CN109846909B - 可在肠道中催化尿酸降解的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于一种可在肠道中催化尿酸降解的组合物，所述组合物含有蛹虫草菌粉或干酶粉，所述蛹虫草菌粉或干酶粉包含可催化尿酸降解的尿酸氧化酶。本发明还提供了上述本发明关于一种可在肠道中催化尿酸降解的组合物的制备方法和应用。本发明的组合物可通过催化尿酸降解为尿囊素，降低肠道中的尿酸含量，增加血液中尿酸向肠道中分泌排泄的比例，从而降低血液中的尿酸浓度，预防和治疗高尿酸血症及痛风疾病；同时也降低了尿液中尿酸的排泄量，降低尿酸结石的发病率。
Description
技术领域
本发明涉及人体或动物体肠道中尿酸或尿酸盐的降解领域，特别是涉及一种可在肠道中催化尿酸降解的组合物及其制备方法和应用。
背景技术
高尿酸血症是一种慢性代谢性疾病，其表现为血尿酸水平高于正常范围(男性血尿酸浓度大于420μmol/L，女性血尿酸浓度大于360μmol/L)。高尿酸血症患者除因结晶尿酸引起的炎症导致的痛风外，还可能发展为肾病、尿结石，心血管紊乱，脑血管紊乱等。
痛风是高尿酸血症的一种并发症，是以血尿酸升高为主要生化指标的病症，与饮食结构、生活方式关系密切。随着国内生活水平提高，饮食结构的变化，糖、脂肪、蛋白质的摄入明显增加，痛风发病日益增多，已经成为一种常见的疾病。在全球范围内，痛风以每年400万人的速度递增，在我国尤其严重，痛风的发病率为6.89％，东南沿海甚至高达15.09％。痛风病的发生常伴有四肢及身体不适等症状，并可诱发肾功能不全、高血压、糖尿病、冠心病等综合病情、重症者可引起关节炎症反复发作，疼痛难忍，并形成痛风石造成关节畸形，给患者带来巨大的痛苦，直接影响生活质量，严重者可危及生命。
正常生理状态下，人体内尿酸总量约1200mg，尿酸是人体嘌呤代谢的产物，人体嘌呤来源有两种，外源性为摄入的嘌呤饮食，约占20％，内源性是指体内氨基酸，核苷酸以及其他小分子化合物合成和核酸分解代谢而来，约占80％。体内尿酸的排泄主要也有两种途径，2/3左右通过肾脏以尿液形式排出，1/3以肠道形式排泄的。临床研究表明，在患者发生肾衰竭后，肠道排泄尿酸的量会显著提升。此研究也给了我们启示，如果进一步降低肠道中的尿酸含量，可增加尿酸通过肠道排泄的比例，从而降低血液中的尿酸水平，进而达到防治高尿酸血症的目的，也就达到了防治痛风的目的。肠道排泄尿酸还有一个优势在于降低血尿酸的同时，缓解了痛风症状，也降低了尿酸结石的风险。
目前，临床上治疗高尿酸血症和痛风的主要策略有两种，一是抑制尿酸生成，此类药物多是黄嘌呤氧化酶的抑制物，如别嘌呤醇，非布司他等；二是增加尿酸的尿液排泄，此类药物多是作用于尿酸转运蛋白等，如丙磺舒，苯溴马隆，等；此外还有部分镇痛抗炎药，如秋水仙碱，糖皮质激素等。然而，这些药物均对肝肾具有较大损害，不能多用，也不能长期使用，许多患者因无法忍受其副作用而放弃使用此类药物进行治疗。而且使用促尿酸排泄药物，虽然可降低血尿酸的水平，但是同时增加了尿尿酸的含量，因而增加了罹患尿酸结石的风险。
虽然已有数个治疗高尿酸血症的重组尿酸氧化酶药物，然而该类药物均为注射用制剂，尚未有口服的尿酸氧化酶产品。注射用尿酸氧化酶由于是外源蛋白，免疫原性大，不能长期使用，而且该类药物生产工艺复杂，成本昂贵，售价也非常高，目前主要用于某些癌症患者在化疗过程中由于细胞的大量死亡导致的高尿酸血症。
目前产朊假丝酵母是目前研究比较多的尿酸氧化酶的表达菌种，然而该菌种表达产量极低，在0.02-2U/mg蛋白，且酶表达在细胞内，必须通过细胞破碎，酶液提取，浓缩与分离纯化才能使用，生产工艺非常复杂。原生发酵的尿酸氧化酶基本不具有应用价值。
胡芳等人研究了蛹虫草提取物对高尿酸血症的防治作用，但实验材料为石油醚、正丁醇萃取物质，其作用机制与其抑制黄嘌呤氧化酶活性，进而抑制尿酸合成有关。尹艳艳等人研究了蛹虫草对高尿酸患者的降尿酸作用，发现有降尿酸效果，但是其材料的服用方式为加热煮沸后服用，因而可断定其有效物质为耐热性的材料，并非尿酸氧化酶。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种可在肠道中催化尿酸降解的组合物及其制备方法和应用。
为了达成上述目的，本发明提供了一种可在肠道中催化尿酸降解的组合物，所述组合物含有蛹虫草菌粉或干酶粉，所述蛹虫草菌粉或干酶粉包含可催化尿酸降解的尿酸氧化酶。
进一步地，其中所述含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉或干酶粉是经液体发酵生产的。
进一步地，其中当所述组合物含有蛹虫草菌粉时，所述蛹虫草菌粉包含的可催化尿酸降解的尿酸氧化酶的活力为0.23U/g-292U/g。
进一步地，其中当所述组合物含有含蛹虫草尿酸氧化酶的干酶粉时，所述蛹虫草干酶粉包含的可催化尿酸降解的尿酸氧化酶的活力为2U/mg-20U/mg。
进一步地，其中所述含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉通过以下步骤制得：
1)将保存于PDA固体培养基上的蛹虫草菌(Cordyceps militaris)挑取菌丝转接到真菌培养基平板，25-28℃培养6-10天进行活化培养，从平板上切取1cm×1cm的菌块，切碎后，接种至液体种子培养基，置于150-170rpm，25-28℃培养箱中培养3-5天，然后用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，继续在相同条件下培养3-5天，再次用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，然后再按2-15％(v/v)的接种量接入种子液培养基中，150-170rpm、25-28℃培养3-5d，制备成种子液；
2)将种子液以5-20％(v/v)的接种量接入发酵培养基中，发酵罐装液比为0.6-0.8，培养基起始pH值为6.5，在25-28℃条件下连续培养，发酵过程中溶氧控制在30-70％，从第2天起，流加诱导剂至终浓度0.01-0.1wt％后进行诱导产酶，调节并维持pH值在7.0-8.5，持续培养7-10天，发酵培养物经板框过滤除去发酵清液，收集发酵菌丝体；
3)将步骤2)收集的发酵菌丝体经纯水洗涤3-5遍后，再次经板框过滤收集菌丝体，菌丝体在50-60℃条件下真空干燥箱干燥后，经机械粉碎为40-80目的粗菌粉，再经气流粉碎为150-300目的超细粉，即得所述含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉。
进一步地，其中所述含蛹虫草尿酸氧化酶的干酶粉通过以下步骤制得：
1)将保存于PDA固体培养基上的蛹虫草菌(Cordyceps militaris)挑取菌丝转接到真菌培养基平板，25-28℃培养6-10天进行活化培养，从平板上切取1cm×1cm的菌块，切碎后，接种至液体种子培养基，置于150-170rpm，25-28℃培养箱中培养3-5天，然后用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，继续在相同条件下培养3-5天，再次用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，然后再按2-15％(v/v)的接种量接入种子液培养基中，150-170rpm、25-28℃培养3-5d，制备成种子液；
2)将种子液以5-20％(v/v)的接种量接入发酵培养基中，发酵罐装液量为0.6-0.8，培养基起始pH值为6.5，在25-28℃条件下连续培养，发酵过程中溶氧控制在30-70％，从第2天起，流加诱导剂至终浓度0.01-0.1wt％后进行诱导产酶，调节并维持pH值在7.0-8.5，持续培养7-10天，发酵培养物经板框过滤除去发酵清液，收集发酵菌丝体；
3)收集的发酵菌丝体经纯水洗涤3-5遍后，加入3-5倍的菌丝体体积的纯水，经机械乳化罐乳化打碎，乳化液经离心机8000-12000rpm离心，收集上清液，即为含蛹虫草尿酸氧化酶的粗提酶液，酶液经纯化或者未经纯化后，加入蛋白保护剂经喷雾干燥或者冷冻干燥，即得所述含蛹虫草尿酸氧化酶的干酶粉。
进一步地，其中所述种子培养基与发酵培养基的配方相同，其组分如下：蔗糖2.0wt％-5.0wt％，蛋白胨2.0wt％-3.0wt％，酵母膏1.0wt％-2.5wt％，磷酸氢二钾0.5wt％-1.5wt％，磷酸二氢钠1.0wt％-2.0wt％，余量为水，pH6.5；所述板框过滤的滤布孔径200-300目；所述蛋白保护剂包含但不限于海藻糖，乳糖，牛血清白蛋白等。
进一步地，其中所述诱导剂为尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、硫代黄嘌呤或氨基尿嘧啶中的一种或几种。
为了达成上述的目的，本发明还提供了一种上述的可在肠道中催化尿酸降解的组合物在制备用于预防和治疗尿酸肾结石、高尿酸血症或痛风的产品中的应用。
本发明提供的可在肠道中催化尿酸降解的组合物，其包含含尿酸氧化酶活性的蛹虫草菌粉和干酶粉，这是从来没有报道过的。并且，本申请人通过创新发酵生产工艺，使蛹虫草菌具有产尿酸氧化酶的能力，且经优化使其产酶效率显著上升，具有在肠道中降解尿酸和尿酸盐的应用潜力。本发明的组合物可通过催化尿酸降解，降低肠道中的尿酸含量，增加血液中尿酸向肠道中分泌的比例，从而降低血液中的尿酸浓度，同时也降低了尿液中尿酸的排泄量，降低的尿酸结石的发病率。同时，本申请人在研究中发现，蛹虫草菌的尿酸氧化酶较产朊假丝酵母和黄曲霉来源的尿酸氧化酶在肠液中的稳定性明显高，尤其是含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉，经分析发现，蛹虫草的菌丝细胞壁具有保护内部的尿酸氧化酶免受胰蛋白酶消化的作用。本发明与上述的胡芳和尹艳艳两人的研究是完全不一样的，该发明的有效物质是尿酸氧化酶。本发明通过发酵生产含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉，与天然生长的蛹虫草菌粉相比，天然蛹虫草无法测出尿酸氧化酶活性，经本专利技术发酵的蛹虫草菌的尿酸氧化酶活性显著提高了数十倍至上千倍，而且尿酸氧化酶被外面包裹的蛹虫草细胞壁保护，具有一定的抗胰酶消化功能。基于本发明技术的产品较市面上的降尿酸药物，具有使用副作用小，不会引发尿酸结石，安全且有效的优势，具有显著的经济价值。
附图说明
图1为本发明实施例13含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉的降血尿酸效果图；
图2为本发明实施例13含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉的降尿尿酸效果图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1：蛹虫草菌(Cordyceps militaris)的分离与保存
本发明研究人员从武汉农贸市场购买新鲜的蛹虫草，采用组织分离法进行蛹虫草菌的分离纯化。具体操作如下：将新鲜的蛹虫草子实体表面用无菌水洗干净，放入超净工作台中的无菌培养皿中，用消毒的镊子夹75％(v/v)的酒精棉球对蛹虫草子实体表面进行消毒，用灭菌的解剖刀切开子实体，并切取子实体内部约2*2mm的菌肉组织块，用接种针移至灭菌的PDA斜面培养基(200g马铃薯，10g葡萄糖，15g琼脂糖，纯水定容至1L，121℃灭菌)上，置于26℃恒温培养箱进行培养。每天进行检查菌落生长状况，直至菌肉组织块上长出正常的白色菌丝体，挑取菌丝转接平板，进行纯化，待平板菌丝单一粗壮，表明分离成功。分离成功的菌种，分别置于4℃及-20℃条件下进行保存。另外，该蛹虫草菌(Cordycepsmilitaris)也可以是直接从中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)购买的。
实施例2：含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉的制备方法
将实施例1保存于PDA固体培养基上的蛹虫草菌(Cordyceps militaris)挑取菌丝转接到真菌培养基平板(蛋白胨0.5wt％，酵母浸出粉0.2wt％，葡萄糖2wt％，磷酸氢二钾0.1wt％，硫酸镁0.05wt％，2.0wt％琼脂糖，纯水定容补齐，pH 6.2～6.6)，25-28℃培养7-10天进行活化培养，从平板上切取1cm×1cm的菌块，切碎后，接种至种子培养基(蔗糖2.0wt％，蛋白胨1.0wt％，酵母膏1.0wt％，磷酸氢二钾0.5wt％，磷酸二氢钠1.0wt％，纯水定容补齐，pH6.5)，置于150rpm，25-28℃培养3-5天，然后用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，继续在相同条件下培养3-5天，再次用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，然后再按2％(v/v)的接种量接入种子液培养基中，150rpm、26℃培养3-5d，制备成种子液。将种子液以5％(v/v)的接种量接入发酵培养基(成分同种子培养基)中，发酵罐装液比为0.6，培养基起始pH值为6.5。在25℃条件下连续培养，发酵过程中溶氧控制在30-70％，从第2天起，流加诱导剂(0.5g/L尿酸)进行诱导产酶，用氨水调节发酵液pH维持在pH7.2-7.5，持续培养7-10天。发酵培养物经板框过滤(滤布孔径200-300目)除去发酵清液，收集发酵菌丝体，收集的发酵菌丝体经纯水洗涤3-5遍后，再次经板框过滤(滤布孔径200-300目)收集菌丝体，菌丝体在50-60℃条件下真空干燥箱干燥后，经机械粉碎为40-80目的粗粉，再经气流粉碎为200-300目的超细粉，即为含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉。
实施例3：含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉的制备方法
将实施例1保存于PDA固体培养基上的蛹虫草菌(Cordyceps militaris)挑取菌丝转接到真菌培养基平板(蛋白胨0.5wt％，酵母浸出粉0.2wt％，葡萄糖2wt％，磷酸氢二钾0.1wt％，硫酸镁0.05wt％，2.0wt％琼脂糖，纯水定容补齐，pH 6.2～6.6)，25-28℃培养6-7天进行活化培养，从平板上切取1cm×1cm的菌块，切碎后，接种至种子培养基(蔗糖2.0wt％，蛋白胨1.0wt％，酵母膏1.0wt％，磷酸氢二钾1.0wt％，磷酸二氢钠1.0wt％，纯水定容补齐，pH6.5)，置于150rpm，25-28℃培养3-5天，然后用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，继续在相同条件下培养3-5天，再次用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，然后再按5％(v/v)的接种量接入种子液培养基中，170rpm、26℃培养3-5d，制备成种子液。将种子液以10％(v/v)的接种量接入发酵培养基(成分同种子培养基)中，发酵罐装液比为0.7，培养基起始pH为6.5。在25℃条件下连续培养，发酵过程中溶氧控制在30-70％，从第2天起，流加诱导剂(1g/L次黄嘌呤)进行诱导产酶，无菌NaOH调节pH维持在pH7.5-8.0，持续培养7-10天。发酵培养物经板框过滤(滤布孔径200-300目)除去发酵清液，收集发酵菌丝体，收集的发酵菌丝体经纯水洗涤3-5遍后，再次经板框过滤(滤布孔径200-300目)收集菌丝体，菌丝体在50-60℃条件下真空干燥箱干燥后，经机械粉碎为40-80目的粗粉，再经气流粉碎为200-300目的超细粉，即为含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉。
实施例4：含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉的制备方法
将实施例1保存于PDA固体培养基上的蛹虫草菌(Cordyceps militaris)挑取菌丝转接到真菌培养基平板(蛋白胨0.5wt％，酵母浸出粉0.2wt％，葡萄糖2wt％，磷酸氢二钾0.1wt％，硫酸镁0.05wt％，2.0wt％琼脂糖，纯水定容补齐，pH 6.2～6.6)，25-28℃培养6-7天进行活化培养，从平板上切取1cm×1cm的菌块，切碎后，接种至种子培养基(蔗糖2.0wt％，蛋白胨1.0wt％，酵母膏1.0wt％，磷酸氢二钾1.5wt％，磷酸二氢钠2.0wt％，纯水定容补齐，pH6.5)，置于150rpm，25-28℃培养3-5天，然后用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，继续在相同条件下培养3-5天，再次用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，然后再按10％(v/v)的接种量接入种子液培养基中，150rpm、26℃培养3-5d，制备成种子液。将种子液以10％(v/v)的接种量接入发酵培养基(成分同种子培养基)中，发酵罐装液比为0.8，培养基起始pH为6.5。在25℃条件下培养，发酵过程中溶氧控制在30-70％，从第2天起，流加诱导剂(0.2g/L8-羟基鸟嘌呤)进行诱导产酶，氨水调节pH维持在pH7.2-7.5，持续培养7-10天。发酵培养物经板框过滤(滤布孔径200-300目)除去发酵清液，收集发酵菌丝体，收集的发酵菌丝体经纯水洗涤3-5遍后，再次经板框过滤(滤布孔径200-300目)收集菌丝体，菌丝体在50-60℃条件下真空干燥箱干燥后，经机械粉碎为40-80目的粗粉，再经气流粉碎为200-300目的超细粉，即为含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉。
实施例5：含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉的制备方法
将实施例1保存于PDA固体培养基上的蛹虫草菌(Cordyceps militaris)挑取菌丝转接到真菌培养基平板(蛋白胨0.5wt％，酵母浸出粉0.2wt％，葡萄糖2wt％，磷酸氢二钾0.1wt％，硫酸镁0.05wt％，2.0wt％琼脂糖，纯水定容补齐，pH 6.2～6.6)，25-28℃培养8-10天进行活化培养，从平板上切取1cm×1cm的菌块，切碎后，接种至种子培养基(蔗糖2.0wt％，蛋白胨1.0wt％，酵母膏1.0wt％，磷酸氢二钾0.5wt％，磷酸二氢钠1.0wt％，纯水定容补齐，pH6.5)，置于150rpm，25-28℃培养3-5天，然后用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，继续在相同条件下培养3-5天，再次用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，然后再按15％(v/v)的接种量接入种子液培养基中，150rpm、26℃培养3-5d，制备成种子液。将种子液以15％(v/v)的接种量接入发酵培养基(成分同种子培养基)中，发酵罐装液比为0.65，培养基起始pH为6.5。在25℃条件下培养，发酵过程中溶氧控制在30-70％，从第2天起，流加诱导剂(0.3g/L尿酸)进行诱导产酶，无菌氨水调节pH维持在pH8.0-8.5，持续培养7-10天。发酵培养物经板框过滤(滤布孔径200-300目)除去发酵清液，收集发酵菌丝体，收集的发酵菌丝体经纯水洗涤3-5遍后，再次经板框过滤(滤布孔径200-300目)收集菌丝体，菌丝体在50-60℃条件下真空干燥箱干燥后，经机械粉碎为40-80目的粗粉，再经气流粉碎为200-300目的超细粉，即为含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉。
实施例6：含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉的制备方法
将实施例1保存于PDA固体培养基上的蛹虫草菌(Cordyceps militaris)挑取菌丝转接到真菌培养基平板(蛋白胨0.5wt％，酵母浸出粉0.2wt％，葡萄糖2wt％，磷酸氢二钾0.1wt％，硫酸镁0.05％，2.0％琼脂糖，纯水定容补齐，pH 6.2～6.6)，25-28℃培养6-7天进行活化培养，从平板上切取1cm×1cm的菌块，切碎后，接种至种子培养基(蔗糖2.0wt％，蛋白胨1.0wt％，酵母膏1.0wt％，磷酸氢二钾1.5wt％，磷酸二氢钠1.0wt％，纯水定容补齐，pH6.5)，置于150rpm，25-28℃培养3-5天，然后用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，继续在相同条件下培养3-5天，再次用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，然后再按15％(v/v)的接种量接入种子液培养基中，150rpm、26℃培养3-5d，制备成种子液。将种子液以20％(v/v)的接种量接入发酵培养基(成分同种子培养基)中，发酵罐装液比为0.75，培养基起始pH为6.5。在25℃条件下培养，发酵过程中溶氧控制在30-70％，从第2天起，流加诱导剂(0.5g/L氨基尿嘧啶)进行诱导产酶，无菌NaOH调节pH维持在pH7.5-8.0，持续培养7-10天。发酵培养物经板框过滤(滤布孔径200-300目)除去发酵清液，收集发酵菌丝体，收集的发酵菌丝体经纯水洗涤3-5遍后，再次经板框过滤(滤布孔径200-300目)收集菌丝体，菌丝体在50-60℃条件下真空干燥箱干燥后，经机械粉碎为40-80目的粗粉，再经气流粉碎为200-300目的超细粉，即为含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉。
实施例7：含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉的制备方法
将实施例1保存于PDA固体培养基上的蛹虫草菌(Cordyceps militaris)挑取菌丝转接到真菌培养基平板(蛋白胨0.5wt％，酵母浸出粉0.2wt％，葡萄糖2wt％，磷酸氢二钾0.1wt％，硫酸镁0.05wt％，2.0wt％琼脂糖，纯水定容补齐，pH 6.2～6.6)，25-28℃培养6-7天进行活化培养，从平板上切取1cm×1cm的菌块，切碎后，接种至种子培养基(蔗糖2.0wt％，蛋白胨1.0wt％，酵母膏1.0wt％，磷酸氢二钾0.5wt％，磷酸二氢钠1.0wt％，纯水定容补齐，pH6.5)，置于150rpm，25-28℃培养3-5天，然后用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，继续在相同条件下培养3-5天，再次用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，然后再按5％(v/v)的接种量接入种子液培养基中，150rpm、26℃培养3-5d，制备成种子液。将种子液以15％(v/v)的接种量接入发酵培养基(成分同种子培养基)中，发酵罐装液比为0.7，培养基起始pH为6.5。在25℃条件下培养，发酵过程中溶氧控制在30-70％，从第2天起，流加诱导剂(0.8g/L次黄嘌呤)进行诱导产酶，无菌NaOH调节pH维持在pH8.0-8.5，持续培养7-10天。发酵培养物经板框过滤(滤布孔径200-300目)除去发酵清液，收集发酵菌丝体，收集的发酵菌丝体经纯水洗涤3-5遍后，再次经板框过滤(滤布孔径200-300目)收集菌丝体，菌丝体在50-60℃条件下真空干燥箱干燥后，经机械粉碎为40-80目的粗粉，再经气流粉碎为200-300目的超细粉，即为含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉。
实施例8：含蛹虫草尿酸氧化酶的干酶粉的制备方法
将实施例1保存于PDA固体培养基上的蛹虫草菌(Cordyceps militaris)挑取菌丝转接到真菌培养基平板(蛋白胨0.5wt％，酵母浸出粉0.2wt％，葡萄糖2wt％，磷酸氢二钾0.1wt％，硫酸镁0.05wt％，2.0wt％琼脂糖，纯水定容补齐，pH 6.2～6.6)，25-28℃培养6-7天进行活化培养，从平板上切取1cm×1cm的菌块，切碎后，接种至种子培养基(蔗糖2.0wt％，蛋白胨1.0wt％，酵母膏1.0wt％，磷酸氢二钾1.5wt％，磷酸二氢钠2.0wt％，纯水定容补齐，pH6.5)，置于150rpm，25-28℃培养3-5天，然后用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，继续在相同条件下培养3-5天，再次用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，然后再按10％(v/v)的接种量接入种子液培养基中，150rpm、26℃培养3-5d，制备成种子液。将种子液以15％(v/v)的接种量接入发酵培养基(成分同种子培养基)中，发酵罐装液比为0.7，培养基起始pH为6.5。在25℃条件下培养，发酵过程中溶氧控制在30-70％，从第2天起，流加诱导剂(1.0g/L黄嘌呤)进行诱导产酶，无菌尿素调节pH维持在pH7.5-8.0，持续培养7-10天。发酵培养物经板框过滤(滤布孔径200-300目)除去发酵清液，收集发酵菌丝体，收集的发酵菌丝体经纯水洗涤后，加入3倍菌丝体体积的纯水，经机械乳化罐打碎乳化，乳化液经蝶式离心机8000-12000g离心，收集上清液，即为含蛹虫草尿酸氧化酶的粗提酶液。将粗提酶液经层析纯化处理后，得到纯化尿酸氧化酶的酶液。将纯化酶液与粗酶液分别加入5％(w/v)蛋白保护剂(海藻糖，乳糖，或牛血清白蛋白)，分别经喷干或者冻干处理得到干酶粉，即为含蛹虫草尿酸氧化酶的干酶粉。
实施例9：蛹虫草粉尿酸氧化酶的活力的测定
尿酸氧化酶活力采用紫外吸收法测定，具体操作为：(1)配制100mg/L尿酸的反应缓冲液(100mM硼酸盐缓冲液，100mg/L尿酸，pH7.4)；(2)分别配制0，10，20，40，60，80，100mg/L的尿酸标准溶液，(3)称取20mg实施例1发酵生产的蛹虫草菌粉，加入5ml尿酸反应缓冲液中，涡旋震荡混匀后，37℃孵育10min，加入250μL 2.5M H2SO4终止反应，过0.22μm滤膜除去蛹虫草菌粉后，用pH7.4的100mM硼酸盐缓冲液稀释3倍，290nm测定吸光值。(4)取尿酸标准溶液5ml，37℃孵育10min，加入250μL 2.5MH2SO4混匀，用pH7.4的100mM硼酸盐缓冲液稀释3倍，290nm测定吸光值，根据吸光值与浓度绘制标准曲线。(5)根据标准曲线，计算反应体系内残留的尿酸含量，计算得到蛹虫草尿酸氧化酶的活力。
应用本实施例的酶活力测定方法对实施例8中不同方式处理得到的蛹虫草干酶粉进行酶活测定，结果(表1)显示，添加蛋白保护剂后，对后处理过程中的酶活力均有较好的保护作用，尤其是对纯化后的尿酸氧化酶(活力提升54-87％)。对比发现未纯化的酶液，添加蛋白保护剂对酶活力的影响相对较小，推测可能粗酶液中残留的蛹虫草菌的蛋白和多糖等成分，对尿酸氧化酶蛋白起到了一定的保护作用。
表1.不同处理方式的蛹虫草尿酸氧化酶干酶粉活力比较
实施例10：不同产地来源的蛹虫草菌的尿酸氧化酶活性测定
除上述实施例中采用的武汉农贸市场采购的蛹虫草菌种外，本专利发明人还分别从吉林，辽宁，黑龙江，新疆，云南，广东，浙江，江西，福建等地分别采购了20余种新鲜蛹虫草产品，并经组织分离法分离得到纯种，采用实施例2的发酵方法，对采购的20余种蛹虫草菌进行诱导发酵培养，结果发现均具有尿酸氧化酶活力(表2)，但酶活力有所不同。
表2.不同产地的蛹虫草的产酶对比
| 蛹虫草菌种编号 | 产地 | 尿酸氧化酶活力(U/g) |
| CM01 | 武汉 | 192 |
| CM02 | 吉林1 | 70 |
| CM03 | 吉林2 | 122 |
| CM04 | 吉林3 | 108 |
| CM05 | 辽宁1 | 64 |
| CM06 | 辽宁2 | 86 |
| CM07 | 辽宁3 | 93 |
| CM08 | 辽宁4 | 57 |
| CM09 | 黑龙江1 | 79 |
| CM10 | 黑龙江2 | 154 |
| CM11 | 黑龙江3 | 113 |
| CM12 | 新疆1 | 44 |
| CM13 | 新疆2 | 49 |
| CM14 | 云南1 | 44 |
| CM15 | 云南2 | 76 |
| CM16 | 广东1 | 61 |
| CM17 | 广东2 | 76 |
| CM18 | 广东3 | 87 |
| CM19 | 浙江1 | 123 |
| CM20 | 浙江2 | 109 |
| CM21 | 江西1 | 187 |
| CM22 | 江西2 | 173 |
| CM23 | 福建1 | 85 |
实施例11：不同诱导剂诱导蛹虫草菌产生尿酸降解酶的对比
发酵条件如实施例2-8，诱导剂分别选用尿酸，黄嘌呤，次黄嘌呤，8-羟基鸟嘌呤，硫代黄嘌呤，氨基尿嘧啶。测试诱导产生尿酸氧化酶的效果，结果如下表3所示：
表3.不同诱导剂的尿酸氧化酶产量比较
由表3可知，6种诱导剂均可以诱导蛹虫草菌产生尿酸氧化酶，但是不同种类的诱导剂以及相同诱导剂的不同剂量，诱导发酵生产的含尿酸氧化酶的蛹虫草粉的活力介于0.23U/g至292U/g之间。然而，从纯化得到的含蛹虫草尿酸氧化酶的干酶粉的活力看，不同发酵条件的酶活介于2.0-20U/mg之间，可知不同诱导剂和发酵条件不但会影响到尿酸氧化酶的活力，同时也影响了蛹虫草菌表达尿酸氧化酶的表达产量。
实施例12：肠道环境下蛹虫草粉的活性测定
本实施例以实施例2工艺制备的含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉，实施例8制备的蛹虫草尿酸氧化酶干酶粉，和市售的产朊假丝酵母尿酸氧化酶，黄曲霉尿酸氧化酶以及酿酒酵母重组表达的黄曲霉尿酸氧化酶进行人工肠液稳定性的对比测试。取配制好的人工肠液尿酸反应液(100mM PBS，1wt％胰蛋白酶，100mg/L尿酸，pH7.4)5ml，分别加入等活力单位(100U)的含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉和产朊假丝酵母尿酸氧化酶，37℃下震荡孵育，并于0min，5min，10min，20min，30min，40min，60min，120min，180min取样，立即加入50μl胰酶抑制剂(1.0mM PMSF溶液)终止反应，立即于290nm测定尿酸含量，评估尿酸氧化酶活力。如下表(表4)所示，含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉和含蛹虫草尿酸氧化酶的干酶粉在肠道中较产朊假丝酵母尿酸氧化酶、黄曲霉尿酸氧化酶及重组黄曲霉尿酸氧化酶(酿酒酵母重组表达)具有更高的稳定性，另外，蛹虫草菌粉较蛹虫草尿酸氧化酶干酶粉在肠液中的稳定性更优，这可能是由于蛹虫草菌丝的细胞壁具有抵抗胰蛋白酶消化的作用，一定程度上保护了内部的尿酸氧化酶免受胰蛋白酶的消化。
表4.含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉在人工肠液中的稳定性
实施例13：在高尿酸血症小鼠模型体内的降尿酸效果
雄性小鼠40只，体重20-25g，动物适应性饲养3-5天后，随机分为空白组、模型组、阳性药组(别嘌呤醇)、蛹虫草菌粉组，每组10只，饲养于独立代谢笼中。所有动物喂食相同的鼠粮和灭菌饮用水。用灭菌水将酵母浸膏配成悬液，按30g/kg的剂量每日给模型组、阳性药物组和蛹虫草菌粉组小鼠进行灌胃1次。同时按照250mg/kg的剂量腹腔注射乙胺丁醇溶液，每日1次，连续13天。测试期间，阳性药组口服5mg/kg别嘌呤醇，每天3次，蛹虫草粉组，口服100mg/次/鼠实施例1制备的蛹虫草菌粉，每天3次，收集24h尿液，用于测定尿液排泄量。在治疗13天时，所有组的小鼠均经尾部取血，测定血液尿酸水平，结果如图1、图2所示。图1及图2的结果显示，口服含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉可以显著降低血尿酸水平，同时尿尿酸排泄量也有明显下降。该实施例也证明了通过降低肠道中的尿酸，可以达到降低血尿酸和尿尿酸的目的，因而显示本发明的产品具有良好的应用潜力。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (5)
1.一种可在肠道中催化尿酸降解的组合物，其特征在于，所述组合物含有蛹虫草菌粉或干酶粉，所述蛹虫草菌粉或干酶粉包含可催化尿酸降解的尿酸氧化酶；
所述含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉通过以下步骤制得：
1)将保存于PDA固体培养基上的蛹虫草菌Cordyceps militaris挑取菌丝转接到真菌培养基平板，25-28℃培养6-10天进行活化培养，从平板上切取1cm×1cm的菌块，切碎后，接种至液体种子培养基，置于150-170rpm，25-28℃培养箱中培养3-5天，然后用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，继续在相同条件下培养3-5天，再次用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，然后再按2-15％(v/v)的接种量接入种子液培养基中，150-170rpm、25-28℃培养3-5d，制备成种子液；
2)将种子液以5-20％(v/v)的接种量接入发酵培养基中，发酵罐装液比为0.6-0.8，培养基起始pH值为6.5，在25-28℃条件下连续培养，发酵过程中溶氧控制在30-70％，从第2天起，流加诱导剂至终浓度0.01-0.1wt％后进行诱导产酶，调节并维持pH值在7.0-8.5，持续培养7-10天，发酵培养物经板框过滤除去发酵清液，收集发酵菌丝体；
3)将步骤2)收集的发酵菌丝体经纯水洗涤3-5遍后，再次经板框过滤收集菌丝体，菌丝体在50-60℃条件下真空干燥箱干燥后，经机械粉碎为40-80目的粗菌粉，再经气流粉碎为150-300目的超细粉，即得所述含尿酸氧化酶的蛹虫草菌粉；
所述含蛹虫草尿酸氧化酶的干酶粉通过以下步骤制得：
1)将保存于PDA固体培养基上的蛹虫草菌Cordyceps militaris挑取菌丝转接到真菌培养基平板，25-28℃培养6-10天进行活化培养，从平板上切取1cm×1cm的菌块，切碎后，接种至液体种子培养基，置于150-170rpm，25-28℃培养箱中培养3-5天，然后用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，继续在相同条件下培养3-5天，再次用无菌手持式匀浆机将菌块打碎，然后再按2-15％(v/v)的接种量接入种子液培养基中，150-170rpm、25-28℃培养3-5d，制备成种子液；
2)将种子液以5-20％(v/v)的接种量接入发酵培养基中，发酵罐装液比为0.6-0.8，培养基起始pH值为6.5，在25-28℃条件下连续培养，发酵过程溶氧控制在30-70％，从第2天起，流加诱导剂至终浓度0.01-0.1wt％后进行诱导产酶，调节并维持pH值在7.0-8.5，持续培养7-10天，发酵培养物经板框过滤除去发酵清液，收集发酵菌丝体；
3)将步骤2)收集的发酵菌丝体经纯水洗涤3-5遍后，加入3-5倍菌丝体体积的纯水，经机械乳化罐乳化打碎，乳化液经离心机8000-12000rpm离心，收集上清液，即为含蛹虫草尿酸氧化酶的粗提酶液，酶液经纯化或者未经纯化后，加入蛋白保护剂经喷雾干燥或者冷冻干燥，即得所述含蛹虫草尿酸氧化酶的干酶粉；
其中，所述诱导剂为尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、硫代黄嘌呤或氨基尿嘧啶中的一种或几种。
2.如权利要求1所述的可在肠道中催化尿酸降解的组合物，其特征在于，当所述组合物含有蛹虫草菌粉时，所述蛹虫草菌粉包含的可催化尿酸降解的尿酸氧化酶的活力为0.23U/g-292U/g。
3.如权利要求1所述的可在肠道中催化尿酸降解的组合物，其特征在于，当所述组合物含有干酶粉时，所述干酶粉包含的可催化尿酸降解的尿酸氧化酶的活力为2U/mg-20U/mg。
4.如权利要求1所述的可在肠道中催化尿酸降解的组合物，其特征在于，所述种子培养基与发酵培养基的配方相同，其组分如下：蔗糖2.0wt％-5.0wt％，蛋白胨2.0wt％-3.0wt％，酵母膏1.0wt％-2.5wt％，磷酸氢二钾0.5wt％-1.5wt％，磷酸二氢钠1.0wt％-2.0wt％，余量为水，pH6.5；所述板框过滤的滤布孔径200-300目；所述蛋白保护剂包含海藻糖、乳糖或牛血清白蛋白。
5.权利要求1-4任一项所述的可在肠道中催化尿酸降解的组合物在制备用于预防和治疗尿酸肾结石、高尿酸血症或痛风的产品中的应用。
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