CN116803295A - 一种降尿酸组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种降尿酸组合物及其制备方法,属于保健品技术领域。提取藜麦蛋白质与黑茶粉混合发酵得到茶素‑肽提取物,将中药组合物水提醇沉得到中药多糖,醇提取得到醇提取物,然后将藜麦蛋白提取后的滤渣、发酵后的滤渣、中药醇提取后的滤渣混合,加入酶酶解,得到酶解培养基,接种活化的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌,发酵得到酶解发酵物,将酶解发酵物和茶素‑肽提取物经过包埋得到包埋颗粒,与中药多糖、醇提取物、活性组分、益生元混合均匀,得到降尿酸组合物。本发明制得的降尿酸组合物具有很好的降血脂和降尿酸的效果,具有刚开的应用前景。

Description

一种降尿酸组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及保健品技术领域,具体涉及一种降尿酸组合物及其制备方法。
背景技术
痛风是一种由于机体嘌呤代谢紊乱引发的尿酸过多或者是尿酸排泄减少,并在机体内蓄积沉淀所导致的一组代谢性疾病。
尿酸内源性产生约占80%,外源性产生约占20%。尿酸主要通过肾脏的排泄,以维持人体尿酸水平的正常。痛风患者血尿酸水平越高,其糖尿病、心衰、高血压、心梗以及肥胖的发生率也越高,与高血压、高脂血症、动脉粥样硬化、肥胖和胰岛素抵抗等疾病的发生密切相关,是当今世界尤其是中老年男性的常见病,已成为威胁人类健康的严重代谢性疾病。在嘌呤代谢途径中,酶的反馈调节对尿酸的最终生成产生不容忽视的影响。研究发现,先天的遗传因素可导致嘌呤代谢相关酶的匮乏或活性的不良变化。先天性的高尿酸血症通常存在着以下几种酶的异变:活性异常升高的酶包括黄嘌呤氧化酶、腺苷脱氨酶和磷酸核糖焦磷酸合成酶;与上述情况相反,相关基因表达障碍或者活性异常降低的酶包括腺嘌呤磷酸核糖转移酶和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,以上情况可导致嘌呤核苷酸的产生量增加,尿酸的合成代谢加强,大量产生尿酸。尿酸的来源可以分为内源产生和外源摄入两个途径。以上几种酶异常的变化在内源生成尿酸的代谢中产生重要的影响,主要体现在体内氨基酸代谢途径、磷酸核糖途径及其他的小分子物质的合成以及核酸的分解代谢过程中。
现有技术中,治疗痛风的医学手段包括:1、服用控制嘌呤药物;2、降低人体内尿酸含量。常用含秋水仙碱的中药或中成药能够抑制尿酸合成,但该药物具有损害肝脏的副作用。别嘌醇、丙磺舒、秋水仙碱以及非甾体类抗炎药和糖皮质激素等是目前常用的抗痛风药物,在抗痛风药物市场占据着主导地位。但这些药物均存在较严重的不良反应,尤其是对肾脏及相关器官具有很大的毒副作用,难以长期用药,在临床应用时受到了一定的限制。因此开发食品来源的新型低毒副作用降尿酸活性物质具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提出一种降尿酸组合物及其制备方法,能明显降低血清肌酐水平,改善肾功能,促进尿酸排泄,增强内源性物质代谢、保肝护肝、调节脂质代谢等机制,缓解氧酸钾诱导的血尿酸,减少肾组织细胞凋亡,对肾脏有较好的保护作用,具有很好的降血脂和降尿酸的效果,具有刚开的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的:
本发明提供一种降尿酸组合物的制备方法,提取藜麦蛋白质与黑茶粉混合发酵得到茶素-肽提取物,将中药组合物水提醇沉得到中药多糖,醇提取得到醇提取物,然后将藜麦蛋白提取后的滤渣、发酵后的滤渣、中药醇提取后的滤渣混合,加入酶酶解,得到酶解培养基,接种活化的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌,发酵得到酶解发酵物,将酶解发酵物和茶素-肽提取物经过包埋得到包埋颗粒,与中药多糖、醇提取物、活性组分、益生元混合均匀,得到降尿酸组合物。
作为本发明的进一步改进,包括以下步骤:
S1.藜麦的蛋白质提取:将藜麦粉碎得到藜麦粉,加入石油醚中,搅拌混合后过滤,洗涤,干燥,加入碱液中,搅拌提取,过滤,滤渣留用,得到碱提取液,加入酸液调节pH值,静置,离心,收集固体,为藜麦蛋白质;
S2.黑茶发酵:取黑茶粉碎后得到黑茶粉,加入水中,加入步骤S1制得的藜麦蛋白质,混合均匀,发酵培养,过滤,滤渣留用,冷冻干燥,得到茶素-肽提取物;
S3.中药多糖的提取:将甘草、茯苓、绞股蓝、蒲公英分别洗净、干燥后粉碎,得到中药粉,加入水中,加热沸腾提取,过滤,滤渣留用,加入乙醇沉淀,离心,乙醇回收,收集固体,得到中药多糖;
S4.中药组合物的醇提取:将步骤S3中的滤渣加入乙醇水溶液中,加热提取,过滤,滤渣留用,滤液减压除去溶剂,得到醇提取物;
S5.酶解培养基的制备:将步骤S1中的滤渣、步骤S2中的滤渣和步骤S4中的滤渣混合均匀,加入无菌水中,灭菌,加入复合酶,无菌条件下酶解,得到酶解培养基;
S6.酶助发酵:将活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5中的酶解培养基中,酶助发酵培养,冷冻干燥,得到酶解发酵物;
S7.活性组分的制备:将白藜芦醇、柠檬酸钾和柠檬酸钠混合均匀,得到活性组分;
S8.益生元的制备:将甜菊糖苷和阿拉伯糖混合均匀,得到益生元;
S9.羧基琼脂糖制备:将琼脂糖加入异丙醇中,加入氯乙酸和碱,加热搅拌反应,加入等体积乙醇水溶液淬灭反应,过滤,洗涤,固体干燥,得到羧基琼脂糖;
S10.降尿酸组合物的制备:将步骤S9制得的羧基琼脂糖溶于水中,加入多巴胺盐酸盐,加入步骤S2制得的茶素-肽提取物、步骤S6制得的酶解发酵物,搅拌混合均匀,得到水相,加入含有表面活性剂的食用油中,乳化,加入催化剂,加热搅拌反应固化,离心,得到包埋颗粒,与步骤S3制得的中药多糖、步骤S4制得的醇提取物、步骤S7制得的活性组分、步骤S8制得的益生元混合均匀,得到降尿酸组合物。
作为本发明的进一步改进,步骤S1中所述藜麦粉的石油醚的固液比为1:10-15g/mL,所述碱液为0.1-0.15mol/L的NaOH或KOH溶液,所述酸液为0.1-0.15mol/L的HCl或硫酸溶液,所述调节pH值为4.4-4.6,所述搅拌提取的温度为40-45℃,时间为2-3h;步骤S2中所述黑茶粉、水、藜麦蛋白质的质量比为10-20:100:5-7,所述发酵培养的温度为38-42℃,时间为12-18h。
作为本发明的进一步改进,步骤S3中所述甘草、茯苓、绞股蓝、蒲公英的质量比为5-7:7-10:3-5:7-10,所述中药粉和水的固液比为1:5-7g/mL,所述加热沸腾提取的时间为3-4h,所述加入乙醇至体系中乙醇的含量为70-80wt%,所述沉淀的时间为4-6h;步骤S4中所述滤渣和乙醇水溶液的质量比为10-12:30-45,所述乙醇水溶液中乙醇的浓度为50-60wt%,所述加热提取的温度为50-60℃,时间为2-4h。
作为本发明的进一步改进,步骤S5中所述步骤S1中的滤渣、步骤S2中的滤渣、步骤S4中的滤渣和无菌水的质量比为10-12:10-15:20-25:120-150,所述复合酶选自纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶、无花果蛋白酶、碱性蛋白酶、ɑ-淀粉酶、β-淀粉酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶中的至少两种,所述复合酶的添加量为体系总质量的3-5wt%,所述酶解的条件为40-45℃,酶解2-3h;步骤S6中所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的制备方法为将副干酪乳杆菌和植物乳杆菌接种至高氏培养基中,37-40℃,50-80r/min,活化培养12-18h,得到含菌量为108-109cfu/mL的菌种种子液,所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的接种量分别为2-3%和1-2%,所述酶助发酵培养的条件为37-40℃,50-80r/min,培养36-48h。
作为本发明的进一步改进,所述复合酶包括纤维素酶、β-淀粉酶和菠萝蛋白酶,质量比为10-12:3-5:7-10。
作为本发明的进一步改进,步骤S7中所述白藜芦醇、柠檬酸钾和柠檬酸钠的质量比为1-2:7-10:12-15;步骤S8中所述甜菊糖苷和阿拉伯糖的质量比为7-10:3-5。
作为本发明的进一步改进,步骤S9中所述琼脂糖、氯乙酸和碱的质量比为10-12:7-10:0.3-0.7,所述碱选自NaOH、KOH、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾中的至少一种,所述加热搅拌反应的温度为50-60℃,时间为1-3h,所述乙醇水溶液中乙醇的浓度为70-80wt%;步骤S10中所述羧基琼脂糖、多巴胺盐酸盐、茶素-肽提取物、酶解发酵物和水的质量比为10-12:15-20:5-7:7-10:100-120,所述表面活性剂选自卵磷脂、半乳糖醇、硬脂酰乳酸钠、硬脂酰乳酸钙、双乙酰酒石酸单甘油酯、蔗糖脂肪酯、蒸馏单甘酯中的至少一种,所述食用油选自大豆油、玉米油、小麦胚油、菜籽油、花生油、亚麻籽油、橄榄油、芝麻油中的至少一种,所述催化剂为含有2-4wt%CoCl2的pH=4-6的Tris-HCl溶液,所述催化剂的添加量为体系总质量的0.1-0.2wt%,所述加热搅拌反应固化的温度为40-50℃,时间为0.5-1h,所述包埋颗粒、中药多糖、醇提取物、活性组分、益生元的质量比为15-20:3-5:5-7:2-3:1-2。
作为本发明的进一步改进,具体包括以下步骤:
S1.藜麦的蛋白质提取:将10重量份藜麦粉碎得到藜麦粉,加入石油醚中,所述藜麦粉的石油醚的固液比为1:10-15g/mL,搅拌混合后过滤,洗涤,干燥,加入50重量份0.1-0.15mol/L的NaOH或KOH溶液中,40-45℃搅拌提取2-3h,过滤,滤渣留用,得到碱提取液,加入0.1-0.15mol/L的HCl或硫酸溶液调节pH值为4.4-4.6,静置,离心,收集固体,为藜麦蛋白质;
S2.黑茶发酵:取10-20重量份黑茶粉碎后得到黑茶粉,加入100重量份水中,加入5-7重量份步骤S1制得的藜麦蛋白质,混合均匀,38-42℃发酵培养12-18h,过滤,滤渣留用,冷冻干燥,得到茶素-肽提取物;
S3.中药多糖的提取:将5-7重量份甘草、7-10重量份茯苓、3-5重量份绞股蓝、7-10重量份蒲公英分别洗净、干燥后粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:5-7g/mL,加热沸腾提取3-4h,过滤,滤渣留用,加入乙醇至体系中乙醇的含量为70-80wt%,沉淀4-6h,离心,乙醇回收,收集固体,得到中药多糖;
S4.中药组合物的醇提取:将10-12重量份步骤S3中的滤渣加入30-45重量份50-60wt%的乙醇水溶液中,加热至50-60℃,提取2-4h,过滤,滤渣留用,滤液减压除去溶剂,得到醇提取物;
S5.酶解培养基的制备:将10-12重量份步骤S1中的滤渣、10-15重量份步骤S2中的滤渣和20-25重量份步骤S4中的滤渣混合均匀,加入120-150重量份水中,灭菌,加入复合酶,所述复合酶的添加量为体系总质量的3-5wt%,无菌条件下,40-45℃酶解2-3h,得到酶解培养基;
所述复合酶包括纤维素酶、β-淀粉酶和菠萝蛋白酶,质量比为10-12:3-5:7-10;
S6.酶助发酵:将活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5中的酶解培养基中,所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的接种量分别为2-3%和1-2%,37-40℃,50-80r/min,酶助发酵培养36-48h,冷冻干燥,得到酶解发酵物;
所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的制备方法为将副干酪乳杆菌和植物乳杆菌接种至高氏培养基中,37-40℃,50-80r/min,活化培养12-18h,得到含菌量为108-109cfu/mL的菌种种子液;
S7.活性组分的制备:将1-2重量份白藜芦醇、7-10重量份柠檬酸钾和12-15重量份柠檬酸钠混合均匀,得到活性组分;
S8.益生元的制备:将7-10重量份甜菊糖苷和3-5重量份阿拉伯糖混合均匀,得到益生元;
S9.羧基琼脂糖制备:将10-12重量份琼脂糖加入100重量份异丙醇中,加入7-10重量份氯乙酸和0.3-0.7重量份碱,加热至50-60℃,搅拌反应1-3h,加入70-80wt%乙醇水溶液淬灭反应,过滤,洗涤,固体干燥,得到羧基琼脂糖;
S10.降尿酸组合物的制备:将10-12重量份步骤S9制得的羧基琼脂糖溶于100-120重量份水中,加入15-20重量份多巴胺盐酸盐,加入5-7重量份步骤S2制得的茶素-肽提取物、7-10重量份步骤S6制得的酶解发酵物,搅拌混合均匀,得到水相,加入200重量份含有3-5wt%表面活性剂的食用油中,乳化,加入体系总质量的0.1-0.2wt%催化剂,加热至40-50℃,搅拌反应固化0.5-1h,离心,得到包埋颗粒,将15-20重量份包埋颗粒与3-5重量份步骤S3制得的中药多糖、5-7重量份步骤S4制得的醇提取物、2-3重量份步骤S7制得的活性组分、1-2重量份步骤S8制得的益生元混合均匀,得到降尿酸组合物;
所述催化剂为含有2-4wt%CoCl2的pH=4-6的Tris-HCl溶液。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的降尿酸组合物。
本发明具有如下有益效果:预防和治疗高尿酸血症的方法一般是降低血清中的尿酸水平。尿酸的生成主要是由嘌呤代谢关键酶调控,尿酸的排泄是由尿酸转运蛋白和有机阴离子转运体调控。
茶叶及其功能成分降尿酸的机制主要为通过抑制嘌呤代谢酶(黄嘌呤氧化酶和腺苷脱氢酶)的活性来减少机体尿酸的产生和调节尿酸转运蛋白包括降低重吸收蛋白尿酸盐阴离子转运体1或葡萄糖转运蛋白9的表达来抑制肾脏的重吸收,促进尿酸入尿从而排出体外,发挥降尿酸作用。冠突散囊菌俗称“金花”,是黑茶发酵过程中的优势菌种,可以通过抑制尿酸生成相关酶的活性,减少尿酸在体内的代谢生成量,从而达到改善高尿酸血症的效果,其发酵产物茶黄素也可以通过降低血清中的腺苷脱氢酶含量,抑制尿酸生成,从而发挥降尿酸作用。本发明通过经过脱酯,碱提取后,得到的藜麦蛋白质,与黑茶混合后,在冠突散囊菌的存在下,同步发酵藜麦蛋白质,产生大量的藜麦多肽,并且藜麦多肽与茶叶发酵产物茶黄素等等形成稳定的复合物茶素-肽提取物,茶素-肽提取物具有很强的胰脂肪酶抑制作用、牛磺胆酸钠结合作用、胆固醇酯酶抑制作用和黄嘌呤氧化酶抑制作用。因其具有高比例的疏水性氨基酸能和黄嘌呤氧化酶结合,从而抑制酶活性。茶素-肽提取物可以抑制黄嘌呤氧化酶的催化作用,降低尿酸积累。茶素-肽提取物能抑制胰脂肪酶的活性,影响胰脂肪酶的结构变化,导致胰脂肪酶对底物的分解作用受阻,达到降血脂功效。茶素-肽提取物的胆酸盐结合能力较强,通过阻碍胆酸盐进入肠道,使胆酸盐随排泄物排出,使胆固醇分解成胆酸盐的水平下降,实现降血脂的效果。茶素-肽提取物具有良好的抑制胆固醇酯酶活性,经胃蛋白酶作用获得的酸性多肽和胆固醇酯酶结合从而降低对底物的催化作用。因此,茶素-肽提取物具有降血脂和降尿酸的能力。
茯苓(主要化学成分为黄酮类、黄酮苷类等)可以降低血尿酸的水平,对肾脏的损伤也有一定的保护作用,作用机制主要为抑制肝脏中黄嘌呤氧化酶的活性,并下调尿酸盐阴离子转运体1及葡萄糖转运体9mRNA的表达,降低白细胞介素1B与TNF-a的表达。茯苓水提取物不仅对黄嘌呤氧化酶的活性具有抑制作用,还能通过下调肾脏组织中的尿酸转运体1的表达,同时上调有机阴离子转运体1和有机阳离子转运体2的表达,进而降低尿酸。
绞股蓝中提取的绞股蓝总皂甙能够抑制黄嘌呤氧化酶、腺苷脱氨酶的活性,并降低尿酸盐阴离子转运体1和葡萄糖转运体9表达,升高有机阴离子转运蛋白1在肾脏中的表达,从而降低血尿酸和促进尿酸的排泄。
甘草黄酮类物质是甘草中最重要的活性物质之一,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、调节血糖等作用,且甘草醇提物可通过抑制高尿酸血症小鼠体内的黄嘌呤氧化酶活性和促进尿酸排泄有效降低小鼠血尿酸值。甘草黄酮醇是甘草中的一种黄酮类化合物,具有抗菌及抗病毒作用,可抑制脂多糖诱导巨噬细胞RAW264.7的NO分泌,发挥较好的抗炎作用。黄酮和黄酮醇类物质由于C2-C3之间的双键而具有黄嘌呤氧化酶抑制活性。
蒲公英中含有丰富的钾离子,而钾离子可以促进肾脏对尿酸的排泄,因此蒲公英提取物可能通过增加尿酸在体内的排泄来降低尿酸水平,含有大量的多酚类化合物和黄酮类化合物等天然抗氧化剂,可以清除自由基、减少氧化应激,从而保护肝脏健康并防止尿酸高伴随的并发症出现,蒲公英还是一种天然的利尿剂,可以促进身体的水分代谢和尿液排出,从而减少水分停留在体内形成的尿酸结晶,有助于缓解尿酸高的情况。蒲公英具有利尿通淋、渗湿止泻功效,可分清降浊使水湿从二便分消,能促进尿酸、尿素及氯化钠等的排泄。本发明中药组合物包括甘草、茯苓、绞股蓝、蒲公英,经过水提醇沉得到中药多糖,通过抑制黄嘌呤氧化酶活性、调节相关尿酸转运蛋白等机制发挥降尿酸作用,明显降低血清肌酐水平,通过抗氧化、清除活性氧自由基作用来保护肾脏,改善肾功能,促进尿酸排泄;醇提取得到的醇提取物含有丰富的黄酮、多酚、生物碱等活性组分,具有增强内源性物质代谢、保肝护肝、调节脂质代谢等机制,缓解氧酸钾诱导的血尿酸,减少肾组织细胞凋亡,对肾脏有较好的保护作用。
人体中的尿酸约30%由肠道直接排出或被肠道菌群分解。益生菌作为人类肠道中重要的生理菌群,可以提高免疫力,减少过敏反应,降低血清胆固醇水平,部分益生菌具有降尿酸的生理功能。
本发明将藜麦提取后的滤渣、茶叶蛋白发酵后的滤渣以及中药粉提取后的滤渣混合,通过复合酶酶解,所述复合酶包括纤维素酶、β-淀粉酶和菠萝蛋白酶,将大部分纤维素、淀粉、蛋白质酶解成小分子的寡糖、单糖、短肽、氨基酸等能够直接被益生菌利用的组分,从而促进了后续发酵过程中益生菌的快速增殖,以及发酵会产生更多的活性组分,包括短链脂肪酸等,能够促进机体降血脂,抑制尿酸生成,减少尿酸排放,保护肾脏,起到很好的效果。副干酪乳杆菌和植物乳杆菌的疏水率大于50%,说明这两株菌可能具有较好的肠道黏附性,同时具有较好的耐酸和耐胆碱性能,还能有效抑制黄嘌呤氧化酶活性,具有高效降解肌苷能力,具有较好的降尿酸的效果。
本发明活性组分包括白藜芦醇、柠檬酸钾和柠檬酸钠,其中,白藜芦醇是一种非黄酮类多酚有机化合物,是许多植物受到刺激时产生的一种抗毒素,主要是通过减少尿酸的重吸收和抑制炎症因子来达到降尿酸的目的。白藜芦醇对痛风和类风湿关节炎细胞的炎症因子有很强的抑制作用,可降低血液中炎症因子的浓度,从而达到抗炎效果。柠檬酸钾和柠檬酸钠能碱化尿液、促进尿酸的排泄,从而起到抑制钙盐结晶,预防尿酸高的效果。且价格便宜,对人体几乎没有副作用。因此,活性组分之间相互作用下,能明显提高尿酸排泄,抑制尿酸生成,起到降低尿酸的作用。
益生元是一种可以被人体内益生菌利用的非消化性碳水化合物,甜菊糖苷和阿拉伯糖是一种典型的益生元,能促进和维持肠道内的益生菌的生长和繁殖,增强益生菌对有害菌的抑制作用,提高肠道的酸度,调节肠道内微生态平衡,从而起到维护肠道健康的作用。此外,益生元还可以促进食物消化和营养吸收,改善便秘、腹泻等肠道问题,并有助于提高免疫力。另外,甜菊糖苷还具有降低血糖和胰岛素反应的作用,阿拉伯糖也还可以用于作为抗氧化剂,提高机体抗炎抗氧化能力。
琼脂糖是提取自红藻的一种线性聚合物,由交替的D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖组成。琼脂糖具有良好的生物相容性,而琼脂糖在室温下水溶性较差,因此,对琼脂糖进行羧基化改性后,能大大提高其水溶性,改善生物活性,提高其可交联性,使得其与聚多巴胺形成相互交联结构,制得的包埋颗粒壁材具有很好的pH响应性和机械强度,具有较好的耐温性,可储存性提高,大大提高了益生菌的存货周期,以及使得活性肽和益生菌能够避开胃酸腐蚀,直接送入肠道后,膨胀缓释出来,能够直达肠道,促进益生菌在肠道的定殖,从而发挥出很好的调节尿酸、降血脂等作用。
本发明制得的降尿酸组合物明显降低血清肌酐水平,改善肾功能,促进尿酸排泄,增强内源性物质代谢、保肝护肝、调节脂质代谢等机制,缓解氧酸钾诱导的血尿酸,减少肾组织细胞凋亡,对肾脏有较好的保护作用,具有很好的降血脂和降尿酸的效果,具有刚开的应用前景。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
黑茶,购于湖南梅山黑茶有限公司;藜麦,净仁率>99%,购于繁峙县懿康土特产有限公司;纤维素酶,SDG-2423,2800U/g,β-淀粉酶,FDY-2218,70万U/g,菠萝蛋白酶,FDG-2201,10万U/g,购于夏盛(北京)生物科技开发有限公司;副干酪乳杆菌,JLPF-176,100亿cfu/g,植物乳杆菌,JYLP-326,100亿cfu/g,购于山东中科嘉亿生物工程有限公司。
实施例1
本实施例提供一种降尿酸组合物的制备方法,具体包括以下步骤:
S1.藜麦的蛋白质提取:将10重量份藜麦粉碎得到藜麦粉,加入石油醚中,所述藜麦粉的石油醚的固液比为1:10g/mL,搅拌混合后过滤,乙醇洗涤,干燥,加入50重量份0.1mol/L的NaOH溶液中,40℃搅拌提取2h,过滤,滤渣留用,得到碱提取液,加入0.1mol/L的HCl溶液调节pH值为4.4,静置,5000r/min离心15min,收集固体,为藜麦蛋白质;
S2.黑茶发酵:取10重量份黑茶粉碎后得到黑茶粉,加入100重量份水中,加入5重量份步骤S1制得的藜麦蛋白质,混合均匀,38℃发酵培养12h,过滤,滤渣留用,冷冻干燥,得到茶素-肽提取物;
S3.中药多糖的提取:将5重量份甘草、7重量份茯苓、3重量份绞股蓝、7重量份蒲公英分别洗净、干燥后粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:5g/mL,加热沸腾提取3h,过滤,滤渣留用,加入乙醇至体系中乙醇的含量为70wt%,沉淀4h,5000r/min离心15min,乙醇回收,收集固体,得到中药多糖;
S4.中药组合物的醇提取:将10重量份步骤S3中的滤渣加入30重量份50wt%的乙醇水溶液中,加热至50℃,提取2h,过滤,滤渣留用,滤液减压除去溶剂,得到醇提取物;
S5.酶解培养基的制备:将10重量份步骤S1中的滤渣、10重量份步骤S2中的滤渣和20重量份步骤S4中的滤渣搅拌混合20min,加入120重量份水中,灭菌,加入复合酶,所述复合酶的添加量为体系总质量的3wt%,无菌条件下,40℃酶解2h,得到酶解培养基;
所述复合酶包括纤维素酶、β-淀粉酶和菠萝蛋白酶,质量比为10:3:7;
S6.酶助发酵:将活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5中的酶解培养基中,所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的接种量分别为2%和1%,37℃,50r/min,酶助发酵培养36h,冷冻干燥,得到酶解发酵物;
所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的制备方法为将副干酪乳杆菌和植物乳杆菌接种至高氏培养基中,37℃,50r/min,活化培养12h,得到含菌量为108cfu/mL的菌种种子液;
S7.活性组分的制备:将1重量份白藜芦醇、7重量份柠檬酸钾和12重量份柠檬酸钠搅拌混合15min,得到活性组分;
S8.益生元的制备:将7重量份甜菊糖苷和3重量份阿拉伯糖搅拌混合15min,得到益生元;
S9.羧基琼脂糖制备:将10重量份琼脂糖加入100重量份异丙醇中,加入7重量份氯乙酸和0.3重量份KOH,加热至50℃,搅拌反应1h,加入70wt%乙醇水溶液淬灭反应,过滤,洗涤,固体干燥,得到羧基琼脂糖;
S10.降尿酸组合物的制备:将10重量份步骤S9制得的羧基琼脂糖溶于100重量份水中,加入15重量份多巴胺盐酸盐,加入5重量份步骤S2制得的茶素-肽提取物、7重量份步骤S6制得的酶解发酵物,搅拌混合20min,得到水相,加入200重量份含有3wt%卵磷脂的花生油中,12000r/min乳化15min,加入体系总质量的0.1wt%催化剂,加热至40℃,搅拌反应固化0.5h,5000r/min离心15min,得到包埋颗粒,将15重量份包埋颗粒与3重量份步骤S3制得的中药多糖、5重量份步骤S4制得的醇提取物、2重量份步骤S7制得的活性组分、1重量份步骤S8制得的益生元混合均匀,得到降尿酸组合物;
所述催化剂为含有2wt%CoCl2的pH=4的Tris-HCl溶液。
实施例2
本实施例提供一种降尿酸组合物的制备方法,具体包括以下步骤:
S1.藜麦的蛋白质提取:将10重量份藜麦粉碎得到藜麦粉,加入石油醚中,所述藜麦粉的石油醚的固液比为1:15g/mL,搅拌混合后过滤,乙醇洗涤,干燥,加入50重量份0.15mol/L的KOH溶液中,45℃搅拌提取3h,过滤,滤渣留用,得到碱提取液,加入0.15mol/L的硫酸溶液调节pH值为4.6,静置,5000r/min离心15min,收集固体,为藜麦蛋白质;
S2.黑茶发酵:取20重量份黑茶粉碎后得到黑茶粉,加入100重量份水中,加入7重量份步骤S1制得的藜麦蛋白质,混合均匀,42℃发酵培养18h,过滤,滤渣留用,冷冻干燥,得到茶素-肽提取物;
S3.中药多糖的提取:将7重量份甘草、10重量份茯苓、5重量份绞股蓝、10重量份蒲公英分别洗净、干燥后粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:7g/mL,加热沸腾提取4h,过滤,滤渣留用,加入乙醇至体系中乙醇的含量为80wt%,沉淀6h,5000r/min离心15min,乙醇回收,收集固体,得到中药多糖;
S4.中药组合物的醇提取:将12重量份步骤S3中的滤渣加入45重量份60wt%的乙醇水溶液中,加热至60℃,提取4h,过滤,滤渣留用,滤液减压除去溶剂,得到醇提取物;
S5.酶解培养基的制备:将12重量份步骤S1中的滤渣、15重量份步骤S2中的滤渣和25重量份步骤S4中的滤渣搅拌混合20min,加入150重量份水中,灭菌,加入复合酶,所述复合酶的添加量为体系总质量的5wt%,无菌条件下,45℃酶解3h,得到酶解培养基;
所述复合酶包括纤维素酶、β-淀粉酶和菠萝蛋白酶,质量比为12:5:10;
S6.酶助发酵:将活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5中的酶解培养基中,所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的接种量分别为3%和2%,40℃,80r/min,酶助发酵培养48h,冷冻干燥,得到酶解发酵物;
所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的制备方法为将副干酪乳杆菌和植物乳杆菌接种至高氏培养基中,40℃,80r/min,活化培养18h,得到含菌量为109cfu/mL的菌种种子液;
S7.活性组分的制备:将2重量份白藜芦醇、10重量份柠檬酸钾和15重量份柠檬酸钠搅拌混合15min,得到活性组分;
S8.益生元的制备:将10重量份甜菊糖苷和5重量份阿拉伯糖搅拌混合15min,得到益生元;
S9.羧基琼脂糖制备:将12重量份琼脂糖加入100重量份异丙醇中,加入10重量份氯乙酸和0.7重量份KOH,加热至60℃,搅拌反应3h,加入80wt%乙醇水溶液淬灭反应,过滤,洗涤,固体干燥,得到羧基琼脂糖;
S10.降尿酸组合物的制备:将12重量份步骤S9制得的羧基琼脂糖溶于120重量份水中,加入20重量份多巴胺盐酸盐,加入7重量份步骤S2制得的茶素-肽提取物、10重量份步骤S6制得的酶解发酵物,搅拌混合20min,得到水相,加入200重量份含有5wt%硬脂酰乳酸钙的大豆油中,12000r/min乳化15min,加入体系总质量的0.2wt%催化剂,加热至50℃,搅拌反应固化1h,5000r/min离心15min,得到包埋颗粒,将20重量份包埋颗粒与5重量份步骤S3制得的中药多糖、7重量份步骤S4制得的醇提取物、3重量份步骤S7制得的活性组分、2重量份步骤S8制得的益生元混合均匀,得到降尿酸组合物;
所述催化剂为含有4wt%CoCl2的pH6的Tris-HCl溶液。
实施例3
本实施例提供一种降尿酸组合物的制备方法,具体包括以下步骤:
S1.藜麦的蛋白质提取:将10重量份藜麦粉碎得到藜麦粉,加入石油醚中,所述藜麦粉的石油醚的固液比为1:12g/mL,搅拌混合后过滤,乙醇洗涤,干燥,加入50重量份0.12mol/L的NaOH溶液中,42℃搅拌提取2.5h,过滤,滤渣留用,得到碱提取液,加入0.12mol/L的HCl溶液调节pH值为4.5,静置,5000r/min离心15min,收集固体,为藜麦蛋白质;
S2.黑茶发酵:取15重量份黑茶粉碎后得到黑茶粉,加入100重量份水中,加入6重量份步骤S1制得的藜麦蛋白质,混合均匀,40℃发酵培养16h,过滤,滤渣留用,冷冻干燥,得到茶素-肽提取物;
S3.中药多糖的提取:将6重量份甘草、8.5重量份茯苓、4重量份绞股蓝、8重量份蒲公英分别洗净、干燥后粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:6g/mL,加热沸腾提取3.5h,过滤,滤渣留用,加入乙醇至体系中乙醇的含量为75wt%,沉淀5h,5000r/min离心15min,乙醇回收,收集固体,得到中药多糖;
S4.中药组合物的醇提取:将11重量份步骤S3中的滤渣加入38重量份55wt%的乙醇水溶液中,加热至55℃,提取3h,过滤,滤渣留用,滤液减压除去溶剂,得到醇提取物;
S5.酶解培养基的制备:将11重量份步骤S1中的滤渣、12重量份步骤S2中的滤渣和22重量份步骤S4中的滤渣搅拌混合20min,加入135重量份水中,灭菌,加入复合酶,所述复合酶的添加量为体系总质量的4wt%,无菌条件下,42℃酶解2.5h,得到酶解培养基;
所述复合酶包括纤维素酶、β-淀粉酶和菠萝蛋白酶,质量比为11:4:8.5;
S6.酶助发酵:将活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5中的酶解培养基中,所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的接种量分别为2.5%和1.5%,38℃,65r/min,酶助发酵培养42h,冷冻干燥,得到酶解发酵物;
所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的制备方法为将副干酪乳杆菌和植物乳杆菌接种至高氏培养基中,38℃,65r/min,活化培养16h,得到含菌量为109cfu/mL的菌种种子液;
S7.活性组分的制备:将1.5重量份白藜芦醇、8.5重量份柠檬酸钾和13.5重量份柠檬酸钠搅拌混合15min,得到活性组分;
S8.益生元的制备:将8.5重量份甜菊糖苷和4重量份阿拉伯糖搅拌混合15min,得到益生元;
S9.羧基琼脂糖制备:将11重量份琼脂糖加入100重量份异丙醇中,加入8.5重量份氯乙酸和0.5重量份NaOH,加热至55℃,搅拌反应2h,加入75wt%乙醇水溶液淬灭反应,过滤,洗涤,固体干燥,得到羧基琼脂糖;
S10.降尿酸组合物的制备:将11重量份步骤S9制得的羧基琼脂糖溶于110重量份水中,加入17重量份多巴胺盐酸盐,加入6重量份步骤S2制得的茶素-肽提取物、8.5重量份步骤S6制得的酶解发酵物,搅拌混合20min,得到水相,加入200重量份含有4wt%硬脂酰乳酸钠的玉米油中,12000r/min乳化15min,加入体系总质量的0.15wt%催化剂,加热至45℃,搅拌反应固化1h,5000r/min离心15min,得到包埋颗粒,将17重量份包埋颗粒与4重量份步骤S3制得的中药多糖、6重量份步骤S4制得的醇提取物、2.5重量份步骤S7制得的活性组分、1.4重量份步骤S8制得的益生元混合均匀,得到降尿酸组合物;
所述催化剂为含有3wt%CoCl2的pH=5的Tris-HCl溶液。
实施例4
与实施例3相比,不同之处在于,复合酶包括β-淀粉酶和菠萝蛋白酶,质量比为4:19.5。
实施例5
与实施例3相比,不同之处在于,复合酶包括纤维素酶、β-淀粉酶,质量比为19.5:4。
对比例1
与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S1。
具体如下:
S1.黑茶发酵:取21重量份黑茶粉碎后得到黑茶粉,加入100重量份水中,40℃发酵培养16h,过滤,滤渣留用,冷冻干燥,得到茶素提取物;
S2.中药多糖的提取:将6重量份甘草、8.5重量份茯苓、4重量份绞股蓝、8重量份蒲公英分别洗净、干燥后粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:6g/mL,加热沸腾提取3.5h,过滤,滤渣留用,加入乙醇至体系中乙醇的含量为75wt%,沉淀5h,5000r/min离心15min,乙醇回收,收集固体,得到中药多糖;
S3.中药组合物的醇提取:将11重量份步骤S2中的滤渣加入38重量份55wt%的乙醇水溶液中,加热至55℃,提取3h,过滤,滤渣留用,滤液减压除去溶剂,得到醇提取物;
S4.酶解培养基的制备:将33重量份步骤S1中的滤渣、22重量份步骤S3中的滤渣搅拌混合20min,加入135重量份水中,灭菌,加入复合酶,所述复合酶的添加量为体系总质量的4wt%,无菌条件下,42℃酶解2.5h,得到酶解培养基;
所述复合酶包括纤维素酶、β-淀粉酶和菠萝蛋白酶,质量比为11:4:8.5;
S5.酶助发酵:将活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5中的酶解培养基中,所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的接种量分别为2.5%和1.5%,38℃,65r/min,酶助发酵培养42h,冷冻干燥,得到酶解发酵物;
所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的制备方法为将副干酪乳杆菌和植物乳杆菌接种至高氏培养基中,38℃,65r/min,活化培养16h,得到含菌量为109cfu/mL的菌种种子液;
S6.活性组分的制备:将1.5重量份白藜芦醇、8.5重量份柠檬酸钾和13.5重量份柠檬酸钠搅拌混合15min,得到活性组分;
S7.益生元的制备:将8.5重量份甜菊糖苷和4重量份阿拉伯糖搅拌混合15min,得到益生元;
S8.羧基琼脂糖制备:将11重量份琼脂糖加入100重量份异丙醇中,加入8.5重量份氯乙酸和0.5重量份NaOH,加热至55℃,搅拌反应2h,加入75wt%乙醇水溶液淬灭反应,过滤,洗涤,固体干燥,得到羧基琼脂糖;
S9.降尿酸组合物的制备:将11重量份步骤S8制得的羧基琼脂糖溶于110重量份水中,加入17重量份多巴胺盐酸盐,加入6重量份步骤S1制得的茶素提取物、8.5重量份步骤S5制得的酶解发酵物,搅拌混合20min,得到水相,加入200重量份含有4wt%硬脂酰乳酸钠的玉米油中,12000r/min乳化15min,加入体系总质量的0.15wt%催化剂,加热至45℃,搅拌反应固化1h,5000r/min离心15min,得到包埋颗粒,将17重量份包埋颗粒与4重量份步骤S2制得的中药多糖、6重量份步骤S3制得的醇提取物、2.5重量份步骤S6制得的活性组分、1.4重量份步骤S7制得的益生元混合均匀,得到降尿酸组合物;
所述催化剂为含有3wt%CoCl2的pH=5的Tris-HCl溶液。
对比例2
与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S2。
具体如下:
S1.藜麦的蛋白质提取:将10重量份藜麦粉碎得到藜麦粉,加入石油醚中,所述藜麦粉的石油醚的固液比为1:12g/mL,搅拌混合后过滤,乙醇洗涤,干燥,加入50重量份0.12mol/L的NaOH溶液中,42℃搅拌提取2.5h,过滤,滤渣留用,得到碱提取液,加入0.12mol/L的HCl溶液调节pH值为4.5,静置,5000r/min离心15min,收集固体,为藜麦蛋白质;
S2.中药多糖的提取:将6重量份甘草、8.5重量份茯苓、4重量份绞股蓝、8重量份蒲公英分别洗净、干燥后粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:6g/mL,加热沸腾提取3.5h,过滤,滤渣留用,加入乙醇至体系中乙醇的含量为75wt%,沉淀5h,5000r/min离心15min,乙醇回收,收集固体,得到中药多糖;
S3.中药组合物的醇提取:将11重量份步骤S2中的滤渣加入38重量份55wt%的乙醇水溶液中,加热至55℃,提取3h,过滤,滤渣留用,滤液减压除去溶剂,得到醇提取物;
S4.酶解培养基的制备:将33重量份步骤S1中的滤渣和22重量份步骤S3中的滤渣搅拌混合20min,加入135重量份水中,灭菌,加入复合酶,所述复合酶的添加量为体系总质量的4wt%,无菌条件下,42℃酶解2.5h,得到酶解培养基;
所述复合酶包括纤维素酶、β-淀粉酶和菠萝蛋白酶,质量比为11:4:8.5;
S5.酶助发酵:将活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5中的酶解培养基中,所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的接种量分别为2.5%和1.5%,38℃,65r/min,酶助发酵培养42h,冷冻干燥,得到酶解发酵物;
所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的制备方法为将副干酪乳杆菌和植物乳杆菌接种至高氏培养基中,38℃,65r/min,活化培养16h,得到含菌量为109cfu/mL的菌种种子液;
S6.活性组分的制备:将1.5重量份白藜芦醇、8.5重量份柠檬酸钾和13.5重量份柠檬酸钠搅拌混合15min,得到活性组分;
S7.益生元的制备:将8.5重量份甜菊糖苷和4重量份阿拉伯糖搅拌混合15min,得到益生元;
S8.羧基琼脂糖制备:将11重量份琼脂糖加入100重量份异丙醇中,加入8.5重量份氯乙酸和0.5重量份NaOH,加热至55℃,搅拌反应2h,加入75wt%乙醇水溶液淬灭反应,过滤,洗涤,固体干燥,得到羧基琼脂糖;
S9.降尿酸组合物的制备:将11重量份步骤S8制得的羧基琼脂糖溶于110重量份水中,加入17重量份多巴胺盐酸盐,加入14.5重量份步骤S5制得的酶解发酵物,搅拌混合20min,得到水相,加入200重量份含有4wt%硬脂酰乳酸钠的玉米油中,12000r/min乳化15min,加入体系总质量的0.15wt%催化剂,加热至45℃,搅拌反应固化1h,5000r/min离心15min,得到包埋颗粒,将17重量份包埋颗粒与4重量份步骤S2制得的中药多糖、6重量份步骤S3制得的醇提取物、2.5重量份步骤S6制得的活性组分、1.4重量份步骤S7制得的益生元混合均匀,得到降尿酸组合物;
所述催化剂为含有3wt%CoCl2的pH=5的Tris-HCl溶液。
对比例3
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S3中未添加茯苓。
具体如下:
S3.中药多糖的提取:将6重量份甘草、4重量份绞股蓝、16.5重量份蒲公英分别洗净、干燥后粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:6g/mL,加热沸腾提取3.5h,过滤,滤渣留用,加入乙醇至体系中乙醇的含量为75wt%,沉淀5h,5000r/min离心15min,乙醇回收,收集固体,得到中药多糖。
对比例4
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S3中未添加蒲公英。
具体如下:
S3.中药多糖的提取:将6重量份甘草、16.5重量份茯苓、4重量份绞股蓝分别洗净、干燥后粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:6g/mL,加热沸腾提取3.5h,过滤,滤渣留用,加入乙醇至体系中乙醇的含量为75wt%,沉淀5h,5000r/min离心15min,乙醇回收,收集固体,得到中药多糖。
对比例5
与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S3中的水提醇沉。
具体如下:
S3.中药粉的制备:将6重量份甘草、8.5重量份茯苓、4重量份绞股蓝、8重量份蒲公英分别洗净、干燥后粉碎,得到中药粉。
对比例6
与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S4。
具体如下:
S1.藜麦的蛋白质提取:将10重量份藜麦粉碎得到藜麦粉,加入石油醚中,所述藜麦粉的石油醚的固液比为1:12g/mL,搅拌混合后过滤,乙醇洗涤,干燥,加入50重量份0.12mol/L的NaOH溶液中,42℃搅拌提取2.5h,过滤,滤渣留用,得到碱提取液,加入0.12mol/L的HCl溶液调节pH值为4.5,静置,5000r/min离心15min,收集固体,为藜麦蛋白质;
S2.黑茶发酵:取15重量份黑茶粉碎后得到黑茶粉,加入100重量份水中,加入6重量份步骤S1制得的藜麦蛋白质,混合均匀,40℃发酵培养16h,过滤,滤渣留用,冷冻干燥,得到茶素-肽提取物;
S3.中药多糖的提取:将6重量份甘草、8.5重量份茯苓、4重量份绞股蓝、8重量份蒲公英分别洗净、干燥后粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:6g/mL,加热沸腾提取3.5h,过滤,滤渣留用,加入乙醇至体系中乙醇的含量为75wt%,沉淀5h,5000r/min离心15min,乙醇回收,收集固体,得到中药多糖;
S4.酶解培养基的制备:将11重量份步骤S1中的滤渣、12重量份步骤S2中的滤渣和22重量份步骤S3中的滤渣搅拌混合20min,加入135重量份水中,灭菌,加入复合酶,所述复合酶的添加量为体系总质量的4wt%,无菌条件下,42℃酶解2.5h,得到酶解培养基;
所述复合酶包括纤维素酶、β-淀粉酶和菠萝蛋白酶,质量比为11:4:8.5;
S5.酶助发酵:将活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液接种至步骤S4中的酶解培养基中,所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的接种量分别为2.5%和1.5%,38℃,65r/min,酶助发酵培养42h,冷冻干燥,得到酶解发酵物;
所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的制备方法为将副干酪乳杆菌和植物乳杆菌接种至高氏培养基中,38℃,65r/min,活化培养16h,得到含菌量为109cfu/mL的菌种种子液;
S6.活性组分的制备:将1.5重量份白藜芦醇、8.5重量份柠檬酸钾和13.5重量份柠檬酸钠搅拌混合15min,得到活性组分;
S7.益生元的制备:将8.5重量份甜菊糖苷和4重量份阿拉伯糖搅拌混合15min,得到益生元;
S8.羧基琼脂糖制备:将11重量份琼脂糖加入100重量份异丙醇中,加入8.5重量份氯乙酸和0.5重量份NaOH,加热至55℃,搅拌反应2h,加入75wt%乙醇水溶液淬灭反应,过滤,洗涤,固体干燥,得到羧基琼脂糖;
S9.降尿酸组合物的制备:将11重量份步骤S8制得的羧基琼脂糖溶于110重量份水中,加入17重量份多巴胺盐酸盐,加入6重量份步骤S2制得的茶素-肽提取物、8.5重量份步骤S5制得的酶解发酵物,搅拌混合20min,得到水相,加入200重量份含有4wt%硬脂酰乳酸钠的玉米油中,12000r/min乳化15min,加入体系总质量的0.15wt%催化剂,加热至45℃,搅拌反应固化1h,5000r/min离心15min,得到包埋颗粒,将17重量份包埋颗粒与10重量份步骤S3制得的中药多糖、2.5重量份步骤S6制得的活性组分、1.4重量份步骤S7制得的益生元混合均匀,得到降尿酸组合物;
所述催化剂为含有3wt%CoCl2的pH=5的Tris-HCl溶液。
对比例7
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S5中未添加复合酶。
具体如下:
S5.酶解培养基的制备:将11重量份步骤S1中的滤渣、12重量份步骤S2中的滤渣和22重量份步骤S4中的滤渣搅拌混合20min,加入135重量份水中,灭菌,得到酶解培养基。
对比例8
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S6中未接种副干酪乳杆菌。
具体如下:
S6.酶助发酵:将活化后的植物乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5中的酶解培养基中,所述活化后的植物乳杆菌菌种种子液的接种量为4%,38℃,65r/min,酶助发酵培养42h,冷冻干燥,得到酶解发酵物;
所述活化后的植物乳杆菌菌种种子液的制备方法为将植物乳杆菌接种至高氏培养基中,38℃,65r/min,活化培养16h,得到含菌量为109cfu/mL的菌种种子液。
对比例9
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S6中未接种植物乳杆菌菌。
具体如下:
S6.酶助发酵:将活化后的植物乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5中的酶解培养基中,所述活化后的植物乳杆菌菌种种子液的接种量为4%,38℃,65r/min,酶助发酵培养42h,冷冻干燥,得到酶解发酵物;
所述活化后的植物乳杆菌菌种种子液的制备方法为将植物乳杆菌接种至高氏培养基中,38℃,65r/min,活化培养16h,得到含菌量为109cfu/mL的菌种种子液。
对比例10
与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S5和S6。
具体如下:
S1.藜麦的蛋白质提取:将10重量份藜麦粉碎得到藜麦粉,加入石油醚中,所述藜麦粉的石油醚的固液比为1:12g/mL,搅拌混合后过滤,乙醇洗涤,干燥,加入50重量份0.12mol/L的NaOH溶液中,42℃搅拌提取2.5h,过滤,滤渣留用,得到碱提取液,加入0.12mol/L的HCl溶液调节pH值为4.5,静置,5000r/min离心15min,收集固体,为藜麦蛋白质;
S2.黑茶发酵:取15重量份黑茶粉碎后得到黑茶粉,加入100重量份水中,加入6重量份步骤S1制得的藜麦蛋白质,混合均匀,40℃发酵培养16h,过滤,滤渣留用,冷冻干燥,得到茶素-肽提取物;
S3.中药多糖的提取:将6重量份甘草、8.5重量份茯苓、4重量份绞股蓝、8重量份蒲公英分别洗净、干燥后粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:6g/mL,加热沸腾提取3.5h,过滤,滤渣留用,加入乙醇至体系中乙醇的含量为75wt%,沉淀5h,5000r/min离心15min,乙醇回收,收集固体,得到中药多糖;
S4.中药组合物的醇提取:将11重量份步骤S3中的滤渣加入38重量份55wt%的乙醇水溶液中,加热至55℃,提取3h,过滤,滤渣留用,滤液减压除去溶剂,得到醇提取物;
S5.活性组分的制备:将1.5重量份白藜芦醇、8.5重量份柠檬酸钾和13.5重量份柠檬酸钠搅拌混合15min,得到活性组分;
S6.益生元的制备:将8.5重量份甜菊糖苷和4重量份阿拉伯糖搅拌混合15min,得到益生元;
S7.羧基琼脂糖制备:将11重量份琼脂糖加入100重量份异丙醇中,加入8.5重量份氯乙酸和0.5重量份NaOH,加热至55℃,搅拌反应2h,加入75wt%乙醇水溶液淬灭反应,过滤,洗涤,固体干燥,得到羧基琼脂糖;
S8.降尿酸组合物的制备:将11重量份步骤S7制得的羧基琼脂糖溶于110重量份水中,加入17重量份多巴胺盐酸盐,加入14.5重量份步骤S2制得的茶素-肽提取物,搅拌混合20min,得到水相,加入200重量份含有4wt%硬脂酰乳酸钠的玉米油中,12000r/min乳化15min,加入体系总质量的0.15wt%催化剂,加热至45℃,搅拌反应固化1h,5000r/min离心15min,得到包埋颗粒,将17重量份包埋颗粒与4重量份步骤S3制得的中药多糖、6重量份步骤S4制得的醇提取物、2.5重量份步骤S5制得的活性组分、1.4重量份步骤S6制得的益生元混合均匀,得到降尿酸组合物;
所述催化剂为含有3wt%CoCl2的pH=5的Tris-HCl溶液。
对比例11
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S7中未添加白藜芦醇。
具体如下:
S7.活性组分的制备:将10重量份柠檬酸钾和13.5重量份柠檬酸钠搅拌混合15min,得到活性组分。
对比例12
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S7中未添加柠檬酸钾和柠檬酸钠。
具体如下:
S7.活性组分的制备:将白藜芦醇作为活性组分。
对比例13
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S10中未进行包埋。
具体如下:
S10.将17重量份混合物(步骤S2制得的茶素-肽提取物和步骤S6制得的酶解发酵物的质量比为6:8.5)与4重量份步骤S3制得的中药多糖、6重量份步骤S4制得的醇提取物、2.5重量份步骤S7制得的活性组分、1.4重量份步骤S8制得的益生元混合均匀,得到降尿酸组合物。
对比例14
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S10中未添加活性组分。
具体如下:
S10.降尿酸组合物的制备:将11重量份步骤S9制得的羧基琼脂糖溶于110重量份水中,加入17重量份多巴胺盐酸盐,加入6重量份步骤S2制得的茶素-肽提取物、8.5重量份步骤S6制得的酶解发酵物,搅拌混合20min,得到水相,加入200重量份含有4wt%硬脂酰乳酸钠的玉米油中,12000r/min乳化15min,加入体系总质量的0.15wt%催化剂,加热至45℃,搅拌反应固化1h,5000r/min离心15min,得到包埋颗粒,将17重量份包埋颗粒与4重量份步骤S3制得的中药多糖、6重量份步骤S4制得的醇提取物、1.4重量份步骤S8制得的益生元混合均匀,得到降尿酸组合物;
所述催化剂为含有3wt%CoCl2的pH=5的Tris-HCl溶液。
对比例15
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S10中未添加益生元。
具体如下:
S10.降尿酸组合物的制备:将11重量份步骤S9制得的羧基琼脂糖溶于110重量份水中,加入17重量份多巴胺盐酸盐,加入6重量份步骤S2制得的茶素-肽提取物、8.5重量份步骤S6制得的酶解发酵物,搅拌混合20min,得到水相,加入200重量份含有4wt%硬脂酰乳酸钠的玉米油中,12000r/min乳化15min,加入体系总质量的0.15wt%催化剂,加热至45℃,搅拌反应固化1h,5000r/min离心15min,得到包埋颗粒,将17重量份包埋颗粒与4重量份步骤S3制得的中药多糖、6重量份步骤S4制得的醇提取物、2.5重量份步骤S7制得的活性组分混合均匀,得到降尿酸组合物;
所述催化剂为含有3wt%CoCl2的pH=5的Tris-HCl溶液。
测试例1
SD大鼠适应性饲养3d后随机分为7组,分别为正常组、模型组、阳性药组、实施例1-5组、对比例1-15组,每组12只。实验期间,除正常组外其余各组动物每天灌胃腺嘌呤(100mg/kg)和乙胺丁醇(250mg/kg)混悬液(溶剂为0.5%羧甲基纤维素钠水溶液),正常组给予相同体积的0.5%羧甲基纤维素钠水溶液,连续给药23d;从造模开始,每5d用代谢笼收取正常组和模型组大鼠24h尿液,记录尿量、饮水量、测定尿液中尿酸含量,若正常组和模型组比较,尿液中尿酸含量有明显差异,则造模成功。造模第5天开始给予药物,各组灌胃给予相应实施例或对比例制得的降尿酸组合物,给药量均为1g/kg。阳性药组每天给与阿洛普尼韦5mg/kg,正常组、模型组每天给予相同质量的纯水,给药量为1g/kg。
1、大鼠尿液指标测定:末次给药前1d用代谢笼收集各组大鼠24h尿液称重,测定大鼠尿液中尿酸含量,测定大鼠最后一次24h尿液中尿蛋白含量。结果见表1。
表1
组别 24h尿量(mL) 24h尿液中尿蛋白含量(mg/L) 24h尿液中尿酸含量(μmol/L)
正常组 13.75±3.12 274.25±50.12 1067.22±89.14
模型组 25.62±3.49* 352.91±55.74* 381.02±48.27*
阳性药组 19.42±3.25# 320.14±53.28# 657.21±68.73#
实施例1 18.72±3.02# 311.21±49.73# 810.24±70.42#
实施例2 19.01±3.15# 308.29±51.19# 824.12±64.25#
实施例3 18.60±2.98# 307.15±50.72# 825.77±68.57#
实施例4 20.24±3.29 332.41±52.44 789.22±69.12
实施例5 21.10±3.15 329.78±51.89 790.14±70.24
对比例1 22.72±2.78 338.69±50.37 780.12±73.11
对比例2 22.94±2.84 340.12±51.72 774.25±71.28
对比例3 22.74±3.04 346.72±55.32 770.14±68.99
对比例4 22.84±3.11 349.15±53.41 765.89±72.14
对比例5 22.52±3.07 343.21±54.19 774.26±71.09
对比例6 22.49±2.94 345.11±51.98 772.89±72.93
对比例7 22.43±2.91 337.54±50.47 780.25±69.21
对比例8 22.69±2.89 345.92±49.81 772.14±69.04
对比例9 22.72±3.14 347.10±48.72 768.54±70.43
对比例10 22.87±3.02 350.22±50.82 760.22±71.22
对比例11 22.70±3.31 348.92±51.27 765.21±72.19
对比例12 22.92±3.27 343.12±55.47 760.17±74.15
对比例13 23.05±3.16 349.25±53.72 752.13±73.01
对比例14 22.94±3.19 338.25±52.89 759.34±70.95
对比例15 22.17±3.07 330.75±51.72 789.24±69.89
注释:*为与正常组相比,P<0.05;#为与模型组相比,P<0.05。
由上表可知,本发明实施例1-3组小鼠尿量以及尿液中尿酸、尿蛋白含量明显降低。
2、大鼠血清生化指标测定:末次给药2h后,大鼠麻醉后腹主动脉取血。离心分离血清,取上清液,存于-40℃备用。酶比色法检测尿酸(UA)含量,用试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。结果见表2。
表2
组别 UA含量(μmol/L) SOD活性(U/mL) MDA含量(nmol/L)
正常组 48.02±6.10 88.92±5.23 4.90±0.72
模型组 68.23±6.82* 79.45±7.02* 6.75±1.04*
阳性药组 23.92±4.12# 112.14±6.27# 5.92±0.84#
实施例1 52.12±5.14# 98.45±5.18# 5.67±0.84#
实施例2 51.49±5.43# 99.10±6.10# 5.62±0.91#
实施例3 51.12±6.01# 99.42±6.32# 5.59±0.87#
实施例4 54.10±5.49 94.21±6.11 5.82±0.92
实施例5 53.98±5.28 93.19±6.29 5.89±0.88
对比例1 55.47±5.12 92.10±6.04 5.87±0.95
对比例2 57.12±5.09 90.37±5.89 5.94±0.82
对比例3 58.89±5.92 89.78±5.92 6.12±0.79
对比例4 59.23±6.04 88.24±5.79 6.19±0.95
对比例5 57.35±5.82 90.15±6.22 6.04±1.02
对比例6 57.49±5.79 90.02±6.19 6.07±0.94
对比例7 55.24±5.81 90.57±6.07 5.94±0.89
对比例8 56.98±5.28 90.28±6.32 6.04±0.85
对比例9 57.21±5.47 89.74±6.28 6.10±0.94
对比例10 58.10±5.19 87.92±6.18 6.17±0.99
对比例11 57.24±5.43 89.42±6.08 6.01±0.87
对比例12 57.87±5.28 91.23±5.92 5.97±0.79
对比例13 60.15±5.17 88.24±6.23 6.10±0.88
对比例14 58.10±5.09 87.46±6.17 6.02±0.93
对比例15 55.37±5.33 93.17±6.09 5.88±1.01
注释:*为与正常组相比,P<0.05;#为与模型组相比,P<0.05。
由上表可知,本发明实施例1-3组小鼠的血尿酸含量明显降低,SOD活性提高,MDA含量明显下降。
3、大鼠肾脏指数测定:在大鼠取血前进行称重,大鼠取血后,取出大鼠肾脏,将脏器上附着的血迹、毛发清理干净后,吸干水分,准确称量其湿重并计算其脏器指数。结果见表3。
脏器指数=脏器湿重(mg)/大鼠体质量(g)。
表3
组别 肾脏脏器指数(mg/g)
正常组 7.14±1.22
模型组 13.32±1.75*
阳性药组 10.71±1.44#
实施例1 10.42±1.28#
实施例2 10.39±1.37#
实施例3 10.32±1.41#
实施例4 10.69±1.39
实施例5 10.74±1.44
对比例1 10.82±1.38
对比例2 10.89±1.42
对比例3 10.98±1.45
对比例4 11.04±1.28
对比例5 10.92±1.32
对比例6 10.94±1.37
对比例7 10.85±1.41
对比例8 10.82±1.35
对比例9 10.89±1.44
对比例10 10.95±1.39
对比例11 10.87±1.48
对比例12 10.90±1.52
对比例13 10.98±1.39
对比例14 10.92±1.41
对比例15 10.70±1.44
注释:*为与正常组相比,P<0.05;#为与模型组相比,P<0.05。
由上表可知,本发明实施例1-3组小鼠的肾脏脏器指数明显降低。
4、大鼠肝组织匀浆指标测定:剖开大鼠腹腔,将大鼠肝脏迅速取出,将部分肝脏组织称重后与预冷的生理盐水按1:9混合,匀浆,离心后取上清液,比色法检测大鼠肝脏组织匀浆黄嘌呤氧化酶(XOD)活性,过氧化物酶法检测大鼠肝脏组织匀浆中腺苷脱氨酶(ADA)活性。结果见表4。
表4
组别 XOD水平(g/L) ADA水平(ng/L)
正常组 10.32±1.72 6.04±0.92
模型组 13.94±2.13* 8.11±1.24*
阳性药组 11.78±2.42# 7.27±1.03#
实施例1 11.97±2.15# 7.32±1.14#
实施例2 11.95±2.74# 7.33±1.02#
实施例3 11.92±2.56# 7.30±0.89#
实施例4 12.14±2.89 7.40±0.82
实施例5 12.09±2.72 7.42±0.94
对比例1 12.21±2.84 7.49±0.85
对比例2 12.29±2.94 7.54±0.95
对比例3 12.38±2.91 7.62±0.99
对比例4 12.43±2.90 7.69±1.05
对比例5 12.27±2.88 7.56±1.02
对比例6 12.32±2.86 7.61±0.93
对比例7 12.23±2.95 7.49±0.82
对比例8 12.29±2.98 7.47±0.96
对比例9 12.33±2.82 7.51±1.08
对比例10 12.45±2.79 7.60±1.10
对比例11 12.35±2.80 7.52±1.02
对比例12 12.34±2.87 7.54±1.05
对比例13 12.49±2.92 7.70±0.92
对比例14 12.39±2.83 7.57±0.87
对比例15 12.21±2.81 7.44±0.82
注释:*为与正常组相比,P<0.05;#为与模型组相比,P<0.05。
由上表可知,本发明实施例1-3组小鼠的XOD、ADA活性明显降低。
5、大鼠肾组织匀浆指标测定:将大鼠肾脏与预冷的生理盐水按1:9混合,匀浆,离心后取上清液,ELISA检测大鼠肾脏组织匀浆中尿酸转运体1(URAT1)、大鼠阴离子转运蛋白1(OAT1)、葡萄糖转运蛋白9(GLUT9)含量。结果见表5。
表5
注释:*为与正常组相比,P<0.05;#为与模型组相比,P<0.05。
由上表可知,本发明实施例1-3组小鼠的URAT1、GLUT9水平明显下降,OAT1水平明显提高。
实施例4、5与实施例3相比,复合酶包括β-淀粉酶和菠萝蛋白酶,质量比为4:19.5或复合酶包括纤维素酶、β-淀粉酶,质量比为19.5:4。对比例7与实施例3相比,步骤S5中未添加复合酶。UA含量提高,SOD活性下降,MAD含量提高,肾脏脏器指数提高。本发明将藜麦提取后的滤渣、茶叶蛋白发酵后的滤渣以及中药粉提取后的滤渣混合,通过复合酶酶解,所述复合酶包括纤维素酶、β-淀粉酶和菠萝蛋白酶,将大部分纤维素、淀粉、蛋白质酶解成小分子的寡糖、单糖、短肽、氨基酸等能够直接被益生菌利用的组分,从而促进了后续发酵过程中益生菌的快速增殖。
对比例1与实施例3相比,未进行步骤S1。对比例2与实施例3相比,未进行步骤S2。尿液中蛋白含量提高,尿酸含量下降,UA含量提高,SOD活性下降,MAD含量提高,肾脏脏器指数提高,URAT1、GLUT9水平提高,OAT1水平下降,XOD、ADA活性提高。本发明通过经过脱酯,碱提取后,得到的藜麦蛋白质,与黑茶混合后,在冠突散囊菌的存在下,同步发酵藜麦蛋白质,产生大量的藜麦多肽,并且藜麦多肽与茶叶发酵产物茶黄素等等形成稳定的复合物茶素-肽提取物。本发明茶素-肽提取物因其具有高比例的疏水性氨基酸能和黄嘌呤氧化酶结合,具有很强的胰脂肪酶抑制作用、牛磺胆酸钠结合作用、胆固醇酯酶抑制作用和黄嘌呤氧化酶抑制作用。可以抑制黄嘌呤氧化酶的催化作用,降低尿酸积累。能抑制胰脂肪酶的活性,影响胰脂肪酶的结构变化,导致胰脂肪酶对底物的分解作用受阻,达到降血脂功效。对胆酸盐结合能力较强,通过阻碍胆酸盐进入肠道,使胆酸盐随排泄物排出,使胆固醇分解成胆酸盐的水平下降,实现降血脂的效果。具有良好的抑制胆固醇酯酶活性,经胃蛋白酶作用获得的酸性多肽和胆固醇酯酶结合从而降低对底物的催化作用。因此,茶素-肽提取物具有降血脂和降尿酸的能力。
对比例3、4与实施例3相比,步骤S3中未添加茯苓或蒲公英。对比例5与实施例3相比,未进行步骤S3中的水提醇沉。对比例6与实施例3相比,未进行步骤S4。尿液中蛋白含量提高,尿酸含量下降,UA含量提高,SOD活性下降,MAD含量提高,肾脏脏器指数提高,URAT1、GLUT9水平提高,OAT1水平下降,XOD、ADA活性提高。本发明中药组合物包括甘草、茯苓、绞股蓝、蒲公英,经过水提醇沉得到中药多糖,通过抑制黄嘌呤氧化酶活性、调节相关尿酸转运蛋白等机制发挥降尿酸作用,明显降低血清肌酐水平,通过抗氧化、清除活性氧自由基作用来保护肾脏,改善肾功能,促进尿酸排泄;醇提取得到的醇提取物含有丰富的黄酮、多酚、生物碱等活性组分,具有增强内源性物质代谢、保肝护肝、调节脂质代谢等机制,缓解氧酸钾诱导的血尿酸,减少肾组织细胞凋亡,对肾脏有较好的保护作用。
对比例8、9与实施例3相比,步骤S6中未接种副干酪乳杆菌或植物乳杆菌菌。对比例10与实施例3相比,未进行步骤S5和S6。尿液中蛋白含量提高,尿酸含量下降,UA含量提高,SOD活性下降,MAD含量提高,肾脏脏器指数提高。本发明发酵过程中会产生更多的活性组分,包括短链脂肪酸等,能够促进机体降血脂,抑制尿酸生成,减少尿酸排放,保护肾脏,起到很好的效果。副干酪乳杆菌和植物乳杆菌的疏水率大于50%,说明这两株菌可能具有较好的肠道黏附性,同时具有较好的耐酸和耐胆碱性能,还能有效抑制黄嘌呤氧化酶活性,具有高效降解肌苷能力,具有较好的降尿酸的效果。
对比例11、12与实施例3相比,步骤S7中未添加白藜芦醇或未添加柠檬酸钾和柠檬酸钠。尿液中蛋白含量提高,尿酸含量下降,UA含量提高,SOD活性下降,MAD含量提高,肾脏脏器指数提高。对比例14与实施例3相比,步骤S10中未添加活性组分。本发明活性组分包括白藜芦醇、柠檬酸钾和柠檬酸钠,其中,白藜芦醇是一种非黄酮类多酚有机化合物,是许多植物受到刺激时产生的一种抗毒素,主要是通过减少尿酸的重吸收和抑制炎症因子来达到降尿酸的目的。白藜芦醇对痛风和类风湿关节炎细胞的炎症因子有很强的抑制作用,可降低血液中炎症因子的浓度,从而达到抗炎效果。柠檬酸钾和柠檬酸钠能碱化尿液、促进尿酸的排泄,从而起到抑制钙盐结晶,预防尿酸高的效果。且价格便宜,对人体几乎没有副作用。因此,活性组分之间相互作用下,能明显提高尿酸排泄,抑制尿酸生成,起到降低尿酸的作用。
对比例13与实施例3相比,步骤S10中未进行包埋。尿液中蛋白含量提高,尿酸含量下降,UA含量提高,SOD活性下降,MAD含量提高,肾脏脏器指数提高,URAT1、GLUT9水平提高,OAT1水平下降,XOD、ADA活性提高。琼脂糖是提取自红藻的一种线性聚合物,由交替的D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖组成。琼脂糖具有良好的生物相容性,而琼脂糖在室温下水溶性较差,因此,对琼脂糖进行羧基化改性后,能大大提高其水溶性,改善生物活性,提高其可交联性,使得其与聚多巴胺形成相互交联结构,制得的包埋颗粒壁材具有很好的pH响应性和机械强度,以及使得活性肽和益生菌能够避开胃酸腐蚀,直接送入肠道后,膨胀缓释出来,能够直达肠道,促进益生菌在肠道的定殖,从而发挥出很好的调节尿酸、降血脂等作用。
对比例15与实施例3相比,步骤S10中未添加益生元。尿液中蛋白含量提高,尿酸含量下降,UA含量提高,SOD活性下降,MAD含量提高,肾脏脏器指数提高。益生元是一种可以被人体内益生菌利用的非消化性碳水化合物,甜菊糖苷和阿拉伯糖是一种典型的益生元,能促进和维持肠道内的益生菌的生长和繁殖,增强益生菌对有害菌的抑制作用,提高肠道的酸度,调节肠道内微生态平衡,从而起到维护肠道健康的作用。此外,益生元还可以促进食物消化和营养吸收,改善便秘、腹泻等肠道问题,并有助于提高免疫力。另外,甜菊糖苷还具有降低血糖和胰岛素反应的作用,阿拉伯糖也还可以用于作为抗氧化剂,提高机体抗炎抗氧化能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种降尿酸组合物的制备方法,其特征在于,提取藜麦蛋白质与黑茶粉混合发酵得到茶素-肽提取物,将中药组合物水提醇沉得到中药多糖,醇提取得到醇提取物,然后将藜麦蛋白提取后的滤渣、发酵后的滤渣、中药醇提取后的滤渣混合,加入酶酶解,得到酶解培养基,接种活化的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌,发酵得到酶解发酵物,将酶解发酵物和茶素-肽提取物经过包埋得到包埋颗粒,与中药多糖、醇提取物、活性组分、益生元混合均匀,得到降尿酸组合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.藜麦的蛋白质提取:将藜麦粉碎得到藜麦粉,加入石油醚中,搅拌混合后过滤,洗涤,干燥,加入碱液中,搅拌提取,过滤,滤渣留用,得到碱提取液,加入酸液调节pH值,静置,离心,收集固体,为藜麦蛋白质;
S2.黑茶发酵:取黑茶粉碎后得到黑茶粉,加入水中,加入步骤S1制得的藜麦蛋白质,混合均匀,发酵培养,过滤,滤渣留用,冷冻干燥,得到茶素-肽提取物;
S3.中药多糖的提取:将甘草、茯苓、绞股蓝、蒲公英分别洗净、干燥后粉碎,得到中药粉,加入水中,加热沸腾提取,过滤,滤渣留用,加入乙醇沉淀,离心,乙醇回收,收集固体,得到中药多糖;
S4.中药组合物的醇提取:将步骤S3中的滤渣加入乙醇水溶液中,加热提取,过滤,滤渣留用,滤液减压除去溶剂,得到醇提取物;
S5.酶解培养基的制备:将步骤S1中的滤渣、步骤S2中的滤渣和步骤S4中的滤渣混合均匀,加入无菌水中,灭菌,加入复合酶,无菌条件下酶解,得到酶解培养基;
S6.酶助发酵:将活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5中的酶解培养基中,酶助发酵培养,冷冻干燥,得到酶解发酵物;
S7.活性组分的制备:将白藜芦醇、柠檬酸钾和柠檬酸钠混合均匀,得到活性组分;
S8.益生元的制备:将甜菊糖苷和阿拉伯糖混合均匀,得到益生元;
S9.羧基琼脂糖制备:将琼脂糖加入异丙醇中,加入氯乙酸和碱,加热搅拌反应,加入等体积乙醇水溶液淬灭反应,过滤,洗涤,固体干燥,得到羧基琼脂糖;
S10.降尿酸组合物的制备:将步骤S9制得的羧基琼脂糖溶于水中,加入多巴胺盐酸盐,加入步骤S2制得的茶素-肽提取物、步骤S6制得的酶解发酵物,搅拌混合均匀,得到水相,加入含有表面活性剂的食用油中,乳化,加入催化剂,加热搅拌反应固化,离心,得到包埋颗粒,与步骤S3制得的中药多糖、步骤S4制得的醇提取物、步骤S7制得的活性组分、步骤S8制得的益生元混合均匀,得到降尿酸组合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S1中所述藜麦粉的石油醚的固液比为1:10-15g/mL,所述碱液为0.1-0.15mol/L的NaOH或KOH溶液,所述酸液为0.1-0.15mol/L的HCl或硫酸溶液,所述调节pH值为4.4-4.6,所述搅拌提取的温度为40-45℃,时间为2-3h;步骤S2中所述黑茶粉、水、藜麦蛋白质的质量比为10-20:100:5-7,所述发酵培养的温度为38-42℃,时间为12-18h。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S3中所述甘草、茯苓、绞股蓝、蒲公英的质量比为5-7:7-10:3-5:7-10,所述中药粉和水的固液比为1:5-7g/mL,所述加热沸腾提取的时间为3-4h,所述加入乙醇至体系中乙醇的含量为70-80wt%,所述沉淀的时间为4-6h;步骤S4中所述滤渣和乙醇水溶液的质量比为10-12:30-45,所述乙醇水溶液中乙醇的浓度为50-60wt%,所述加热提取的温度为50-60℃,时间为2-4h。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S5中所述步骤S1中的滤渣、步骤S2中的滤渣、步骤S4中的滤渣和无菌水的质量比为10-12:10-15:20-25:120-150,所述复合酶选自纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶、无花果蛋白酶、碱性蛋白酶、ɑ-淀粉酶、β-淀粉酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶中的至少两种,所述复合酶的添加量为体系总质量的3-5wt%,所述酶解的条件为40-45℃,酶解2-3h;步骤S6中所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的制备方法为将副干酪乳杆菌和植物乳杆菌接种至高氏培养基中,37-40℃,50-80r/min,活化培养12-18h,得到含菌量为108-109cfu/mL的菌种种子液,所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的接种量分别为2-3%和1-2%,所述酶助发酵培养的条件为37-40℃,50-80r/min,培养36-48h。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述复合酶包括纤维素酶、β-淀粉酶和菠萝蛋白酶,质量比为10-12:3-5:7-10。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S7中所述白藜芦醇、柠檬酸钾和柠檬酸钠的质量比为1-2:7-10:12-15;步骤S8中所述甜菊糖苷和阿拉伯糖的质量比为7-10:3-5。
8.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S9中所述琼脂糖、氯乙酸和碱的质量比为10-12:7-10:0.3-0.7,所述碱选自NaOH、KOH、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾中的至少一种,所述加热搅拌反应的温度为50-60℃,时间为1-3h,所述乙醇水溶液中乙醇的浓度为70-80wt%;步骤S10中所述羧基琼脂糖、多巴胺盐酸盐、茶素-肽提取物、酶解发酵物和水的质量比为10-12:15-20:5-7:7-10:100-120,所述表面活性剂选自卵磷脂、半乳糖醇、硬脂酰乳酸钠、硬脂酰乳酸钙、双乙酰酒石酸单甘油酯、蔗糖脂肪酯、蒸馏单甘酯中的至少一种,所述食用油选自大豆油、玉米油、小麦胚油、菜籽油、花生油、亚麻籽油、橄榄油、芝麻油中的至少一种,所述催化剂为含有2-4wt%CoCl2的pH=4-6的Tris-HCl溶液,所述催化剂的添加量为体系总质量的0.1-0.2wt%,所述加热搅拌反应固化的温度为40-50℃,时间为0.5-1h,所述包埋颗粒、中药多糖、醇提取物、活性组分、益生元的质量比为15-20:3-5:5-7:2-3:1-2。
9.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
S1.藜麦的蛋白质提取:将10重量份藜麦粉碎得到藜麦粉,加入石油醚中,所述藜麦粉的石油醚的固液比为1:10-15g/mL,搅拌混合后过滤,洗涤,干燥,加入50重量份0.1-0.15mol/L的NaOH或KOH溶液中,40-45℃搅拌提取2-3h,过滤,滤渣留用,得到碱提取液,加入0.1-0.15mol/L的HCl或硫酸溶液调节pH值为4.4-4.6,静置,离心,收集固体,为藜麦蛋白质;
S2.黑茶发酵:取10-20重量份黑茶粉碎后得到黑茶粉,加入100重量份水中,加入5-7重量份步骤S1制得的藜麦蛋白质,混合均匀,38-42℃发酵培养12-18h,过滤,滤渣留用,冷冻干燥,得到茶素-肽提取物;
S3.中药多糖的提取:将5-7重量份甘草、7-10重量份茯苓、3-5重量份绞股蓝、7-10重量份蒲公英分别洗净、干燥后粉碎,得到中药粉,加入水中,所述中药粉和水的固液比为1:5-7g/mL,加热沸腾提取3-4h,过滤,滤渣留用,加入乙醇至体系中乙醇的含量为70-80wt%,沉淀4-6h,离心,乙醇回收,收集固体,得到中药多糖;
S4.中药组合物的醇提取:将10-12重量份步骤S3中的滤渣加入30-45重量份50-60wt%的乙醇水溶液中,加热至50-60℃,提取2-4h,过滤,滤渣留用,滤液减压除去溶剂,得到醇提取物;
S5.酶解培养基的制备:将10-12重量份步骤S1中的滤渣、10-15重量份步骤S2中的滤渣和20-25重量份步骤S4中的滤渣混合均匀,加入120-150重量份水中,灭菌,加入复合酶,所述复合酶的添加量为体系总质量的3-5wt%,无菌条件下,40-45℃酶解2-3h,得到酶解培养基;
所述复合酶包括纤维素酶、β-淀粉酶和菠萝蛋白酶,质量比为10-12:3-5:7-10;
S6.酶助发酵:将活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液接种至步骤S5中的酶解培养基中,所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的接种量分别为2-3%和1-2%,37-40℃,50-80r/min,酶助发酵培养36-48h,冷冻干燥,得到酶解发酵物;
所述活化后的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌种种子液的制备方法为将副干酪乳杆菌和植物乳杆菌接种至高氏培养基中,37-40℃,50-80r/min,活化培养12-18h,得到含菌量为108-109cfu/mL的菌种种子液;
S7.活性组分的制备:将1-2重量份白藜芦醇、7-10重量份柠檬酸钾和12-15重量份柠檬酸钠混合均匀,得到活性组分;
S8.益生元的制备:将7-10重量份甜菊糖苷和3-5重量份阿拉伯糖混合均匀,得到益生元;
S9.羧基琼脂糖制备:将10-12重量份琼脂糖加入100重量份异丙醇中,加入7-10重量份氯乙酸和0.3-0.7重量份碱,加热至50-60℃,搅拌反应1-3h,加入70-80wt%乙醇水溶液淬灭反应,过滤,洗涤,固体干燥,得到羧基琼脂糖;
S10.降尿酸组合物的制备:将10-12重量份步骤S9制得的羧基琼脂糖溶于100-120重量份水中,加入15-20重量份多巴胺盐酸盐,加入5-7重量份步骤S2制得的茶素-肽提取物、7-10重量份步骤S6制得的酶解发酵物,搅拌混合均匀,得到水相,加入200重量份含有3-5wt%表面活性剂的食用油中,乳化,加入体系总质量的0.1-0.2wt%催化剂,加热至40-50℃,搅拌反应固化0.5-1h,离心,得到包埋颗粒,将15-20重量份包埋颗粒与3-5重量份步骤S3制得的中药多糖、5-7重量份步骤S4制得的醇提取物、2-3重量份步骤S7制得的活性组分、1-2重量份步骤S8制得的益生元混合均匀,得到降尿酸组合物;
所述催化剂为含有2-4wt%CoCl2的pH=4-6的Tris-HCl溶液。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的降尿酸组合物。
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