KR20160127827A

KR20160127827A - 자가-조립 펩타이드 조성물

Info

Publication number: KR20160127827A
Application number: KR1020167028031A
Authority: KR
Inventors: 은 석 길; 칼 길버트; 마나브 메타
Original assignee: 가부시끼가이샤 쓰리디 매트릭스
Priority date: 2014-03-10
Filing date: 2015-03-10
Publication date: 2016-11-04
Also published as: JP2022036947A; CA2939696C; RU2016139369A; US20220033442A1; CN117138022A; US20200399310A1; US10654893B2; EP3466965A1; JP2017510568A; JP6628733B2; BR112016020584A2; ES2711728T3; US20160362451A1; JP2020055836A; CA2939696A1; DK3116896T3; CN106459154A; AU2019219809A1; AU2015229549A1; AU2015229549B2

Abstract

본 발명은 특히 유용한 물질적 특성들을 나타내는 특정한 속성들(예: 펩타이드 정체, 펩타이드 농도, pH, 이온 강도(염 정체 및/또는 농도를 포함함))을 갖는 펩타이드 조성물(예: 자가-조립 펩타이드의 조성물)을 제공한다. 본 발명은 또한 특수한 상황에서 유용한 특정한 펩타이드 조성물을 선택 및/또는 제형화기 위한 기술을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제공된 펩타이드 조성물은 약 2.5 내지 약 3.5의 범위 내의 상승된 pH 및/또는 수중에서 동일한 농도에서의 동일한 펩타이드의 상응하는 조성물의 이온 강도를 초과하지만 펩타이드에 대한 임계 염점 아래인(예를 들면, 당해 조성물이 혼탁하지 않도록) 이온 강도를 갖는다.

Description

자가-조립 펩타이드 조성물{SELF-ASSEMBLING PEPTIDE COMPOSITIONS}

관련 출원에 대한 상호참조

본 출원은 2014년 3월 10일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/950,529호에 대한 35 U.S.C.§119(e) 하의 이익을 주장하며, 이것은 전문이 본원에서 참고로 인용된다.

서열목록

본 출원은 "2004837-0046_Sequences.txt"란 명칭의 ascii .txt 파일로서 전자 형태로 제출된 서열목록을 참조로 한다. 상기 .txt 파일은 2015년 3월 9일자로 생성되었으며 크기는 1kb이다.

겔 구조로 자가-조립하는 능력을 갖는 펩타이드 제제는 치료학적 및 조사 상황에서 광범위한 용도를 갖는다. 이러한 한가지 펩타이드 제제, 예를 들면, 아르기닌, 알라닌 및 아스파르트산의 반복 서열(즉, RADARADARADARADA[서열번호 1], "RADA16"으로서도 공지됨)을 갖는 합성 16-아미노산 폴리펩타이드는 3-디 매트릭스 메디칼 테크놀로지(3-D Matrix Medical Technology)로부터 상표명 PuraStat^®, PuraMatrix^® 및 PuraMatrix GMP^® 하에 시판되고 있으며, 세포 배양, 약물 전달, 가속화된 연골 및 뼈 성장, 및 CNS, 연조직 및 심근의 재생을 포함한 광범위한 실험실 및 임상 적용에서의 유용성 및 추가로 하나 이상의 검출가능한 제제, 생물학적 활성 제제, 세포 및/또는 세포 성분과 연합할 수 있는 매트릭스(matrix), 스캐폴드(scaffold) 또는 테더(tether)로서의 유용성이 입증되었다.

개요

본 발명은 특히, 특정 펩타이드 조성물(및 특히 자가-조립 펩타이드 제제의 특정 조성물) 및 이와 관련된 기술들을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이러한 조성물은 용액일 수 있거나 용액을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 조성물은 겔일 수 있거나 겔을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 조성물은 고체(예: 건조된/동결건조된) 펩타이드일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.

예를 들면, 본 발명은 특정한 펩타이드 조성물(즉, 특수한 농도, 이온 강도(ionic strength), pH, 점도 및/또는 기타 특징들을 갖는 펩타이드 조성물)이 유용하고/하거나 놀라운 속성들(예: 겔화 또는 자가-조립 동역학[예: 겔화 속도 및/또는 펩타이드 자가-조립의 속도 및 가역성], 강성[예: 저장 모듈러스(storage modulus)를 통해서 평가된 바와 같은] 및/또는 기타 기계적 특성들)을 갖는다는 것을 입증한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 특수한 상황(예: 특정 생체내 또는 시험관내 적용)에서의 이러한 특정 조성물의 특정한 용도를 입증한다.

특히, 본 발명은 특정 상황 또는 적용에서 유용한 특정한 펩타이드 조성물을 선택, 디자인 및/또는 제형화할 수 있도록 하는 지침을 제공한다.

본 발명은 특정 양이온 및 음이온이 자가-조립 펩타이드 제제와 상호작용하는 정도 및 또한 이러한 상호작용이 펩타이드 조성물의 특정 물질적(예: 레올로지) 특성을 어떻게 변경시킬 수 있는가(예: 기계적 강성 및/또는 점도를 증가시킬 수 있는가)를 확립시킨다. 추가로, 본 발명은 이러한 상호작용이, 특히 변형(예: 기계적 교란 또는 기타 붕괴)에 노출된 후에, 겔화 동역학, 겔화 상태의 복원(예: 겔화 및/또는 겔 특성의 복원의 시기 및/또는 정도)에 어떻게 영향을 미칠 수 있는가를 확립시킨다.

본원에 기재된 연구는 기존의 특정 자가-조립 펩타이드 기술들의 다양한 문제점들의 근원을 확인하였으며, 추가로 펩타이드 조성물 기술의 특정한 적용에 맞는 특유의 특히 유용한 및/또는 필수적 속성들 및/또는 특징들을 정의한다.

일부 실시형태에서, 제공된 조성물에 포함된 펩타이드는 자가-조립 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 제공된 조성물에 포함된 펩타이드는 양친매성 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 제공된 조성물에 포함된 펩타이드는 친수성 아미노산과 소수성 아미노산이 교호되는 적어도 하나의 신장부(stretch)(예를 들면, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 등의 아미노산의 신장부)를 특징으로 하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 제공된 조성물에 포함된 펩타이드는 하나 이상의 Arg-Ala-Asp-Ala(RADA) 반복체를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 제공된 조성물에 포함된 펩타이드는 서열 Lys-Leu-Asp-Leu(KLDL)의 반복 단위를 포함하거나 이것으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 제공된 조성물에 포함된 펩타이드는 서열 Ile-Glu-Ile-Lys(IEIK)의 반복 단위를 포함하거나 이것으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 펩타이드는 IEIK13, KLD12 또는 RADA16일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 펩타이드의 조성물은 상이한(예를 들면, 더 낮은) pH 수준 및/또는 이온 강도를 갖는 적절한 참조 조성물과 비교해 증진된 특성들을 가질 수 있다.

보다 온화한 pH 수준에서의 펩타이드 조성물은 이러한 조성물이 더욱 광범위한 적용분야에 적합하도록 만드는 더욱 강성의 레올로지 특성을 가질 수 있다. 4.0을 넘는 pH로의 환경적 pH 변화는 또한 펩타이드 조성물로부터의 겔화 동역학에 유익한 영향을 줄 수 있다. 일부 실시형태에서, 증가된 pH는 펩타이드 조성물이 체내로 배치되는 경우에 발생할 수 있는 생리학적 pH일 수 있다.

하나 이상의 양상에 따라서, IEIK13, KLD12 및 RADA16을 포함하나 이에 제한되지 않는 특정 펩타이드 조성물의 레올로지 특성은 증가된 이온 강도를 유지시킴으로써 증진될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이온 강도는 임계 이온 강도보다 낮을 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물은 순수 대신에 염을 갖는 물 중에 용해될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이온 강도는 이의 임계 이온 강도보다 낮을 수 있다.

일부 실시형태에서, 증가된 이온 강도는 펩타이드 조성물에 대한 강성 및/또는 겔화 동역학에 유익하게 영향을 주어서, 이러한 펩타이드 조성물이 더욱 광범위한 적용에 적합하도록 만든다. 일부 실시형태에서, 증가된 이온 강도는 체내로 배치되는 경우에 발생할 수 있는 생리학적 이온 강도일 수 있다.

하나 이상의 양상에 따라서, IEIK13, KLD12 및 RADA16을 포함하나 이로 제한되지 않는 특정 펩타이드 조성물의 특성은 이의 pH 수준을 약 3.5 이하에서 유지시키고 동시에 이의 염 농도를 이의 임계 이온 강도 수준 미만(즉, 침전 없음)에서 유지시킴으로써 증진될 수 있다.

하나 이상의 양상에 따라서, 자가-조립 펩타이드, 예를 들면, IEIK13, KLD12 및 RADA16은 펩타이드 제형을 다양한 적용을 위해 최적화하는 외관, pH 수준, 이온 강도 수준, 겔화 동역학, 레올로지 특성 및 세포 생존력을 포함하는 특성들의 측면에서 특징지어질 수 있다. IEIK13 및 KLD12는 기본적 겔화 특성 및 기타 특징들의 측면에서 RADA16과 유사한 펩타이드 조성물로서 특징지어질 수 있다.

일부 실시형태에서, 펩타이드는 약 6 내지 약 20개 아미노산의 범위 내의 길이 및 소수성 아미노산과 친수성 아미노산이 교호되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물은 용액, 겔 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.

일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물은 적어도 0.05%의 농도로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물은 3% 미만의 농도로 존재할 수 있다.

일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물은 약 2.5 내지 약 4.0의 범위 내 또는 약 3.0 내지 약 4.0의 범위 내의 pH를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물의 pH는 수산화나트륨 또는 수산화칼륨, 수산화칼슘, 탄산나트륨, 나트륨 아세테이트, 황화나트륨, DMEM(둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)) 및 PBS(포스페이트 완충 염수)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용액을 사용하여 달성할 수 있다.

일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물의 이온 강도는 약 0.0001M 내지 약 1.5M일 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물의 이온 강도는 통상의 염, 예를 들면, NaCl, KCl, MgCl₂, CaCl₂, CaSO₄, DPBS(둘베코 포스페이트-완충 염수, 10X)을 혼합하여 조정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물의 이온 강도는 통상의 염을 혼합하여 조정할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 통상의 염은 하나 이상의 염 형성 양이온과 하나 이상의 염 형성 음이온으로 구성되며, 여기서 상기 염 형성 양이온은 암모늄, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 피리디늄, 4급 암모늄 및 나트륨으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 상기 염 형성 음이온은 아세테이트, 카보네이트, 클로라이드, 시트레이트, 시아나이드, 플루오라이드, 니트레이트, 니트라이트 및 포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물은 약 1 내지 약 10000Pa·S의 범위 내의 점도를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물은 약 50 내지 약 2500Pa의 범위 내의 저장 모듈러스를 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, 특정한 생체내 부위에 적용하기 위한 펩타이드 조성물을 선택하는 방법은 펩타이드 조성물에 대한 저장 모듈러스, 점도, 겔화 시간, 복원 시간 및/또는 정도 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 매개변수를 결정하는 단계, 결정된 매개변수를 다양한 적용을 위한 사양과 비교하는 단계, 상기 비교에 비추어 펩타이드 조성물을 선택하는 단계 및 선택된 펩타이드 조성물을 부위에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 특정한 실시형태에서, 본 발명은, 예를 들면, 약 6 내지 약 20개 아미노산의 범위 내의 길이 및 소수성 아미노산과 친수성 아미노산이 교호되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함할 수 있고, (i) 실온에서 약 1Pa·s 내지 약 500,000Pa·s의 범위 내의 점도를 갖고/갖거나; (ii) 1rad/sec의 진동수 및 1Pa의 진동 응력(oscillation stress)에서 약 1 내지 약 5000Pa의 범위 내의 저장 모듈러스를 갖고/갖거나; (iii) 약 2.5 내지 약 4.0의 범위 내의 pH 및/또는 약 0.0001M 내지 약 1.5M의 범위 내의 이온 강도에 노출/유지되는 경우 약 0 내지 약 30초의 시간 기간 내에 겔을 형성함을 특징으로 하는 액체 펩타이드 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이러한 조성물은 수성 조성물이다.

또한, 일부 특정한 실시형태에서, 본 발명은 어떤 특수한 상황에서 사용하기에 특히 적절한 펩타이드 조성물을 디자인, 선택 및/또는 제조하는 방법을 제공한다. 일부 이러한 실시형태에서, 어떤 특수한 상황은 특정한 생체내 부위에로의 적용이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 제공된 방법은, 예를 들면, (i) 저장 모듈러스, 점도, 겔화 시간, 전단-담화(shear-thinning) 특성, 펩타이드 나노섬유 재조립 시간으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 매개변수 및/또는 특정한 생체내 부위에로의 적용을 위해 적절한 본원에 기재된 하나 이상의 기타 매개변수를 결정하고; (ii) 이러한 매개변수에 의해 특징지워진 펩타이드 조성물을 본원에 제공된 지침에 따라서 디자인, 선택 및/또는 제조하는 것을 포함할 수 있다.

대안적으로 또는 추가로, 일부 특정한 실시형태에서, 본 발명은, 예를 들면, 특정 생체내 부위에 투여하기 위한 특정한 펩타이드 조성물을 선택하는 방법을 제공하며; 이러한 예시적 방법은 (i) 저장 모듈러스, 점도, 겔화 시간, 전단-담화 특성, 펩타이드 나노섬유 재조립 시간으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 매개변수 및/또는 펩타이드 조성물에 대한 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 기타 매개변수를 결정하는 단계; (ii) 결정된 하나 이상의 매개변수를 특정한 생체내 부위에로의 적용에 적절한 것으로 결정된 한 세트의 특징들과 비교하는 단계; (iii) 상기 비교에 비추어 펩타이드 조성물을 선택하는 단계 및 (iv) 선택된 펩타이드 조성물을 부위에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 목적 및 특징은 하기 기재된 도면 및 청구범위를 참조로 하여 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1은 PBS 완충 용액 중에서의 펩타이드 조성물의 예시적 겔 형성을 도시한다. RADA16, IEIK13,및 KLD12를 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0% 및 2.5%의 다양한 농도에서 플레이팅하였다. RADA16, IEIK13 및 KLD는 모든 농도에서 겔화되었다.
도 2a 및 2b는 RADA16의 예시적 레올로지 특성을 도시한다. 도 2a는 1Pa 및 10rad/s에서 수행된 응력 스윕(stress sweep) 시험을 도시한다. 도 2b는 RADA16 농도의 함수로서 측정된 저장 모듈러스를 도시한다. RADA16 조성물의 저장 모듈러스는 이의 농도와 선형 관계를 가질 수 있다.
도 3a 및 3b는 IEIK13의 예시적 레올로지 특성을 도시한다. 도 3a는 1Pa 및 10rad/s에서 수행된 응력 스윕 시험을 도시한다. 도 3b는 IEIK 농도의 함수로서 측정된 저장 모듈러스를 도시한다. IEIK13 조성물의 저장 모듈러스는 이의 농도와 선형 관계를 가질 수 있다.
도 4a 및 4b는 KLD12의 예시적 레올로지 특성을 도시한다. 도 4a는 1Pa 및 10rad/s에서 수행된 응력 스윕 시험을 도시한다. 도 4b는 KLD12 농도의 함수로서 측정된 저장 모듈러스를 도시한다. KLD12 조성물의 저장 모듈러스는 이의 농도와 선형 관계를 가질 수 있다.
도 5a 및 5b는 1% 펩타이드 조성물에 미치는 DMEM(둘베코 변형 이글 배지)의 효과를 도시하는 막대 그래프이다. 도 5a는 펩타이드 조성물에 대한 DMEM 처리 전 또는 후의 저장 모듈러스 데이터(1Pa 및 10rad/s에서 수행됨)를 도시한다. 도 5b는 DMEM 처리 후 저장 모듈러스의 배수 증가를 도시한다.
도 6A는 RADA16 및 DMEM 혼합물(1:1 용적 비)의 사진이다. 상기 혼합물은 묽고 혼탁하였다. 도 6B는 원심분리 후의 혼합물을 도시한다. RADA16(즉, 원심분리관의 바닥에 있는 반투명 축적물)은 혼합물로부터 침전되었다.
도 7은 pH 2 내지 3 및 생리학적 pH(DMEM)에서의 RADA16, KLD12 및 IEIK13 조성물의 나노구조를 도시한다. DMEM 처리가 강성 조성물을 형성할 수 있는 반면, DMEM을 혼합하는 것은 펩타이드를 침전시킬 수 있다.
도 8은 pH = 2.0 및 3.4에서의 1% KLD12 조성물의 10rad/s에서의 예시적 응력 스윕 시험을 도시한다. 도 9는 pH = 2.1 및 3.7에서 1% IEIK13 조성물의 10rad/s에서의 예시적 응력 스윕 시험을 도시한다. 도 10은 pH = 2.5 및 3.4에서 1% RADA16 조성물의 10rad/s에서의 예시적 응력 스윕 시험을 도시한다. 펩타이드 조성물의 저장 모듈러스는 pH 증가에 따라 증가될 수 있다.
도 11a 및 11b는 1Pa에서의 RADA16의 예시적 진동수 스윕(frequency sweep) 시험을 도시한다. 도 11a는 pH 2.5 및 3.4에서 1% RADA16의 측정이다. 도 11b는 pH 2.5 및 3.4에서 2.5% RADA16의 측정이다.
도 12는 pH 3.2, 3.4, 3.6 및 4.0에서 2.5% RADA16의 사진이다. 상기 조성물은 pH 수준이 약 3.5였을 때 투명하였고 pH = 3.6에서는 약간 혼탁하였다. 상기 조성물은 pH = 4.0에서 침전되었다.
도 13은, 전단 응력의 존재 또는 부재하에, 상이한 pH 수준에서의 RADA16, KLD12 및 IEIK13의 나노구조 및/또는 재조립을 도시한다. 주된 상호작용은 pH 및 전단 응력에 의해 결정될 수 있다.
도 14 내지 16은 각각 선택된 농도에서 RADA16, IEIK 및 KLD의 세포 생존력(mMSC)을 도시한다. *는 세포 생존력이 그 다음 좌측 컬럼에서의 세포 생존력보다 유의적으로 낮다는 것을 나타낸다(p-값 < 0.05). #는 세포 생존력이 그 다음 좌측 컬럼에서의 세포 생존력보다 유의적으로 높다는 것을 나타낸다(p-값 < 0.05).
도 17a는 IEIK13의 구조를 예시한다. 도 17b는 DMEM 처리 전과 후의 IEIK13의 SEM 영상을 도시한다. DMEM 처리 후의 IEIK13 섬유는 DMEM 처리 전의 섬유보다 두꺼울 수 있다.
도 18은 2.5% RADA16의 레올로지 특성에 미치는 pH의 효과를 보여주는 저장 모듈러스의 막대 그래프이다. 저장 모듈러스는 1rad/s에서 측정되었다.
도 19는 1.5% IEIK13의 레올로지 특성에 미치는 pH의 효과를 보여주는 저장 모듈러스의 막대 그래프이다. 저장 모듈러스는 1rad/s에서 측정되었다.
도 20a는 pH = 2.1, 3.0, 3.3 및 3.5에서의 1% IEIK13의 예시적 유동 점도 시험을 도시한다. 도 20b는 0.003 l/sec의 전단 속도에서의 예시적 점도 측정의 막대 그래프이다.
도 21a, 21b, 21c 및 21d는 각각 pH = 2.1, 3.0, 3.3 및 3.5에서 1% IEIK13에 높은 전단응력을 가한 후에 시간의 함수로서 저장 모듈러스 측정을 도시한다. 수평선은 1% IEIK13의 본래 저장 모듈러스를 나타낸다.
도 22a 및 22b는 pH 2.2 및 3.4에서 RADA16 농도의 함수로서 저장 모듈러스의 막대 그래프이다. 도 22a는 DMEM 처리 전의 측정이다. 도 22b는 DMEM 처리 후의 측정이다.
도 23a 및 23b는 pH 2.3 및 3.4에서 IEIK 농도의 함수로서 저장 모듈러스의 막대 그래프이다. 도 23a는 DMEM 처리 전의 측정이다. 도 23b는 DMEM 처리 후의 측정이다.
도 24 및 25는 시간의 함수로서 저장 모듈러스 측정을 도시한다. 도 24는 pH 2.2, 2.6, 2.8, 3.1 및 3.4에서의 2.5% RADA16 데이터를 포함한다. 도 25는 pH 2.3, 2.6, 2.9 및 3.2에서의 1.5% IEIK13 데이터를 포함한다. 시간 스윕 시험은 20mm 플레이트 및 500㎛ 갭 거리를 이용하여 1rad/sec 및 1Pa에서 수행되었다. 시간 스윕 시험 동안, DMEM을 측정 플레이트 주변의 챔버에 부가하여 펩타이드를 시간 = 0에서 침지시켰다.
도 26은 낮은 염 조건 또는 높은 염 조건(즉, 임계 이온 강도를 초과)에서의 펩타이드의 나노구조 및/또는 재조립을 도시한다. 염 용액의 적용 방법(처리 또는 혼합)은 나노구조를 변화시킬 수 있다. 펩타이드를 염 용액으로 처리하는 것은 강성 겔을 형성할 수 있는 한편, 염 용액을 펩타이드와 혼합하는 것은 상 분리를 유발할 수 있다.
도 27 내지 29는 1Pa에서 1rad/s 내지 10rad/s의 예시적 진동수 스윕 시험을 도시한다. 도 27은 NaCl 용액(0.2M 이온 강도)의 존재 또는 부재하의 1% KLD12의 측정이다. 도 28은 NaCl 용액(0.02M 이온 강도)의 존재 또는 부재하의 1% IEIK13의 측정이다. 도 29는 NaCl 용액(0.7M 이온 강도)의 존재 또는 부재하의 1% RADA16의 측정이다.
도 30은 1rad/s에서의 저장 모듈러스의 막대 그래프이다. 1.0% RADA16을 이온 강도가 0 내지 1.0M로 다양한 NaCl에 노출시켰다.
도 31은 1rad/s에서의 저장 모듈러스의 막대 그래프이다. 1.0% IEIK13을 이온 강도가 0 내지 0.04M로 다양한 NaCl에 노출시켰다.
도 32a는 0, 0.01 및 0.02M의 NaCl 이온 강도에서의 1% IEIK13의 유동 점도 시험을 도시한다. 도 32b는 0.003 l/sec의 전단 속도에서의 점도의 막대 그래프이다.
도 33a, 33b 및 33c는 각각 0, 0.01 및 0.02의 NaCl 이온 강도에서 1% IEIK13에 높은 전단응력을 가한 후 시간의 함수로서 저장 모듈러스 측정을 도시한다. 수평선은 각 1% IEIK13 조성물의 본래 저장 모듈러스를 나타낸다.
도 34는 DMEM 처리 전 또는 후 NaCl 이온 강도의 함수로서 1Pa에서의 1% RADA16의 예시적 저장 모듈러스를 도시한다.
도 35는 DMEM 처리 전 또는 후 NaCl 이온 강도의 함수로서 1Pa에서의 1% IEIK13의 예시적 저장 모듈러스를 도시한다.
도 36은 선택된 염(NaCl, KCl, MgCl₂ 및 CaCl₂)을 갖는 1% RADA16의 예시적 저장 모듈러스를 도시한다. *는 G'가 대조물(염 없음)보다 유의적으로 높다는 것을 나타낸다(P < 0.05). #는 G'가 0.15M의 NaCl 이온 강도를 갖는 1% RADA16보다 유의적으로 낮다는 것을 나타낸다(P < 0.05).
도 37은 DMEM 처리 후 선택된 염(NaCl, KCl, MgCl₂ 및 CaCl₂)을 갖는 1% RADA16의 예시적 저장 모듈러스를 도시한다. *는 G'가 대조물(염 없음, DMEM 처리 후)보다 유의적으로 높다는 것을 나타낸다(P < 0.05).
도 38은 완충 염수 처리 후 1.5% IEIK13, 1.5% KLD12 및 2.5% RADA16에 대한 시간의 함수로서 예시적 저장 모듈러스 측정을 도시한다. 시간 스윕 시험은 20mm 플레이트 및 500㎛ 갭 거리를 이용하여 1rad/sec 및 1Pa에서 수행하였다. 시간 스윕 시험 동안, 완충 염수를 측정 플레이트 주변의 챔버에 부가하여 펩타이드를 시간 = 0에서 침지시켰다.
도 39는 특정 이온 강도에서의 RADA16, KLD12 및 IEIK13의 나노구조 및/또는 재조립을 예시한다. 높은 전단응력은 나노구조 및/또는 재조립을 변화시킬 수 있다.
도 40은 1rad/sec에서의 2.5% RADA16의 저장 모듈러스를 도시한다. NaCl 부가 및 pH 상승은 2.5% RADA16의 저장 모듈러스를 증가시켰다.
도 41A, 41B, 41C 및 41D는 실시예 4 및 7에서 기재된 바와 같은 상이한 염 및/또는 염 농도를 갖는 펩타이드 조성물을 제조하는데 있어 사용된 단계들을 예시한다. 당업계의 숙련가는, 예를 들면, 상이한 pH, 펩타이드 농도 등을 갖는 펩타이드 조성물을 분석하는데 유사한 전략이 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 도 41A에서, 펩타이드 분말을 유리 바이알에 위치시켰다. 도 41B에서, 펩타이드 분말을 먼저 최종 용적의 선택된 분율에서 탈이온수에 용해시키고; 완전한 가용화를 성취하거나 이를 보장하기 위해 와류(vortexing) 및/또는 초음파처리를 원하는 대로 사용하였다. 도 41C에서, 농축된 염 용액을 사용된 탈이온수의 용적에 의존적인 양 및 농도로 상부에 부가하였다. 도 41D에서, 용액을 예를 들면 와류에 의해 혼합하였다.
도 42A, 42B, 42C, 42D, 42E, 42F 및 42G는 각각 똑바로 세워진 및 뒤집힌, 0.5% RADA16, 및 0, 0.005, 0.05, 0.125, 0.250, 0.500 및 1M CaCl₂ 혼합물의 사진들이다. 도 42E는 최적의 완전히 기능적인 겔을 도시한다. 도 42F는 반-기능적 겔을 도시한다. 도 42G는 비기능적 겔을 도시한다.
도 43은 0.125M, 0.250M 및 0.500M의 농도에서 NaCl, KCl 및 CaCl₂와 혼합된 0.5% RADA16의 저장 모듈러스 측정을 도시한다.
도 44는 2.5% RADA16 및 0.125M CaCl₂를 갖는 2.5% RADA16의 저장 모듈러스 측정을 도시한다.
도 45a 및 45b는 기계적 교란 후 0.125M, 0.250M 및 0.500M을 갖는 RADA16의 저장 모듈러스 측정이다. *는 대조 샘플이고 교란된 샘플이 다소 상이함을 나타낸다.
도 46은 시간의 함수로서, CaCl₂ 및 CaSO₄로 처리된 2.5% RADA16의 저장 모듈러스 측정이다.
도 47a는 IEIK13 및 인디고 카민으로 처리된 IEIK13의 예시적 레올로지 데이터이다. 도 47b는 IEIK13 및 인디고 카민으로 처리된 IEIK13의 강성을 도시한다. 도 47c는 RADA16 및 링거액을 갖는 RADA16의 강성을 도시한다. 도 47d는 뒤집힌, 링거액을 갖는 RADA16의 사진이다. 도 46e는 IEIK13 및 뒤집힌, 인디고 카민을 갖는 IEIK13의 사진이다. 도 47f는 주사기 내에 위치한 인디고 카민을 갖는 IEIK13의 사진이다.
도 48은 폐의 파열 압력(burst pressure)의 증가를 도시하는, 2.5% RADA16 및 NaCl을 갖는 2.5% RADA16의 그래프이다.

정의

본원에서 사용되는 바와 같은 "제제"란 용어는, 예를 들면, 폴리펩타이드, 핵산, 사카라이드, 지질, 소분자, 금속 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 화학적 부류의 화합물 또는 실체를 의미할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제제는 천연에서 발견되고/되거나 천연으로부터 수득되는 천연 산물이거나 이러한 천연 산물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제제는 사람 손의 작동을 통해 디자인, 조작 및/또는 생산되고/되거나 천연에서 발견되지 않는 하나 이상의 실체이거나 이러한 실체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제제는 분리된 또는 순수한 형태로 사용될 수 있고; 일부 실시형태에서, 제제는 조(crude) 형태로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 잠재적 제제는 예를 들면 그 내부에서 활성 제제를 동정하거나 특징규명하기 위해 스크리닝될 수 있는 컬렉션 또는 라이브러리로서 제공된다. 본 발명에 따라서 이용될 수 있는 제제들의 일부 특정한 실시형태는 소분자, 항체, 항체 단편, 압타머, 핵산(예: siRNA, shRNA, DNA/RNA 하이브리드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임), 펩타이드, 펩타이드 모사체(peptide mimetic) 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제제는 중합체이거나 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제제는 중합체가 아니고/아니거나 실질적으로 어떠한 중합체도 함유하지 않는다. 일부 실시형태에서, 제제는 적어도 하나의 중합체 모이어티를 함유한다. 일부 실시형태에서, 제제는 중합체 모이어티가 부족하거나 실질적으로 어떠한 중합체 모이어티도 함유하지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "아미노산"이란 용어는 이의 가장 넓은 의미에서, 하나 이상의 펩타이드 결합의 형성을 통해 폴리펩티드 쇄 내로 통합될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 일반적 구조 H₂N-C(H)(R)-COOH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 천연 발생 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 합성 아미노산이고; 일부 실시형태에서, 아미노산은 D-아미노산이고; 일부 실시형태에서, 아미노산은 L-아미노산이다. "표준 아미노산"은 천연 발생 펩티드에서 통상적으로 발견되는 임의의 20개 표준 L-아미노산을 지칭한다. "비표준 아미노산"은 합성적으로 제조되거나 또는 천연 공급원으로부터 수득되는지에 관계없이, 표준 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드에서 카복시- 및/또는 아미노-말단 아미노산을 포함하는 아미노산은 상기 일반적 구조와 비교하여 구조적 변형을 함유할 수 있다. 예를 들면, 아미노산은 일반적 구조와 비교하여 메틸화, 아미드화, 아세틸화 및/또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 변형은 예를 들면 그 외의 동일한 비변형 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드와 비교하여 변형 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드의 순환 반감기를 변화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 변형은 그 외의 동일한 비변형 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드와 비교하여 변형 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드의 관련 활성을 실질적으로 변경하지 않는다. 문맥으로부터 명백한 바와 같이, 일부 실시형태에서, "아미노산"이란 용어는 유리 아미노산을 지칭하는데 사용되고; 일부 실시형태에서, 이는 폴리펩타이드 아미노산 잔기를 지칭하는데 사용된다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "대략" 또는 "약"은 관심대상의 하나 또는 그 이상의 값에 적용될 때, 언급된 참조값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 명시되지 않거나 달리 문맥으로부터 명백하지 않으면, 언급된 참조값의 어느 한쪽 방향(보다 큰 또는 보다 적은)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 이하 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다(이런 수가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우를 제외하고).

하나의 존재, 수준 및/또는 형태가 다른 것의 존재, 수준 및/또는 형태와 상호관련된다면, 두 사건 또는 실체는 본원에서 사용되는 바와 같이 서로 "연합"된다. 예를 들어, 특정 실체(예를 들어, 폴리펩티드, 유전적 특징(genetic signature), 대사산물 등)는 이의 존재, 수준 및/또는 형태가 (예를 들어, 관련 집단에 걸쳐) 특정한 질환, 장애 또는 병태의 발병률 및/또는 감수성과 상호관련된다면 이러한 질환, 장애, 또는 병태와 연관되는 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하여 서로 물리적으로 인접하고 계속 유지된다면 2개 이상의 실체는 서로 "연합"된다. 일부 실시형태에서, 물리적으로 서로 연합된 2개 이상의 실체는 서로 공유 결합되고; 일부 실시형태에서, 물리적으로 서로 연합된 2개 이상의 실체는 서로 공유 결합되지 않지만, 예를 들면, 수소결합, 반데르발스 상호작용, 소수성 상호작용, 자성 및 이들의 조합에 의해 비-공유적으로 연합된다.

"필적하는"은 수득된 결과 또는 관찰된 현상의 비교를 허용할 만큼 충분히 서로 유사한 조건, 환경, 개체 또는 집단의 2가지(또는 그 이상) 세트를 기재하기 위해 본원에서 이용된다. 일부 실시형태에서, 조건, 환경, 개체 또는 집단의 필적하는 세트는 복수의 실제적으로 동일한 특질 및 하나 또는 적은 수의 변화된 특질에 의해 특징된다. 당업계의 숙련가는 환경, 개체 또는 집단의 상이한 세트 하에 또는 이를 이용하여 수득된 결과 또는 관찰된 현상에서 차이가 변화된 특질에서 변이에 의해 유발되거나 또는 변이를 지시한다는 합리적인 결론을 보장하는 충분한 수와 유형의 실질적으로 동일한 특질을 특징으로 할 때, 환경, 개체 또는 집단의 세트가 서로에 필적한다는 것을 인지할 것이다.

본원에 기재된 특정 방법론은 "결정하는" 단계를 포함한다. 당업계의 숙련가라면, 본 명세서를 판독할 때 이러한 "결정"이 예를 들면 본원에 명백히 언급된 특정 기술들을 포함하는 당업계의 숙련가들이 이용할 수 있는 각종 기술들을 이용할 수 있거나 이러한 기술들 중 어느 것의 사용을 통해 달성될 수 있음을 인지할 것이다. 일부 실시형태에서, 측정은 물리적 샘플의 조작을 수반한다. 일부 실시형태에서, 측정은 예를 들면 관련 분석을 수행하도록 맞게 조정된 컴퓨터 또는 기타 처리 유닛을 이용하는 데이터 또는 정보의 고려 및/또는 조작을 수반한다. 일부 실시형태에서, 측정은 공급원으로부터 관련 정보 및/또는 자료를 수용하는 것을 수반한다. 일부 실시형태에서, 측정은 샘플 또는 실체의 하나 이상의 특질을 필적하는 참고물과 비교하는 것을 수반한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "겔"이란 용어는 레올로지 특성이 용액, 고체 등과 구별되는 점탄성 물질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 이의 저장 모듈러스(G')가 이의 모듈러스(G")보다 클 경우 겔인 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 용액 중에서 화학적 또는 물리적 가교결합된 망이 있을 경우 겔인 것으로 간주되며, 이것은 점성 용액 중의 얽힌(entangled) 분자들과 구별된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "시험관내(in vitro)"란 용어는 다세포 유기체 내가 아니라, 인공 환경, 예를 들면, 시험관 또는 반응 용기 내, 세포 배양물 내 등에서 일어나는 사건을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "생체내(in vivo)"란 용어는 사람 또는 비-사람 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 일어나는 사건을 의미한다. 세포 기반 시스템의 맥락에서, 상기 용어는 살아있는 세포 내에서 일어나는 사건(예를 들면, 시험관내 시스템과 반대되는)을 의미하기 위해 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "펩타이드"란 용어는 전형적으로 비교적 짧은, 예를 들면 약 100개 아미노산, 약 50개 미만 아미노산, 20개 미만 아미노산 미만 또는 10개 미만 아미노산의 길이를 갖는 폴리펩타이드를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "폴리펩타이드"란 용어는 아미노산들의 임의의 중합체 쇄를 의미한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 천연에서 발생하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 천연에서 발생하지 않는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 사람 손의 작용을 통해 디자인 및/또는 생산되도록 조작되는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 천연 아미노산, 비-천연 아미노산 또는 이들 둘 다를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 오직 천연 아미노산만을 포함하거나 오직 천연 아미노산만으로 이루어질 수 있거나, 오직 비-천연 아미노산만을 포함하거나 오직 비-천연 아미노산만으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 D-아미노산, L-아미노산 또는 이들 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 오직 D-아미노산만을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 오직 L-아미노산만을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는, 예를 들면, 폴리펩타이드의 N-말단, 폴리펩타이드의 C-말단 또는 이들의 조합에서 하나 이상의 아미노산 측쇄를 변형시키거나 이에 부착된 하나 이상의 펜던트 그룹 또는 기타 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 펜던트 그룹 또는 변형은 아세틸화, 아미드화, 지질화, 메틸화, 페길화 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있으며, 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 사이클릭일 수 있고/있거나 사이클릭 부분을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 사이클릭이 아니고/아니거나 어떠한 사이클릭 부분도 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 직쇄이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 스테이플드 폴리펩타이드(stapled polypeptide)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, "폴리펩타이드"란 용어는 참조 폴리펩타이드, 활성 또는 구조의 명칭에 추가될 수 있고; 이러한 경우에, 이는 본원에서 관련 활성 또는 구조를 공유하고 따라서 동일한 폴리펩타이드 부류 또는 계열의 구성원인 것으로 간주될 수 있는 폴리펩타이드를 지칭하는데 사용된다. 각각의 이러한 부류의 경우, 본 명세서는 아미노산 서열 및/또는 기능이 공지되어 있는 부류 내의 예시적 폴리펩타이드를 제공하고/하거나 당업계의 숙련가들은 이러한 예시적 폴리펩타이드를 알 것이고; 일부 실시형태에서, 이러한 예시적 폴리펩타이드는 이 폴리펩타이드 부류 또는 계열에 대한 참조 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 부류 또는 계열의 구성원은 이 부류의 참조 폴리펩타이드와(일부 실시형태에서는 이 부류 내의 모든 폴리펩타이드와) 현저한 서열 상동성 또는 동일성을 나타내고/내거나 이와 공통의 서열 모티프(예: 특징적인 서열 요소)를 공유하고/하거나 (일부 실시형태에서는 필적하는 수준에서 또는 지정된 범위 내에서) 이와 공통의 활성을 공유한다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 구성원 폴리펩타이드는 적어도 약 30 내지 40%이고 흔히 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상을 초과하는, 참조 폴리펩타이드와의 전체적 서열 상동성 또는 동일성 정도를 나타내고/내거나, 매우 높은 서열 동일성, 흔히 90% 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과의 동일성을 나타내는 적어도 하나의 영역(예를 들면, 일부 실시형태에서 특징적인 서열 요소일 수 있거나 이를 포함할 수 있는 보존된 영역)을 포함한다. 이러한 보존된 영역은 일반적으로 적어도 3 내지 4개 및 흔히 20개 이하 또는 그 이상의 아미노산을 포괄하고; 일부 실시형태에서, 보존된 영역은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 그 이상의 연속적 아미노산의 적어도 하나의 신장부를 포괄한다. 일부 실시형태에서, 유용한 폴리펩타이드는 모(母) 폴리펩타이드의 단편을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 유용한 폴리펩타이드는 복수의 단편들을 포함하거나 이러한 단편들로 이루어질 수 있는데, 상기 단편 각각은 관심대상의 폴리펩타이드에서 발견되는 서로에 대한 공간적 배열과 상이한 공간적 배열로 동일한 모 폴리펩타이드 내에서 발견되어(예를 들면, 모 폴리펩타이드 내에서 직접 연결되어 있는 단편은 관심대상의 폴리펩타이드 내에서는 공간적으로 분리될 수 있거나 그 반대일 수 있고/있거나, 단편은 모 폴리펩타이드 내에서의 순서와 상이한 순서로 관심대상의 폴리펩타이드 내에 존재할 수 있다), 관심대상의 폴리펩타이드는 이의 모 폴리펩타이드의 유도체가 된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "참조물"이란 용어는 이에 대해 비교가 수행되는 표준물 또는 대조물을 말한다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 관심대상의 제제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은 참조 또는 대조 제제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값과 비교된다. 일부 실시형태에서, 참조물 또는 대조물은 관심대상의 시험 또는 측정과 실질적으로 동시에 시험 및/또는 측정된다. 일부 실시형태에서, 참조물 또는 대조물은 임의로 실질적인 매체로 구현되는 역사적 참조물 또는 대조물이다. 전형적으로, 당업계의 숙련가들에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 참조물 또는 대조물은 평가중인 것과 필적하는 조건 또는 환경 하에 측정되거나 특징 규명된다. 당업계의 숙련가들은 특정한 가능한 참조물 또는 대조물에 대한 의존성 및/또는 비교가 타당함을 보여주기에 충분한 유사성이 언제 존재하는지를 인지할 것이다.

"자가-조립"이란 용어는, 본원에서 적절한 조건 하에, 예를 들면, 특정 폴리펩타이드를 함유하는 용액(예: 수용액)이 겔 특징을 발현하도록 하는 구조로 자발적으로 자가-연합할 수 있는 특정 폴리펩타이드를 지칭하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 조성물 내에서 각각의 자가-조립 폴리펩타이드들 간의 상호작용은 가역적이여서, 상기 조성물은 겔 상태와 용액 상태 간에 가역적으로 전이될 수 있다. 일부 실시형태에서, 자가-조립(및/또는 분해)은 하나 이상의 환경적 유발원(예: pH, 온도, 이온 강도, 오스몰농도(osmolarity), 오스몰랄농도(osmolality), 가해진 압력, 가해진 전단응력 등 중 하나 이상의 변화)에 반응성이다. 일부 실시형태에서, 자가-조립 폴리펩타이드의 조성물은 이 폴리펩타이드가 조립된 상태로 있을 경우에 검출가능한 베타-쉬트(beta-sheet) 구조를 특징으로 한다.

특정 실시형태의 상세한 설명

하나 이상의 실시형태에 따라서, 본 발명은 동일한 펩타이드의 다른 제조물과 비교하여 증진된 유용성 및 개선된 성능을 제공할 수 있는 특정 펩타이드의 제조물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 개시된 제조물은 예를 들면 다양한 조사 및/또는 임상 적용과 연관된 충족되지 않은 요건들을 사전에 다룰 수 있는 상이한 또는 독특한 특성들을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 펩타이드 제조물의 특정한 목적하는 특징은, 제조물의 pH 수준을 펩타이드의 표준 또는 참조 제조물과 비교하여 상승시키고/시키거나 표준 또는 참조 제조물 중의 염의 종류 및/또는 양과 비교하여 하나 이상의 염을 제조물에 부가함으로써 제공된다. 일부 실시형태에서, 제공된 제조물은 본원에 기재된 바와 같이 표준 또는 참조 제조물에 비해 보다 안정한 하이드로겔 형성 및/또는 기타 속성들을 특징으로 한다.

펩타이드

하나 이상의 실시형태에 따라서, 펩타이드 조성물은 약 6 내지 약 200개 아미노산 잔기를 갖는 양친매성 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드는 적어도 약 7개 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드는 약 7 내지 약 17개 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드는 적어도 8개 아미노산, 적어도 약 12개 아미노산 또는 적어도 약 16개 아미노산의 길이를 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, 당업계에서 이해되는 바와 같이, 양친매성 폴리펩타이드는 그 서열이 친수성 아미노산과 소수성 아미노산 둘 다를 포함하는 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 이러한 친수성 아미노산 및 소수성 아미노산은 교호적으로 결합되어 펩타이드가 친수성 아미노산과 소수성 아미노산이 교호되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 폴리펩타이드는 서열 Arg-Ala-Asp-Ala(RADA)의 반복 단위를 포함하거나 이것으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 폴리펩타이드는 서열 Lys-Leu-Asp-Leu(KLDL)의 반복 단위를 포함하거나 이것으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 폴리펩타이드는 서열 Ile-Glu-Ile-Lys(IEIK)의 반복 단위를 포함하거나 이것으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 펩타이드는 일반적으로 자가-조립될 수 있고/있거나 특정 조건 하에 수용액 중에서 베타-쉬트 구조를 나타낼 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드는 아미노산 서열: Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala(즉, RADA16, aka [RADA]4; 서열번호 1)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드는 아미노산 서열: Lys-Leu-Asp-Leu-Lys-Leu-Asp-Leu-Lys-Leu-Asp-Leu(즉, KLDL12, aka [KLDL])3 aka KLD12; 서열번호 2)을 갖는다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드는 아미노산 서열: Ile-Glu-Ile-Lys-Ile-Glu-Ile-Lys-Ile-Glu-Ile-Lys-Ile(즉, IEIK13, aka (IEIK)3I; 서열번호 3)을 갖는다.

당업계의 숙련가라면, 본 명세서를 판독할 때, 본 발명을 실시하는데 있어 각종 기타 펩타이드 중 어느 것이라도 대안으로 사용될 수 있음을 이해할 수 것이다. 일부 실시형태에서, 예를 들면, 하나 이상의 펩타이드는 미국 공개 특허출원 제US2009/0111734 A1호, 미국 공개 특허출원 제US2008/0032934 A1호, 미국 공개 특허출원 제US2014/0038909 A1호, 허여된 미국 특허 제US7,846891 B2호, 허여된 미국 특허 제US7,713923 B2호, 허여된 미국 특허 제US 5670483 B2호에 기재되어 있고, 상기 문헌들의 관련 내용은 본원에서 참조로 인용된다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드는 하기 식들 중 하나로 표현되는 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는다.

[화학식 a]

((XY)_l ―(ZY)_m)_n

[화학식 b]

((YX)_l ―(YZ)_m)_n

[화학식 c]

((ZY)_l ―(XY)_m)_n

[화학식 d]

((YZ)_l ―(YX)_m)_n

상기 식들에서,

X는 산성 아미노산을 나타내고, Y는 소수성 아미노산을 나타내고, Z는 염기성 아미노산을 나타내고, l, m 및 n은 모두 정수이다(n(l+m)<200), (1 ≤n ≤100)).

조성물

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 펩타이드 조성물은 특정한 레올로지 및/또는 광학적 특성을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 이러한 레올로지 특성은 겔화 동역학, 가역적 조립 특징, 저장 모듈러스, 점도 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 레올로지 특성은 시험 및/또는 결정(예: 측정)될 수 있고; 일부 실시형태에서, 하나 이상의 레올로지 특성은 육안 관찰에 의해 평가될 수 있다.

일부 실시형태에서, 관련 광학적 특성은 투명도, 광학적 선명도 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 광학적 특성은 시험 및/또는 결정(예: 측정)될 수 있고; 일부 실시형태에서, 하나 이상의 레올로지 특성은 육안 관찰에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 특정한 조성물의 광학적 선명도는 투명, 다소 혼탁 또는 혼탁으로서 기술될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 투명하다.

일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 특정한 수준의 강성을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 강성은 저장 모듈러스의 결정에 의해 평가된다. 당업계의 숙련가들에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 일반적으로 저장 모듈러스 및 강성은 양의 상관관계를 갖는데; 즉 보다 높은 저장 모듈러스는 보다 높은 강성과 관련된다.

일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 특정한 겔화 특성(예: 특정한 시간 기간 내의 특정한 겔화 정도)을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 약 10초 내지 약 48시간 범위의 시간 기간 내에 실질적으로 완전한 겔화를 특징으로 한다.

일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 겔화 및/또는 기타 물질적 및/또는 레올로지 특성의 특정한 복원 정도를 특징으로 한다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 겔화된 제공된 조성물이 붕괴되는 경우, 이들 조성물은 특정한 시간 기간(예: 약 10초 내지 약 48시간 기간) 내에, 기계적 및/또는 레올로지 특성이 본래 겔의 특성들과 상당히 필적하는 겔로 재겔화(re-gel)되는 능력을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 세포 성장 및/또는 생존력을 뒷받침하는 능력을 특징으로 한다.

일부 실시형태에서, 본원에서 기재된 및/또는 이용된 펩타이드 조성물의 하나 이상의 물질적(예: 레올로지) 특성은, 예를 들면, 펩타이드 정체(identity)(예: 아미노산 서열, 소수성 정도 등), 펩타이드 농도, pH, 이온 강도(예: 염 농도), 이온 정체 등 및 이들의 조합에 의해 결정될 수 있다.

펩타이드 농도

하나 이상의 실시형태에 따라서, 본원에 기재된 펩타이드 조성물의 레올로지 특성은 펩타이드 농도의 선택에 의해 제어될 수 있다. 본 발명은, 펩타이드 농도의 선택 및/또는 조정을 통해서, 예를 들면 조성물의 특정한 적용 또는 사용에 특별히 바람직할 수 있는 특정한 목적하는 특징들을 갖는 펩타이드의 조성물의 선택 및/또는 제조를 가능케 하는 매개변수를 정의한다.

예를 들면, 본 발명은 특히, 많은 펩타이드에 있어서, 조성물 강성이 펩타이드 농도에 따라서 실질적으로 선형적으로 증가한다는 것을 입증한다. 게다가, 본원에 기재된 바와 같이, 특정 펩타이드 조성물은 임계 응력 수준을 초과하는 전단 담화 특성을 나타냈다. 또한, 본 발명은 특정한 펩타이드 농도에서 달성된 레올로지 특성이 펩타이드의 정체에 따라서 달라질 수 있다는 것을 입증한다. 예를 들면, 1.5% KLD12의 저장 모듈러스는 2.5% RADA16의 저장 모듈러스과 유사한 것으로 밝혀졌다. 1% IEIK13의 저장 모듈러스는 2.5% KLD12의 저장 모듈러스과 유사하고 2.5% RADA16의 저장 모듈러스보다 높은 것으로 밝혀졌다. 종합적으로, 본 실시예에서 시험된 조성물들 간의 레올로지 강도의 순서는 IEIK13 > KLD12 > RADA16이었고, 따라서 펩타이드 농도가 각 경우에 동일한 경우, IEIK13의 조성물은 KLD12의 조성물이 나타낸 레올로지 강도보다 큰 레올로지 강도를 나타냈고, KLD12의 조성물은 RADA16의 조성물이 나타낸 레올로지 강도보다 큰 레올로지 강도를 나타냈다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드 조성물 중의 펩타이드 농도는 적어도 0.05%, 적어도 0.25%, 적어도 0.5%, 적어도 0.75%, 적어도 1.0% 또는 그 이상이다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드 조성물 중의 펩타이드 농도는 5% 미만, 4.5% 미만, 4% 미만, 3.5% 미만, 3% 미만 또는 그 이하이다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드 조성물 중의 펩타이드 농도는 약 0.5% 내지 약 3%의 범위 내에 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드 조성물 중의 펩타이드 농도는 약 0.5% 내지 약 2.5%의 범위 내에 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드 조성물 중의 펩타이드 농도는 약 1% 내지 약 3%의 범위 내에 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드 조성물 중의 펩타이드 농도는 약 1% 내지 약 2.5%의 범위 내에 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드 조성물 중의 펩타이드 농도는 약 0.5%, 약 1%, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3% 또는 그 이상이다. 일부 특정한 실시형태에서, 펩타이드가 RADA16인 경우, 본 발명의 펩타이드 조성물 중의 펩타이드 농도는 약 0.05% 내지 약 10%의 범위 내에 있다.

일부 특정한 실시형태에서, 펩타이드가 KLD12인 경우, 본 발명의 펩타이드 조성물 중의 펩타이드 농도는 약 0.05% 내지 약 10%의 범위 내에 있다.

일부 특정한 실시형태에서, 펩타이드가 IEIK13인 경우, 본 발명의 펩타이드 조성물 중의 펩타이드 농도는 약 0.05% 내지 약 10%의 범위 내에 있다.

pH

본 발명은 특히, pH가 펩타이드 조성물의 특성들에 영향을 줄 수 있다는 것을 입증한다. 본원에 기재된 바와 같이, 펩타이드 조성물의 pH의 최적화는 기계적 강도를 개선시켜, 펩타이드 조성물이 다양한 임상적 적용을 위해 사용될 수 있도록 한다. 본 출원의 실시예 3은 특정 구체적 실시형태의 세부사항을 예시한다.

하나 이상의 실시형태에 따라서, 제공된 펩타이드 조성물은 관련 펩타이드 및/또는 이 펩타이드가 수중에 가용화될 때 수득되는 것의 pI를 초과(예를 들면, 현저하게 초과하는) pH를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물의 특성들은 pH를 이용하여 제어할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 약 2.5 내지 약 4.0의 범위 내의 pH에서, 펩타이드 조성물의 강성 및/또는 점도는 적절한 참조 조성물(예: 수중에서 동일한 농도에서의 동일한 펩타이드의 조성물)의 것에 비해 증가될 수 있다.

일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물은 펩타이드 및 용매, 전형적으로는 수성 용매를 포함할 수 있고, pH는 염기 또는 산과 같은 pH-조정제를 통해 조정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물은 펩타이드 및 완충액을 포함한다.

일부 실시형태에서, pH-조정된 펩타이드 조성물은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 탄산나트륨, 나트륨 아세테이트, 황화나트륨, DMEM 및/또는 PBS 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 자동화 적정 장치가 pH 조정을 위해 실행될 수 있다.

일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 관련 펩타이드에 대한 pI를 초과하는(예를 들면, 실질적으로 초과하는) pH를 갖고/갖거나 이러한 pH에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 동일한 농도에서 동일한 펩타이드의 수용액의 pH 초과(예를 들면, 실질적으로 초과)의 pH를 갖고/갖거나 이러한 pH에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 이 조성물이 혼탁해지는 pH 미만의 pH를 갖고/갖거나 이러한 pH에서 유지된다.

일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 약 2.5 내지 4.0 이상의 pH를 특징으로 하고; 일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 생리학적 pH에 가까운 pH를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 제공된 조성물 약 3.0 내지 4.0 범위 내의 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 약 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 약 3.1, 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5 또는 그보다 높은 pH 이상의 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 약 4.3, 약 4.2, 약 4.1, 약 4.0, 약 3.9, 약 3.7, 약 3.6, 약 3.5, 약 3.4 또는 그보다 낮은 pH 이하의 pH를 갖는다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 상승된-pH 조성물(즉, pH가 약 2.5 이상인 조성물)은 적절한 참조 조성물(예: 임의로 동일한 염을 갖지만 상이한 pH를 갖는, 동일한 농도에서 동일한 펩타이드의 필적하는 조성물)과 비교하여 더 큰 레올로지 강성 및/또는 개선된 겔화 특성을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 상승된 pH 조성물은 보다 낮은 pH의 상응하는 참조 조성물보다 더 광범위한 적용분야에서 유용하다.

본 발명은, 일부 실시형태에서, 상승된 pH 3.5 이하에서는 IEIK13 조성물의 강성이 현저하게 증가될 수 있는 반면, RADA16 및 KLD12 조성물의 강성은 그렇지 않을 수 있다는 것을 구체적으로 입증한다. 어떠한 특정 이론으로 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명은 pH 3.5 이하에서의 펩타이드 조성물의 상이한 거동이 RADA16 및 KLD12 내의 아스파르트산(D)의 pKa(pKa = 3.71) 및 IEIK13 내의 글루탐산(E)의 pKa(pKa = 4.15)와 관련될 가능성이 있다는 것을 제안한다.

pH가 아스파르트산(D) 및 글루탐산(E)의 pKa보다 높을 경우, 펩타이드 쇄 내의 산성 그룹은 주로 음으로 하전된다. 음으로 하전된 그룹은 펩타이드 쇄 내의 양으로 하전된 그룹(즉, RADA16 내의 아르기닌(R) 및 IEIK13 및 KLD12 내의 라이신(K))과의 분자내 또는 분자간 유인성 전하-전하 상호작용을 유도하여 반투명하거나 불투명한(즉, 이는 이의 구름점을 초과한다) 보다 큰 응집체를 형성하고, 나노섬유(즉, 투명한 점성 조성물)를 형성하기 보다는 가능한 상 분리를 제공한다.

pH가 아스파르트산(D) 및 글루탐산(E)의 pKa보다 낮지만 이의 pKa에 근접한 경우, 더 많아진 음으로 하전된 그룹은 양성 그룹과의 보다 강력한 유인성 전하-전하 상호작용을 유도할 수 있다. 조성물은 나노섬유 형성을 유지할 수 있어 강성이 증가한다.

pH가 약 3.5인 어떤 특정한 예시적 펩타이드 조성물은 표 2에 제시되어 있다. 본원에서 "상승된 pH 조성물"로 간주되는 이러한 조성물은 다양한 응용분야에서 (예를 들면, 실시예에 기술된 것들을 포함하여 본원에 기재된 바와 같은 관련 참조 조성물과 같은 그 외의 보다 낮은 pH의 필적하는 조성물에 비해) 개선된 성능을 제공할 수 있다. 펩타이드 조성물의 기계적 강도 및 다기능성은 상승된 pH에 의해 증진될 수 있다.

[표 2]

하나 이상의 실시형태에 따라서, pH는 겔화 동역학(예를 들면, 겔화가 시작하기까지의 반응 시간)에 영향을 줄 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 펩타이드 조성물의 최적화된 pH를 동정하기 위해 겔화 동역학에 미치는 pH의 효과를 평가할 수 있다.

일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물은 더 높은 pH에서 더 빠르게 겔화될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이, pH 조정을 하지 않은 IEIK13 조성물은 즉각적 저장 모듈러스 증가를 나타내는 반면, pH 조정을 하지 않은 RADA16 조성물(pH 2.2)은 처음 13초 동안은 저장 모듈러스 증가를 나타내지 않는다. pH 조정을 하였을 때, IEIK13와 RADA16 둘 다는 도 24 및 25에 도시된 바와 같이 빠른 겔화로 인해 즉각적 저장 모듈러스 증가를 나타낸다.

이온 강도

본 발명은 이온 강도가 펩타이드 조성물의 레올로지 특성을 변화시킬 수 있음을 입증한다. 펩타이드 조성물의 이온 강도를 증가시키는 것은 일반적으로 다양한 임상적 적용을 위한 기계적 특성을 개선시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 펩타이드 조성물을 위한 최적화된 이온 강도를 동정하기 위해 펩타이드 조성물의 특성에 미치는 이온 강도의 효과는 예를 들면 본원에 기재된 바와 같이 평가할 수 있다.

일부 실시형태에서, 약 0.0001M 내지 약 1.5M 범위 내의 이온 강도에서, 펩타이드 조성물의 강성, 점도 및/또는 겔화 동역학은 증가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물은 이온 강도를 이용하여 제어할 수 있다.

하나 이상의 실시형태에 따라서, 펩타이드 조성물의 이온 강도는 NaCl, KCl, MgCl₂, CaCl₂ 및 CaSO₄를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 통상의 염을 이용하여 조정할 수 있다. 통상의 염은 양이온과 음이온으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 양이온은 암모늄, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 피리디늄, 4급 암모늄 및 나트륨으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 음이온은 아세테이트, 카보네이트, 클로라이드, 시트레이트, 시아나이드, 플루오라이드, 니트레이트, 및 포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

하나 이상의 실시형태에 따라서, 이온 강도가 최적 수준(예를 들면, 가장 높은 강성)에 도달한 경우, 하나 이상의 염 또는 염 용액의 부가는 조심스럽게 조절될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이온 강도가 목적하는 것보다 높다면, 순수가 부가될 수 있다. 하나 이상의 염 또는 염 용액의 부가를 조절하여 이의 오스몰랄농도가 이의 적용에 따라서 저장성, 등장성 또는 고장성이 되도록 조정할 수 있다.

일부 실시형태에서, 특정 펩타이드 조성물의 이온 강도를 조정하기 위해, 일례로서 특정 염 완충용액, 예를 들면, NaCl, KCl, MgCl₂, CaCl₂ 및 DPBS(둘베코 포스페이트-완충 염수, 10X)를 부가할 수 있다.

일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 하나 이상의 염을 포함하고, 상기 염의 정체 및/또는 농도는 상기 조성물을 펩타이드의 물질 침전이 관찰되는 이온 강도 미만의 임계 이온 강도에서 유지시킨다. 일부 실시형태에서, 물질 침전은 액체 조성물이 (예를 들면, 육안 검사에 의해 평가한 바와 같이) 혼탁할 경우에 발생한 것으로 간주된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 혼탁하지 않으며 혼탁한 그 외의 필적하는 조성물(예를 들면, 동일한 농도에서의 동일한 펩타이드의 조성물)보다 낮은 이온 강도를 갖는다.

일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 적절한 참조 조성물(예를 들면, 동일한 농도 및 pH에서 동일한 펩타이드를 갖지만 상이한 염 또는 동일한 염의 상이한 농도를 갖는 조성물)의 이온 강도에 비해 상승된 이온 강도를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 생리학적 강도에 근접한 또는 생리학적 강도에서의 이온 강도를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 상이한 이온 강도의 적절한 참조 조성물과 비교하여 보다 큰 레올로지 강성 및/또는 개선된 겔화 특성을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 상이한(예를 들면, 더 낮은) 이온 강도의 상응하는 참조 조성물보다 광범위한 적용분야에서 사용하기에 적합하다.

어떤 특정한 실시형태에서 따라서, 염 용액 중에 IEIK13, KLD12 또는 RADA16을 포함하는 펩타이드 조성물이 제공되며, 이러한 조성물은 수중에 용해된 관련 펩타이드의 참조 조성물과 상이한 이온 강도를 갖고 참조 조성물에 비해서 개선된 하나 이상의 물질적(예를 들면, 레올로지) 특성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 관련 참조 조성물보다 강성이다. 일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 참조 조성물에 비해 상승된 이온 강도를 갖지만, 여전히 이의 임계 염점(critical salt points) 미만의 이온 강도를 갖는다.

[표 10]

어떠한 특정 이론으로 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명은 이온 강도가 증가된 펩타이드 조성물의 특성이 펩타이드의 용해도와 관련될 수 있음을 제안한다. 약 2 내지 4의 pH 수준에서의 자가-조립 펩타이드의 용해도는 투명하고 균질한 펩타이드 조성물을 제조할 수 있을 정도로 매우 충분히 높다. 펩타이드 쇄 주변의 증가된 이온 강도는 펩타이드의 용해도를 감소시킨다. 펩타이드의 용해도가 조성물이 혼탁해질 정도로 낮은 경우, 이러한 상황은 임계점으로서 지칭될 수 있다. 증가된 이온 강도가 이의 임계점보다 낮지만 임계점에 가까운 경우, 펩타이드는 보다 강력한 소수성 상호작용을 유도하여 강성을 증가시킬 수 있다. 펩타이드 용해도가 이의 임계점 미만으로 감소될 경우(즉, 높은 이온 강도), 펩타이드 조성물은 반투명 또는 불투명할 수 있고(즉, 이는 이의 구름점을 초과한다) 침전될 수 있다(즉, 상 분리). 펩타이드는 투명한 점성 용액을 만드는 나노섬유를 형성하지 않을 수 있다. 무작위적 소수성 상호작용은 염석 효과(salting out effect)로 인해서 높은 이온 강도에서 자가-조립된 나노섬유를 생성하는 소수성 상호작용보다 우세할 수 있다. 무작위적 분자내 및/또는 분자간 응집체는 상 분리를 유발할 수 있다.

하나 이상의 실시형태에 따라서, 임계 이온 강도는 염 및 펩타이드 정체에 따라서 달라질 수 있다. 용해도와 염 농도 간의 관계는 하기 코헨(Cohen) 방정식으로 표현될 수 있다:

log S = B - KI

상기 식에서, S는 펩타이드의 용해도이고, B는 펩타이드-특이적 상수이고, K는 염-특이적 상수이고, I는 염의 이온 강도이다. B는 pH 및 온도와 관련되며, K는 pH와 관련된다.

일부 실시형태에서, 펩타이드의 용해도는 온도 및 pH가 일정할 때(즉, B가 일정할 때) 염석 상수 K 및 이온 강도 I에 의해 통제될 수 있다. K 및 I가 더 높을수록 펩타이드 용해도는 더 낮아진다. 일정한 pH 및 온도에서, K는 염 내의 이온 정체에 의해 결정된다. 종합하면, 4종의 염들 간에 상수 K의 순서는 NaCl > KCl > MgCl₂ = CaCl₂이다.

하나 이상의 실시형태에 따라서, 펩타이드의 용해도는 아미노산 서열에 의해(예를 들면, 펩타이드 내의 친수성 및 소수성 아미노산 잔기의 조성에 의해) 결정될 수 있다. 소수성 아미노산 함량이 비교적 높은 펩타이드(예: IEIK13)는 전형적으로 수성 용매 중에서 낮은 용해도를 갖는다. 이러한 펩타이드는 흔히 높은 강성을 초래하는 자가-조립된 펩타이드 쇄들 간의 강력한 소수성 상호작용을 특징으로 한다. 본원에서 입증된 바와 같이, 이러한 펩타이드의 조성물은 소량의 염을 부가하였을 때 극적인 강성 증가를 나타낼 수 있다. 반대로, 소수성 아미노산 함량이 비교적 낮은 펩타이드(예: RADA16)는 수성 용매 중에서 높은 용해도를 갖는다. 이들 펩타이드는 전형적으로 낮은 강성을 초래하는 자가-조립된 펩타이드들 간의 약한 소수성 상호작용을 갖는다. 이러한 펩타이드의 조성물의 강성은 심지어 대량의 염을 부가하였을 때에도 크게 증가하지 않는다. 이러한 모델과 일치되게, 본 발명은 상대적 소수성과 유사한, 3종의 특정한 예시된 펩타이드들 간의 임계 이온 강도의 순서(예를 들면, 조성물이 혼탁해질 때)를 입증한다: RADA16(0.9 내지 1.2M) > KLD12(0.3 내지 0.4M) > IEIK13(0.03 내지 0.04M).

하나 이상의 실시형태에 따라서, 펩타이드 조성물의 이온 강도는 이의 겔화 동역학에 영향을 줄 수 있다. 일부 실시형태에서, 상승된 이온 강도는 펩타이드 조성물의 겔화를 가속화시킬 수 있다. 겔화를 위해 요구되는 이온 강도는 염 및/또는 펩타이드 정체에 의존할 수 있다. 예를 들면, RADA16, KLD12 및 IEIK13 펩타이드가 완충 염수(즉, 0.15M NaCl, 등장성 채액에 필적함)에 노출되었을 때, IEIK13의 겔화만이 개시되었다. RADA16 및 KLD12는 겔화를 나타내지 않거나 미미한 겔화를 나타냈다. 이러한 조사결과는 상승된 이온 강도에 따른 감소된 펩타이드 용해도를 반영할 수 있다. IEIK13은 전술한 바와 같이 RADA16 및 KLD12보다 이온 강도에 더 민감하다.

일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물의 이온 강도는, 예를 들면 혼합 및/또는 교반 과정이 (통상 소수성) 펩타이드-펩타이드 상호작용으로부터 발생하는 초기에 형성된 조립체(예: 나노섬유)를 파괴한 후, 이의 복원 특징에 영향을 줄 수 있다.

조합된 pH 및 염 효과

본 발명은 pH와 이온 강도의 동시적 조정(예를 들면, 생리학적 조건에의 노출을 통한)이 펩타이드 조성물의 레올로지 특성을 변경시킬 수 있음을 입증한다. 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이, 제공된 펩타이드 조성물에 세포 배양 배지를 포함시킴으로 인해 증가된 pH 수준 및 이온 강도는 이러한 조성물의 다양한 특성들(예: 레올로지 특성)에 영향을 줄 수 있다.

일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물의 강성, 점도 및/또는 겔화 동역학은 생리학적 조건 하에 증가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물의 특성은 pH와 이온 강도의 조합을 통해 제어될 수 있다.

어떠한 특정 이론으로 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명은 펩타이드 조성물의 강성과 관련된 2가지의 주요 분자간 상호작용이 있다고 제안한다: 소수성 상호작용 및 전하-전하 상호작용.

첫째, 소수성 상호작용 및 반발성 정전기 상호작용(repulsive electrostatic interaction)은 낮은 pH에서 β-쉬트 나노섬유의 형성을 통해 점성 용액을 형성하기 위한 주요 구동력이다. 이러한 상호작용들은 낮은 pH에서 현저할 것으로 예상되고, 여기서 다수의 아스파르트산과 글루탐산은 음전하 없이 양성화되며 다수의 아르기닌과 라이신은 양으로 하전된다. 펩타이드 분자는 소수성 상호작용으로 인해 자가-조립하여 나노섬유를 형성하는 한편, 나노섬유의 표면은 펩타이드 분자들 간의 반발성 정전기 상호작용으로 인해 수화된다.

일부 실시형태에서, 약 2 내지 약 3의 pH 수준 부근의 펩타이드 조성물의 강성은 주로 이의 소수성과 관련된다. IEIK13은 7개의 이소류신 그룹(강한 소수성 그룹)을 갖고, KLD12는 6개의 류신 그룹(강한 소수성 그룹)을 갖고, RADA16은 8개의 알라닌 그룹(약한 소수성 그룹)을 갖는다. IEIK13은 동일한 pH 및 농도에서 KLD12 및 RADA16보다 더 높은 저장 모듈러스를 갖는다.

도 17b에 도시된 바와 같이, 수용액 중의 IEIK13 분자를 모의 체액, 예를 들면, DMEM으로 처리하였을 때, 이의 섬유상 구조는 보다 두꺼워졌다. 보다 두꺼운 섬유상 구조는 생리학적 pH 및 인접 나노섬유들 간의 오스몰랄농도에서 증가된 소수성 상호작용으로 인해 발생할 수 있다.

소수성 상호작용은 수성 환경에서 나노섬유 형성을 유도하여 점성 조성물을 생성시킬 수 있다. 높은 전단응력(즉, 감소된 점도 및 강성)이 가해진 후, 펩타이드는 또한 나노섬유를 개질시켜 이의 특성을 회복시킨다. 따라서, 펩타이드는 pH 2 내지 3에서 틱소트로픽 특성을 나타낸다. 펩타이드 조성물은 일단 가해진 전단응력이 제거되면 이의 본래 특성을 천천히 회복한다.

둘째, 유인성 전하-전하 상호작용은 생리학적 조건에서 기존의 소수성 상호작용과 동시에 일어날 수 있다. 펩타이드 분자 부근의 pH가 산성에서 중성으로 변화될 경우, 기존의 소수성 상호작용은 붕괴되지 않을 수 있다. 음으로 하전된 그룹 및 양으로 하전된 그룹은 추가의 유인성 전하-전하 분자간 상호작용을 유도하여, 도 7에서 입증된 바와 같이 펩타이드 조성물이 보다 강성이 될 수 있다.

그러나, 생리학적 조건에서 펩타이드 조립체가 높은 전단응력에 노출될 때, 펩타이드 조립체는 펩타이드 응집체로 붕괴된다. 이는 도 7에 예시된 바와 같이 비가역적 과정이다.

예를 들면, 0.5mL의 DMEM을 수차례 피펫팅에 의해 0.5mL의 2% RADA16와 혼합하였을 때, RADA16은 투명한 점성의 펩타이드 조립체를 형성하지 않았다(즉, 혼탁하고 묽은 에멀젼). 혼합물을 2500rpm에서 5분 동안 원심분리하였을 때, 혼탁한 RADA16의 상 분리가 혼합물로부터 침전되었다. 이러한 경우, 펩타이드 조립체(즉, 소수성 상호작용을 통해 초기에 형성되었음)는 혼합 과정 동안 붕괴될 가능성이 있었다. 유인성 전하-전하 상호작용은 소수성 상호작용보다 우세하였으며, 이는 무작위적 분자내 및 분자간 응집체의 형성을 유도한다. 상 분리는 도 7에 예시되어 있다.

하나 이상의 실시형태에 따라서, IEIK13, KLD12 또는 RADA16은 염 완충액(예: NaCl)에 용해될 수 있고, 이의 pH는 알칼리 염 완충액(예: NaOH)을 이용하여 상승시킬 수 있다. 이의 염 이온 강도는 이의 임계 염점 미만일 수 있다. 이의 pH는 약 2.5 내지 약 4.0일 수 있다. 조성물은 동일한 농도에서의 동일한 펩타이드의 적절한 참조 조성물에 비해 증가된 강성 및 점도를 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, 생리학적 조건(예: 상승된 pH 및 염 이온 강도)은 펩타이드 조성물의 겔화를 가속화시킬 수 있다. 생리학적 조건 하에 IEIK13의 가속화된 겔화는 2가지 구동력, 즉 증가된 pH 및 이온 강도와 관련될 수 있다. 생리학적 조건 하에 RADA16의 가속화된 겔화는 오직 1가지 구동력, 즉 증가된 pH만을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 체액을 갖는 펩타이드 조성물의 가속화된 겔화는 일반적으로 다양한 임상 적용을 위한 이의 기능 및 반응 시간을 개선시킬 수 있다.

세포 친화성(cell compatibility)

하나 이상의 실시형태에 따라서, 제공된 펩타이드 조성물은 일반적으로 높은 세포 생존력과 연관된다.

일부 실시형태에서, KLD12 및 IEIK13은 RADA16에 비해서 유사하거나 높은 세포 생존력을 가질 수 있다. 이들 펩타이드 조성물 간에 전체적 세포 생존력의 순서는 KLD12 > IEIK13 > RADA16이었다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 조성물은 이의 농도가 약 0.75% 이하일 때 80%보다 높은 세포 생존력을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 생존력은 펩타이드 농도가 0.75%보다 높을 때 감소될 수 있다.

형태

일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 펩타이드 조성물은 건조 분말, 용액, 겔(예: 하이드로겔) 또는 이들의 임의의 조합의 형태이다.

일부 실시형태에서, 건조 분말 조성물은, 선택된 용적의 용매(예: 임의로 하나 이상의 염 및/또는 하나 이상의 pH 조정제를 포함하는 수성 용매)를 부가시 목적하는 농도의 용액을 생성하기에 적절한 양으로 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 건조 분말 조성물은 선택된 용적의 용매(예: 임의로 하나 이상의 염 및/또는 하나 이상의 pH 조정제를 포함하는 수성 용매)를 부가시 본원에 기재된 바와 같은 목적하는 펩타이드 농도 및 이온 강도의 용액을 생성하기에 적절한 유형 및 상대량의 펩타이드 및 염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 건조 분말 조성물은 선택된 용적의 용매(예: 임의로 하나 이상의 추가 염 및/또는 하나 이상의 추가 pH 조정제를 포함하는 수성 용매) 부가시 본원에 기재된 바와 같은 목적하는 펩타이드 농도 및 pH의 용액을 생성하기에 적절한 유형 및 상대량의 펩타이드 및 pH 조정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 건조 분말 조성물은 선택된 용적의 용매(예: 임의로 하나 이상의 추가 염 및/또는 하나 이상의 추가 pH 조정제를 포함하는 수성 용매) 부가시 본원에 기재된 바와 같은 목적하는 펩타이드 농도, pH 및/또는 이온 강도의 용액을 생성하기에 적절한 유형 및 상대량의 펩타이드, 염 및 pH 조정제를 포함한다.

일부 실시형태에서, 제공된 조성물은 용기(예: 주사기, 바이알, 웰 등) 내에 내장된다. 일부 실시형태에서, 용기는 그 안에 용적 표시를 포함하는 눈금이 매겨진 용기이다. 일부 실시형태에서, 용기는 캐뉼라 또는 주사기와 같은 전달 장치에 연결시키기에 적절하다. 일부 실시형태에서, 용기는 씰(seal)의 제거 없이 유동성(예: 액체) 물질의 부가 및/또는 제거를 가능케 하는 방식(예: 투과성 포장)으로 밀봉된다.

적용

일부 실시형태에서, 본 발명은 특정 적용에서 사용하기 위한 펩타이드 조성물을 선택하기 위한 시스템을 제공한다. 본원에 기재한 바와 같이 펩타이드 정체, 펩타이드 농도, pH, 염 동일성 및/또는 염 농도는 특정 적용을 위한 특정한 펩타이드 조성물의 특징 및 이에 따른 유용성에 영향을 줄 수 있다.

몇가지 실례를 들자면, 일반적으로, 보다 높은 강성도를 갖는 펩타이드 조성물은 지혈, 조직 플러그(tissue plug), 유착방지 또는 특정 조직 재생을 특징으로 하는 적용에 보다 적합하다. 보다 빠른 겔화 시간을 갖는 펩타이드 조성물은 예를 들면, 약 1분 내지 약 1시간 미만의 겔화 시간이 전형적으로 요구되거나 바람직한, 지혈, 조직 플러그, 유착방지 또는 약물 전달, 혈관 플러그와 같은 특정 조직 플러그 적용에 특히 적합할 수 있다. 보다 빠른 회복 시간을 갖는 펩타이드 조성물은 지혈, 조직 플러그 또는 혈관 플러그에 특히 적합하다.

본원에서 주지된 바와 같이, 자가-조립 펩타이드 조성물은, 예를 들면, 세포 스캐폴드, 액체 이동에 대한 장벽, 지혈제, 공극 충전제 등을 포함하는 각종 생체내 및 시험관내 상황에서 매우 유용할 것이다. 본원에 기재된 바와 같은 이러한 상이한 조성물은 상이한 상황에서 보다 유용할 수 있다.

예를 들면, 수술 동안 (예를 들면 지혈제로서) 펩타이드 조성물의 투여를 수반하는 상황은 이 조성물이 수술 부위에의 투여에 적절한 시간 기간 동안에는 주로 액체로 유지되도록 하고 이어서 빠른 겔화에 의해 안정한, 바람직하게는 투명하고 비교적 강성의 겔을 형성하도록 하는 겔화 동역학으로부터 이득을 얻을 수 있으며, 이러한 조성물을 통해 수술적 조작이 쉽게 진행될 수 있다.

몇가지 실례를 들자면, 본원에 기재된 바와 같이, 일부 실시형태에서, IEIK13 조성물은 예를 들면 특정 강성도 및 빠른 겔화를 요하는 다양한 생체의학적 적용에서 특히 유용할 수 있다. 본 발명은 특정 IEIK13 조성물이 전단응력이 가해진 후 비교적 높은 강성도 및/또는 빠른 회복 속도(가장 빠른 자가-조립)를 특징으로 한다는 것을 입증한다. 또한, 본 발명은 특정 IEIK13 조성물이 생리학적 매질과 접촉될 경우 특히 유용한(예: 높은) 강성을 나타낼 수 있다는 것을 입증한다.

본 발명은 또한 특정 KLD12 조성물이, 예를 들면, 높은 최종 강성도와 함께 용이한 주사가 요구될 경우에 특히 유용할 수 있다는 것을 입증한다. 일부 실시형태에서, KLD12의 자가-조립된 나노섬유는 높은 전단응력에 의해 분해된 다음, 다시 천천히 조립될 수 있다.

본 발명은 또한 특정 KLD12 조성물이 높은 세포 생존력이 요구될 경우에 특히 유용할 수 있다는 것을 입증한다. 일부 실시형태에서, KLD12의 농도는 특정 적용을 위해 요구되는 강성도를 갖도록 증가될 수 있다.

실시예

실시예 1: 특정 참조 펩타이드 조성물의 광학적 선명도

본 실시예는 표시된 펩타이드가 수중에 용해된 특정 참조 펩타이드 조성물의 광학적 선명도 및 상 안정성(즉, 상 분리의 부재)를 예시한다. 일부 실시형태에서, 제공된 펩타이드 조성물의 광학적 선명도(및/또는 상 안정성)를 이러한 참조 조성물의 광학적 선명도와 비교하여 평가한다. 일부 실시형태에서, 특정 농도에서의 특정 펩타이드의 제공된 조성물은 적어도 수중에 용해된 동일한 조성에서의 동일한 펩타이드의 참조 조성물의 것만큼 우수한 광학적 선명도 및/또는 상 안정성을 나타낸다.

표 1을 참조하여 알 수 있는 바와 같이, 다양한 펩타이드 농도에 걸쳐서 광학적 선명도(및 또한 상 안정성)를 나타낸 각종 참조 펩타이드 조성물을 제조하였다. 특히, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5% 또는 그 이상의 농도에서의 펩타이드 조성물은 투명한 광학적 특징 및 상 분리의 부재를 나타냈다.

[표 1]

펩타이드의 외관

실시예 2: 농도의 함수로서의 펩타이드 조성물의 레올로지 특성

본 실시예는 특정 펩타이드 조성물의 레올로지 특성에 미치는 펩타이드 농도의 효과를 기술한다. 일부 실시형태에서, 레올로지 특성은 펩타이드 농도와 선형 관계를 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, 특정한 목적하는 강성도를 갖는 펩타이드 조성물은 수학 모델(즉, 모듈러스 추세선 방정식)을 사용하여 결정된 특정 펩타이드 농도를 갖도록 제형화될 수 있다. 펩타이드 조성물의 제형 차트는, 예를 들면 하기 표 3A에 제시된 바와 같이, 탈이온수 중의 이의 농도를 이의 특정한 저장 모듈러스에 관련시킬 수 있다. 이러한 차트로부터, 당업계의 숙련가는 제형화된 조성물이 목적하는 강성도를 갖도록 하는 특정한 펩타이드 및 적절한 펩타이드 농도를 선택함으로써 목적하는 레올로지 특성을 갖는 펩타이드 조성물을 제형화할 수 있다.

예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이, 일반적으로 RADA16, KLD12 또는 IEIK13 펩타이드를 함유하는 펩타이드 조성물의 레올로지 강도의 순서는 IEIK13 > KLD12 > RADA16인 것으로 입증된다.

[표 3A]

본 실시예는 40mm 플레이트를 갖는 레오미터(AR500, TA Instruments)를 사용하는 선택된 농도에서의 특정 펩타이드 조성물의 다양한 레올로지 특성의 측정을 추가로 설명한다. 펩타이드 조성물(700㎕)을 레오미터 플레이트에 위치시키고, 과량의 조성물을 킴와이프스(Kimwipes)로 조심스럽게 제거하였다. 측정은 37℃에서 2분의 이완 시간 후에 수행하였다. 저장 모듈러스, 손실 모듈러스 및 점도(η')를 300㎛의 측정 기하 갭에 위치한 플레이트를 이용하여 37℃에서 측정하고, 응력 스윕 시험을 0.1Pa 내지 1000Pa의 진동 응력에서 10rad/s에서의 각 진동수(angular frequency)를 이용하여 수행하였다.

RADA16, IEIK13 및 KLD12에 대한 결과는 도 2 내지 4에 도시되어 있다. 도 2 내지 4에 도시된 바와 같이, 펩타이드 조성물은 진동 응력이 약 10 내지 200Pa 미만인 경우 거의 평탄한(plateau) 모듈러스를 나타냈다. 상기 펩타이드 조성물들은 모두 특정 항복 진동 응력(yield oscillation stress)에서 극적인 모듈러스 감소를 가졌다. 적어도 약 1% 내지 약 2.5% 범위의 시험된 농도에서, 펩타이드 조성물은 농도가 증가함에 따라서 저장 모듈러스의 선형 증가를 나타냈다(선형 추세선의 R2는 0.971 내지 0.992이다). 특정 펩타이드 조성물은 임계 응력 수준 초과의 전단 담화 특성을 나타냈다.

본 실시예에서 시험된 다양한 펩타이드 조성물에 대해 결정된 레올로지 결과는 하기 표 3에 기재되어 있다. 알 수 있는 바와 같이, 1.5% KLD12의 저장 모듈러스는 2.5% RADA16의 저장 모듈러스와 유사한 것으로 밝혀졌다. 1% IEIK13의 저장 모듈러스는 2.5% KLD12의 저장 모듈러스와 유사하고 2.5% RADA16의 저장 모듈러스보다 높은 것으로 밝혀졌다. 종합하면, 여기서 시험된 조성물들 간에 레올로지 강도의 순서는 IEIK13 > KLD12 > RADA16였다.

[표 3]

선택된 농도에서의 펩타이드 조성물의 레올로지 특성

*: 1Pa의 진동 응력에서

#: 최대 점도 데이터는 측정된 응력의 범위에서 점도 플롯 내에서 맞게 조정되었다.

실시예 3: pH의 함수로서 펩타이드 조성물의 레올로지 특성

본 실시예는 특정 펩타이드 조성물의 레올로지 특성에 미치는 pH의 효과를 기술한다. 일부 실시형태에서, pH는 펩타이드 조성물의 강성도, 점도, 및/또는 회복 시간에 영향을 주는 제어 매개변수(control parameter)일 수 있다.

하기 표 2는 표시된 펩타이드가 표시된 농도로 수중에 가용화된 참조 조성물에 대해 관찰된 pH 농도를 제시한다.

[표 2]

본 실시예에서, 펩타이드 조성물의 pH 수준은 예를 들면, 0.1N NaOH를 2mL의 2.5% 펩타이드 조성물에 부가하여 조정하였다. 조정된 조성물의 pH 및 외관을 관찰하였다. pH 수준이 목적하는 수준보다 높은 경우에는 산성 염을 부가하였다.

결과는 표 5에 제시되어 있다. 특히, pH 증가(즉, 최대 약 3.5 이하까지)는 RADA16, IEIK13 및 KLD12 조성물의 투명한 색상을 변화시키지 않은 반면, 이의 겉보기 강성도는 증가되었다. 특정 조성물에 있어서, 펩타이드 조성물의 pH 수준이 3.5(RADA16 및 KLD12) 또는 3.7(IEIK13)보다 높은 경우, 이 펩타이드 조성물은 상 분리가 시작되었다(즉, 혼탁해진다). 일부 실시형태에서, 제공된 펩타이드 조성물은 약 3.0 내지 약 3.7(특히 IEIK3의 경우) 또는 약 3.0 내지 약 3.5(특히, RADA16 및/또는 KLD12의 경우)의 범위 내의 pH를 갖는다.

[표 5]

특정 펩타이드 조성물의 레올로지 특성을 이의 pH 수준을 3.4(RADA16 및 KLD12) 또는 3.7(IEIK13)로 조정하기 전 및 후에 관찰하였다. 펩타이드의 레올로지 특성을 40mm 플레이트를 갖는 레오미터(AR500, TA Instruments)를 사용하여 평가하였다. 구체적으로, 펩타이드 조성물(700㎕)을 레오미터 플레이트에 위치시키고, 과량의 조성물을 킴와이프스로 부드럽게 제거하였다. 측정은 37℃에서 2분의 이완 시간 후에 수행하였다. 응력 스윕 시험 결과는 도 8 내지 11에 도시되어 있다. 상승된 pH에서의 RADA16, KLD12 및 IEIK13 조성물은 2.5(RADA16), 2.0(KLD12) 및 2.1(IEIK13)에서의 조성물들보다 강성이었다.

선택된 pH 수준에서의 특정 펩타이드 조성물의 저장 모듈러스를 20mm 플레이트를 갖는 레오미터(DHR-1, TA Instruments)를 사용하여 평가하였다. RADA16 및 IEIK13 조성물의 저장 모듈러스는 pH가 3.4까지 증가함에 따라 증가하였다. 시험된 펩타이드 조성물에 대해 결정된 저장 모듈러스는 각각 RADA16에 대해 도 18 및 IEIK13에 대해 도 19에 도시되어 있다.

선택된 pH 수준에서의 1% IEIK13 조성물의 점도를 20mm 플레이트를 갖는 레오미터(DHR-1, TA Instruments)를 사용하여 평가하였다. IEIK13 조성물의 점도는 pH가 3.5까지 증가함에 따라 증가하였다. IEIK13 조성물은 전형적인 전단 담화 특성을 나타냈다. 본 결과는 도 20a 및 20b에 도시되어 있다.

레올로지 특성의 회복 시간을 1% IEIK13 조성물에 높은 전단응력을 가한 후에 선택된 pH에서 평가하였다. 1000 l/sec의 전단 속도를 1분 동안 샘플에 적용한 후, DHR-1 레오미터(TA Instruments)를 사용하여 1% IEIK13의 저장 모듈러스 변화를 1Pa에서 1rad/s로 측정하였다. 선택된 pH에서의 IEIK13 조성물은 전형적인 틱소트로픽 거동을 나타냈으며, 이는 이의 레올로지 특성이 천천히 회복되었음을 의미한다. 어떠한 특정 이론으로 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 레올로지 특성 회복 시간이 조성물 중에서 다시 자가-연합(예: 나노섬유)을 형성하기 위한 펩타이드 분자의 재조립에 요구되는 시간을 나타낸다는 것을 제안한다. 1% IEIK13 대조 조성물(pH 2.3)의 완전한 재조립 시간은 최대 12시간 이하인 반면, pH-상승된 IEIK13 조성물의 완전한 재조립 시간은 6 내지 10분이었다. 대표적 결과는 IEIK13에 대해 도 21a 내지 21d에 도시되어 있다.

실시예 4: 이온 강도의 함수로서 펩타이드 조성물의 레올로지 특성

본 실시예는 특정 펩타이드 조성물의 레올로지 특성에 미치는 이온 강도의 효과를 기술한다. 일부 실시형태에서, 이온 강도는 펩타이드 조성물의 강성도, 점도 및/또는 회복 시간의 제어 매개변수일 수 있다.

선택된 염(예: KCl, MgCl₂, CaCl₂)을 갖는 RADA16, KLD12 및 IEIK13 조성물의 육안 관찰은 표 7 내지 9에 요약되어 있다. 특정 이온 강도에서의 펩타이드 조성물은 투명하고 낮은 이온 강도에서의 조성물보다 높은 강성도를 나타냈다. RADA16(표 7)의 경우, 대략 0.85 내지 1.15M의 범위 내의 이온 강도(염 정체에 의존함)는 RADA16 조성물의 불투명도를 현저하게 변화시키지 않았다. KLD12(표 8)의 경우, 대략 0.25 내지 0.35M의 범위 내의 이온 강도(염 정체에 의존함)는 KLD12 조성물의 불투명도를 현저하게 변화시키지 않았다. IEIK13(표 9)의 경우, 대략 0.025 내지 0.035M의 범위 내의 이온 강도(염 정체에 의존함)는 IEIK13 조성물의 불투명도를 변화시키지 않았다. RADA16, KLD12 및 IEIK13 조성물의 겉보기 강성도는 이온 강도가 증가함에 따라 증가하였다.

어떠한 특정 이론으로 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 증가된 레올로지 특성이 각 염의 염석 상수 K와 관련될 수 있다는 것을 제안한다. RADA16에 대한 NaCl의 상수 K는 다른 염보다 더 높을 수 있다. NaCl을 갖는 RADA16 조성물의 레올로지 특성은 KCl 및 CaCl₂을 갖는 조성물의 레올로지 특성보다 다소 높았다.

[표 7]

[표 8]

[표 9]

임계 이온 강도를 표 7 내지 9에 기록된 육안 관찰로부터 결정하였다. 펩타이드 조성물의 이온 강도가 0.9M(RADA16), 0.3M(KLD12) 또는 0.03M(IEIK13)보다 높은 경우, 펩타이드 조성물은 상 분리가 시작되었다. 0.9M, 0.3M 및 0.03M은 각각 RADA16, KDL12 및 IEIK13에 대한 임계 이온 강도를 나타낼 수 있다.

도 27 내지 29는 이온 강도가 임계 이온 강도보다 다소 낮을 때 20mm 플레이트를 갖는 레오미터(DHR-1, TA Instruments)로 측정된 레올로지 특성을 도시한다. RADA16, KDL12 및 IEIK13은 측정시 각각 0.7M, 0.2M 및 0.02M이었다. RADA16, KLD12 및 IEIK13 조성물의 레올로지 특성은 NaCl을 이용하여 이의 이온 강도 수준을 0.7M(RADA16), 0.2M(KLD12) 또는 0.02M(IEIK13)까지 조정한 후에 보다 높았다.

선택된 이온 강도에서의 펩타이드 조성물의 레올로지 특성을 20mm 플레이트를 갖는 레오미터(DHR-1, TA Instruments)를 사용하여 측정하였다. 1% RADA16 조성물의 레올로지 특성은 이온 강도가 최대 0.7M까지 조정됨에 따라 증가한 반면에, 이온 강도가 0.7M보다 높았을 때는 감소되었다. 1% IEIK13 조성물의 레올로지 특성은 이온 강도가 최대 0.0.03M까지 조정됨에 따라 증가한 반면에, 이온 강도가 0.03M보다 높았을 때는 감소되었다. 결과는 선택된 염 이온 강도에서의 펩타이드 조성물의 육안 조사결과와 잘 일치하였다. 결과는 RADA16에 대해 도 30 및 IEIK13에 대해 도 31에 도시되어 있다.

선택된 이온 강도 수준에서의 펩타이드 조성물의 점도를 평가하였다. IEIK13 조성물의 점도는 이온 강도가 증가함에 따라 증가되었다. 1% IEIK13 조성물은 전형적인 전단 담화 특성을 나타냈다. 1% IEIK13 조성물의 점도를 20mm 플레이트를 갖는 레오미터(DHR-1, TA Instruments)를 사용하여 평가하였다. 본 결과는 IEIK13에 대해 도 32a 및 32b에 도시되어 있다.

레올로지 특성의 회복 시간은 높은 전단응력을 선택된 이온 강도에서의 1% IEIK13 조성물에 가한 후에 측정하였다. 1000 l/sec의 전단 속도를 1분 동안 샘플에 가한 후에, DHR-1 레오미터(TA Instruments)을 사용하여 1% IEIK13의 저장 모듈러스 변화를 1rad/s에서 1Pa에서 시간 스윕 시험으로 측정하였다. 선택된 이온 강도에서의 IEIK13 조성물은 전형적인 틱소트로픽 거동을 나타냈으며, 이의 레올로지 특성을 천천히 회복하였다. 레올로지 특성의 복원 시간은 나노섬유를 다시 형성하기 위한 펩타이드 분자의 재조립에 기초한다. 염 부가가 없는 1% IEIK13 대조 조성물의 완전한 재조립 시간은 최대 12시간까지인 반면에, NaCl 0.01M 및 0.02M을 갖는 IEIK13 조성물은 1분 내지 3분 미만이었다. 본 결과는 IEIK13에 대해 도 33a 내지 33c에 도시되어 있다.

실시예 5: pH 및 이온 강도 둘 다의 함수로서 펩타이드 조성물의 레올로지 특성

본 실시예는 증가된 pH 및 이온 강도에서의 펩타이드 조성물의 레올로지 특성을 설명한다. 특히, 본 실시예는 특정 펩타이드 조성물의 레올로지 특성에 미치는 세포 배양 배지와 같은 생리학적 매질의 효과를 기술한다.

IEIK13, KLD12 및 RADA16 조성물의 레올로지 특성에 미치는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modied Eagle's medium; DMEM)(pH 7.4)의 효과를 40mm 플레이트를 갖는 레오미터(AR500, TA Instruments)를 사용하여 평가하였다. DMEM은 6.4g/L의 NaCl, 3.4g/L의 NaHCO₃(중탄산나트륨), 미량의 기타 염, 각종 아미노산 및 4.5g/L의 글루코스를 함유하는 세포 배양 배지이다. DMEM의 pH는 7.2±0.2이고 오스몰랄농도는 335±30mOsm/Kg H₂O이다. DMEM는 사람 생리학적 체액, 예를 들면 혈액에 가깝다.

DMEM 용액과 혼합하기 전, 1% 펩타이드 조성물을 적어도 48시간 동안 4℃에서 보관한다. 실험을 수행하기 위해, 1mL의 펩타이드 조성물을 조심스럽게 피펫팅하여 레오미터의 플레이트에 위치시켰다. 2mL의 DMEM 용액을 펩타이드 조성물 주변에 조심스럽게 부가하였다. 펩타이드 조성물을 2분 동안 DMEM으로 처리한 다음, 배지를 제거하고, 플레이트를 약 450㎛에서 측정 기하 갭에 위치시켰다. 측정은 2분의 이완 시간 후에 37℃에서 수행하였다. 진동수 시험을 1Pa의 진동 응력에서 1rad/s부터 100rad/s까지 수행하였다.

1% 펩타이드 조성물의 레올로지 특성을 2분 동안 DMEM으로 처리하기 전 및 후에 측정하였고; 결과는 도 5a에 제시되어 있다. DMEM 처리 후의 저장 모듈러스의 배수 증가는 도 5b에 도시되어 있다. 알 수 있는 바와 같이, 펩타이드 조성물은 DMEM 처리 후 저장 모듈러스의 큰 증가를 나타냈다. DMEM 처리 후 RADA16, KLD12 및 IEIK13 간의 배수 차이는 DMEM 처리 전의 것과 비교해 비교적 작았다. 유사하게, 보다 강성의 펩타이드 조성물(예: IEIK13)은 DMEM 처리 후 덜 강성의 펩타이드 조성물(예: RADA16)보다 낮은 저장 모듈러스의 배수 증가를 나타냈다. 임계 분자간 상호작용은 DMEM 처리 후 증가되었는데, 이는 최종 강성도를 결정할 수 있다.

DHR-1 레오미터(TA Instruments)를 사용하여, 선택된 농도에서의 펩타이드 조성물의 레올로지 특성을 DMEM 처리 전과 후에 측정하였다. 진동수 스윕 시험을 1Pa에서 1rad/s부터 10rad/s까지 수행하였고, 그래프에서 저장 모듈러스는 1rad/sec에 있었다. RADA16 및 IEIK13 조성물의 레올로지 특성은 DMEM 처리 및/또는 pH 상승에 따라 증가되었다. 결과는 RADA16에 대해 도 22a 및 22b 및 IEIK에 대해 도 23a 및 23b에 도시되어 있다.

DHR-1 레오미터(TA Instruments)를 사용하여, 선택된 이온 강도에서의 펩타이드 조성물의 레올로지 특성을 DMEM 처리한지 10분 후에 측정하였다. 진동수 스윕 시험을 1Pa에서 1rad/s부터 10rad/s까지 수행하였고, 1rad/sec에서의 저장 모듈러스를 데이터를 위해 선택하였다. RADA16 조성물의 레올로지 특성은 이온 강도를 최대 0.7M까지 조정함에 따라 증가된 반면에, 0.7M 이상일 때는 감소되었다. NaCl의 0.9M 이상의 이온 강도에서, RADA16 조성물은 혼탁해졌다. RADA16의 레올로지 특성은 DMEM 처리에 의해 변화되지 않았다(예를 들면, 겔화 없음). 그러나, IEIK13 조성물의 레올로지 특성은 선택된 이온 강도에서 DMEM 처리에 의해 증가되었다. 결과는 도 34 내지 35에 도시되어 있다.

IEIK13, KLD12 및 RADA16을 염 완충액(예: NaCl)에 용해시키고, 알칼리 염 완충액(예: NaCl)으로 조정된 상승된 pH 수준에서 보관하였다. 상기 조성물들은 pH 수준이 약 2.5 내지 4.0이었고 이온 강도가 이의 임계점보다 낮았다. RADA16, KLD13 및 IEIK13과 관련하여, 펩타이드 조성물은 pH 3.4(NaOH로 조정됨)에서 0.9% NaCl(즉, 0.15M의 이온 강도) 부가시 여전히 투명하였다. pH 3.4에서의 0.9% NaCl을 갖는 RADA16의 레올로지 특성은 RADA16 대조물(즉, 이온 강도 및 pH 상승 없음) 및 0.9% NaCl을 갖는 RADA16(pH 상승 없음)의 레올로지 특성보다 더 강성이었다. 결과는 도 40에 도시되어 있다.

도 1에 도시된 바와 같이, PBS(포스페이트 완충 염수) 용액(pH 7.4) 중에서 펩타이드 조성물의 겔 형성을 측정하기 위해 콩고 레드 검정을 수행하였다. 선택된 농도에서의 100㎕의 각 겔을 유리 슬라이드에 플레이팅하였다. 30초 후, 500㎕의 1% 콩고 레드 용액을 각 조성물 분취액의 주변 및 최상단에 부가한 다음, 과량의 콩고 레드 용액을 검사 전에 닦아냈다. RADA16, IEIK13 및 KLD12를 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0% 및 2.5%의 선택된 농도에서 플레이팅하였다. 육안 관찰로 각 농도에서의 겔화의 성공 또는 실패를 결정하였다. RADA16, IEIK13 및 KLD는 모든 농도에서 겔화되었다.

실시예 6: 세포 생존력

본 실시예는 세포 생존력을 뒷받침하는 특정 펩타이드 조성물의 능력을 기술한다. 일부 실시형태에서, 제공된 펩타이드 조성물은 특히 적절한 참조 조성물과 비교하여 높은 세포 생존력을 뒷받침하는 것을 특징으로 한다.

본원에 기재된 바와 같은 IEIK13, KLD12 및 RADA16 조성물을 이용하여 C57　BL/6　마우스 중간엽 줄기세포(mMSCs)의 생존력을 측정하기 위해 세포 생존력(세포독성) 검정을 수행하였다. mMSC는 하이드로겔 조직 배양 시스템에서 흔히 사용되는 세포주이다. 펩타이드 조성물을 2.5%의 농도로 제조한 다음, 슈크로스를 이용하여 1.5%, 1.25%, 1.0%, 0.75% 및 0.50%의 농도로 희석시켰다. 슈크로스의 최종 농도는 10%였다. 세포를 세척하고 5백만개 세포/ml의 최종 농도로 10% 슈크로스에 재현탁시켰다. 세포를 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 세포를 10% 슈크로스를 이용하여 펩타이드 조성물에 재현탁시켰다. 이어서, 점적 배양물을 플레이팅하고 후속적으로 PuraMatrix^® 사용지침(BD/Corning 웹사이트)에 기재된 바와 같이 단리하기 위해 프로토콜을 수행하였다. 결과는 각각 RADA16, IEIK13 및 KLD12에 대해 도 14 내지 16에 도시되어 있다.

0.5%에서의 IEIK13 및 KLD12 조성물에서의 세포 생존력은 0.25%에서의 세포 생존력과 유사하였다. 0.5%에서의 RADA16 조성물에서의 세포 생존력은 0.25%에서의 세포 생존력보다 현저하게 높다. 그러나, 세포 생존력은 펩타이드의 농도가 0.75%를 초과한 경우에 현저하게 감소되었다. KLD12 및 IEIK13 조성물은 0.25% 내지 1.5% 범위 내의 모든 시험된 농도에서 RADA16과 비교하여 유사하거나 더 높은 세포 생존력을 나타냈다. 이들 펩타이드 조성물들 간의 전체 세포 생존력의 순서는 KLD12 > IEIK13 > RADA16이었다. 농도가 0.75% 이하인 펩타이드 조성물은 80%보다 높은 세포 생존력을 나타냈다.

실시예 7: 상이한 염을 갖는 RADA16 조성물의 레올로지 특성

본 실시예는 특히, 겔 가역성을 여전히 유지하면서(예를 들면, 기계적 교란 후 겔 형성 및 이의 기계적 무결성이 약화됨이 없이) 자가-조립 펩타이드 겔의 제어된 기계적 증진을 달성한 연구를 설명한다. 이러한 설명된 연구들은 또한 다양한 자가-조립 펩타이드, 무엇보다도 특히 RADARADARADARADA(또는 RADA-16)와 함께 선택된 농도에서의 양이온과 음이온의 혼합을 통해 겔 동역학의 제어를 달성하였다.

본 실시예는 특히, 본 명세서와 함께 고려될 때, 펩타이드 조성물이 특정 적용을 위해 특히 유용한 물질적 및/또는 레올로지 특징들을 갖도록 특수하게 제형화되도록 하는 매개변수가 정의되었음을 확인시킨다. 예를 들면, 본원에 기재된 기술은 실란트(예를 들면, 증진된 강성도를 필요로하거나 이로부터 이득을 얻을 수 있음), 윤활제(예를 들면, 증진된 동역학을 필요로하거나 이로부터 이득을 얻을 수 있음), 약물 혼합물(예를 들면, 가역성 및 증진된 동역학을 필요로하거나 이로부터 이득을 얻을 수 있음), 주사가능 물질(예를 들면, 가역성을 필요로하거나 이로부터 이득을 얻을 수 있음) 등으로서 잘 기능을 하도록 특수하게 조정되는 자가-조립 펩타이드 조성물의 제조를 가능케 한다. 대안으로 또는 추가로, 본원에 기재된 기술은 펩타이드 조성물의 제조 및/또는 이들 조성물에 포함되거나 적용된 매개변수의 선택을 가능케 하며, 이는 일반적으로 유용한 펩타이드 조성물 및/또는 이들 조성물을 포함하는 장치의 취급 및/또는 제조를 도울 수 있다.

예를 들면, 본원에서 입증된 바와 같이, 자가-조립 펩타이드 조성물에 포함되는 양이온의 유형, 예를 들면, Na, K 및 Ca, 및/또는 농도를 전체적으로 제어함으로써, 여전히 가역성 및 겔화 동역학을 유지하면서 기계적 강도(즉, 강성도)를 조정할 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 음이온의 유형, 예를 들면, Cl, SO₄, PO₄, 및/또는 농도를 전체적으로 제어함으로써, 여전히 가역성을 유지하면서 겔화 동역학을 제어할 수 있다.

본 실시예에서 입증되는 바와 같이, 일부 실시형태(및 특히 RADA16 펩타이드를 이용하는 실시형태)에서, Ca는 Na 및 K와 비교하여 펩타이드 겔에서의 강성도를 더 크게 증진시킬 수 있을 것이다. 또한, 일부 실시형태(및 특히 RADA16 펩타이드를 이용하는 실시형태)에서, Cl은 SO₄와 비교하여 펩타이드 겔에서의 보다 빠른 겔화 동역학을 가능하게 할 것이다. 게다가, 일부 실시형태(및 특히 RADA16 펩타이드를 이용하는 실시형태)에서, CaCl₂는 0.125M 이상 및 0.500M 미만의 농도에서 최적으로 기계적으로 증진된 가역적 겔을 가능하게 할 것이다. 본 실시예에 보고된 특정한 연구에서, 0.500M 이상의 농도는 특정 겔의 기계적 특성을 약화시키거나 특정 겔을 겔화 후 기계적 교란에 사용할 수 없도록 만들었다.

일반적으로, 본 실시예에 보고된 연구결과는, 다양한 염 및 염 농도의 사용을 통해서 강성도, 겔화 동역학 및 겔화의 가역성과 같은 속성들이 펩타이드의 농도, 펩타이드의 정체(예: 아미노산 서열), 양이온/음이온의 농도, 양이온/음이온 등의 정체와 같은 매개변수의 선택에 의해 결정될 수 있음을 입증한다. 양이온과 음이온 둘 다는 독립적으로 및 함께, 속성들에 영향을 줄 수 있다. 본 실시예를 포함하는 본 발명에 제공된 교시는 예를 들면 특정한 적용 또는 상황에 적절할 수 있는 목적하는 속성(예: 성능 특징)에 따라서 펩타이드 혼합물을 맞게 조정하기 위한 시스템을 제공한다.

본 실시예는 양이온 및/또는 음이온의 어떤 특정한 유형 및/또는 이의 농도가 목적하는 유익한 효과를 가짐을 입증하며; 특히 본 실시예는 예시된 상황과 관련하여 이러한 음이온/양이온 및 농도를 정의하며, 또한 당업계의 숙련가들이 다른 경우(예를 들면, 다른 펩타이드 등)에도 동일한 것을 행할 수 있도록 하는 기본 틀을 제공한다.

본 실시예는 특히 그리고 놀랍게도 자가-조립 펩타이드의 유용한 조성물을 제공하기 위한 현행 전략의 문제점을 확인한다. 즉, 자가 조립 능력이, 펩타이드의 포화 능력인 이온성 염에 의한 공격에 이용될 수 있는 하전된 그룹의 양에 의존적이라는 이론이 제시되었다[참조: P. Chen. (2005). "Self-assembly of ionic-complementary peptides: a physicochemical viewpoint." Colloids and Surfaces]. 그러나, 본 실시예는, 적어도 일부 경우에, 펩타이드가 염 농도에 의해 비례적으로 영향을 받지 않으며, 따라서 기계적 특성 및 가역성이 선형적으로 증가하지 않고 속도 의존적이 아니라는 것을 입증한다.

도 41A 내지 41D는 특정 RADA16 조성물에 미치는 펩타이드 용해를 수행하고 특정한 음이온 및/또는 양이온 및/또는 이들의 농도의 효과를 평가하기 위해 사용된 프로토콜을 도시한다. 도시된 바와 같이, 바이알 내의 펩타이드 분말을 와류 및 초음파처리를 이용하여 탈이온수에 용해시켰다. 본 실시예에서 이용된 특정한 펩타이드 조성물은 0.5% RADA16의 최종 농도 및 염의 목적하는 몰 농도를 수득하기 위해 2X 염 용액과 1:1 비로 혼합된 RADA16의 1% 조성물이었다.

염 농도 연구

도 41A 내지 41D에 도시된 프로토콜을 수행하여 상이한 농도의 CaCl₂를 갖는 RADA16의 0.5% 용액을 제조하였다. 혼합된 용액을 약 24시간의 이완 기간 동안 정치시켰다. 이어서, 바이알을 거꾸로 뒤집어서 겔 특성이 평가될 수 있도록 하였다. 조성물을 함유하는 바이알을 뒤집었을 때에도 조성물이 전부 제자리에서 유지된 경우, 조성물은 완전히 기능적인 겔로서 간주되었다. 조성물을 함유하는 바이알을 뒤집었을 때 절반이 넘는 조성물이 제자리에서 유지된 경우, 조성물은 반기능적 겔로서 간주되었다. 조성물을 함유하는 바이알을 뒤집었을 때 절반이 넘는 조성물 및 특히 실질적으로 모든 조성물이 바이알의 반대편 끝으로 낙하한 경우, 조성물은 비기능적 겔로서 간주되었다.

도 42A 내지 42G는 달성된 결과의 영상을 도시하는 것으로, 구체적으로는 다양한 CaCl₂ 농도 각각에 대한 똑바로 세워진 및 뒤집힌 바이알들을 도시한다. 알 수 있는 바와 같이, 이들 0.5% RADA16 조성물에 있어서, 완전히 기능적인 겔은 0.250M CaCl₂(패널E)로 형성되었고, 반기능적 겔은 0.500M CaCl₂(패널 F)로 형성되었고, 비기능적 겔은 1M CaCl₂(패널 G)에서 형성되었다.

양이온 선택 연구

도 41A 내지 41D에 도시된 프로토콜을 수행하여 0.005, 0.05, 0.125, 0.25, 0.5 및 1M NaCl, KCl, 및 CaCl₂를 갖는 RADA16의 0.5% 용액을 제조하였다. 양이온 나트륨(Na⁺), 칼륨(K⁺) 및 칼슘(Ca²⁺)의 효과를 관찰하기 위해 음이온 클로라이드(Cl^-)를 동일하게 유지시켰다. 결과는 도 43에 도시되어 있으며, 이는 염 용액의 양이온을 변화시키는 것이 생성된 조성물의 점탄성 특성 및 강성도에 어떻게 영향을 미치는가에 대한 기본적 이해를 제공한다.

기계적 강도 연구

도 41A 내지 41D에 도시된 프로토콜을 수행하여 2.5% RADA16을 함유하고 염이 부가되지 않은 펩타이드 조성물 또는 2.5% RADA16 및 0.125M CaCl₂을 함유하는 펩타이드 조성물의 강성도를 분석하였다. 결과는 도 44에 도시되어 있으며, 이는 생성된 조성물의 점탄성 특성에 대한 기본적 이해를 제공한다. 알 수 있는 바와 같이, 양이온이 용액에 혼합되었을 때 두 용액들 간에 강성도의 뚜렷한 증가가 있다.

가역성 연구

도 41A 내지 41D에 도시된 프로토콜을 수행하여 0.125, 0.25 또는 0.5M CaCl₂와 혼합된 0.5% RADA16의 용액을 제조하였다. 와류 및 초음파처리를 통하여 조성물에 기계적 응력을 가하여, 이의 구조가 완전히 파괴되도록(예를 들면, 무작위화되도록) 하였다. 이어서, 파괴된 조성물을 48시간 동안 실온에서 정치시켜 자가-조립이 일어나도록 하였다. 도 45a 및 45b는 본 연구로부터의 결과를 제시하며, 펩타이드 조성물의 기본적 점탄성 특성을 보여주며, 이는 0.125 또는 0.25M CaCl₂가 포함될 경우에는 조성물 중의 임의의 구조의 교란 후에도 가역성이 유지될 수 있음을 나타낸다. 반대로, 0.5M CaCl₂를 갖는 조성물은 파괴 후에 극적으로 적은 강성도(극적으로 감소된 구조 복원 능력을 반영함)를 나타낸다.

참조문헌

등가물

당업계의 숙련가라면, 단지 통상적인 실험을 사용하여, 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시형태에 대한 많은 등가물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 상기 발명의 설명으로 한정하기 위한 것이 아니며, 하기 청구범위에 제시된 바와 같다.

SEQUENCE LISTING <110> 3-D MATRIX, LTD. <120> SELF-ASSEMBLING PEPTIDE COMPOSITIONS <130> 2004837-0044 <150> US 61/950,529 <151> 2014-03-10 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala 1 5 10 15 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Lys Leu Asp Leu Lys Leu Asp Leu Lys Leu Asp Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 3 Ile Glu Ile Lys Ile Glu Ile Lys Ile Glu Ile Lys Ile 1 5 10

Claims

IEIK13 펩타이드를 적어도 0.25%의 농도로 포함하는 IEIK13 조성물로서, 상기 조성물이 약 2.5 내지 약 4.0의 범위 내의 pH를 갖는, IEIK13 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 용액인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 겔인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 약 0.0001M 내지 약 0.1M의 범위 내의 이온 강도(ionic strength)를 갖는, 조성물.
제4항에 있어서, 상기 이온 강도가 통상의 염에 의해 조정/제공되고, 상기 통상의 염이 NaCl, KCl, MgCl₂, CaCl₂ 및 CaSO₄로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
제4항에 있어서, 상기 이온 강도가 통상의 염에 의해 제공되며, 상기 통상의 염이 하나 이상의 염 형성 양이온 및 하나 이상의 염 형성 음이온으로 구성되고, 상기 염 형성 양이온이 암모늄, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 피리디늄, 4급 암모늄 및 나트륨으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 상기 염 형성 음이온이 아세테이트, 카보네이트, 클로라이드, 시트레이트, 시아나이드, 플루오라이드, 니트레이트, 니트라이트 및 포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 1rad/sec의 진동수 및 1Pa의 진동 응력에서 약 100 내지 약 10000Pa의 범위 내의 저장 모듈러스(storage modulus)를 갖는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 탄산나트륨, 나트륨 아세테이트, 황화나트륨 또는 DMEM으로 완충되는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 IEIK13 펩타이드가 3% 미만의 농도로 존재하고/하거나, 상기 조성물이 약 3.0 내지 약 4.0의 범위 내의 pH를 갖는, 조성물.
제9항에 있어서, 상기 조성물이 1rad/sec의 진동수 및 1Pa의 진동 응력에서 500Pa 초과의 저장 모듈러스를 나타내는 겔인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 탄산나트륨, 나트륨 아세테이트 또는 황화나트륨으로 완충되어 상기 조성물의 pH가 조절되는, 조성물.
약 6 내지 약 20개 아미노산의 범위 내의 길이 및 소수성 아미노산과 친수성 아미노산이 교호되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 액체 펩타이드 조성물로서,
상기 조성물이 실온에서 약 1Pa·s 내지 약 500,000Pa·s의 범위 내의 점도를 갖고,
1rad/sec의 진동수 및 1Pa의 진동 응력에서 약 1 내지 약 5000Pa의 범위 내의 저장 모듈러스를 갖고,
약 2.5 내지 약 4.0의 범위 내의 pH 및/또는 약 0.0001M 내지 약 1.5M의 범위 내의 이온 강도하에 노출/유지되는 경우에 약 0 내지 약 30초의 시간 기간 내에 겔을 형성함을 특징으로 하는, 액체 펩타이드 조성물.
[청구항 12A]
제12항에 있어서, 수성 조성물인 조성물.
제12항에 있어서, 상기 펩타이드가 RADA16을 포함하는, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 펩타이드가 IEIK13을 포함하는, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 펩타이드가 KLD12를 포함하는, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 이온 강도가 통상의 염에 의해 제공되고, 상기 통상의 염이 NaCl, KCl, MgCl₂, CaCl₂ 및 CaSO₄로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 이온 강도가 통상의 염에 의해 제공되며, 상기 통상의 염이 하나 이상의 염 형성 양이온 및 하나 이상의 염 형성 음이온으로 구성되고, 상기 염 형성 양이온이 암모늄, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 피리디늄, 4급 암모늄 및 나트륨으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 상기 염 형성 음이온이 아세테이트, 카보네이트, 클로라이드, 시트레이트, 시아나이드, 플루오라이드, 니트레이트, 니트라이트 및 포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 조성물이 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 탄산나트륨, 나트륨 아세테이트 또는 황화나트륨으로 완충되어 상기 조성물의 pH가 조절되는, 조성물.
특정한 생체내 부위에 적용하기 위한 펩타이드 조성물을 선택하는 단계를 포함하는 방법으로서,
상기 방법이,
상기 펩타이드 조성물에 대해 저장 모듈러스, 점도, 겔화 시간, 전단-담화(shear-thinning) 특성, 및 펩타이드 나노섬유 재조립 시간으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 매개변수를 결정하는 단계;
상기 결정된 하나 이상의 매개변수를 특정한 생체내 부위에로의 적용에 적절한 것으로 결정된 한 세트의 특징들과 비교하는 단계;
상기 비교에 비추어 상기 펩타이드 조성물을 선택하는 단계 및
상기 선택된 펩타이드 조성물을 상기 부위에 투여하는 단계
를 포함하는, 방법.