降。如上所述，IEIK13比RADA16和KLD12对离子强度更敏感。
在一些实施方案中，肽组合物的离子强度会影响其恢复特性，例如，在混合和/或搅拌过程破坏了由肽-肽相互作用(通常为疏水性的)产生的初期形成的组装物(例如，纳米纤维)之后。
pH和盐的组合效应
本申请表明，同时调整pH和离子强度(例如，通过暴露于生理条件下)可以改变肽组合物的流变性能。例如，如本文所述，由于在所提供的肽组合物中包括了细胞培养液而导致的升高的pH和离子强度会影响这种组合物的各种性能(例如，流变性能)。
在一些实施方案中，在生理条件下可以提升肽组合物的刚度、粘度和/或凝胶化动力学。在一些实施方案中，可以通过pH和离子强度的组合来控制肽组合物的性能。
在不希望受到任何特定理论束缚的前提下，本申请提出，存在两种与肽组合物的刚度相关的主要分子间相互作用：疏水性相互作用和电荷-电荷相互作用。
首先，疏水性相互作用和排斥性静电相互作用是在低pH条件下通过β片层纳米纤维的形成而形成粘性溶液的主要驱动力。可预测这些相互作用在低pH时是显著的，其中大多数天冬氨酸和谷氨酸被质子化且不带负电荷并且大多数精氨酸和赖氨酸带正电荷。由于疏水性相互作用，肽分子自组装形成纳米纤维，而由于所述肽分子间的排斥性静电相互作用，所述纳米纤维的表面是水合的。
在一些实施方案中，在pH水平为约2至约3时，肽组合物的刚度应主要与其疏水性相关。IEIK13具有七个异亮氨酸基团(强疏水性基团)，KLD12具有六个亮氨酸基团(强疏水性基团)，以及RADA16具有八个丙氨酸基团(弱疏水性基团)。在相同的pH和浓度条件下，IEIK13比KLD12和RADA16具有更高的储能模量。
如图17B所示，当用模拟体液(例如，DMEM)处理水溶液中的IEIK13分子时，其纤维结构变厚。较厚的纤维结构的发生可能归因于生理pH下升高的疏水性相互作用和相邻纳米纤维之间的渗透压。
在含水环境中疏水性相互作用可能引起纳米纤维的形成，产生粘稠的组合物。在应用了高剪切压力(即降低的粘度和刚度)后，肽也可以重新形成纳米纤维以恢复其性能。因此，所述肽在pH 2-3时显示触变性。一旦移除了所应用的剪切压力，肽组合物慢慢恢复其原来的性能。
其次，在生理条件下吸引性电荷-电荷相互作用会与现有的疏水性相互作用同时发生。当肽分子周围的pH从酸性变化成中性时，可能不会破坏现有的疏水性相互作用。如图7中所示，带负电荷的基团和带正电荷的基团诱导额外的吸引性电荷-电荷分子间相互作用，使得肽组合物可以更硬。
然而，当在生理条件下肽组装物暴露于高剪切压力时，所述肽组装物分解成肽聚集体。如图7中所示，这是不可逆的过程。
例如，当通过将0.5mL DMEM和0.5mL 2％RADA16吹打几次进行混合时，RADA16没有形成清澈粘稠的肽组装物(即浑浊的流状乳液)。当将该混合物在2500rpm离心5分钟时，浑浊状RADA16相分离从混合物中沉淀了下来。在这种情况下，所述肽组装物(即，最初通过疏水性相互作用形成的肽组装物)有可能在混合过程中被破坏。吸引性电荷-电荷相互作用超过了疏水性相互作用，从而诱发形成随机的分子内和分子间聚集体。所述相分离示于图7中。
根据一个或多个实施方案，可以将IEIK13、KLD12、或者RADA16溶解在盐缓冲液(例如NaCl)中，并且可以用碱盐缓冲液(例如NaOH)升高其pH。其盐离子强度可以低于其其临界盐点。其pH可以是约2.5到约4.0。相对于相同肽在相同浓度下形成的适当的参照组合物，该组合物可以具有升高的刚度和粘度。
在一些实施方案中，生理条件(例如，升高的pH和盐离子强度)会加速肽组合物的凝胶化。在生理条件下加速的IEIK13凝胶化可能与两个驱动力相关，即升高的pH和离子强度。在生理条件下加速的RADA16凝胶化可能仅具有一个驱动力，即升高的pH。在一些实施方案中，加速的含有体液的肽组合物的凝胶化通常可以提高其功能以及针对各种临床应用的响应时间。
细胞相容性
根据一个或多个实施方案，提供的肽组合物通常与高细胞存活力有关。
在一些实施方案中，相较于RADA16，KLD12和IEIK13可以具有相似的或者更高的细胞存活力。在这些肽组合物中，整体细胞存活力的排序为KLD12>IEIK13>RADA16。在一些实施方案中，当肽组合物的浓度是约0.75％或者小于0.75％时，其可以具有高于80％的细胞存活力。在一些实施方案中，当肽浓度大于0.75％时，细胞存活力可能会降低。
形式
在一些实施方案中，根据本发明的肽组合物是干粉、溶液、凝胶(例如，水凝胶)、或其任意组合的形式。
在一些实施方案中，干粉组合物包括适量的肽，使得在添加选定体积的溶剂(例如，水性溶剂，任选地包括一种或多种盐和/或一种或多种pH调节剂)时产生所需浓度的溶液。在一些实施方案中，干粉组合物包括适当类型以及相对量的肽和盐，使得在添加选定体积的溶剂(例如，水性溶剂，任选地包括一种或多种额外的盐和/或一种或多种pH调节剂)时产生如本文所述的具有所需肽浓度和离子强度的溶液。在一些实施方案中，干粉组合物包括适当类型以及相对量的肽和pH调节剂，使得在添加选定体积的溶剂(例如，水性溶剂，任选地包括一种或多种盐和/或一种或多种额外的pH调节剂)时产生如本文所述的具有所需肽浓度和pH的溶液。在一些实施方案中，干粉组合物包括适当类型以及相对量的肽、盐和pH调节剂，使得在添加选定体积的溶剂(例如，水性溶剂，任选地包括一种或多种额外的盐和/或一种或多种额外的pH调节剂)时产生如本文所述的具有所需肽浓度、pH和/或离子强度的溶液。
在一些实施方案中，提供的组合物被纳于容器(例如，注射器、小瓶、孔等)内。在一些实施方案中，所述容器是带有刻度的容器，其包括体积的指示。在一些实施方案中，所述容器适于与输送装置如套管或注射器连接。在一些实施方案中，以允许在不去除密封的条件下添加和/或去除可流动(例如，液体)物质的方式(例如，可穿透的覆盖层)密封所述容器。
应用
在一些实施方案中，本申请提供了用于选择用于特定应用的的肽组合物的系统。本文所述的肽成分、肽浓度、pH、盐的成分和/或盐浓度的效应，可以影响表征，并且因此影响特定的肽组合物针对某些应用的用途。
举几个例子，在一般情况下，具有更高刚度的肽组合物更适合于以止血、组织塞、抗粘连、或者某些组织再生为特征的应用。具有更快的凝胶化时间的肽组合物可能特别适合于某些组织塞的应用如，例如，通常需要或者优选低于约1分钟到约1小时的凝胶化时间的止血、组织塞、抗粘连、或者药物递送，血管塞。具有更快的恢复时间的肽组合物可能特别适合于止血、组织塞、或者血管塞。
如本文中所指出的，自组装肽组合物在多种体内和体外环境中极其有用，包括例如作为细胞支架，作为液体运动的屏障，作为止血剂，作为缝隙填料等。如本文所述，不同的这种组合物在不同的环境中可能更有用。
例如，涉及在手术过程中施用肽组合物的环境(例如，作为止血剂)可以得益于凝胶化动力学，所述凝胶化动力学允许所述组合物在一段时间基本上保持液体以适合于施用到手术部位，接着快速凝胶化以形成稳定的、优选透明且相对硬的凝胶，通过所述凝胶可以容易地进行手术操作。
为了给出具体的例子，如本文所述，在一些实施方案中，IEIK13组合物可以在多种生物医学应用中特别有用，例如，需要一定的刚度和快速凝胶化的应用。本申请表明，某些IEIK13组合物的特征在于在施加了高剪切压力后具有相对高的刚度和/或快速恢复速度(例如最快的自组装)。此外，本申请表明，当与生理介质接触时，某些IEIK13组合物可能显示特别有用的(例如，高的)刚度。
本申请还表明，例如，当需要易于注射和较高的最终刚度时，某些KLD12组合物可能特别有用。在一些实施方案中，KLD12的自组装纳米纤维可以在高剪切压力下分解组装，然后再慢慢地组装回来。
本申请还表明，当需要高细胞存活力时，某些KLD12组合物可能特别有用。在一些实施方案中，可以提升KLD12的浓度以具有针对某个应用所需的刚度。
其他实施方式：
实施方式1.一种IEIK13组合物,其包括：
浓度至少为0.25％的IEIK13肽；
所述组合物具有约2.5到约4.0范围内的pH。
实施方式2.根据实施方式1所述的组合物，所述组合物是溶液。
实施方式3.根据实施方式1所述的组合物，所述组合物是凝胶。
实施方式4.根据实施方式1所述的组合物，其中所述组合物具有约0.0001M到约0.1M范围内的离子强度。
实施方式5.根据实施方式4所述的组合物，其中用常见盐调整/产生所述离子强度，其中所述常见盐选自下组：NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2和CaSO4。
实施方式6.根据实施方式4所述的组合物，其中用常见盐产生所述离子强度，其中所述常见盐由一种或多种形成盐的阳离子和一种或多种形成盐的阴离子组成，其中所述形成盐的阳离子选自下组：铵、钙、铁、镁、钾、吡啶、季铵和钠，其中所述形成盐的阴离子选自下组：乙酸、碳酸、氯、柠檬酸、氰、氟、硝酸、亚硝酸和磷酸。
实施方式7.根据实施方式1所述的组合物，其中所述组合物在1弧度/秒的频率和1Pa的振荡压力下具有约100到约10000Pa范围内的储能模量。
实施方式8.根据实施方式1所述的组合物，其中用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、乙酸钠、硫化钠或者DMEM缓冲所述组合物。
实施方式9.根据实施方式1所述的组合物，其中：
所述IEIK13肽以小于3％的浓度存在和/或
所述组合物具有约3.0到约4.0范围内的pH。
实施方式10.根据实施方式9所述的组合物，所述组合物是凝胶，所述凝胶在1弧度/秒的频率和1Pa的振荡压力下呈现出大于500Pa的储能模量。
实施方式11.根据实施方式1所述的组合物，其中用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、乙酸钠、或者硫化钠缓冲所述组合物，使得所述组合物的pH被调节。
实施方式12.一种液体肽组合物，其包括：
肽，所述肽具有约6个到约20个氨基酸范围内的长度以及疏水性氨基酸和亲水性氨基酸交替的氨基酸序列，所述组合物的特征在于：
其在室温下具有约1Pa·s到约500,000Pa·s范围内的粘度。
其在1弧度/秒的频率和1Pa的振荡压力下具有约1Pa到约5000Pa范围内的储能模量
当其暴露于/维持在约2.5到约4.0范围内的pH和/或约0.0001M到约1.5M范围内的离子强度时，在约0s到约30s的时段内形成凝胶。
实施方式12A.根据实施方式12所述的组合物，所述组合物是水性组合物。
实施方式13.根据实施方式12所述的组合物，其中所述肽包括RADA16。
实施方式14.根据实施方式12所述的组合物，其中所述肽包括IEIK13。
实施方式15.根据实施方式12所述的组合物，其中所述肽包括KLD12。
实施方式16.根据实施方式12所述的组合物，其中用常见盐产生所述离子强度，其中常见盐选自下组：NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2和CaSO4。
实施方式17.根据实施方式12所述的组合物，其中用常见盐产生所述离子强度，其中所述常见盐由一种或多种形成盐的阳离子和一种或多种形成盐的阴离子组成，其中所述形成盐的阳离子选自下组：铵、钙、铁、镁、钾、吡啶、季铵和钠，其中所述形成盐的阴离子选自下组：乙酸、碳酸、氯、柠檬酸、氰、氟、硝酸、亚硝酸和磷酸。
实施方式18.根据实施方式12所述的组合物，其中用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、乙酸钠、或者硫化钠缓冲所述组合物，使得所述组合物的pH被调节。
实施方式19.一种方法，其包括以下步骤：
选择肽组合物用于在特定的体内部位进行应用，所述方法包括以下步骤：
确定所述肽组合物的一种或多种参数，所述参数选自下组：储能模量、粘度、胶凝时间、剪切稀化特性和肽纳米纤维重组装时间；以及
将所确定的所述一个或多个参数与一组被确定为适合于应用到所述特定体内部位的特征进行比较；以及
根据所述比较选择所述肽组合物；以及
将所选择的肽组合物施用到所述部位上。
实施例
实施例1：某些参照肽组合物的光学清晰度
本实施例示出了某些参照肽组合物的光学清晰度和相稳定性(即，不发生相分离)，其中所指示的肽溶解在水中。在一些实施方案中，提供的肽组合物的光学清晰度(和/或相稳定性)是相对于这种参照组合物而评估的。在一些实施方案中，提供的特定浓度的特定肽的组合物显示与相同肽以相同浓度溶于水中的参照组合物至少一样好的光学清晰度和/或相稳定性。
参照表1可以看到，制备在一系列肽浓度下显示出光学清晰度(还有相稳定性)的各种参照肽组合物。尤其在0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％或者更高的浓度下，肽组合物显示出清晰的光学特点并且不发生相分离。
表1肽的外观
实施例2：肽组合物的流变性能作为浓度的函数
本实施例描述了肽浓度对某些肽组合物的流变性能的效应。在一些实施方案中，流变性能可能与肽浓度呈线性关系。
在一些实施方案中，可以将具有特定所需刚度的肽组合物配制成具有特定肽浓度，所述特定肽浓度通过使用数学模型(即，模量趋势线方程)而确定。肽组合物的配方表可以显示其在去离子水中的浓度与其特定储能模量的关系，例如下面的表3A中所示。根据这样的图表，本领域技术人员可以通过选择特定的肽和适当的肽浓度配制出具有所需流变性能的肽组合物，使得所配制的组合物具有所需的刚度。
例如，如本文所述，通常，含有RADA16、KLD12、或IEIK13肽的肽组合物的流变强度的顺序被证实为IEIK13>KLD12>RADA16。
表3A肽组合物的配方表。通过用去离子水改变其浓度以获得特定所需的储能模量，其通过上述线性趋势线方程计算得到。
本实施例进一步描述了使用带有40mm平板的流变仪(AR500,TA Instruments)测得的某些肽组合物在选定浓度下的各种流变性能。将肽组合物(700μL)放置在流变仪平板上并且用Kimwipes轻轻除去过量的组合物。在37℃下2分钟驰豫时间之后进行测量。以300μm的测量几何间隙放置板，在37℃下测量了储能模量、损耗模量和粘度(η’)，并且在振荡压力为0.1Pa～1000Pa角频率为10弧度/秒的条件下执行了压力扫描试验。
RADA16，IEIK13，和KLD12的结果示于图2-4中。如图2-4所示，当振荡压力小于约10到200Pa时，肽组合物显示了接近于平台的模量。其在一定的屈服振荡压力下都具有急剧的模量下降。至少在约1％到约2.5％的测试浓度范围内，肽组合物显示储能模量随升高的浓度线性升高(线性趋势线的R2在0.971～0.992之间)。某些肽组合物在临界压力水平上表现出剪切稀化特性。
在本实施例中测试的各种肽组合物的确定的流变学结果列于表3中。可以看出，1.5％KLD12的储能模量类似于2.5％RADA16的储能模量。1％IEIK13的储能模量类似于2.5％KLD12的储能模量并且高于2.5％RADA16的储能模量。总体来说，在此测试的组合物中流变强度的排序是IEIK13>KLD12>RADA16。
表3肽组合物在选定浓度下的流变性能
*：在1Pa振荡压力下
#：在所测压力范围内，在粘度曲线上调试了最大粘度数据。
实施例3：肽组合物的流变性能作为pH的函数
本实施例描述了pH对某些肽组合物的流变性能的效应。在一些实施方案中，pH可以是影响肽组合物的刚度、粘度和/或恢复时间的控制参数。
下面的表2呈现了对于参照组合物所观察到的pH浓度，其中所示肽以所示浓度溶解在水中。
表2参照肽组合物(在水中)在所选浓度下的pH值。
在这个实施例中，例如，通过向2mL的2.5％肽组合物中加入0.1N NaOH，调整了肽组合物的pH水平。观察了调整后组合物的pH和外观。如果pH水平高于所需水平，则加入酸性盐。
结果示于表5中。值得注意的是，pH的升高(即，高达约3.5或以下)并没有改变RADA16，IEIK13，和KLD12组合物的清澈颜色，而其表观刚度有所增加。对于某些组合物，当肽组合物的pH水平高于3.5(RADA16和KLD12)或者3.7(IEIK13)时，所述肽组合物开始相分离(即变得浑浊)。在一些实施方案中，提供的肽组合物具有在约3.0到约3.7(特别是IEIK3)，或者约3.0到约3.5(特别是RADA16和/或KLD12)范围内的pH。
表5对在选定pH水平下的某些肽组合物的视觉观察
在将pH水平调整到3.4(RADA16和KLD12)或者3.7(IEIK13)之前以及之后观察了某些肽组合物的流变性能。使用带有40mm平板的流变仪(AR500，TA Instruments)评估了肽的流变性能。具体地，将肽组合物(700μL)放置在流变仪平板上并且用Kimwipes轻轻除去过量的组合物。在37℃下2分钟驰豫时间之后进行了测量。压力扫描试验结果示于图8-11。在升高的pH条件下的RADA16、KLD12和IEIK13组合物比在2.5(RADA16)、2.0(KLD12)和2.1(IEIK13)条件下的组合物更硬。
在选定的pH水平下，使用带有20mm平板的流变仪(DHR-1,TA Instruments)评估了某些肽组合物的储能模量。随着pH升高到3.4，RADA16和IEIK13组合物的储能模量有所升高。对于测试的肽组合物RADA16和IEIK13确定的储能模量分别示于图18和图19中。
在选定的pH水平下，使用带有20mm平板的流变仪(DHR-1,TA Instruments)评估了1％IEIK13组合物的粘度。随着pH升高到3.5，IEIK13组合物的粘度有所升高。IEIK13组合物显示出典型的剪切稀化属性。结果示于图20A和20B中。
在向1％的IEIK13组合物施加了高剪切压力后，在选定的pH下评估了流变性能的恢复时间。在向样品施加了1000 1/秒的剪切速率1min后，在1弧度/秒1Pa条件下使用DHR-1流变仪(TA Instruments)测量了1％IEIK13的储能模量的变化。在选定的pH值下IEIK13组合物显示出典型的触变行为，这意味着其性能慢慢地恢复了。在不希望受任何特定理论束缚的前提下，我们提出，流变性质的恢复时间代表肽分子重组装以在组合物中再次形成自我关联(例如，纳米纤维)所需的时间。1％IEIK13的对照组合物(pH 2.3)完整的重组装时间长达12小时或者以下，而pH升高的IEIK13组合物的完整重组装时间为6～10min。IEIK13的代表性结果示于图21A-21D中。
实施例4：肽组合物的流变性能作为离子强度的函数
本实施例描述了离子强度对某些肽组合物的流变性能的效应。在一些实施方案中，离子强度可以是肽组合物的刚度、粘度和/或恢复时间的控制参数。
在存在选定的盐(例如KCl、MgCl2、CaCl2)的条件下对RADA16、KLD12和IEIK13组合物进行的视觉观察总结于表7-9中。在某些离子强度下肽组合物清澈并且表现出比在更低的离子强度下的肽组合物更高的刚度。对于RADA16(表7)，在约0.85～1.15M(取决于盐的成分)范围内的离子强度并没有显著改变RADA16组合物的不透明度。对于KLD 12(表8)，在约0.25～0.35M(取决于盐的成分)范围内的离子强度并没有显著改变KLD12组合物的不透明度。对于IEIK13(表9)，在约0.025～0.035M(取决于盐的成分)范围内的离子强度并没有改变IEIK13组合物的不透明度。RADA16、KLD12和IEIK13组合物的表观刚度随升高的离子强度而升高。
在不希望受任何特定理论束缚的前提下，我们提出，升高的流变性能可能与每种盐的盐析常数K相关。对于RADA16来说NaCl的常数K可能比其他盐更高。在存在NaCl条件下的RADA16组合物的流变性能可能略高于在存在KCl和CaCl2条件下的RADA16组合物的流变性能。
表7室温下对在存在选定盐条件下的RADA16组合物的视觉观察
表8室温下对在存在选定盐条件下的KLD12组合物的视觉观察
表9室温下对在存在选定盐条件下的IEIK13组合物的视觉观察
从表7-9中所记录的视觉观察中确定了临界离子强度。当肽组合物的离子强度高于0.9M(RADA16)、0.3M(KLD12)或者0.03M(IEIK13)时，肽组合物开始相分离。0.9M、0.3M和0.03M可能分别代表RADA16、KDL12和IEIK13的临界离子强度。
图27-29显示了当离子强度略低于临界离子强度时用带有20mm平板的流变仪(DHR-1，TA Instruments)测得的流变性能。对于所述测量，RADA16、KDL12和IEIK13的离子强度分别为0.7M、0.2M和0.02M。RADA16、KLD12和IEIK13组合物的流变性能在用NaCl将其离子强度水平调整为0.7M(RADA16)、0.2M(KLD12)或者0.02M(IEIK13)之后变得更高。
用带有20mm平板的流变仪(DHR-1，TA Instruments)测量了肽组合物在选定的离子强度下的流变性能。1％RADA16组合物的流变性能随着离子强度上调到0.7M而升高，但是当离子强度高于0.7M时降低。1％IEIK13组合物的流变性能随着离子强度上调到0.03M而升高，但是当离子强度高于0.03M时降低。结果和在选定的盐离子强度下对肽组合物的视觉检查相匹配。RADA16的结果示于图30以及IEIK13的结果示于图31。
评价了肽组合物在选定的离子强度水平下的粘度。IEIK13组合物的粘度随着升高的离子强度而升高。1％的IEIK13组合物显示出典型的剪切稀化属性。用带有20mm平板的流变仪(DHR-1，TA Instruments)评估了1％IEIK13肽组合物的粘度。IEIK13的结果示于图32A和32B。
在选定的离子强度下向1％IEIK13组合物施加了高剪切压力后，评估了流变性能的恢复时间。在向样品施加了1000 1/秒的剪切速率1min后，使用DHR-1流变仪(TAInstruments)，用1Pa下1弧度/秒的时间扫描测试测量了1％IEIK13的储能模量的变化。IEIK13组合物在选定的离子强度下显示出典型的触变行为，其流变性能恢复缓慢。流变性能恢复时间是基于肽分子再次形成纳米纤维的重组装。在未添加盐的条件下，1％IEIK13对照组合物的完整重组装时间长达12小时或者以下，而添加了0.01M和0.02M NaCl的IEIK13组合物的完整重组装时间则少于1min～3min。IEIK13的结果示于图33A-33C。
实施例5：肽组合物的流变性能作为pH和离子强度的函数
本实施例描述了肽组合物在升高的pH和离子强度下的流变性能。特别地，本实施例描述了生理介质(例如细胞培养液)对某些肽组合物的流变性能的效应。
使用带有40mm平板的流变仪(AR500,TA Instruments)评估了Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)对IEIK13，KLD12和RADA16组合物的流变性能的效应。DMEM是含有6.4g/L NaCl、3.4g/L NaHCO3(碳酸氢钠)、少量其他盐、各种氨基酸以及4.5g/L葡萄糖的细胞培养液。DMEM的pH是7.2±0.2并且渗透压为335±30mOsm/Kg H2O.DMEM接近于人的生理体液，例如，血液。
在与DMEM溶液混合之前，将1％的肽组合物保持在4℃至少48小时。为了执行实验，轻轻吸入1mL肽组合物并且放置在流变仪的平板上。将2mL DMEM溶液轻轻加入到所述肽组合物的周围。用DMEM处理所述肽组合物两分钟，然后除去培养液，并将平板放置在约450μm的测量几何间隙处。在进行了2min的弛豫后于37℃执行了测量。在1Pa的振荡压力下从1弧度/秒到100弧度/秒执行了频率测试。
在用DMEM处理2分钟之前和之后测量了1％肽组合物的流变性能；结果示于图5A中。储能模量在DMEM处理之后的倍数增长示于图5B中。可以看到，肽组合物在DMEM处理之后显示出储能模量的大幅提升。在DMEM处理之后RADA16、KLD12和IEIK13之间的倍数差异相比在DMEM处理之前的倍数差异相对较小。同样地，在DMEM处理之后，较硬的肽组合物(例如，IEIK13)相对于没那么硬的组合物(例如，RADA16)储能模量显示出较低的倍数提升。临界分子间相互作用在DMEM处理之后有所升高，其可能决定最终的刚度。
在DMEM处理之前和之后使用DHR-1流变仪(TA Instruments)测量了肽组合物在选定浓度下的流变性能。在1Pa下从1弧度/秒到10弧度/秒执行了扫频测试，图中的储能模量为在1弧度/秒下的。RADA16和IEIK13组合物的流变性能随DMEM的处理和/或pH的上升而升高。RADA16的结果示于图22A和22B以及和IEIK的结果示于图23A和23B。
使用DHR-1流变仪(TA Instruments)在DMEM处理之后10min时评估肽组合物在选定离子强度下的流变性能。在1Pa下从1弧度/秒到10弧度/秒执行了扫频测试并且将1弧度/秒时的储能模量选定为数据。当将离子强度调高到不超过0.7M时RADA16组合物的流变性能升高，而当离子强度为0.7M或更高时，其有所下降。当NaCl的离子强度为0.9M或者更高时，RADA16组合物变得混浊。RADA16的流变性能不随DMEM的处理发生变化(例如，无凝胶化)。然而，在选定的离子强度下，IEIK13组合物的流变性能随DMEM的处理而升高。结果示于图34-35。
将IEIK13、KLD12和RADA16溶于盐缓冲液(例如，NaCl)并且保持在用碱盐缓冲液(例如，NaOH)调节的上升的pH水平。所述组合物具有约2.5-4.0的pH水平以及低于其临界点的离子强度。对于RADA16、KLD13和IEIK13，肽组合物在pH 3.4(用NaOH调节)的条件下在0.9％NaCl(即0.15M的离子强度)中仍是清澈的。RADA16在pH 3.4的条件下在0.9％NaCl中的流变性能比RADA16对照(即，没有离子强度和pH的上升)和在0.9％NaCl中的RADA16(没有pH的上升)具有更高硬度。结果示于图40。
如图1所示，执行了刚果红试验来确定肽组合物在PBS(磷酸缓冲盐)溶液(pH 7.4)中凝胶的形成。将100μl所选浓度的每种凝胶放置在玻璃载片上。30秒后将500μl的1％刚果红溶液加到等分的每种组合物的周围和上方，然后在检查前擦掉多余的刚果红溶液。以选定的浓度0.5％、1.0％、1.5％、2.0％和2.5％放置RADA16、IEIK13和KLD12。以视觉观察来确定在每个浓度下凝胶化的成功或失败。RADA16、IEIK13和KLD在所有浓度下均凝胶化。
实施例6：细胞存活力
本实施例描述了某些肽组合物支持细胞存活力的能力。在一些实施方案中，提供的肽组合物的特征在于其支持高细胞存活力，特别是与适当的参照组合物相比。
如本文所述，执行了细胞存活力(细胞毒性)试验来测量在存在IEIK13、KLD12和RADA16组合物的条件下，C57 BL/6小鼠间质干细胞(mMSC)的存活力。mMSC是在水凝胶组织培养系统中经常使用的细胞系。制备2.5％浓度的肽组合物，然后用蔗糖将其稀释至1.5％、1.25％、1.0％、0.75％和0.50％的浓度。蔗糖的终浓度为10％。洗涤细胞并将其重悬于10％蔗糖以达到500万个细胞/ml的终浓度。将细胞离心并除去上清液。将细胞再悬浮于含10％蔗糖的肽组合物。然后如使用指南(BD/Corning网站)中所述，按照步骤铺板了悬滴培养物以及随后的分离。RADA16、IEIK13和KLD12的结果分别示于图14-16。
0.5％和0.25％的IEIK13和KLD12组合物中的细胞存活力相似。0.5％RADA16组合物中的细胞存活力比0.25％RADA16组合物中的细胞存活力显著增高。然而，当肽的浓度超过0.75％时细胞存活力显著下降。在0.25％到1.5％范围内的所有测试浓度下，KLD12和IEIK13组合物相较于RADA16显示出相似的或者更高的细胞存活力。在这些肽组合物中，总细胞存活力的排序为KLD12>IEIK13>RADA16。浓度为0.75％或者以下的测试肽组合物表现出高于80％的细胞存活力。
实施例7：带有不同盐的RADA16组合物的流变性能
本实施例还描述这样的研究：其获得了自组装肽凝胶的受控的机械增强，同时仍保持了凝胶的可逆性(例如，不损害凝胶的形成及其在机械扰动之后的机械完整性)。这些被描述的研究还通过将阳离子和阴离子以选定浓度与各种自组装肽(最值得注意的是RADARADARADARADA(或者RADA-16))组合起来混合，来达到对凝胶化动力学的控制。
本实施例，特别是在本说明书上下文的背景下，证实了允许将肽组合物特别配制成具有对于某些应用特别有用的材料和/或流变特征的参数已经被定义。例如，本文所描述的技术允许制备自组装肽组合物，所述自组装肽组合物是专门定制的，使其作为密封剂(其可能需要或者受益于，例如，增强的刚度)、润滑剂(其可能需要或者受益于，例如，增强的动力学)、药物混合物(其可能需要或者受益于，例如，可逆性和增强的动力学)、注射剂(其可能需要或者受益于，例如，可逆性)等可以很好的发挥作用。或者另外，本文所描述的技术允许制备肽组合物和/或选择其中所包括的参数或者向其所施加的参数，所述参数可以协助一般性地操作和/或制造有用的肽组合物和/或包括其的设备。
例如，如本文所证实的，通过系统地控制自组装肽组合物中所包括的阳离子的类型(例如Na、K和Ca)和/或浓度，可以调整机械强度(即刚度)同时仍保持可逆性和凝胶化动力学。或者另外，通过系统地控制阴离子的类型(例如Cl、SO4、PO4)和/或浓度，可以控制胶凝化动力学同时保持可逆性。
如在本实施例中所证实的，在一些实施方案中(尤其在利用RADA16肽的实施方案中)，与Na和K相比，Ca会使得肽凝胶中具有更为增强的刚度。此外，在一些实施方案中(尤其在利用RADA16肽的实施方案中)，与SO4相比，Cl会使得在肽凝胶中具有更快的凝胶化动力学。此外，在一些实施方案中(尤其在利用RADA16肽的实施方案中)，CaCl2会使得在≥0.125和<0.500M的浓度下产生最佳机械增强的可逆凝胶。在本实施例中所报道的特定研究中，≥0.500M的浓度削弱了某些凝胶的机械性能，或者使其无法用于凝胶化后的机械扰动。
通常，在本实施例中所报道的发现表明，通过使用各种盐和盐浓度，可以通过选择参数如肽浓度、肽成分(例如，氨基酸序列)、阳离子/阴离子的浓度、阳离子/阴离子的成分等来确定属性如刚度、凝胶化动力学和凝胶化可逆性。已经观察到，阳离子和阴离子可以独立地以及组合地影响属性。本公开内容，包括本实施例提供的教导，提供了用于根据所需属性(例如，性能特性)定制肽组合物的系统(例如可能适合于特定的应用或者情况)。
本实施例具体证实了某些特定类型的阳离子和/或阴离子和/或其浓度具有所需的有益效应；此外，本实施例还就所示例的上下文对这样的阴离子/阳离子以及浓度进行了定义，而且提供了框架，所述框架允许本领域技术人员能够在其他情况下(例如，其他肽)进行同样的操作。
本实施例尤其令人惊讶地发现了用于提供有用的自组装肽组合物的当前策略的问题。即，有理论表明自组装的能力取决于可供离子盐攻击的带电基团的量，其为肽的饱和能力[P.Chen.(2005).“Self-assembly of ionic-complementary peptides:aphysicochemical viewpoint.”Colloids and Surfaces]。然而，本实施例表明，至少在一些情况下，肽并非按比例地受盐浓度的影响，并且因此机械性能和可逆性并非线性地升高并且不依赖于速率。
图41A-41D描绘了用于跟踪肽溶解和评估特定阴离子和/或阳离子和/或其浓度对某些RADA16组合物的效应的步骤。如图所示，通过涡旋和超声处理将小瓶中的肽粉末溶解在去离子水中。本实施例中使用的特定的肽组合物是RADA16的1％的组合物，其以1：1的比例与2X盐溶液混合，以获得0.5％RADA16的终浓度和所需的盐摩尔浓度。
盐浓度研究
按照图41A-41D中所描述的步骤来用不同浓度的CaCl2制备RADA16的0.5％溶液。允许混合的溶液静置约24小时的弛豫时间。然后上下倒置小瓶以便评估凝胶性能。如果当倒置含有组合物的小瓶时该组合物完全留在原处，则认为所述组合物是全功能的凝胶。如果当倒置含有组合物的小瓶时超过一半的该组合物仍然留在原处，则认为其是半功能的凝胶。如果在倒置时超过一半的组合物，特别是如果基本上全部组合物落到含有该组合物的小瓶的另一端，则认为其是非功能性的凝胶。
图42A-42G显示了得到的结果图，具体描绘了针对多种CaCl2浓度中每种浓度的直立的和倒置的小瓶。可以看到，对于这些0.5％RADA16组合物，具有0.250M CaCl2的形成了全功能的凝胶(图E)，具有0.500M CaCl2的形成了半功能的凝胶(图F)，以及具有1M CaCl2的形成了非功能性的凝胶(图G)。
阳离子选择的研究
按照图41A-41D中所示的步骤用0.005、0.05、0.125、0.25、0.5和1M的NaCl、KCl和CaCl2制备了RADA16的0.5％溶液。将阴离子氯(Cl-)保持恒定以观察阳离子钠(Na+)、钾(K+)和钙(Ca2+)的效应。结果示于图43，其对于变换盐溶液的阳离子如何影响所得组合物的粘弹性能和刚度提供了基本的理解。
机械强度研究
按照图41A-41D中所示的步骤分析含有2.5％RADA16并且不含添加盐或者含有2.5％RADA16和0.125M CaCl2的肽组合物的刚度。结果示于图44，其对于所得组合物的粘弹性能提供了基本的理解。
可逆性研究
按照图41A-41D中所示的步骤制备了与0.125、0.25、或者0.5M的CaCl2混合的0.5％RADA16的溶液。通过涡旋和超声处理使组合物经受机械压力，使得其结构被彻底破坏(例如，完全打乱)。然后将被破坏的组合物在室温下放置48小时，以允许发生自组装。图45A和45B示出了来自这个研究的结果，并且揭示了肽组合物的基本粘弹性能，表明当包括了0.125或者0.25M CaCl2时，甚至在所述组合物中的任意结构被扰乱之后，仍能维持可逆性。相反地，具有0.5M CaCl2的组合物在被破坏之后显示出剧烈降低的刚度(反映出剧烈降低的恢复结构的能力)。
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等同方式
本领域技术人员将认识到，或者能够使用不超出常规实验的方法来确定，本文描述的本发明具体实施方案的许多等同方式。本发明的范围并不旨在限于上述说明书，而是如所附的权利要求中所示。

Claims (10)

1.一种IEIK13组合物,其包括：
浓度至少为0.25％的IEIK13肽；
所述组合物具有约2.5到约4.0范围内的pH。
2.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物是溶液。
3.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物是凝胶。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物具有约0.0001M到约0.1M范围内的离子强度。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中用常见盐调整/产生所述离子强度，其中所述常见盐选自下组：NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2和CaSO4。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中用常见盐产生所述离子强度，其中所述常见盐由一种或多种形成盐的阳离子和一种或多种形成盐的阴离子组成，其中所述形成盐的阳离子选自下组：铵、钙、铁、镁、钾、吡啶、季铵和钠，其中所述形成盐的阴离子选自下组：乙酸、碳酸、氯、柠檬酸、氰、氟、硝酸、亚硝酸和磷酸。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在1弧度/秒的频率和1Pa的振荡压力下具有约100到约10000Pa范围内的储能模量。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、乙酸钠、硫化钠或者DMEM缓冲所述组合物。
9.一种液体肽组合物，其包括：
肽，所述肽具有约6个到约20个氨基酸范围内的长度以及疏水性氨基酸和亲水性氨基酸交替的氨基酸序列，所述组合物的特征在于：
其在室温下具有约1Pa·s到约500,000Pa·s范围内的粘度。
其在1弧度/秒的频率和1Pa的振荡压力下具有约1Pa到约5000Pa范围内的储能模量
当其暴露于/维持在约2.5到约4.0范围内的pH和/或约0.0001M到约1.5M范围内的离子强度时，在约0s到约30s的时段内形成凝胶。
10.一种方法，其包括以下步骤：
选择肽组合物用于在特定的体内部位进行应用，所述方法包括以下步骤：
确定所述肽组合物的一种或多种参数，所述参数选自下组：储能模量、粘度、胶凝时间、剪切稀化特性和肽纳米纤维重组装时间；以及
将所确定的所述一个或多个参数与一组被确定为适合于应用到所述特定体内部位的特征进行比较；以及
根据所述比较选择所述肽组合物；以及
将所选择的肽组合物施用到所述部位上。
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