CN116113714A - 用于检测病毒序列的组合物、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于从样本中特异性和差异检测SARS‑CoV‑2和/或其它病毒的组合物、测定、方法、诊断方法、试剂盒和诊断试剂盒，所述样本包括兽医样本、临床样本、食物样本、法医样本、环境样本(例如，从土壤、垃圾、污水、空气、水、食品加工和制造表面等获得的样本)，或从人类或非人类动物获得的生物样本。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年1月8日提交的题为“用于检测病毒序列的组合物、试剂盒和方法(COMPOSITIONS,KITS AND METHODS FOR DETECTION OF VIRALSEQUENCES)”的美国临时专利申请序列号63/199,570；2020年12月4日提交的题为“用于检测病毒序列的组合物、试剂盒和方法”的美国临时专利申请序列号63/199,076；2020年10月16日提交的题为“用于检测病毒序列的组合物、试剂盒和方法”的美国临时专利申请序列号63/198,421；2020年9月30日提交的题为“用于检测病毒序列的组合物、试剂盒和方法”的美国临时专利申请序列号63/198,134；2020年7月30日提交的题为“用于检测病毒序列的组合物、试剂盒和方法”的美国临时专利申请序列号62/706,081；2020年7月15日提交的题为“用于检测病毒序列的组合物、试剂盒和方法”的美国临时专利申请序列号63/052,385；2020年6月25日提交的题为“用于检测病毒序列的组合物、试剂盒和方法”的美国临时专利申请序列号63/044,160；2020年2月26日提交的题为“用于检测病毒序列的组合物、试剂盒和方法”的美国临时专利申请序列号62/981,938；和2020年2月18日提交的题为“用于检测病毒序列的组合物、试剂盒和方法”的美国临时专利申请序列号62/978,274的优先权和权益。前述申请中的每一个都通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用整体并入本文。创建于2021年1月15日的所述ASCII副本被命名为LT01529PCT_SL.txt，并且大小为665,718字节。
技术领域
本教导涉及用于特异性检测、诊断和区分涉及传染病的病毒的组合物、方法、系统和试剂盒。特异性病毒因子的差异检测允许准确诊断，使得可以及时提供适当的治疗和感染控制措施。
背景技术
传染病是由病原微生物或传染因子(例如病毒)引起的。由于若干原因，传染病的早期和准确诊断很重要。例如，正确的诊断可以导致更早、更有效的治疗，其将改善受感染个体的结局。另一方面，未被诊断或误诊的个体可能会在不知不觉中将疾病传播给他人。准确的诊断还有助于确保应用适当的治疗，特别是对于某些具有多种致病原因和类似症状特征的疾病类别，如呼吸系统疾病。
与传染病相关的问题病毒的一个实例是冠状病毒。冠状病毒是具有约30千碱基长度的正义链单链RNA基因组的病毒家族。人类冠状病毒在20世纪60年代中期首次被鉴定为普通感冒的许多病原体(etiologic agent)之一。世界各地的人通常会感染人类冠状病毒毒株229E(一种α冠状病毒)、NL63(一种α冠状病毒)、OC43(一种β冠状病毒)和HKU1(一种β冠状病毒)。这些感染表现为轻度临床症状和极低的死亡率。
一些冠状病毒感染非人类动物，在那里它们可以进化并经历人畜共患病，将它们的嗜性扩展到人类。在过去的几年里，这类交叉事件已被证明是毁灭性的。例如，中东呼吸综合征(MERS)是由MERS-CoV(一种从单峰骆驼传播到人类的β冠状病毒)引起的。MERS-CoV与约35％的高死亡率相关，但其低传播率有助于限制其传播和破坏的可能性。作为另一实例，由另一种β冠状病毒SARS-CoV引起的严重急性呼吸系统综合症(SARS)被认为是从蝙蝠传播给果子狸，果子狸然后将病毒传播给人类。尽管不像MERS-CoV那样致命，但SARS-CoV仍然与约9.6％的较高死亡率相关。很可能，至少部分地是由于SARS-CoV在人体内的生命周期，这种病毒的传播主要局限于东南亚国家。感染SARS-CoV的人通常在脱落传染性病毒之前出现症状，这使得隔离成为限制感染的暴露和传播的特别有用的工具。
最近，出现了新的变体β冠状病毒SARS-CoV-2(也被称为2019-nCoV)。虽然流行病学数据不完整，但迄今为止的报告表明，全世界超过8500万人被认为已经被SARS-CoV-2感染。然而，与之前的MERS-CoV和SARS-CoV不同，SARS-CoV-2似乎平均致死显著更低，其中死亡率为约2.3％。由于其增加的传播性，与SARS-CoV-2相关的看似很小的死亡百分比掩盖了其在世界范围内的影响，在本申请提交时，全球疫情估计已有190万人死亡，并且目前在继续增加。受SARS-CoV-2影响的原始人数超过了由MERS-CoV和SARS-CoV合并造成的死亡总数—据报道为约1,600人。
鉴于新的冠状病毒毒株的目前和持续出现，迫切需要开发用于快速检测和表征现有和新型冠状病毒毒株的方法，使得以及时的方式适当地制定适当的治疗和感染控制措施。有问题的是，许多SARS-CoV-2检测测定在检测和区分SARS-CoV-2与其他呼吸道病原体，特别是其他冠状病毒方面没有特异性，这导致患者对当前SARS-CoV-2检测测定的诊断潜力缺乏信心。此外，由于感染SARS-CoV-2的个体通常经历与感染A型或B型流感(Flu A或FluB)和/或呼吸道合胞病毒(RSV)的个体相似的症状，因此额外需要能够同时测试这些呼吸道病毒中的每一种，以便在寻求/提供治疗和/或在可能错误地认为个体感染了SARS-CoV-2的情况下将该个体限制在隔离区域之前提供准确的诊断。每个被错误鉴定或误诊的SARS-CoV-2感染病例都进一步混淆了流行病学数据，并且阻碍了适当的、知情的解决方案的实施。
因此，用于检测其他常见呼吸道病毒病原体中的现有和新型冠状病毒毒株的当前方法、系统、组合物和试剂盒存在许多缺点，这些缺点可以被解决，并且本公开的方法、系统、组合物和试剂盒解决并克服了本领域中的至少一些前述问题。
附图说明
为了描述可以获得本公开的上述以及其它优点和特征的方式，将通过参考附图中所示的其特定实施例呈现对以上简要描述的本公开的更具体描述。应当理解，这些附图仅描绘了本公开的典型实施例，并且因此不应被视为限制本公开的范围。
将通过使用附图以附加的特征和细节来描述和说明本公开，在附图中：
图1A示出了在整个基因组中和在冠状病毒基因组内的特定基因区域中，共有的SARS-CoV-2序列与三种密切相关的冠状病毒，即Bat-SL-CoVZC45、Bat-SL-CoVZXC21和SARS-CoVGZ02之间的序列同一性。
图1B以图表形式示出了图1A的表格信息，其中x轴是病毒基因组内的碱基对位置，并且y轴是每个相关病毒与相应SARS-CoV-2共有序列的相似性百分比。
图2A示出了在包含SARS-CoV-2核酸的示例性样本上进行的ORF1ab单重(singleplex)qPCR测定的扩增图，用于qPCR测定的试剂是本文公开的用于检测SARS-CoV-2的试剂盒的一部分。
图2B示出了图2A的单重qPCR测定的标准曲线。
图2C示出了对含有SARS-CoV-2核酸的示例性样本进行的N蛋白单重qPCR测定的扩增图，用于qPCR测定的试剂是本文公开的用于检测SARS-CoV-2的试剂盒的一部分。
图2D示出了图2C的单重qPCR测定的标准曲线。
图2E示出了对含有SARS-CoV-2核酸的示例性样本进行的S蛋白单重qPCR测定的扩增图，用于qPCR测定的试剂是本文公开的用于检测SARS-CoV-2的试剂盒的一部分。
图2F示出了图2E的单重qPCR测定的标准曲线。
图3A-3C示出了在运行7500标准方案或7500快速方案的7500Fast Dx仪器(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))上进行的ORF1ab(图3A)、N蛋白(图3B)和S蛋白(图3C)qPCR测定的比较扩增图。
图4A-4C示出了当在7500Fast Dx仪器(赛默飞世尔科技公司)或QuantStudio 5实时PCR系统(赛默飞世尔科技公司)上运行相同的标准方案时产生的ORF1ab(图4A)、N蛋白(图4B)和S蛋白(图4C)qPCR测定的比较扩增图。
图5A-5C示出了在QuantStudio5实时PCR系统(赛默飞世尔科技公司)上使用TaqPath1步RT-qPCR主混合物(TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix)(赛默飞世尔科技公司)或TaqMan快速病毒1步主混合物(TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix)(赛默飞世尔科技公司)进行的ORF1ab(图5A)、N蛋白(图5B)和S蛋白(图5C)qPCR测定的比较扩增图。
具体实施方式
在详细描述本公开的各种实施例之前，应理解，本公开不限于特别示例的系统、方法、设备、产物、工艺和/或试剂盒的参数，所述参数理所当然地可以变化。因此，虽然将参考特定配置、参数、部件、元件等来详细描述本公开的某些实施例，但是所述描述为示例性的，且不应被理解为限制所要求保护的发明的范围。另外，本文中所用的术语是出于描述实施例的目的，且不必用于限制所要求保护的发明的范围。
此外，应理解，对于本文中描述的任何给定部件或实施例，除非隐含地或明确地另有理解或陈述，否则针对所述部件列出的任何可能候选或替代方案通常可以单独使用或彼此结合使用。另外，应理解，除非另外隐含地或明确地理解或陈述，否则此类候选或替代方案的任何列表仅是示例性的，而不是限制性的。
另外，除非另有指示，否则在说明书和权利要求书中所使用的表达数量、构成、距离或其它度量的数字应被理解为由术语“约”修饰，正如术语在本文中定义。因此，除非有相反的指示，否则在说明书和所附权利要求书中所阐述的数值参数是可根据寻求通过本文提出的主题获得的期望特性而改变的近似值。最低限度地，并且不试图限制等效物原则应用于权利要求书的范围，至少应根据所报告的有效数字的数目并且通过应用一般四舍五入技术来解释每个数值参数。尽管阐述本文呈现的主题的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但尽可能精确地报告特定示例中阐述的数值。然而，任何数值固有地含有某些必然因其相应测试测量中存在的标准偏差所致的误差。
本文所引用的所有公开和专利申请以及本文所附的附录出于所有目的而以相同程度以全文引用的方式并入本文中，其引用程度如同每篇公开和专利申请被具体地且个别地指明以如此引用的方式并入一样。尽管为了清楚和理解的目的，已经通过图示和实例的方式详细地描述了本发明，但是很明显，在本公开和所附权利要求的精神和实质的范围内，可以实施某些改变和修改。
本文所使用的标题和小标题只是出于组织目的，而不用于限制本说明书或权利要求书的范围。
用于检测靶序列的组合物、系统和试剂盒的概述
如上所述，一种新的变体β冠状病毒SARS-CoV-2(也被称为2019-nCoV)最近已成为最新的大流行病毒。鉴于现有的用于鉴定SARS-CoV-2感染的非特异性检测测定，当前的流行病学数据可能处于不利地位。缺乏从样本(例如，从鼻咽拭子、鼻咽抽吸物、支气管肺泡灌洗液、口腔拭子、唾液或尿液中获得的临床样本)中准确和特异性地鉴定SARS-CoV-2和/或将该病毒与其他常见的呼吸道病原体区分开的可靠测定可能会妨碍医疗保健专业人员对患者进行适当的治疗和建议。此外，由于无法准确、快速地识别感染SARS-CoV-2的个体，因此很难建立系统的治疗活动或实施成功的预防措施。
鉴于新的冠状病毒毒株的目前和持续出现，迫切需要开发用于快速检测和表征现有和新型冠状病毒毒株的方法，使得以及时的方式适当地制定适当的治疗和感染控制措施。有问题的是，许多可用的SARS-CoV-2检测测定在检测和区分SARS-CoV-2与其他呼吸道病原体，特别是其他冠状病毒方面没有特异性，这有可能导致患者对当前SARS-CoV-2检测测定的诊断潜力缺乏信心。此外，由于感染SARS-CoV-2的个体通常经历与感染A型或B型流感和/或呼吸道合胞病毒(RSV)和/或其他呼吸道微生物的个体相似的症状，因此额外需要能够同时测试这些呼吸道感染因子中的每一种，以便在寻求/提供治疗和/或在可能错误地认为个体感染了SARS-CoV-2的情况下将该个体限制在隔离区域之前提供准确的诊断。每个被错误鉴定或误诊的SARS-CoV-2感染病例都可能进一步混淆流行病学数据，并且阻碍可能有助于控制疫情的适当的、知情的解决方案的实施。
许多测定据称可用于检测SARS-CoV-2的存在，例如由美国疾病控制和预防中心(United States Centers for Disease Control and Prevention)(US-CDC)提供的含有靶向N蛋白的探针的测定，由中国CDC开发的靶向N蛋白和ORF1ab蛋白的编码区的测定，以及靶向N蛋白、E蛋白和密切相关的RdRp SARS/冠状病毒的编码区的WHO试剂盒。虽然上述测定中的每一种都100％覆盖了迄今为止所有已发表的SARS-CoV-2基因组—这意味着这些测定在理论上都能够从核酸样本中鉴定SARS-CoV-2的存在—但是这些测定的设计使得检测是非特异性的，这可能使上述问题持续存在，而不是缓解它们。
例如，WHO试剂盒中用于E蛋白和N蛋白的探针完美地映射到数百种非SARS-CoV-2冠状病毒毒株。此外，鉴定RdRp-SARS/病毒的验证性探针被设计成检测SARS和SARS-CoV-2，通过设计使其非特异性。这些测定也缺乏内源性对照。总的来说，这种测定对SARS-CoV-2没有特异性，并且容易提供假阳性结果。类似地，用于检测SARS-CoV-2的US-CDC试剂盒也表现出一些非特异性。它依赖于针对N蛋白的编码区的三个独立探针，并且这些探针中的两个在存在非SARS-CoV-2冠状病毒(例如许多SARS毒株和甚至bat-SARS-CoV毒株)的情况下，尤其是当以较高的浓度存在时，可以产生假阳性信号。因此，即使该试剂盒也未能提供具有所需SARS-CoV-2特异性的测定，并且在市场上仍然存在对SARS-CoV-2检测测定的未满足需求，所述检测测定是准确和特异性的，并且优选地可以在获得样本和接收结果之间的短周转时间内快速实施。
本文公开了用于特异性地检测病毒序列，特别是SARS-CoV-2的组合物、试剂盒和方法。公开了另外的组合物、试剂盒和方法，它们能够检测和区分SARS-CoV-2与其他相关冠状病毒、呼吸道微生物群以及在人类中产生类似症状感染的常见呼吸道病原体，包括A型流感(Flu A)、B型流感(Flu B)和呼吸道合胞病毒(例如，RSV A和RSV B)。如在整个本说明书中所证明的，本文公开的许多探针包括与文献中报道的SARS-CoV-2的所有52个基因组序列表现出100％同一性(即，无错配)的核酸结合部分。此外，本文提供的试剂盒和方法特异性地靶向目前在GISAID可获得的所有71个完整基因组，并且不靶向目前在NCBI可获得的其它冠状病毒的2,116个完整基因组中的任何一个，强调了所公开的用于检测SARS-CoV-2的方法和试剂盒的有益特异性。实际上，所公开的实施例解决了病毒鉴定领域中的至少一些未满足的需求，并且提供了对现有病毒检测组合物、试剂盒和方法的有意义的改进。
在一些实施例中，基于对截至2020年7月6日可从GISAID获得的35,833个高质量完整序列的计算机分析，本文所述的用于检测SARS-CoV-2的组合物、试剂盒和方法(包括具有选自SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:2533的引物和探针的组合物、试剂盒和方法)的毒株覆盖率为99.9％。此外，基于截至2020年4月13日从NCBI获得的数据，本文公开的用于检测病毒序列的组合物、试剂盒和方法，特别是那些使用选自SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:2533的引物和探针来鉴定SARS-CoV-2、Flu A、Flu B、RSV A和/或RSV B的特异性存在的多重测定，对于鉴定SARS-CoV-2毒株保留了99.9％的特异性和精确度，并且对于Flu A毒株覆盖率为98.2％(6730/6854)，且对于Flu B毒株覆盖率为99.3％(3105/3127)。
SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:257包括可适合用作正向引物的序列的列表，所述正向引物靶向SARS-CoV-2基因组的ORF1ab、S蛋白或N蛋白编码区、人类A型或B型流感(Flu)病毒基因组的区域、A型或B型呼吸道合胞病毒(RSV)病毒基因组的区域，或对照序列，如MS2噬菌体和RNase P。
SEQ ID NO:267-SEQ ID NO:510包括可适合用作反向引物的序列的列表，所述反向引物靶向SARS-CoV-2基因组的ORF1ab、S蛋白或N蛋白编码区、人类A型或B型流感(Flu)病毒基因组的区域、A型或B型呼吸道合胞病毒(RSV)病毒基因组的区域，或对照序列，如MS2噬菌体和RNase P。
SEQ ID NO:520-SEQ ID NO:2533包括序列的列表，这些序列是靶向SARS-CoV-2基因组的ORF1ab、S蛋白或N蛋白编码区、人类A型或B型流感(Flu)病毒基因组的区域、A型或B型呼吸道合胞病毒(RSV)病毒基因组的区域或控制序列(如MS2噬菌体和RNase P)的探针的核酸部分。
此外，由于SARS-CoV-2是一种RNA病毒，它可以以相对高的频率突变，使得随着时间的推移很难一致地检测。通过使用针对相同靶基因的不同区域的多种测定来确保冗余性和特异性，即使在未来变体的情况下也可以确保特异性检测。与需要多个测定设计和针对每个基因座的单独反应以增强特异性的其他已发表的测定设计不同，所公开的引物和探针可以使用在单个或至多两个反应体积中进行的单个和特异性测定来区分SARS-CoV-2毒株。
本公开的实施例有益地提供了用于检测和区分在人类中具有相似症状表现的病毒性呼吸道病原体的改进的组合物、试剂盒和方法。因此，这些公开的实施例有利地提高了评估呼吸样本(例如，在实验室环境中、在销售点位置和/或在护理点位置)是否存在病毒序列的效率和准确性，并且可以提高受影响个体的诊断和治疗。
所公开的用于检测病毒序列的组合物、试剂盒和方法还可以提高与SARS-CoV-2、Flu A、Flu B和/或RSV感染相关的流行病学研究的准确性。本文公开的另外的实施例包括用于确定病毒、细菌和真菌核酸序列的存在的测定板(例如，以阵列卡的形式)，所述测定板尤其可以通过能够检测和区分SARS-CoV-2与相关冠状病毒、流感病毒、鼻病毒、腺病毒和其它病毒、细菌和真菌微生物来改善综合征评估和流行病学研究。
样本采集
所公开的组合物、试剂盒和方法被配置成检测来自样本的病毒核酸，优选地对来自样本的SARS-CoV-2进行特异性和差异检测。样本可以是兽医样本(例如，来自非人类动物如水貂)、临床样本(例如，来自有症状或无症状的人)、食物样本、法医样本、环境样本(例如，土壤、污垢、垃圾、污水、空气或水)，包括食物加工和制造表面，或任何其他生物样本。在大多数情况下，通过分析从拭子获得的拭子或流体来检测SARS-CoV-2或其他冠状病毒和呼吸道病原体，所述拭子例如咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子、鼻中鼻甲拭子、口咽拭子、颊拭子、唾液拭子或其他拭子，尽管应当理解，也可以通过分析尿液样本、唾液样本或其他临床样本来检测SARS-CoV-2或其他冠状病毒和/或呼吸道病原体。
样本可以由医疗保健环境中的医疗保健专业人员收集，但在一些情况下，样本也可以由受试者自己收集或者由协助受试者自我收集的个体收集。例如，鼻咽拭子迄今已经用作获得待用于临床诊断或筛查的样本的金标准。这类拭子通常在医疗保健环境中由医疗保健专业人员使用。其他样本，例如唾液样本，可以类似地在医疗保健环境中在医疗保健专业人员的协助或监督下获得。然而，在一些情况下，样本的自我收集可能更有效，并且可以在医疗保健环境之外进行。
在一些实施例中，样本是在无菌管或专门设计的唾液收集装置中收集的原始唾液样本—无论是通过自我收集还是辅助/监督收集。唾液收集管/装置可以是具有使用说明(例如样本收集说明、样本制备或储存说明和/或运输说明)的自行收集套件的部件。在一些实施例中，在容器内接收唾液样本之前或作为封闭/密封容器的结果，可以将原始唾液样本直接收集到可密封容器中，而在容器中没有任何保存溶液或其它流体或物质。在一些其他实施例中，将原始唾液样本收集到已经包含一定量的保存或处理溶液或其他流体或物质的容器中。
传统上，在对其中的病毒核酸进行任何检测之前，从样本中提取或纯化样本的核酸级分—无论是通过拭子、原始唾液还是其他体液获得。令人惊讶的是，用于从样本中检测病毒核酸的公开的实施例可以适于直接从原始唾液样本中检测病毒核酸，而在其用于下游检测测定(例如，RT-qPCR)之前无需特定的核酸纯化和/或提取步骤。在一些实施例中，唾液样本在使用前进行预处理(参见例如本文的实例8)。这可以包括，例如，加热唾液样本，例如通过将原始唾液样本放置在设置为95℃的温度的加热块/水浴上持续30分钟，然后将热处理的唾液与缓冲液或裂解溶液混合。缓冲液或裂解溶液可以包括，例如，任何适合核酸的缓冲液，例如TBE，并且可以进一步包括洗涤剂和/或乳化剂，例如Triton-X-100、NP-40或聚山梨醇酯型非离子表面活性剂，吐温-20。
应当理解，在一些实施例中，所公开的组合物可以包括与缓冲液和洗涤剂/乳化剂混合的样本。可以将样本添加到缓冲液/洗涤剂混合物中，或者反之亦然。作为非限制性的实例，通过将用于每个受试者的一定体积的热处理的样本加入多孔板中的一个(或多个)孔中，可以将一组受试者样本制备成用于下游分析和检测病毒序列的组合物。然后可以将一定体积的缓冲液/洗涤剂混合物(例如TBE+吐温-20)加入到含有受试者样本的每个孔中。可替代地，多孔板可以装载有一定体积的缓冲液/洗涤剂混合物，其中加入一定体积的热处理的唾液。一旦结合，这种验证性的模板溶液可以立即使用或储存供以后分析。这类验证性的模板溶液也可以在储存之前或之后与PCR试剂(例如，缓冲液、dNTP、主混合物等)组合。
用于检测SARS-CoV-2病毒序列的组合物、试剂盒和方法
本文公开的引物和探针可用于从样本(例如从人类或非人类(例如水貂)受试者获得的生物样本)中检测SARS-CoV-2。此类引物和/或探针可以在试剂盒中使用，用于进行基于核酸的测定以用于检测和鉴定样本中的一种或多种靶核酸，所述靶核酸可以是任何大小的单链或双链。例如，如本文所述，SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:2533中提供的引物和探针可以用于扩增和/或分析SARS-CoV-2病毒基因组中或Flu A、Flu B、RSV A、RSV B、其他目标呼吸道微生物和/或对照中的一种或多种中存在的一种或多种特定靶序列(参见，例如，表3A和3B)。可以使用任何合适的方法并在任何合适的平台上检测和/或分析扩增的产物(“扩增子”)。
聚合酶链式反应(PCR)和相关方法是核酸扩增的常用方法。PCR是用于扩增核酸测试样本的核酸聚合酶反应方法的一个但不是唯一的实例，包含使用已知的核酸作为引物和核酸聚合酶以扩增或产生特定的靶核酸。通常，PCR利用由正向引物和反向引物组成的引物对，所述正向引物和反向引物被配置为扩增核酸模板的靶区段。通常，但不总是，正向引物与靶序列的5'端杂交，并且反向引物将与靶序列的3'端存在的序列相同。反向引物通常会与靶序列的互补序列杂交，例如正向引物的延伸产物和/或反之亦然。PCR方法通常在多个不同的温度下进行，导致PCR反应期间的反复温度变化(“热循环”)。其他扩增方法，诸如例如环介导的等温扩增(“LAMP”)，以及其他等温方法，例如表1中列出的那些，可能比PCR需要更少或更少广泛的热循环，或者不需要热循环。这类等温扩增方法也被考虑用于本文所述的测定组合物、反应混合物、试剂盒。
表1.任选的等温扩增方法的总结。
进行PCR的方法(包括表1中的那些)是本领域中熟知的；然而，PCR和其他方法的进一步讨论可以在例如Green和Sambrook的《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，2012年第4版(其通过引用以其整体并入本文)中找到。
SARS-CoV-2具有单链正义RNA基因组。其他病毒(如Flu A、Flu B、RSV A和RSV B)也具有基于RNA的基因组。因此，在一些实施例中，扩增反应(例如LAMP或PCR)可以与逆转录(RT)反应组合，例如在RT-LAMP或RT-PCR中，以将RNA基因组转化为cDNA模板。然后使用cDNA模板在随后的扩增反应中创建靶序列的扩增子。
在一些实施例中，扩增步骤可以包括进行qPCR，如本文所定义的该术语。qPCR是一种灵敏且特异性的方法，用于检测和任选地定量样本中起始核酸模板(例如，冠状病毒核酸)的量。qPCR的方法是本领域中熟知的；一种领先的方法涉及将特定的水解探针与引物对结合使用。水解探针可以包括在一端处的可检测标记(例如，荧光团)和在另一端处淬灭可检测标记的淬灭剂。在一些实施例中，标记位于探针的5’端，当核酸聚合酶将正向引物朝向靶序列内的探针结合位点延伸时，通过探针的5’水解发生5’标记的切割。通过探针的切割(或解折叠)将探针标记从探针淬灭剂中分离出来导致信号的增加，该信号可以被检测并任选地被定量。可以随时间监测可检测信号并对其进行分析以确定样本中存在的起始核酸模板的相对或绝对量。本文描述了合适的标记。在一些实施例中，使用染料-淬灭剂组合，例如实施例中描述的那些。应当理解，qPCR和RT-qPCR方法是本领域技术人员已知的。然而，在实例中提供了特定的实施例并且提供了关于qPCR以及其相关组合物和使用方法的进一步细节。
反应容器或体积可以任选地包括表面上的管、通道、孔、空腔、位点或特征，或者可替代地可以沉积到表面上或沉积到表面孔或腔中或悬浮在流体流内(或部分受流体流限制)的液滴(例如微液滴或纳米液滴)。在一些实施例中，反应体积包括排列在表面上或存在于乳液中的一个或多个液滴。反应体积可以任选地通过融合包含扩增反应的不同组分的多个预反应体积来形成。例如，含有一种或多种引物的反应前体积可以与含有人核酸样本和/或聚合酶、核苷酸和缓冲液的反应前体积融合。在涉及以阵列形式进行qPCR反应的一些实施例中，表面包含多个凹槽、通道、孔、空腔、位点或特征，其限定了包含一种或多种扩增试剂(例如，引物、探针、缓冲液、聚合酶、核苷酸等)的反应体积。在一些阵列格式的单重实施例中，所选的管、凹槽、通道、孔、空腔、位点或特征内的反应体积仅包含单个正向引物序列和单个反向引物序列。任选地，探针序列也包括在单重反应体积中。
在一些阵列格式的多重实施例中，所选的管、凹槽、通道、孔、空腔、位点或特征内的反应体积包含多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个等)正向引物序列和多个反向引物序列。任选地，一种或多种探针序列也被包括在多重反应体积中。
例如，适用于如本文所述的用途的聚合和/或扩增和检测核酸的示例性方法可作为TaqMan测定商购(参见例如美国专利号4,889,818；5,079,352；5,210,015；5,436,134；5,487,972；5,658,751；5,210,015；5,487,972；5,538,848；5,618,711；5,677,152；5,723,591；5,773,258；5,789,224；5,801,155；5,804,375；5,876,930；5,994,056；6,030,787；6,084,102；6,127,155；6,171,785；6,214,979；6,258,569；6,814,934；6,821,727；7,141,377；和/或7,445,900，所有这些专利均据此通过引用以其整体并入本文中)。TaqMan测定通常通过使用具有5’至3’核酸酶活性的核酸聚合酶、能够与靶多核苷酸杂交的引物和能够相对于引物与所述靶多核苷酸3’杂交的寡核苷酸探针对靶多核苷酸进行核酸扩增来进行。寡核苷酸探针通常包括可检测标记(例如荧光报告分子)和能够淬灭报告分子的荧光的淬灭剂分子。通常，可检测标记和淬灭剂分子是单个探针的一部分。随着扩增进行，聚合酶消化探针以从淬灭剂分子分离可检测标记。在反应期间监测可检测标记，其中标记的检测与核酸扩增的发生相对应(例如，信号越高，扩增的量越大)。TaqMa测定的变化在本领域中是已知的并且将适用于本文中所述的方法中。
例如，单重或多重qPCR可以包括与基因座特异性引物缔合的单一TaqMan染料或分别与多重形式的多个基因座缔合的多种TaqMan染料。作为非限制性实例，4重反应可以包括FAM(发射峰约517nm)、VIC(发射峰约551nm)、ABY(发射峰约580nm)和JUN(发射峰约617nm)染料，每种染料与不同的靶序列缔合，每种染料都被QSY淬灭，可以允许在单个反应容器中实时扩增和跟踪多达4个靶标。这些上述报告染料被优化，以与最小的光谱重叠一起工作，以用于提高性能。这些染料还可以与Mustang Purple(发射峰约654nm)组合，用于监测对照的荧光或用于非发射光谱重叠的5重测定。此外，QSY淬火剂与具有小沟结合剂淬火剂的探针完全兼容。
检测器探针可以与替代的淬灭剂缔合，包括但不限于暗荧光淬灭剂(DFQ)、黑洞淬灭剂(BHQ)、Iowa Black、QSY淬灭剂和Dabsyl和Dabcel磺酸盐/羧酸盐淬灭剂。检测器探针也可以包括两个探针，其中，例如，荧光团与一个探针缔合，并且淬灭剂与互补探针缔合，使得两个探针在靶上的杂交淬灭荧光信号，或者靶上的杂交通过荧光的变化改变信号特征。检测器探针还可以包括用SO3代替羧酸根基团的荧光素染料的磺酸盐衍生物、荧光素的亚磷酰胺形式、Cy5的亚磷酰胺形式。
应当理解，当使用多于一种可检测标记时，特别是以多重形式使用时，每种可检测标记应当在其光谱特性上不同于与其一起使用的其它可检测标记，使得这些标记可以彼此区分，或者使得这些可检测标记一起发出由单独的任一可检测标记所不能发出的信号。示例性的可检测标记包括例如荧光染料或荧光团(例如，可以通过光激发以发射荧光或磷光的化学基团)、能够淬灭来自荧光供体染料的荧光信号的“受体染料”等，如上所述。合适的可检测标记可以包括例如荧光素(例如5-羧基-2,7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-羟基色胺(5-HAT)；6-JOE；6-羧基荧光素(6-FAM)；Mustang Purple、VIC、ABY、JUN；FITC；6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基-荧光素(JOE))；6-羧基-1,4-二氯-2’,7’-二氯荧光素(TET)；6-羧基-1,4-二氯-2’,4’,5’,7’-四氯荧光素(HEX)；Alexa Fluor荧光团(例如350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750)；BODIPY荧光团(例如492/515、493/503、500/510、505/515、530/550、542/563、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650-X、650/665-X、665/676、FL、FL ATP、FI-神经酰胺、R6G SE、TMR、TMR-X缀合物、TMR-X、SE、TR、TR ATP、TR-X SE)、层叠蓝、层叠黄；CyTM染料(例如3、3.18、3.5、5、5.18、5.5、7)、青色GFP、环状AMP荧光传感剂(FiCRhR)、荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(例如GFP、EGFP)、蓝色荧光蛋白(例如BFP、EBFP、EBFP2、蓝铜矿、mKalama1)、青色荧光蛋白(例如ECFP、天蓝色、CyPet)、黄色荧光蛋白(例如YFP、柠檬黄、Venus、YPet)、FRET供体/受体对(例如荧光素/荧光素、荧光素/四甲基罗丹明、IAEDANS/荧光素、EDANS/dabcyl、BODIPYFL/BODIPY FL、荧光素/QSY7和QSY9)、LysoTracker和LysoSensor(例如LysoTracker蓝DND-22、LysoTracker蓝白DPX、LysoTracker黄HCK-123、LysoTracker绿DND-26、LysoTracker红DND-99、LysoSenso蓝DND-167、LysoSenso绿DND-189、LysoSensor绿DND-153、LysoSensor黄/蓝DND-160、LysoSensor黄/蓝10,000MW葡聚糖)、奥勒冈绿(Oregon Green)(例如488、488-X、500、514)；罗丹明(例如110、123、B、B 200、BB、BG、B extra、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、5GLD、6-羧基罗丹明6G、丽丝胺、丽丝胺罗丹明B、鬼笔环肽、鬼笔环肽，红、Rhod-2、ROX(6-羧基-X-罗丹明)、5-ROX(羧基-X-罗丹明)、磺酰罗丹明B can C、磺酰罗丹明GExtra、TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)、四甲基罗丹明(TRITC)、WT)、德克萨斯红、德克萨斯红-X、VIC和其它标记物，如本领域的技术人员将已知的。
也可以使用其它可检测标记。例如，引物可以被标记并用于产生扩增子和检测反应中产生的扩增子的存在(或浓度)，并且这类引物可以被用作本文描述的标记的探针的补充或替代物。作为另外的实例，引物可以如Nazarenko等人.(《核酸研究(Nucleic AcidsRes.)》，2002年5月1日；30(9):e37),Hayashi等人，(《核酸研究》，1989年5月11日；17(9):3605)，和/或Neilan等人.(《核酸研究》，第25卷，第14期，1997年7月1日，第2938-39页)所述被标记和使用。本领域技术人员还将理解并能够利用Zhu等人.(《生物技术(Biotechniques.)》，2020年7月：10.2144/btn-2020-0057)描述的PCR过程(以及相关的探针和引物设计技术)。
在一些实施例中，使用插入标记，例如溴化乙锭、SYBR绿色I、SYBR绿色ER和PicoGreen(生命技术公司(Life Technologies Corp.)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))，由此允许在不存在检测器探针的情况下实时可视化或在扩增产物的终点可视化。然而，应当理解，插入标记的使用可能会限制多路复用能力，因为许多插入标记对于给定序列是非特异性的并且仅报告反应中的总(或成比例的)核酸含量。在一些实施例中，实时可视化可以包括插入检测器探针和基于序列的检测器探针。检测器探针在扩增反应中未杂交到互补序列时被至少部分地淬灭，并且在扩增反应中杂交到互补序列时被至少部分地未淬灭。在一些实施例中，探针可以进一步包含各种修改，例如小沟结合剂，以进一步提供期望的热力学特征。
SARS-CoV-2的遗传序列可作为NCBI登记号NC_045512.2和GenBank登记号MN908947.3获得，描述了29,844个碱基对的正义单链RNA基因组；有时，这种序列在本文中被称为SARS-CoV-2的“正常”、“野生型”或“参考”序列，与SARS-CoV-2变体或突变序列相反。SARS-CoV-2的初步遗传特征鉴定了三种与SARS-CoV-2具有密切同源性的冠状病毒，即Bat-SL-CoVZC45、Bat-SL-CoVZXC21和SARS-CoVGZ02。这些毒株之间的序列同一性在图1A和1B中描绘。特别是，图1A示出了在整个基因组中以及在冠状病毒基因组内的每个特定基因区域中，共有SARS-CoV-2序列与Bat-SL-CoVZC45、Bat-SL-CoVZXC21和SARS-CoVGZ02中的每一种相比之间的序列同一性。图1B示出了图1的表格信息。图1A以图形形式显示，x轴是病毒基因组内的碱基对位置，y轴是每种相关病毒与相应SARS-CoV-2共有序列的相似性百分比。
图1A和1B中示出的分析鉴定了至少三个在SARS-CoV-2和其他相关病毒之间具有显著变异性的遗传区域，特别是在编码ORF1ab蛋白(SEQ ID NO:1；碱基对1对应于MN908947.3的碱基对1000)，S蛋白(SEQ ID NO:2；碱基对1对应于MN908947.3的碱基对21564)，和N蛋白(SEQ ID NO:3；碱基对1对应于MN908947.3的碱基对28275)的病毒基因内。包含ORF1ab蛋白的编码序列的区域位于SARS-CoV-2基因组的碱基对1000-3000之间；该序列对应于SEQ ID NO:1。包括S蛋白的编码序列的SARS-CoV-2基因组的2,000个碱基对区域位于碱基对21,564–23,564之间；该序列对应于SEQ ID NO:2。最后，包括N蛋白的编码序列的SARS-CoV-2基因组的1,283个碱基对区域位于碱基对28,275–29,558之间；该序列对应于SEQ ID NO:3。
在一些实施例中，检测靶序列的扩增包括测量由与一种或多种引物或探针连接或缔合的可检测标记发出的一种或多种信号。任选地，随着扩增反应的进行，多次测量一种或多种信号，在一些实施例中，每个热循环至少一次(例如，在热循环的退火或延伸阶段期间或之后)，从而允许“实时”检测扩增。在“多重”扩增实施例中，可以通过测量一个或多个检测通道中的信号随时间跟踪多个单独和不同扩增产物的形成。信号可以由可检测标记(任选地荧光标记)发射，该检测标记连接至与扩增产物选择性杂交的引物和/或探针。在一些实施例中，校准每个通道以优先地或选择性地检测相应的扩增产物，并且每个通道中的信号被用作相应扩增产物的浓度的量度。例如，在一些实施例中，基于由第一标记发射的第一信号在第一检测通道中检测来自SARS-CoV-2的S基因的扩增产物，所述第一标记连接至选择性地与S基因扩增产物杂交的第一引物和/或第一探针或与选择性地与S基因扩增产物杂交的第一引物和/或第一探针缔合；并且基于由第二标记发射的第二信号在第二检测通道中检测N基因的扩增产物，所述第二标记连接至选择性地与N基因扩增产物杂交的第二引物和/或第二探针或与选择性地与N基因扩增产物杂交的第二引物和/或第二探针缔合。任选地，在涉及ORF1ab基因的扩增的“三重(triplex)”实施例中，基于由与第三引物和/或第三探针连接的第三标记发出的第三信号在第三通道中检测ORF1ab基因的扩增产物，所述第三引物和/或第三探针选择性地与ORF1ab扩增产物或Orf1ab靶区域杂交。在一些实施例中，基于由与第四引物和/或第四探针连接的第四标记发出的第四信号，在第四通道中检测对照或参考序列的扩增产物，所述第四引物和/或第四探针选择性地与对照或参考序列中的扩增产物或靶序列杂交。
在一些实施例中(例如，在熟知的且广泛使用的TaqManTM系列qPCR测定中)，检测扩增产物包括检测由连接到可切割探针的5'端的荧光标记发出的信号，所述可切割探针在扩增期间选择性地与扩增产物杂交。可切割探针进一步包括将荧光标记淬灭至“基线”荧光水平的淬灭剂。可切割探针的5'端在延伸步骤期间被聚合酶切割，导致荧光标记与淬灭剂分离，并且荧光相对于基线相应增加。随着PCR反应的进行，在每个循环中测量荧光相对于基线的持续增加。在一些实施例中，基于由连接至探针的VIC染料发射的第一信号，在第一通道中检测来自SARS-CoV-2的N基因的扩增产物，所述探针选择性地与来自N基因的相应扩增产物杂交。任选地，基于由附着于探针的ABY染料发射的第二信号，在第二通道中检测来自SARS-CoV-2的S基因的第二扩增产物，所述探针选择性地与来自S基因的相应扩增产物杂交。任选地，基于由附着于探针的FAM染料发射的第三信号，在第三通道中检测来自SARS-CoV-2的ORF1ab基因的第三扩增产物，所述探针选择性地与来自ORF1ab基因的相应扩增产物杂交。任选地，基于由附着于探针的JUN染料发射的第四信号，在第四通道中检测来自对照或参考序列的第四扩增产物，所述探针选择性地与来自对照或参考序列的相应扩增产物杂交。
在一些实施例中，在反应混合物中包括被动参考染料，例如ROXTM。度量“Rn”可选地用于跟踪扩增反应的进展并确定e扩增前反应混合物中最初存在的靶序列的量。Rn可以被计算为报告染料的荧光除以反应混合物中存在的被动参比染料的荧光；即，Rn是归一化为被动参考染料的荧光信号的报告信号。在一些实施例中，将Rn相对于PCR循环数绘图。在一些实施例中，ΔRn(被计算为Rn减去基线)可以针对PCR循环数绘图。在一些实施例中，扩增图显示log(ΔRn)随PCR循环数的变化。Ct(阈值循环)是扩增曲线与阈值线之间的交点。给定扩增产物的Ct值越低，可检测到的扩增越早，并且反应混合物中最初存在的相应靶序列的绝对量和相对浓度就越高。在一些实施例中，Ct的截止值用于确定在扩增之前在反应混合物中最初是否存在靶序列。例如，在一些实施例中，如果Ct值小于或等于37，则确定存在靶序列。
在一些实施例中，可检测到新出现的SARS-CoV-2的变体，即使此类变体包括一个或多个上述靶区域(即ORF1ab蛋白区域、S蛋白区域或N蛋白区域)中的突变。通过查看SARS-CoV-2基因组中的多个靶区域，即使在其中突变严重到足以导致在一个(或者甚至两个)靶区域中出现阴性测试结果的情况下，也可实现准确检测。例如，新出现的B.1.1.7变体(通常被称为“UK变体”)具有与S蛋白区域相关的异常数量的突变。这些突变足够大，以至于为早期SARS-CoV-2变体设计的一些测试部件和方案将对S蛋白区域显示阴性结果。然而，查看多个区域的内置冗余确保了整体测试仍然能够检测到SARS-CoV-2变体B.1.1.7(基于阳性ORF1ab和/或N蛋白区域检测)而对测试的整体准确性没有显著影响。在另一个实例中，未发现501Y.V2变体(在南非发现)影响S蛋白区域或本文描述的任何其他测试区域的检测。然而，针对SARS-CoV-2基因组的多个区域的实施例的稳健性和冗余性限制了这些变体或未来出现的其他变体将显著影响SARS-CoV-2检测的整体准确性的风险。
为了使SARS-CoV-2的遗传测定的特异性最大化，设计了靶向ORF1ab、S蛋白和N蛋白的编码区域的引物和探针。特别地，本文公开的病毒检测试剂盒、阵列、测定等包括对编码S蛋白的SARS-CoV-2遗传序列特异性的引物和/或探针；目前可用的SARS-CoV-2病毒检测试剂盒都没有靶向S基因。靶向S基因(除了与N蛋白和ORF1ab相关的编码区外)在特异性和可靠性方面提供了几个优势。例如，至少一些公开的靶向S蛋白的编码区的测定已经显示在受体结合水平上区分SARS-CoV和SARS-CoV-2。包括这些靶向S基因序列的引物和/或探针在检测针对其他类似冠状病毒的SARS-CoV-2毒株时提供了更高的特异性，尤其是在其中受试者存在SARS-CoV和SARS-CoV-2的共同感染的地理区域中。
使用标准映射算法zpcr3p在计算机上估计SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:2533中提供的引物和探针的特异性。发现这些引物和探针在计算机中对SARS-CoV-2显示出比其它市售的基于SARS-CoV-2qPCR的测定的引物和探针更高的特异性。因此，所公开的用于检测病毒序列的组合物、试剂盒和方法包括至少一种引物和/或探针，该引物和/或探针具有由SEQID NO:4-SEQ ID NO:2533定义的序列，其使得本文所述的单重和多重测定能够显示出高水平的灵敏度、特异性和准确性。在一些实施例中，第一正向引物是SEQ ID NO:160。在一些实施例中，第二正向引物是SEQ ID NO:100。在一些实施例中，第三正向引物是SEQ ID NO:211。在一些实施例中，第一反向引物是SEQ ID NO:468。在一些实施例中，第二反向引物是SEQ ID NO:337。在一些实施例中，第三反向引物是SEQ ID NO:501和/或510。在一些实施例中，探针是SEQ ID NO:1049、864和/或833。在所公开的组合物、试剂盒和方法的一些实施例中，第一正向引物是SEQ ID NO:160，第二正向引物是SEQ ID NO:100，第三正向引物是SEQID NO:211，第一反向引物是SEQ ID NO:468，第二反向引物是SEQ ID NO:337，第三反向引物是SEQ ID NO:501和/或510，并且互补探针分别是SEQ ID NO 1049、864和833。
例如，本文描述的测定的灵敏度可以是至少30GCE/rxn、25GCE/rxn、20GCE/rxn、15GCE/rxn或10GCE/rxn，包括其间的所有范围和数字，以用于同时检测多个靶标或病原体(包括本文所述的任何靶标或病原体)。在一些实施例中，本文所述的多重测定证明当从连续稀释计算时，检测的线性动态范围(LDR)为107至10GCE/rxn。如本文所使用的，“线性动态范围(LDR)”是指观察到可接受的线性度(R2≥0.980)和效率(优选地在90-110％之间)的输入模板的范围(在最高和最低输入RNA或DNA之间)。
在一些实施例中，本文所述的单重测定可以证明灵敏度水平低至每个反应1-10拷贝/μL输入。例如，本文所述的测定的灵敏度可以低至每个反应20拷贝/μL、15拷贝/μL、10拷贝/μL、5拷贝/μL、4拷贝/μL、3拷贝/μL、2拷贝/μL或1拷贝/μL，包括其间的所有数字和范围。在一些实施例中，本文所述的单重测定可以证明在至少5至6个数量级的范围内的LDR，其中R2>0.99，并且使用系列稀释的PCR效率接近100％。例如，本文所述的单重测定可以证明至少103、104、105或106的LDR增加。在一些实施例中，通过连续稀释，使用本文所述的测定，从107个拷贝低至101个拷贝的样本输入范围是线性的。
在一些实施例中，RNA病毒基因组的扩增是通过进行逆转录然后扩增所得的cDNA的至少一部分来实现的。合适的方法是本领域已知的并且包括例如RT-PCR或RT-LAMP方法，其中靶序列(例如病毒RNA基因组)被逆转录以形成第一cDNA链，然后将其以模板依赖的方式复制以形成双链DNA序列。然后从该双链cDNA扩增靶序列。
在一些实施例中，使用包含病毒颗粒或疑似包含病毒颗粒的样本进行RT-PCR，所述样本可以是感染性病毒体、封闭病毒核酸的非感染性或灭活的病毒衣壳，或从感染的细胞获得的病毒基因组RNA。在此类实施例中，本文公开的组合物、反应混合物和试剂盒可以包括至少一种RNA依赖性DNA聚合酶，通常被称为逆转录酶(RT)，以及用于进行逆转录的相关组分。可以使用本文所述的组合物、反应混合物和试剂盒进行RT-PCR，例如，当RNA是用于后续分析的起始材料时。
在一些实施例中，RT-PCR可以是使用如本文所述的一种或多种引物和一种或多种探针的一步程序。在一些实施例中，RT-PCR可以在单个反应管、反应容器中进行(例如，“单管”或“1管”或“单管”反应)。在一些实施例中，RT-PCR可以在多位点反应容器(例如多孔板或阵列)中进行。在一些实施例中，RT和PCR在相同的反应容器或反应位点中进行，例如在1步或1管RT-qPCR中。合适的示例性RT可以包括例如莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney MurineLeukemia Virus)(M-MLV)逆转录酶、SuperScript逆转录酶(赛默飞世尔科技公司)、SuperScript IV逆转录酶(赛默飞世尔科技公司)或Maxima逆转录酶(赛默飞世尔科技公司)，或任何此类RT的修改形式。
在一些实施例中，在反应容器或体积内仅包括单个RT-qPCR测定(由给定的正向引物和给定的反向引物序列组成)，这种反应模式在本文中被称为“单重”。任选地，除了正向引物序列和反向引物序列之外，单重qPCR测定还可以包括单个探针序列。探针序列可以是水解探针序列。任选地，探针包括MGB(小沟结合蛋白)，如在TaqMan探针中。
在一些实施例中，所公开的组合物和方法可以以多重形式使用，其中两个或更多个qPCR测定存在于单个反应体积中，每个qPCR测定能够扩增和检测不同的靶序列。在一些实施例中，当反应体积经受合适的扩增条件并且在相同的反应体积中可以形成多个扩增子时，相同反应体积中的不同测定将导致产生相应的不同扩增产物。当反应体积经受扩增条件时，可以同时产生不同的扩增产物；可替代地，不同的扩增产物可以系列地或连续地产生。例如，由于模板的初始起始浓度，一些测定反应产物可能比其他反应产物需要更长的时间出现，或者可能受益于不同的反应条件以获得最佳生产。
在一些实施例中，不同的测定产物可以被独立地检测或至少彼此区分。例如，可以光学地区分不同的测定产物(例如，对于每个qPCR测定使用光学上不同的标记，其发射光谱可以是例如在光谱上，包括红外、UV和可见光)，或者可以使用一些其他合适的方法来区分，包括如在美国专利公开第2019/0002963号(其通过引用以其整体并入本文)中所述。在一些实施例中，标记的特定组合用于区分不同的病原体、毒株和/或病原体类型。例如，不同的呼吸道病原体或病毒可以使用对每种病原体或病毒特异性的不同标记彼此区分开来，使得该标记仅在病原体或病毒特异性核酸序列的存在和扩增时可检测到。
在一些基于阵列的实施例中，两个或更多个不同的qPCR测定(每个包含正向引物、反向引物和任选的探针)存在于阵列的单个孔、空腔、位点或特征中，并且每个测定的产物可以被独立检测。例如，不同的测定产物可以通过光学方法(例如，使用作为每种测定的组分存在的不同标记)或使用一些其他合适的方法来区分，包括如美国专利公开第2019/0002963号中所述。在一些实施例中，每个测定的至少一个引物包含可以与至少一个其他测定的光学标记区分开来的光学可检测标记。出于本公开的目的，为了清楚起见包括本文公开的任何聚合酶驱动的扩增反应(例如，qPCR和RT-qPCR)的PCR测定被认为与另一种PCR测定不同，如果相应的扩增子在核酸序列上相差至少一个核苷酸。
在优选的多重形式中，将至少两种不同的测定组合到单个反应体积中，以至少从由临床或实验室来源获得或衍生的核酸样本中确定SARS-CoV-2的存在。
应当理解，受试者和样本的类型可能会有所不同。例如，鼻咽拭子在许多临床诊断情况下(特别是与上呼吸道感染相关的情况下)传统上用作金标准。通过鼻咽拭子获得的样本的核酸级分可以被提取并用于下游分析，例如RT-qPCR。拭子(或本文公开的其他样本)可以从人类受试者获得或收集，但应当理解，公开的实施例可以另外扩展到加工来自非人类受试者(例如非人类动物)的样本。在一些实施例中，非人类动物受试者可以是水貂或其他驯化的(或非驯化的)动物，并且所公开的组合物、试剂盒和方法可以用于检测非人类动物体内SARS-CoV-2的存在(例如，用于诊断或筛选目的)。
作为另外的实例，收集的样本可以是原始唾液样本。如本文所提供的，原始唾液样本可以自我收集(例如，在唾液收集装置或无菌管内)或由受试者附近的任何其他个体从受试者收集。在一些实施例中，在接收唾液样本之前或作为封闭/密封容器的结果，将原始唾液样本直接收集到可密封容器中，而在容器中没有任何保存溶液或其他流体或物质。用于从样本中检测病毒核酸的公开的实施例可以适于直接从唾液样本中检测病毒核酸，或者在替代的实施例中，样本可以在其用于检测测定(例如，RT-qPCR)之前经历特定的RNA纯化和/或提取步骤。因此，应当理解，在一些实施例中，受试者样本(例如唾液)可以直接用作样本输入用于随后的下游分析，例如PCR，并且在一些实施例中，这可以在其使用之前在没有核酸纯化和/或提取步骤的情况下完成。
在一些实施例中，用于直接从原始唾液样本中检测病毒核酸(特别是SARS-CoV-2)的方法可以包括从受试者收集或接收唾液样本，并对样本进行热处理，例如通过将原始唾液样本放置在设置为95℃的加热块/水浴上持续30分钟。加热步骤可以提供许多益处，包括例如使唾液中的核酸酶(例如核糖核酸酶)变性，这可能会干扰对病毒存在的准确评估。加热原始唾液样本也可以分解粘液，使样本更易于使用诸如移液器的实验室设备进行操作。高热还可引起样本中存在的任何原核细胞和真核细胞的热破坏，并且还可以破坏样本中存在的包膜病毒和/或病毒衣壳，从而增加对任何病毒核酸的可及性。
该方法还可以包括在将热处理后的样本平衡至室温之前和/或之后混合热处理后的样本(例如，通过涡旋样本持续至少10秒)。然后可以制备裂解溶液并与热处理的样本组合(例如，以1:1的比例)以产生验证性的模板溶液，用于通过核酸扩增反应(例如，PCR、RT-PCR、qPCR、RT-qPCR等)检测样本中病毒核酸的存在。裂解溶液可以包括核酸可处理的缓冲液，例如与洗涤剂和/或乳化剂(例如吐温-20、Triton-X-100、NP-40等)、聚山梨醇酯型非离子表面活性剂组合的TBE。洗涤剂和/或乳化剂可以促进试剂更好地混合并且还可以用于增加对样本内的任何病毒核酸的可及性(例如，通过从病毒体中去除脂质包膜)。
一旦形成了验证性的模板溶液，就可以将其与PCR试剂组合并经受适合产生病毒特异性(例如，SARS-CoV-2特异性、Flu A/B特异性和/或RSV-A/B特异性)扩增子的条件(如果存在病毒核酸)。在一些实施例中，引物可以选自SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:510，并且可以与由SEQ ID NO:520-SEQ ID NO:2533中公开的序列产生的一种或多种探针偶联，以除了待鉴定的任何其他选定的病毒序列之外，特异性鉴定与SARS-CoV-2N蛋白和S蛋白和/或ORF1ab区域相关联的扩增的编码区。在一些实施例中，引物和/或探针可以被包括在试剂盒中，该试剂盒可以另外包括用于鉴定阳性对照编码序列(例如，内源性存在的人RNase PRPP30序列)的内部对照引物和探针组。上述和类似的方法与一些当前可用的测定/试剂盒(例如，TaqCheckSARS-CoV-2快速PCR测定、TaqCheckSARS-CoV-2对照和TaqCheckSARS-CoV-2对照稀释缓冲液)有利地兼容，并且可能还与现有的热循环主混合物(如TaqPath 1步RT-qPCR主混合物CG)兼容。
值得注意的是，在一些实施例中，核酸扩增方案可以被配置成用于快速处理(例如，在少于约45分钟内)和高通量，从而允许微创方法从而以可扩展的方式快速筛选大量个体。这对于执行无症状测试(例如，在学校、工作场所、会议、体育赛事、大型社交聚会等处的高频/广泛测试)或用于流行病学目的可能特别有用。所公开的实施例还可以有益地提供较低成本的样本采集系统和方法，其能够使用低成本的采集装置进行自我采集(减少医疗保健专业人员(HCP)人员配备需求)。这消除了对拭子、缓冲液、病毒传播媒介(或其他专用传输媒介)等的要求。所公开的实施例还允许降低个人防护设备(PPE)的要求和成本。因为试剂和方法是流线型的(例如，没有前体核酸纯化和/或提取步骤)，存在减少的核酸制备塑料的使用，这同时带来试剂成本和库存成本的降低。还有利地减少了对供应受限项目的依赖，并且这些方法和试剂盒部件与现有设备的兼容性提高了它们对大众实施的灵活性和简单性。总体而言，这类实施例允许更便宜的测定，其可以从样本收集到结果生成更快地完成。
所公开的用于从原始唾液样本中直接检测病毒核酸(特别是SARS-CoV-2)的方法是有益稳健的。例如，从原始唾液样本中获得的验证性的模板可以与许多不同的PCR试剂和/或可商购的试剂盒一起使用和/或与其兼容。也就是说，在一些实施例中，直接从受试者接收唾液样本(无论是通过自行收集还是辅助收集)、热处理并与缓冲液/洗涤剂混合物(例如TBS/吐温-20溶液)组合，以用作现有PCR/LAMP试剂盒的样本输入，并且以其他方式与许多市售PCR/LAMP缓冲液、聚合酶和其它PCR/LAMP试剂相容。实际上，在一些实施例中，当使用TBS/吐温-20(或其它缓冲液/洗涤剂混合物)中的热处理唾液样本作为用于扩增的核酸源时，不需要对现有PCR/LAMP方案进行额外的步骤或修改。这允许快速采用和实施，同时保持诊断测试的所需的(并且通常是必需的)特异性和可靠性。在一些实施例中，用于从原始唾液样本中直接检测SARS-CoV-2的公开的方法具有<10,000GCE/mL的灵敏度。在一些实施例中，所述方法和试剂盒具有<5,000GCE/mL、<2,500GCE/mL、<1,000GCE/mL或它们之间的任何值或范围的灵敏度。例如，
在下面的实施例部分中提供了用于直接从原始唾液样本中检测病毒核酸，特别是SARS-CoV-2的示例性方法。
如本文所提供的，应当理解，核酸样本可以从其他身体组织或来源获得，包括但不限于除了唾液以外的体液(例如，血液、尿液、痰液等)。在一些实施例中，通过分析拭子或从拭子获得的流体来检测SARS-CoV-2或其他病毒，所述拭子例如咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子、颊拭子、唾液拭子或其他拭子。在一些实施例中，核酸样本包括通过鼻咽拭子、鼻咽抽吸物和/或支气管肺泡灌洗从受试者分离的总核酸含量。然而，应该理解，也可以通过分析尿液样本、唾液样本或其他合适的临床样本来检测SARS-CoV-2或其他冠状病毒和/或其他病毒。
在一些实施例中，特别是在样本不直接用于鉴定病毒序列的存在的情况下，用于检测病毒序列的初始步骤可以包括对每个样本进行核酸纯化测定。然后将受试者样本的纯化或以其他方式提取的核酸级分添加到下游检测测定中。总核酸含量可以通过本领域已知的任何手段分离，包括例如使用MagMAX病毒/病原体超核酸分离试剂盒(MagMAX Viral/Pathogen Ultra Nucleic Acid Isolation Kit)(由赛默飞世尔科技公司以目录号No.A42356销售)。简而言之，MagMAX试剂盒提供核酸结合珠和其他试剂，以用于结合、洗涤和洗脱来自临床/实验室样本的核酸。这些洗脱的核酸优选地包括从样本中纯化的总核酸含量。
在一些实施例中，除了在取样过程期间捕获的源自受试者的真核和/或原核微生物群的任何基因组/转录的核酸之外，总核酸含量还包括在样本中捕获的来自受试者细胞的任何基因组DNA和转录的RNA。来自在样本中捕获的病毒的任何单链(正或负)RNA、双链RNA、其cDNA衍生物、单链(正或负)DNA或双链DNA也优选地被包括在从临床/实验室样本中洗脱的总核酸含量中。然后，该洗脱的总核酸含量可以用作公开的RT-qPCR测定中的模板核酸来源。
组合物、反应混合物和试剂盒还可以包含进行此类RT-qPCR反应所需的任何其他组分，例如可以在SuperScript IV VILO主混合物(赛默飞世尔科技公司)、TaqPath 1步RT-qPCR主混合物(赛默飞世尔科技公司)、TaqMan快速病毒1步主混合物(赛默飞世尔科技公司)或任何其他合适的可以商购的RT-PCR主混合物中找到的组分。RT-PCR方案在本领域内是已知的。尽管如此，在实例中阐述了用于本文所述的多重病毒检测方案的示例性RT-PCR方案。
在一些实施例中，如本文所述的逆转录和/或核酸扩增测定使用实时定量PCR(qPCR)仪器进行，包括例如QuantStudio实时PCR系统，例如QuantStudio 5实时PCR系统(QS5)和QuantStudio 12K Flex系统(QS12K)，或7500实时PCR系统，例如来自赛默飞世尔科技公司的7500Fast Dx系统。
在一些实施例中，所公开的用于检测病毒序列的试剂盒包含用于检测SARS-CoV-2基因组中的靶核酸序列的正向引物、反向引物和/或探针中的一种或多种，例如分别在SEQID NO:4-SEQ ID NO:251；SEQ ID NO:267-SEQ ID NO:504和SEQ ID NO:510；以及SEQ IDNO:520-SEQ ID NO:1295和SEQ ID NO:1466-SEQ ID NO:2359中公开的。在一些实施例中，本文所述的引物以约100nM至1mM(例如300nM、400nM、500nM等)的浓度(包括其间的所有浓度量和范围)被包括在试剂盒、阵列卡和类似物中。在一些实施例中，本文所述的探针以约50nM至500nM(例如，75nM、125nM、250nM等)的浓度(包括其间的所有浓度量和范围)被用于核酸测定。
本文所公开的公开的试剂盒、阵列等可以包括用于执行核酸扩增方法的试剂，如本文所讨论的，本文所公开的通常包括针对SARS-CoV-2靶核酸序列的至少一个引物对(例如，选自SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:251的正向引物和选自SEQ ID NO:267-SEQ ID NO:504和SEQ ID NO:510的反向引物)、核酸聚合酶(例如，温度耐受的DNA依赖性DNA聚合酶，如Taq或RNA依赖性DNA聚合酶，也被称为逆转录酶)，以及用于合成cDNA模板和/或扩增子的脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)的池。如本领域已知的，根据需要，前述的每一种可以以适合于其中使用它们的各种热循环反应的浓度被单独包括在所公开的试剂盒中。在一些实施例中，试剂盒可以额外包括适当浓度的缓冲液和/或盐，用于产生反应混合物，例如，增加反应混合物中聚合酶活性的水平，如本领域已知的或本文以其他方式公开的。
在一些实施例中，病毒基因组的最佳扩增和可检测性通过所公开的试剂盒实现，所述试剂盒使用包括在其中的主混合物，并且所述主混合物可以在扩增之前添加到反应体积中。主混合物可以包括例如核酸聚合酶、dNTP、缓冲液和盐中的一种或多种，所有这些都以适当的浓度被包括在主混合物中，使得当加入所需体积的样本时(有或没有平衡体积的PCR级水)。在一些实施例(特别是多重测定)中，所公开的试剂盒和/或反应体积可以包括TaqMan快速病毒1步主混合物(由赛默飞世尔科技公司以目录号44444432出售)，或可替代地，TaqPath1步RT-qPCR主混合物,CG(由赛默飞世尔科技公司以目录号A15299出售)。在其他实施例中，主混合物是TaqPath 1步多重主混合物(TaqPath 1Step Multiplex MasterMix)(无ROX)(由赛默飞世尔科技公司以目录号A48111和A28521销售)或本领域已知的类似主混合物。在一些实施例中，试剂盒包括足以构成反应混合物的引物、探针和主混合物，所述反应混合物支持在单个反应体积中多重扩增编码N蛋白、S蛋白和/或ORF1ab蛋白的一个或多个SARS-CoV-2区域。
在一些实施例中，试剂盒包括至少一种被配置为扩增编码ORF1ab蛋白的基因的区域的qPCR测定(包括正向引物、反向引物、探针和任选地主混合物或其组分)。在一些实施例中，试剂盒包括至少一种被配置为扩增编码N蛋白的基因的区域的qPCR测定(包括正向引物、反向引物、探针和任选地主混合物或其组分)。在一些实施例中，试剂盒包括至少一种被配置为扩增编码S蛋白的基因的区域的qPCR测定(包括正向引物、反向引物、探针和任选地主混合物或其组分)。在一些实施例中，试剂盒包括至少一种被配置为扩增编码N蛋白的基因的区域的qPCR测定(包括正向引物、反向引物和任选地探针)、至少一种被配置为扩增编码S蛋白的基因的区域的qPCR测定(包括正向引物、反向引物、探针和任选地主混合物或其组分)，和/或至少一种被配置为扩增编码ORF1ab蛋白的基因的区域的qPCR测定(包括正向引物、反向引物、探针和任选地主混合物或其组分)。
在一些实施例中，与SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:2533和/或表2相关联的引物和/或探针可以进一步包含荧光或其他可检测标记和/或淬灭剂或小沟结合剂，例如上述那些。作为非限制性实例，所述引物和/或探针可以与作为可检测标记的FAM、ABY、VIC或JUN以及作为淬灭剂的QSY缔合。因此，应当理解，SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:2533和/或表2的引物和探针可以被包括在所公开的试剂盒、阵列等中，以用于单重或多重测定形式。
在本文所述的多重测定形式的一些实施例中，检测一种或多种不同的SARS-CoV-2基因组区域，包括用于检测ORF1ab(例如，FAM-标记的)、N蛋白(例如，VIC-标记的)和/或S蛋白(例如，ABY标记的)的编码区域的测定。如上所述，除了标记的探针之外或作为标记的探针的替代，可以使用一种或多种标记的引物来检测一种或多种靶核酸。因此，在一些实施例中，不使用探针。
在本文所述的多重测定形式的一些实施例中，检测各种SARS-CoV-2基因组区域，包括用于N蛋白和S蛋白(例如，两者都是FAM标记的)的编码区域的测定，任选地与用于FluA(例如，VIC标记的)和/或Flu B(例如，ABY标记的)的测定组合。在本文所述的多重测定形式的一些实施例中，检测各种SARS-CoV-2基因组区域，包括用于检测N蛋白和S蛋白(例如，VIC标记的)的编码区域的测定，任选地与用于Flu A和/或B(例如，都是FAM标记的)和/或用于A型和/或B型RSV(例如，都是ABY标记的)的测定组合。任选地，在一些实施例中，对照(例如，JUN标记的)，例如噬菌体MS2或RNase P对照，被包括在包含多重测定的试剂盒、阵列等中。应当理解，尽管上面提供了特定的实例，表明给定的荧光团与给定的病毒序列的检测相关联，但是引物和/或探针可以被修饰以包括本文所述的或如本领域以其他方式已知的功能相似的荧光团。此外，淬灭剂(例如QSY)可以被包括在任何前述的实例中，并且可检测标记和/或淬灭剂可以基于给定qPCR测定的单重或多重要求，按照上述的限制和考虑或者由本领域技术人员以其他方式所理解的进行选择。
在一些实施例中，qPCR测定中的至少一种靶向SARS-CoV-2基因内的序列，所述基因选自由N蛋白、ORF1ab蛋白和S蛋白组成的组。在一些实施例中，反应体积进一步包括靶向上述组的不同基因的第二qPCR测定。在一些实施例中，反应体积进一步包括靶向来自上述组的剩余第三基因的第三qPCR测定，使得当反应体积经受扩增条件时，并且如果样本包括SARS-CoV-2基因组RNA，至少一个扩增子由编码S蛋白的遗传序列产生，至少一个扩增子由编码N蛋白的遗传序列产生，并且至少一个扩增子由编码ORF1ab蛋白的遗传序列产生。
在另外的多重形式中，将至少两个qPCR测定组合到单个反应体积中，该反应体积包括如本文所述从身体组织获得或衍生的核酸样本，以及至少一个外源性阳性对照核酸序列。外源性阳性对照序列可以包含MS2噬菌体序列/基因或其他核酸序列，优选地RNA序列。另外地或可替代地，多重qPCR测定包括内源性阳性对照，例如人RNase P。在一些实施例中，可以使用美国疾病控制和预防中心(United States Centers for Disease Control andPrevention)(CDC)描述的引物和/或探针序列(https://www.cdc.gov/coronavirus/2019- ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html)。例如，本文所述的测定可以包括表2中所示的一种或多种引物和/或探针。
表2：CDC 2019-新型冠状病毒(2019-nCoV)实时RT-PCR引物和探针
1-所示的标记对本文所述的组合物、反应混合物、试剂盒或方法的一些实施例是示例性的，并且决不意味着限制预期用于本文所述的引物和探针的其他可能的标记，包括各种荧光团和淬灭剂。
*-所示的最终浓度对本文所述的组合物、反应混合物、试剂盒或方法的一些实施例是示例性的，并且绝不意味着限制用于本文设想的组合物、反应混合物、试剂盒或方法的其他可能的浓度或浓度范围。
在一些实施例中，提供了试剂盒，所述试剂盒包括用于多重qPCR测定的试剂，所述多重qPCR测定靶向选自ORF1ab蛋白、N蛋白和/或S蛋白的编码区的SARS-CoV-2序列。在一些实施例中，试剂盒还包括用于第二qPCR测定的试剂，所述第二qPCR测定靶向选自ORF1ab蛋白、N蛋白和S蛋白的编码区域的不同的SARS-CoV-2序列。在一些实施例中，所述试剂盒还包括用于第三qPCR测定的试剂，所述第三qPCR测定靶向选自与ORF1ab蛋白、N蛋白和S蛋白缔合的编码区域的第三SARS-CoV-2序列，使得当含有来自第一、第二和第三qPCR测定的试剂的反应体积经受扩增条件时—并且如果被测试的核酸样本包括SARS-CoV-2基因组RNA(或由其反向转录的cDNA)—至少一个扩增子由与ORF1ab蛋白缔合的编码区域产生，至少一个扩增子由与S蛋白缔合的编码区域产生，并且至少一个扩增子由与N蛋白缔合的编码区域产生(例如，使用选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:160的第一正向引物，选自SEQID NO:5和SEQ ID NO:100的第二正向引物，以及选自SEQ ID NO:211和SEQ ID NO:248的第三正向引物；使用选自SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:423和SEQ ID NO:468的第一反向引物，选自SEQ ID NO:337和SEQ ID NO:441的第二反向引物，以及选自SEQ ID NO:487、SEQ IDNO:501和510的第三反向引物；并且使用选自SEQ ID NO:520-SEQ ID NO:1295和/或SEQ IDNO：1466-SEQ ID NO：2359的互补探针；优选地一种或多种选自SEQ ID NO:821-1054、SEQID NO:1853-2027、SEQ ID NO:2028-2220和/或SEQ ID NO:2221-2359的探针；和更优选地一种或多种选自SEQ ID NO:565、SEQ ID NO:599、SEQ ID NO:833、SEQ ID NO:864、SEQ IDNO:930、SEQ ID NO:971、SEQ ID NO:1049、SEQ ID NO:1106、SEQ ID NO:1160、SEQ ID NO:1203、SEQ ID NO:1866、SEQ ID NO:1891、SEQ ID NO:1962、SEQ ID NO:2031、SEQ ID NO:2188、SEQ ID NO:2203、SEQ ID NO:2216、SEQ ID NO:2248、SEQ ID NO:2291和/或SEQ IDNO:2345的探针)。在一些实施例中，第一正向引物是SEQ ID NO:160。在一些实施例中，第二正向引物是SEQ ID NO:100。在一些实施例中，第三正向引物是SEQ ID NO:211。在一些实施例中，第一反向引物是SEQ ID NO:468。在一些实施例中，第二反向引物是SEQ ID NO:337。在一些实施例中，第三反向引物是SEQ ID NO:501和/或510。在一些实施例中，互补探针是SEQ ID NO:1049、864和/或833。在一些实施例中，第一正向引物是SEQ ID NO:160，第二正向引物是SEQ ID NO:100，第三正向引物是SEQ ID NO:211，第一反向引物是SEQ ID NO:468，第二反向引物是SEQ ID NO：337，第三反向引物是SEQ ID NO：501和/或510，并且互补探针分别是SEQ ID NO 1049、864和833。
本文所述的引物和探针序列不需要与其靶标具有100％的同源性才有效，尽管在一些实施例中，同源性基本上是100％。在一些实施方案中，一种或多种所公开的引物和/或探针序列与它们相应的靶具有约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或高达基本上100％的同源性。引物和/或探针的一些组合可以包括这样的引物和/或探针，每个这样的引物和/或探针与它们相应的靶具有不同的同源性，并且同源性可以在例如由任何两个前述值定义的端点的范围内。
在一些实施例中，本文公开的多重qPCR试剂盒还包括用于第四qPCR测定的试剂，所述第四qPCR测定靶向外源性/内源性阳性对照序列，使得当多重反应体积经受扩增条件时—并且如果样本包括SARS-CoV-2基因组RNA和受试者衍生的核酸或外源添加的模板核酸—如上所述，至少一个扩增子由与ORF1ab蛋白缔合的编码区域产生，至少一个扩增子由与S蛋白缔合的编码区域产生，至少一个扩增子由与N蛋白缔合的编码区域产生，并且至少一个扩增子由外源性/内源性阳性对照序列产生。如果阳性对照序列是内源性衍生的对照(例如RNase P)，则受试者来源的核酸(例如，编码RNase P、RNase P RNA和/或逆转录的RNase P转录物的基因组DNA)的存在可以用作RNase PqPCR测定的模板。用于此类RNase PqPCR阳性对照的示例性的引物和探针可以包括SEQ ID NO:2552-SEQ ID NO:2556，尽管本领域技术人员应当理解，可以使用其他RNase-P特异性引物和/或探针。如果阳性对照序列是外源性衍生的对照(例如MS2噬菌体的组分)，则将已知或预定浓度的模板核酸添加到反应体积中，以用作MS2qPCR测定的所需的模板。用于外源性MS2 qPCR阳性对照的示例性引物和探针可以包括SEQ ID NO:256、SEQ ID NO:509和SEQ ID NO:1300，尽管本领域技术人员应当理解，可以使用其他MS2特异性引物和/或探针。
在一些实施例中，单重测定和多重测定可以包括用于被测试的致病靶标、临床分离研究样本和/或生物体样本的合成DNA对照和/或基因组RNA对照。组合物和试剂盒还可以包括对照DNA构建体，所述对照DNA构建体包含携带N蛋白、S蛋白和ORF1ab蛋白的靶序列的质粒。对照质粒可以另外包括用作阳性对照的RNase P编码序列和/或用于监测样本污染的Xeno盒。在一些实施例中，合成对照构建体在单独的试剂盒中提供，该试剂盒具有包括在用于从生物样本中检测SARS-CoV-2病毒核酸的互补试剂盒中的相同引物和探针。在一些实施例中，这两个试剂盒可以在不同的位置制造，以防止检测试剂盒内任何可能的对照质粒的交叉污染(这将导致假阳性样本结果)。
在一些实施例中，本文公开的多重RT-qPCR试剂盒还包括用于第五qPCR测定的试剂，所述第五qPCR测定靶向两个单独的(外源性/内源性)阳性对照序列，使得当反应体积经受扩增条件时—并且如果样本包括SARS-CoV-2基因组RNA和受试者来源的核酸或外源添加的模板核酸—如上所述，至少一个扩增子由与ORF1ab蛋白缔合的编码区域产生，至少一个扩增子由与S蛋白缔合的编码区域产生，至少一个扩增子由与N蛋白缔合的编码区域产生，并且至少两个扩增子由外源性和/或内源性阳性对照序列产生(例如，使用针对上述RNaseP和/或MS2的引物和探针，或可以用作本文所述的qPCR测定中的阳性对照的其它选择性和特异性引物和探针)。
在一些实施例中，所公开的引物和探针(包括在SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:2533中列出的那些)以靶向SARS-CoV-2基因组中的至少两个不同基因座的多重测定形式使用，即：编码ORF1ab的基因、编码S蛋白的基因和/或编码N蛋白的基因。在一些实施例中，所公开的引物和探针以靶向SARS-CoV-2基因组中的至少三个基因座的多重测定形式使用，即：编码ORF1ab的基因、编码S蛋白的基因和编码N蛋白的基因。单个qPCR反应体积包括针对这些靶基因中的每一个的多个测定，以确保靶病毒的冗余和特异性鉴定。
例如，本公开的多重测定包括4重测定，其中四个染料通道中的三个各自专用于鉴定不同的SARS-CoV-2编码区域，特别是与N蛋白、S蛋白或ORF1ab缔合的编码区域的允许特异性和选择性鉴定SARS-CoV-2的部分。第四染料通道可以用于鉴定阳性对照(例如，外源添加的对照如MS2或内源存在的对照如RNase P)。也就是说，本公开的多重测定可以包括对与如本文证明的可检测标记和/或淬灭剂偶联的N蛋白、S蛋白或ORF1ab的编码区域具有序列特异性的探针。作为非特定的实例，多重分析可以包括靶向SARS-CoV-2特异性N蛋白编码序列并具有与其相关的VIC染料的第一探针。多重测定的第二探针可以靶向SARS-CoV-2特异性S蛋白编码序列并具有与其相关的ABY染料。多重测定的第三探针可以靶向SARS-CoV-2特异性ORF1ab编码序列并具有与其相关的FAM染料。多重测定的第四探针可以对阳性对照序列是特异性的并具有与其相关的JUN染料。本领域技术人员将认识到前述染料可以互换或交换为本领域已知的另一种可检测标记。
在一些实施例中，4重测定包括至少两个共享相同染料通道的SARS-CoV-2特异性探针。4重测定的第二染料通道和第三染料通道可以分别与Flu A和Flu B特异性探针相关联，并且第四染料通道可以与RSV A和/或RSV B特异性探针或阳性对照探针相关联。可替代地，第二染料通道可以由Flu A和Flu B特异性探针共享，第三通道可以与RSV A和/或RSV B特异性探针相关联，并且第四个染料通道可以与阳性对照探针相关联。可替代地，第三染料通道可以与Flu A特异性探针相关联，并且第四通道可以与Flu B特异性探针相关联。
在一些实施例中，4重测定包括至少两个共享相同染料通道的SARS-CoV-2特异性探针。4重测定的第二染料通道和第三染料通道可以分别与RSV A特异性和RSV B特异性探针相关联，并且第四染料通道可以与Flu A和/或Flu B特异性探针或阳性对照探针相关联。可替代地，第二染料通道可以由RSV A和RSV B特异性探针共享，第三个通道可以与Flu A和/或Flu B特异性探针相关联，并且第四染料通道可以与阳性对照探针相关联。可替代地，第三染料通道可以与RSV A特异性探针相关联，并且第四通道可以与RSV B特异性探针相关联。
所公开的引物和探针可以被包括在另外的和/或可替代的多重测定中。例如，5重测定可以包括至少两个SARS-CoV-2特异性探针(例如，用于N蛋白、S蛋白和/或ORF1ab扩增子)。探针可以与不同的染料通道相关联或者可以共享相同的染料通道。在一些实施例中，不区分CoV-2N蛋白和S蛋白基因组序列之间的检测。在一些实施例中，区分CoV-2N蛋白基因组序列和S蛋白基因组序列之间的检测。另外地，第二染料通道、第三染料通道和/或第四染料通道可以与例如Flu A特异性和/或Flu B特异性探针和/或RSV A特异性探针和/或RSV B特异性探针相关联。在一些实施例中可以另外包括阳性对照探针。作为特定的非限制性实例，编码SARS-CoV-2N蛋白、S蛋白和/或ORF1ab的基因内的区域可以使用单个染料通道(例如，VIC)检测，同时使用一种或多种不同的染料通道(例如FAM、ABY和/或JUN)在同一反应中同时检测A型和/或B型流感和/或A型和/或B型RSV的组合测定。在一个实施例中，至少两个SARS-CoV-2特异性可检测引物和/或探针可以与单个染料通道相关联，例如通过用VIC染料标记，并且任选地，Flu A特异性可检测引物和/或探针可以与第二染料通道相关联，例如通过用ABY染料标记，和/或Flu B特异性可检测引物和/或探针可以与第三染料通道相关联，例如通过用FAM染料标记。在另一实施例中，用于SARS-CoV-2和/或A型和/或B型流感的测定可以进一步与RSV A和RSV B可检测引物和/或探针组合，以包括通过另一个染料通道的检测，例如通过相应的缔合JUN染料。任选地，可以为MS2或RNase P阳性对照引物和/或与ALEXA(AF)染料缔合的探针保留第五通道。
用于检测多种呼吸道病原体的组合物、试剂盒和方法
上文和本文其他地方描述的用于检测SARS-CoV-2的组合物、试剂盒和方法可以形成用于检测多种呼吸道病原体的测定的基础。例如，上述qPCR测定(无论是单重还是多重)可以作为一组qPCR测定的组分或作为用于检测来自受试者样本的多种病原体的多重测定被包括。
在一些实施例中，除了用于检测Flu A和/或Flu B病毒的一种或多种测定之外，一组qPCR测定还包括一种或多种用于检测SARS-CoV-2的测定。在一些实施例中，除了用于RSVA和/或RSV B的一种或多种测定之外，该组qPCR测定还包括一种或多种用于SARS-CoV-2的测定。在一些实施例中，除了用于Flu A和/或Flu B病毒的一种或多种测定以及用于RSV A和/或RSV B的一种或多种测定外，该组qPCR测定还包括用于SARS-CoV-2的一种或多种测定。在一些实施例中，除了至少两种用于Flu A病毒和/或Flu B病毒的测定以及至少两种用于RSV A和/或RSV B的测定外，该组qPCR测定还包括至少两种用于SARS-CoV-2的测定。
应该理解，该组qPCR测定可以以单重格式进行，允许每个qPCR靶标的探针在各种测定之间共享。可替代地，qPCR测定可以以多重格式进行，其中组的每种组分与发射光谱基本上不重叠的不同探针相关联(即，每个探针的发射光谱与其他探针是唯一可识别的)。
在一些实施例中，除了针对对照序列的一种或多种测定之外，该组qPCR测定还包括一种或多种针对SARS-CoV-2的测定。在一些实施例中，对照序列是RNase P序列和/或MS2噬菌体序列。在一些实施例中，该组qPCR测定包括一种或多种测定，这些测定包含SEQ IDNO:4-SEQ ID NO:2533中列出的任何正向引物、反向引物和探针序列。应当理解，qPCR和RT-qPCR方法是本领域技术人员已知的。然而，在实例中提供了特定实施例，说明了qPCR测定用于检测SARS-CoV-2、Flu A和/或Flu B、和/或RSV A、和/或RSV B靶标的用途。
在一些实施例中，该组qPCR测定包括四个或更多个测定，这些测定包含SEQ IDNO:4-SEQ ID NO:2533中列出的任何正向引物、反向引物和探针序列。在一些实施例中，该组qPCR测定包括六种或更多种测定，这些测定包含SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:2533中列出的任何正向引物、反向引物和探针序列。每个qPCR测定可以包括正向引物和反向引物。任选地，该测定进一步包括探针，所述探针可以是水解探针。在一些实施例中，每个qPCR测定包括至少一种正向引物、至少一种反向引物和至少一种探针，所述探针分别选自SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:267-SEQ ID NO:510和SEQ ID NO:520-SEQ ID NO:2533中列出的任何一种。
在一些实施例中，该组qPCR测定包括至少一种用于检测SARS-CoV-2的qPCR测定，加上至少一种用于检测下面表3A中列出的呼吸道微生物的至少一种测定的qPCR测定。在一些实施例中，该组qPCR测定包括至少一种用于检测SARS-CoV-2的qPCR测定，加上至少一种用于检测表3A中所列的微生物中的每一种的qPCR测定。在一些实施例中，该测定检测表3A中的两个或更多个(例如，2、3、4、5、6个等)靶标。在一些实施例中，该测定检测SARS-CoV-2基因组内的至少两个靶标以及内部阳性对照(参见例如表3B)，例如人RNase P。在一些实施例中，除了一种或多种阳性对照(例如对于RNase P和/或18S rRNA和/或外源性对照，如噬菌体MS2)之外，该测定还同时检测表3A的每种靶(参见，例如，表3A)。在一些实施例中，该组测定被格式化为开放阵列卡。在其他实施例中，该组测定被格式化为开放阵列板。在一些实施例中，该组测定用于多个单重测定。在一些其他实施例中，该组测定用于一种或多种多重测定。在一些实施例中，该组测定包括汇合的测定。在一些实施例中，该组测定包括干燥和/或冻干测定。
表3A.呼吸道微生物群(RTM)的目标和检测方法列表
表3B：用于呼吸道微生物群对照的测定
在一些实施例中，一组不同的qPCR测定可以用于测试除SARS-CoV-2之外的多种毒株或类型的病原体，包括但不限于其他病毒病原体，例如Flu A和/或Flu B,以及A型和/或B型RSV、细菌病原体和/或真菌病原体。在一些实施例中，该组qPCR测定可以同时用于测试单个受试者样本或包含多个受试者样本的汇合的样本，其中每个测定以阵列形式平行运行。任选地，可以将对每种靶核酸特异性的不同qPCR测定铺板到单个阵列或多孔板的单独的孔中，类似于例如TaqMan阵列卡(例如，由赛默飞世尔科技公司以目录号4346800和4342265出售)或MicroAmp多孔反应板(例如，由赛默飞世尔科技公司以目录号4346906、4366932、4306737、4326659和N8010560出售)。任选地，阵列或板的不同孔中存在的不同qPCR测定可以原位干燥或冷冻干燥，并且阵列或板可以在使用前被储存或运输。在一些实施例中，阵列格式的测定可以作为单重或作为多重测定运行。
本文公开的示例性阵列卡可以包括存在于TaqMan阵列呼吸道微生物群综合卡(TaqMan Array Respiratory Tract Microbiota Comprehensive Card)(由赛默飞世尔科技公司以目录号A41238出售)中的一些或所有测定，特别是那些涉及从样本中鉴定病毒、细菌或真菌微生物的测定，以及一种或多种用于检测阵列的至少一个孔中存在的如本文公开的SARS-CoV-2的测定。SARS-CoV-2检测测定可以包括至少一种选自SEQ ID NO:4-SEQ IDNO:2533的引物或探针。
在一些实施例中，该组包括对其他循环冠状病毒毒株(包括但不限于229E、KHU1、NL63和OC43冠状病毒)的测定。组/阵列卡可以包括任何数量的单独测定，但在一些实施例中，组/阵列卡包括48个单独的测定，其中至少一个是对照测定(例如，RNase P、18S rRNA等)。在一些实施例中，所公开的方法包括使用该组来概述存在于取自生物体(例如，人)的样本中的呼吸道微生物，并且确定存在于生物体的样本中的呼吸道微生物群的概况。任选地，所公开的方法可以包括诊断存在于从中获取样本的生物体(例如，人)中的感染。
在任何前述实施例中，应该理解，用于检测病毒核酸的组合物、试剂盒和方法可以在“服务点”(POS)系统中实施或者可以被包括在“服务点”(POS)系统中。另外或可替代地，可以在“护理点”(POC)位置收集和/或分析样本。在一些实施例中，在POC位置的分析通常不需要专门的设备并且具有快速且易于阅读的视觉结果。在一些实施例中，分析可以在现场、在家庭环境中和/或由不具有专业技能的外行人执行。在某些实施例中，例如，小体积临床样本的分析可以使用POS系统在短的时间段内(例如，在几小时或几分钟内)完成。
任选地，“服务点”(POS)或“服务点系统”在某一位置使用在该位置处的系统执行，该系统能够在受试者的部位或位置处或附近提供服务(例如，测试、监测、治疗、诊断、指导、样本收集、身份验证(ID验证)和其他服务)。服务可以是医疗服务或者可以是非医疗服务。在一些情况下，POS系统在预定的位置(例如受试者的家、学校或工作场所)，或者在杂货店、药店、社区中心、诊所、医生办公室、医院、室外分诊帐篷、临时医院、边境检查站等提供服务。POS系统可以包括一个或多个服务点设备，例如便携式病毒/病原体检测器。在一些实施例中，POS系统是护理点系统。在一些实施例中，POS系统适用于非专业工作人员或人员，例如护士、警察、平民志愿者或受试者本人。
在某些实施例中，本文所述的测定可以在“护理点”(POC)进行，例如，提供医疗相关护理(例如，治疗、测试、监测、诊断、咨询等)的位置。POC可以是，例如，在受试者的家、工作场所或学校，或在杂货店、社区中心、药店、医生办公室、诊所、医院、户外分诊帐篷、临时医院、边境检查站等。POC系统是可以帮助或可以用于提供这类医疗相关护理的系统，并且可以位于或靠近受试者或受试者的健康护理提供者的场所或位置(例如，受试者的家、工作场所或学校，或在杂货店、社区中心、药店、医生办公室、诊所、医院等)。
在实施例中，这类系统是服务点系统(POS系统)，其中POS系统位于服务点位置。在实施例中，POS系统位于服务点位置并且被配置为在POS位置接受从受试者获得的临床样本。在实施例中，POS系统位于服务点位置并且被配置为在POS位置接受从受试者获得的临床样本，并且进一步被配置为在POS位置分析临床样本。在实施例中，临床样本是小体积临床样本。在实施例中，在短的时间段内分析临床样本。在实施例中，相对于样本分析开始的时间来确定短的时间段。在实施例中，相对于将样本插入到装置中以用于样本的分析的时间来确定短的时间段。在实施例中，相对于从受试者获得样本的时间来确定短的时间段。
在一些实施例中，POS可以包括本文公开的基于扩增的方法、组合物和试剂盒，包括任何所述的测定和/或测定组。此类测定被设想用于热循环扩增工作流程和方案(例如在PCR中)以及等温扩增工作流程和方案(例如在LAMP中)。
在一些实施例中，POS或POC包含生物样本(例如鼻拭子或唾液样本)的自行收集。在一些实施例中，自行收集可以包含使用自行收集试剂盒和/或装置，例如拭子或管。在一些实施例中，自行收集试剂盒包含使用说明，包括收集说明、样本制备或储存说明和/或运输说明。例如，自行收集试剂盒和/或装置可以由不具有专业技能或医学专业知识的个体(例如非专业人士)使用。在一些实施例中，自行收集可以由受试者自己或由受试者附近的任何其他个体(例如但不限于父母、护理者、老师、朋友或其他家庭成员)执行。
POS/POC实施可以有益地提供一种方便的方式来监测和/或检测可能被所公开的试剂盒和方法所寻找的任何病毒感染的个体。这包括，例如，筛选无症状个体(例如，感染了SARS-CoV-2并且在出现与呼吸道感染相关的标志性症状(例如，发热、咳嗽、不适)之前可能正在脱落传染性病毒粒子的个体)。一旦检测到，受感染的个体可以被隔离，以防止感染的进一步传播。另外地或可替代地，可以向个体提供适当的医疗护理，在一些实施例中，可以在POC设施处直接启动该医疗护理和/或在由POS系统/POC设施通知医疗保健专业人员之后启动该医疗护理。
所公开的用于检测病毒序列的试剂盒和方法有益地为从医院和/或传统临床实验室服务分散的公司和/或场馆提供了在现场快速筛选样本并在适当时采取行动的能力，并且仅针对那些其中应当采取行动的个体。例如，体育赛事的观众可能在赛事开始之前到达相应的场馆，在那里他们可以被筛选SARS-CoV-2(除了任何其他公开的病毒)。那些测试呈阴性的观众可以随后进入场馆，并且可以不被要求进行社交距离练习或佩戴个人防护设备，例如佩戴面罩。另一方面，那些测试呈阳性的观众可能会被拒绝进入并被引导至医疗保健专业人员，从而限制SARS-CoV-2(或由本文公开的试剂盒和方法检测到的其他病毒)在场馆的暴露和/或传播。
因为所公开的试剂盒和方法使得能够在从医院和/或传统临床实验室服务分散的位置处筛选个体，所以所公开的试剂盒和/或方法可以另外用于更有效和更快速地从人群中收集准确的流行病学数据。此类数据可以用于鉴定社区内的热点和/或使此类病毒病原体的传播延续的行为或队列，这可以实现定向的或更有效的解决方案。
当进行筛选时，如上所述，来自报告为健康的个体(即，对于SARS-CoV-2或其他呼吸道感染的特征无症状)的样本可以被合并成单一的汇合的样本。由于大多数样本预计为阴性，因此这类方法可以有利地快速和有效地筛选大的群体，尽管它可能需要少数人被重新测试以确定在给定的汇合的样本中的哪个(哪些)样本导致汇合的样本测试对于靶核酸(例如，SARS-CoV-2)的存在呈阳性。分开处理每个样本将需要更少的测定资源和/或仪器，和/或相同量的测定资源和/或仪器可以用于筛选更多数量的样本。
即，在一些实施例中，样本获自多种生物体(例如，多个受试者或患者)，并且将多个样本汇合在一起以制备用于测试的单个汇合的样本。样本可以从至少两种不同的生物体或个体中获得，以用于汇合在一起以形成用于测试的单个汇合的样本。在一些实施例中，样本可以从2-10个不同的生物体或个体中获得并且被汇合在一起以形成用于测试的单个样本。在一些实施例中，样本可以从2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的生物体或个体中获得，用于汇合在一起以形成用于测试的单个样本。在一些实施例中，样本可以从多达并包括5种不同的生物体或个体中获得，用于汇合在一起以形成用于测试的单个样本。例如，根据本文所述的方法和组合物，用于测试的样本可以包含从不同生物体或个体(例如2个、3个、4个、5个不同个体)获得的多个样本，这些样本被组合在一起以形成用于随后检测病原体(例如SARS-CoV-2)的单个样本。
无论样本是被汇合还是被单独评估，发明人都意外地发现，混合RT-qPCR反应体积可以在防止样本的光学混合和/或错误分类方面发挥关键作用。因此，在RT-qPCR之前混合(例如涡旋)反应体积的步骤被包括在用于检测本文公开的病毒序列的优选的方法中。这可以包括，例如，涡旋反应体积(例如，单管、阵列和/或基于板的)。在一些实施例中，将反应体积涡旋至少5秒，优选地至少10秒。在一些实施例中，反应体积被涡旋约一分钟或更长，优选地少于约一分钟，或更优选地少于约30秒。在一些实施例中，将反应体积涡旋5秒至约1分钟，优选地10-30秒的时间段。
所定义术语的缩写列表
为了帮助理解前述和即将到来的书面描述和所附权利要求的范围和内容，下面直接定义了选择的几个术语。
SARS-CoV-2病毒(也被称为2019-nCoV)与人类呼吸道疾病COVID-19相关联。从早期COVID-19病例中分离的病毒被临时命名为2019-nCoV，并且国际病毒分类委员会冠状病毒研究组(Coronavirus Study Group of the International Committee on Taxonomyof Viruses)随后将2019-nCoV命名为SARS-CoV-2。出于本公开的目的，术语“SARS-CoV-2”和“2019-nCoV”被认为是指相同的病毒，并且可以互换使用来指代COVID-19的病原体。如本文所使用的，这些术语还包括SARS-CoV-2的不同变体，包括变体B.1.1.7、变体501Y.V2以及未来可能出现的其他变体。
如本文所使用的，术语“试剂盒”是指用于递送材料的任何递送系统。在反应分析的情形下，这类递送系统包括允许从一个位置到另一个位置储存、输送或递送反应试剂(例如适合的容器中的寡核苷酸、酶、引物组等)和/或支持材料(例如缓冲液、进行分析的书面说明等)的系统。例如，试剂盒可以包括一个或多个含有相关反应试剂和/或支持材料的外壳(例如，盒子)。如本文所使用，术语“片段化试剂盒”指包含两个或更多个单独的容器的递送系统，每个单独的容器含有全部试剂盒部件的子部分。容器可以一起或单独地递送给预期的接受者。举例来说，第一个容器可以含有用于分析的酶，而第二个容器含有寡核苷酸。实际上，在术语“片段化试剂盒”中包括包含各自含有全部试剂盒部件的子部分的两个或更多个单独容器的任何递送系统。相比之下，“组合试剂盒”是指在单个容器中(例如，在容纳期望的部件中的每个部件的单个盒子中)含有反应测定的所有部件的递送系统。术语“试剂盒”包括分部式和组合式试剂盒。
本文所述的部件可以彼此组合并且作为这样的组合试剂盒或片段化试剂盒提供，或者备选地每个部件可以单独提供并且供用户根据需要使用。例如，如本文所述的处理溶液可以被包括在试剂盒中或可以作为“独立”物品(在适当的容器中)提供以供用户根据需要使用。
如本文所使用的，术语“患者”通常是指在保健提供者的护理、观察或治疗下的任何动物，例如哺乳动物，特别是指在初级保健医师、传染病专家或其他可能诊断或治疗病毒感染的相关医学专业人员的护理下的人。出于本申请的目的，“患者”可以与“个体”或“受试者”互换。因此，在一些实施例中，受试者是人类患者。然而，应当理解，“受试者”不一定必须是“患者”，如本文所述的术语。例如，受试者可以是无症状携带者或正在筛查一种或多种病毒的未感染的人(或动物)。“受试者”也可以是非人类动物，例如水貂。
如本文所使用的，术语“实时PCR”或“定量实时PCR”或“qPCR”是指通过实时PCR对核酸的可测量的扩增，通常通过监测反应体积中的荧光探针并使PCR产物进行任选定量。术语“实时”和“实时连续”是可互换的，并且指的是通过在扩增反应过程期间的周期性监测进行数据收集的方法。因此，实时方法将扩增和检测组合成单个步骤。应当理解，数据收集可以通过在PCR过程期间的周期性监测来进行，而这种数据的分析可以在以后进行。
术语“逆转录PCR”或简称“RT-PCR”旨在包括那些首先使用RNA依赖性DNA聚合酶(通常被称为逆转录酶)将RNA模板(如病毒RNA基因组模板)转录成互补DNA(cDNA)的PCR方法。然后，该cDNA被PCR方法中常用的任何DNA依赖性DNA聚合酶用作靶核酸序列的PCR扩增的模板。为了便于在说明书中使用，术语“RT-PCR”和“RT-qPCR”可以互换使用，正如本领域技术人员所理解的那样，可以调整用于在终点监测扩增子产生的方法和试剂，如在传统PCR方法中所进行的，使得可以在PCR的热循环期间和/或之间监测扩增子产生，如在传统qPCR方法中所进行的。
此外，应当理解，当本文使用术语“qPCR”时，它不一定排除包括初始逆转录步骤的方法和/或试剂盒。因此，“qPCR”方法、试剂盒、阵列和/或用于进行qPCR的测定的说明书中的任何指示被理解为包括具有初始逆转录步骤的相同或相似的方法、试剂盒、阵列和/或测定以及任何伴随的试剂(例如逆转录酶、缓冲液、dNTP、盐等)。
除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
可参考本质上是示范性的一个或多个实施例或实施方式来说明本公开的各个方面，包括装置、系统和方法。如本文中所使用，术语“示范性”意味着“充当示例、例子或说明”，且未必应解释为相比本文中所公开的其它实施例为优选的或有利的。此外，对本公开或本发明的“实施”的引用包括对其一个或多个实施例的具体引用，且反之亦然，且所述引用意图提供说明性示例而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书而不是以下描述指示。
在本申请中，“可以”和“能够”是在允许的意义上使用的(即意味着有可能)，而不是在强制的意义上(即意味着必须)。另外，术语“包括(including)”、“具有(having)”、“涉及(involving)”、“含有(containing)”、“特征在于(characterized by)”以及其变体(例如“包括(includes)”、“具有(has)”、“涉及(involves)”、“含有(contains)”等)以及如本文中(包括权利要求书)使用的类似术语应为包含性的和/或开放式的，应具有与词语“包含(comprising)”以及其变体(例如“包含(comprise和comprises)”)相同的含义，并且不排除额外的、未引用的元件或方法步骤。
应注意，除非上下文另有清楚地规定，否则如本说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一(a、an)”和“所述(the)”包括多个指示物。因此，例如，对单数指代物(例如，“小部件”)的引用包括一个、两个或更多个指代物。类似地，除非内容和/或上下文清楚地规定，否则对多个指代物的引用应解释为包含单个指代物和/或多个指代物。举例来说，对复数形式的指代物(例如，“小部件”)的引用不一定需要多个这种指代物。相反，应了解，除非另有说明，否则独立于所推断的指代物的数目，在本文中设想了一个或多个指代物。
为了便于理解，在可能的情况下使用相似参考标号(即，部件和/或元件的相似编号)来指定图式中共有的相似元件。具体地说，在图式中说明的示例性实施例中，在可能的情况下，将为相似结构或具有相似功能的结构提供类似的参考标示。本文将使用特定语言来描述示例性实施例。然而，应理解，并不因此旨在限制本公开的范围。相反，应理解，用于描述示例性实施例的语言仅为说明性的并且不被理解为限制本公开的范围(除非这类语言在本文中明确地描述为必要的)。
本文使用的标题仅用于组织目的，并不意味着用于对描述或权利要求的范围进行限制。
可通过描述粘结、联接、附接、连接和/或接合在一起的部件来说明本公开的各种方面。如本文中所使用，术语“粘结”、“联接”、“附接”、“连接”和/或“接合”用于指示两个部件之间的直接关联，或在适当时通过间插或中间部件与彼此的间接关联。相比之下，当部件被提及为“直接粘结”、“直接联接”、“直接附接”、“直接连接”和/或“直接接合”到另一个部件时，不存在或不预期间插元件。此外，粘结、联接、附接、连接和/或接合可以包含机械和/或化学关联。
实例
实例1：用于检测SARS-CoV-2的单重测定
进行了用于通过单重测定从生物样本中检测SARS-CoV-2的示例性方案。该测定使用用于检测ORF1ab的引物和FAM标记的探针，以及用于检测SARS-CoV-2的S蛋白和N蛋白编码序列的附加引物和工艺，所述S蛋白和N蛋白编码序列选自本文公开的引物和探针。该测定还使用来自TaqMan 2019-nCoV测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录号A47532)的通用组分(例如，主混合物和其他非寡核苷酸组分)。还包括针对RNase P的任选的VIC标记的内部对照。在单独的试剂盒中，包括相同的引物/探针并用作阳性对照，以从编码ORF1ab、S蛋白、N蛋白和RNase P的靶序列的合成DNA构建体中检测靶序列。
使用MagMAX病毒/病原体核酸分离试剂盒(由赛默飞世尔科技公司以目录号A42356出售)，根据随其提供的说明书，从通过鼻咽拭子、鼻咽抽吸物或支气管肺泡灌洗收集的样本中分离总核酸含量。
对于每个测定，表4中的组分对于反应次数加上10％的过量进行组合：
表4.RT-qPCR反应混合物
将反应混合物涡旋约10-30秒并短暂离心。对于每个反应，下表5中的组分在MicroAmp光学96孔反应板(0.2mL/孔)中混合：
表5.RT-qPCR反应
该板用MicroAmp光学粘合膜密封并短暂涡旋以混合内容物。将板短暂离心以收集孔的底部处的内容物。将板加载到7500实时PCR仪器中，并运行表6或表7中的方案，取决于用于创建反应混合物的相应RT-qPCR主混合物。
表6.使用TaqPath 1步RT-qPCR主混合物的RT-qPCR方案
表7.使用TaqMan快速病毒1步主混合物的RT-qPCR方案
使用包括的7500软件v2.3分析所得的数据，因为该程序更新了算法，提高了检测低拷贝样本的灵敏度。使用上述软件的自动基线和自动阈值分析设置进行分析。对于每个板，确认对照反应按预期进行(即，无模板对照具有未确定的Ct值，并且阳性对照具有小于或等于30的Ct值)。
还根据表8分析了每个单独测定的Ct值。
表8.单独测定结果指南
| 2019-nCoV测定(FAM) | RNase P测定(VIC) | 解释结果 |
| Ct<37 | 任何值 | 阳性。 |
| 37≤Ct<40 | 任何值 | 无定论的。重复测试。 |
| Ct＝40或未确定 | Ct<40 | 阴性。 |
如果(i)三个2019-nCoV测定中的任何两个呈阳性，或(ii)在从同一受试者采集的两个不同样本中2019-nCoV测定中的任何一个呈阳性，则每份测试的样本的结果被解释为存在SARS-CoV-2RNA。如果所有三个2019-nCoV测定均呈阴性，则在样本中不存在SARS-CoV-2RNA。
说明ORF1ab的扩增曲线和相关联的标准曲线的示例性结果分别在图2A和2B中提供。类似地，S蛋白的扩增图和相关联的标准曲线分别在图2C和2D中提供，并且N蛋白的扩增图和相关联的标准曲线分别在图2E和2F中提供。
实例2：用于检测SARS-CoV-2的多重测定
执行了用于通过多重测定从生物样本中检测SARS-CoV-2的示例性方案。.该测定试剂盒包括用于检测ORF1ab的引物和FAM标记的探针(分别为SEQ ID NO:160、468和1049)，用于检测S蛋白的引物和ABY标记的探针(分别为SEQ ID NO:100、337和864)，以及用于检测SARS-CoV-2的N蛋白编码序列的引物和VIC标记的探针(分别为SEQ ID NO:211、501和833)。还包括针对内源性RNase P或外源性MS2 RNA模板的JUN标记的内部阳性对照。在单独的试剂盒中，包括相同的引物/探针并用作阳性对照，以从编码ORF1ab、S蛋白、N蛋白和RNase P/MS2 RNA的靶序列的合成DNA构建体中检测靶序列。剩余的扩增试剂获自TaqPathTM COVID-19Combo试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录号A47814)。
使用MagMAX病毒/病原体核酸分离试剂盒(由赛默飞世尔科技公司以目录号A42356出售)，根据随其提供的说明书，从通过鼻咽拭子、鼻咽抽吸物或支气管肺泡灌洗收集的样本中分离总核酸含量。
对于每个测定，表9中的组分对于反应次数加上10％的过量进行组合：
表9.RT-qPCR反应混合物
将反应混合物涡旋约10-30秒并短暂离心。对于每个反应，将下表10中的组分在MicroAmp光学96孔反应板(0.2mL/孔)中组合：
表10.RT-qPCR反应
该板用MicroAmp光学粘合膜密封并短暂涡旋以混合内容物。将板短暂离心以收集孔的底部处的内容物。将反应混合物涡旋约10–30秒并短暂离心。将板加载到QuantStudio5实时PCR系统中并运行表11中的方案。
表11.用于多重测定的RT-qPCR方案
使用QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统包括的QuantStudio设计和分析软件v1.5.1来分析所得的数据，因为该程序更新了算法，提高了检测低拷贝样本的灵敏度。对于每个板，确认对照反应按预期进行(即，无模板对照具有未确定的Ct值，并且阳性对照具有小于或等于30的Ct值)。
还根据表8分析了每个单独测定的Ct值。
表12.单独测定多重测定结果指南
如果在从同一受试者采集的两个不同样本中(i)ORF1ab、S蛋白或N蛋白中的任何两个为阳性或(ii)ORF1ab、S蛋白或N蛋白中的任何一个为阳性，则每个测试的样本的结果都被解释为存在SARS-CoV-2RNA。如果ORF1ab、S蛋白和N蛋白中的所有三个均为阴性，则在样本中不存在SARS-CoV-2RNA。
实例3：SARS-CoV-2检测测定的稳健性测试
为了确保在进行实例1和2中描述的单重和多重测定时观察到的特异性，基于所使用的RT-qPCR方案、qPCR仪器和RT-qPCR主混合物测试了每个测定的稳健性。在图3A-3C中示出的示例性结果说明了在7500标准方案和7500快速方案下的稳健测定性能，并且表明任一种方案可以有效地用于鉴定带有SARS-CoV-2RNA的样本。
qPCR仪器之间的测定性能的稳健性也得到证实。如图4A-4C所示，无论使用7500仪器还是QuantStudio 5系统，所公开的SARS-CoV-2测定都可能有效地鉴定样本中的SARS-CoV-2RNA。
尽管预计测定的稳健性不会随所使用的主混合物的类型而变化，但图4A–4C中示出的结果是特定于使用TaqMan快速病毒1步主混合物的测定。因此，还测试了关于主混合物的测定稳健性。如图5A–5C所示，在Quant Studio 5仪器上运行的TaqPath 1步主混合物和快速病毒1步主混合物均显示出稳健的测定性能，使任一种主混合物可有效地鉴定含有SARS-CoV-2RNA的样本。
这些实验的总结在下面的表13中示出，表明所公开的测定足够稳健以鉴定具有SARS-CoV-2RNA的样本，而不管使用的qPCR主混合物、qPCR方案或qPCR仪器如何。
表13.测定稳健性调查的总结
实例4：SARS-CoV-2的单重和多重测定的特异性测试
使用KingFisher上的MagMAX病毒/病原体超核酸分离试剂盒(由赛默飞世尔科技公司以目录号A42356出售)提取22种病毒和细菌(如下所列)的核酸并用于该测试。提取的RNA和DNA使用TaqPath 1步RT-qPCR主混合物,CG和包含用于SARS-CoV-2和MEGAPLEXPREAMP PRIMERS,RTM(由赛默飞世尔科技公司以目录号A41374出售)的引物的PreAmp池进行预扩增。使用下表14中描述的热循环方案进行预扩增。
表14.PCR扩增方案
PreAMP反应产物的用水(优选地RT-PCR级水)以1:10的比率稀释，并且将5μL稀释的PreAmp反应加入到25μL反应体积中，用于包含RT-PCR酶和测定试剂的单重和多重反应。在表15中提供了用于单重反应的配方，并且在表16中提供了用于多重反应的配方。
5μL稀释的PreAmp反应(即样本)和11μL的水(优选地RT-PCR级水)。按照相应的主混合物的推荐方案在QS5仪器上运行反应。对每个样本进行三个重复。
表15.用于单重反应的RT-qPCR混合物
表16.用于多重反应的RT-qPCR混合物
将反应混合物各自涡旋约10-30秒并短暂离心。将22种病毒和细菌中的每一种的预扩增和稀释的样本用于特异性测试。除作为临床分离物的冠状病毒毒株HKU1外，所有生物体均从ZeptoMetrix获得。对于待测试的每种反应混合物和基因组样本，下表17中的组分在MicroAmp光学96孔反应板(0.2mL/孔)中以一式三份组合：
表17.RT-qPCR反应
结果：测试的22种生物体中没有一种显示出与用于SARS-CoV-2检测的单重测定或多重测定的交叉反应性，如在下表18中总结的。因此，测定是特异性的。
表18. 2019-nCoV单重测定和多重测定的特异性测试结果
实例5：混合RT-PCR反应板
为了确保对SARS-CoV-2研究样本的正确分析，有必要通过涡旋板来正确地混合RT-qPCR反应。不这样做可能会导致光学混合，当样本体积超过PCR反应体积的20％时可能会发生这种现象。光学混合可以导致RTPCR基线不稳定性，从而导致整个板的QC失败和样本的潜在错误分类。
混合方案：
在将主混合物、测定、水、样本和对照添加到RT-PCR反应板中后，用MicroAmp光学粘合膜密封板的孔。使用MicroAmp粘合膜施加器来确保所有孔被完全密封。MicroAmp光学粘合剂盖使用压敏粘合剂背衬将盖粘附到光学96孔板或384孔板。使用足够的力来激活压敏粘合剂将防止从孔中蒸发。
涡流混合器(例如来自Scientific Industries的Vortex-Genie 2)的速度被设置为最高设置，其中激活模式被设置为“触摸”。涡流混合器还配备有平台而不是管杯。
将板与涡流混合器接触并保持与之接触持续10-15秒，同时允许涡流平台剧烈移动并使反应混合物在孔中自由移动。施加到涡流平台的过大或过小的压力都降低混合效率。在涡流过程中，板被四处移动，以确保在所有四个象限和板的中心处与平台的接触持续相等的时间。
实验设计：
在第一组实验中，创建了两个相同的96孔板。第一个板在Vortex-Genie 2上以最大速度涡旋30秒，而另一个板根本不混合。每个板含有提取的人为设计的阳性样本和阴性样本的一式三份反应。人为设计的阳性样本由汇合的鼻咽试样组成，其中掺入了9X、3X或1X检测限(分别为2,250GCE/mL、750GCE/mL和250GCE/mL)的SARS-CoV-2病毒RNA。使用MagMAX病毒/病原体核酸分离试剂盒和400μL试样体积或MagMAX病毒/病原体II核酸分离试剂盒和200μL试样体积来提取样本，并且两种提取工作流程在相同RT-PCR板上运行。
在第二组实验中，创建了两个相同的384孔板；一个板在Vortex-Genie 2上以最大速度涡旋10秒，而另一个板根本不混合。每个平板包含48个以10GCE/反应的提取的SARS-CoV-2病毒RNA的重复反应，加上MS2内部对照。RT-PCR运行在具有384孔模块的AppliedBiosystems QuantStudio 7Flex系统上进行。
结果：
在热方案的早期循环期间，未混合的96孔板和384孔板在荧光信号中表现出陡峭的向下斜率。相比之下，混合的96孔板和384孔板表明，对于相同的条件，适当的混合产生更平坦的基线。因此，与不混合相比，涡旋10-30秒产生更平坦的基线，而与提取方案、板类型或样本类型无关。因为下降的基线可能产生板失效或不准确的结果，所以涡旋混合对于获得可靠的、特定的结果似乎很重要。
实例6：SARS-CoV-2、Flu A/B、RSV多重测定
使用用于检测来自A型和B型Flu(流感)基因组的靶序列的引物和FAM标记的探针(SEQ ID NO:252、253、257、505、506、1296和1297)；用于检测来自SARS-CoV-2的S基因(SEQID NO:100、337和864)和N蛋白(SEQ ID NO:211、510和833)的SARS-CoV-2靶序列的引物和VIC标记的探针，用于检测对RSV病毒基因组(SEQ ID NO:254、255、507、508、1298和1299)特异性的靶序列的引物和ABY标记的探针，以及针对外源性MS2 RNA模板的内部阳性对照的引物和JUN标记的探针(SEQ ID NO:206、509和1300)，进行用于通过多重测定检测来自生物样本的与SARS-CoV-2、Flu A/B或RSV相关联的基因组核酸的存在的示例性方案。用于该实验的SEQ ID NO:510的引物与SEQ ID NO:501的引物相似，但在3'端还包括额外的“A”核苷酸残基。发现添加该残基有助于减少在含有某些额外的引物和探针的PCR反应期间中形成的伪影。
在单独的孔中，包括相同的引物/探针，并与合成阳性对照构建体一起使用，该构建体编码用于鉴定SARS-CoV-2、Flu(A和B)和RSV的靶序列。
使用MagMAX病毒/病原体核酸分离试剂盒(由赛默飞世尔科技公司以目录号A42356出售)，根据随其提供的说明书，从通过鼻咽拭子、鼻咽抽吸物或支气管肺泡灌洗收集的样本中分离总核酸含量。
将表19A-19C之一中的组分组合，以制备对于反应总数加上10％的过量的RT-PCR反应混合物:
表19A.RT-qPCR反应混合物
表19B.RT-qPCR反应混合物
表19C.RT-qPCR反应混合物(400-μL样本输入体积)
将反应混合物涡旋约10–30秒并短暂离心。对于每个反应，将下表20A-20D中的组分在MicroAmp光学96孔反应板中组合：
表20A.RT-qPCR反应(0.2mL/孔)
表20B.RT-qPCR反应(0.2mL/孔)
表20C.RT-qPCR反应(0.2mL/孔)
表20D.RT-qPCR反应(0.4mL/孔)
该板用MicroAmp光学粘合膜密封并短暂涡旋以混合内容物。将板短暂离心以收集孔的底部处的内容物。将板加载到7500实时PCR仪器中并运行表21中的方案。
表21.用于多病原体多重测定的RT-qPCR方案
在阳性对照中具有扩增的产物且在阴性对照中没有扩增的产物的每个测试样本的结果被解释为使得：(i)如果VIC信号为阳性，则存在SARS-CoV-2RNA，(ii)如果FAM信号为阳性，则存在Flu A/B，和/或(iii)如果ABY信号为阳性，则存在RSV。
实例7
在1管中开发了4重RT-qPCR测定，用于SARS-CoV-2、Flu A和Flu B病毒的核酸检测以及过程控制。4重测定的该SARS-CoV-2部分靶向具有较高的特异性且呈现出较低的突变风险的S蛋白和N蛋白区域。靶向S蛋白区域的引物是SEQ ID NO:100和337，具有SEQ ID NO:864的相关联的探针。靶向N蛋白区域的引物是SEQ ID NO:211和510，具有SEQ ID NO:833的相关联的探针。专有的生物信息学管道用于设计针对具有大的覆盖范围的Flu A和Flu B的特异性测定。对于SARS-CoV-2，引物和探针组的所得的毒株覆盖率为99.9％，具有35,833个高质量的完整序列。Flu A和Flu B的引物和探针组的所得的毒株覆盖率分别为6,730/6,854或98.2％，以及3,105/3,127或99.3％。使用qPCR仪器(例如QS5和7500Fast Dx)使用基于TaqPath COVID-19Combo试剂盒(附录2)的修改后的RT-PCR方案并使用其中提供的相同主混合物、水和dNTP对测定进行测试。
在可行性测试和开发的不同阶段使用DNA、体外转录的RNA、基因组RNA和病毒生物体对照。DNA和体外转录的RNA对照包括SARS-CoV-2、Flu A和Flu B。病毒RNA和病毒生物物对照包括SARS-CoV-2、基因组RNA和γ辐照灭活的病毒A型流感：H1N1(Brisbane/59/2007)和H3N2(Perth/16/2009)以及B型流感:Victoria谱系(Wisconsin/01/2010)和Yamagata谱系(Florida/04/2006)。
PCR热循环方案是根据我们之前的TaqPath COVID-19Combo试剂盒进行的，并有两处修改：(1)在RT后添加预孵育步骤(85℃，10分钟)(预孵育减少ABY通道的异常扩增曲线)；(2)循环数从40增加到46(将真实扩增的ΔRn增加到最大串扰水平以上)。
用于分析验证研究的标准：
工作流程检测限(LoD)将被确定为可以在≥95％的时间(例如，≥19/20次重复)内检测到的病毒的GCE的最低浓度。
反应性/包容性：100％的测试的毒株必须通过测定进行检测；在3X LoD下未检测到的毒株将在更高浓度下重新测试，直到达到100％命中率；100％的重复必须是阳性的。
干扰物质：如果100％的重复对给定的干扰物产生预期的结果，则该物质将被确定为在测试的浓度下无干扰。
竞争干扰：至少95％的4X LoD或更低的阳性样本在存在1,000X LoD或更高的竞争对手的情况下产生阳性的结果，ΔCt＝平均组合Ct-平均单个靶标Ct≤1.5个循环
4重实时PCR测定可以同时检测和区分SARS-CoV-2、Flu A和Flu B病毒核酸。在测试的实例中，Flu A引物和探针组与FAM通道相关联，SARS-CoV-2N蛋白和S蛋白引物和探针组与VIC通道相关联，Flu B引物和探针组与ABY通道相关联，并且内部对照MS2引物和探针组与JUN通道相关联。
检查了一个SARS-CoV-2毒株、两个Flu A的毒株(一个H1N1和一个H3N2)和两个FluB的毒株(一个Victoria谱系和一个Yamagata谱系)的工作流程LoD。使用MagMAX病毒/病原体II(MVP II)核酸分离试剂盒和KingFisher Flex 96深孔的病毒RNA提取。RT-qPCR在7500Fast Dx实时PCR系统和QuantStudio 5实时PCR仪器上进行。来自工作流程检测限的结果在下表22中提供。
表22.检测限(LOD)
4重测定中使用的引物和探针不与测试并列于下表23中的41种呼吸道病原体中的任何一种发生交叉反应。
表23.用于多病原体多重测定的RT-qPCR方案
对可能的干扰物质进行了测试，以证明在存在潜在干扰物质的情况下，这种4重测试在低浓度下检测每种靶标病毒的能力，并证明单独的潜在的干扰物质不产生假阳性结果。血液、皮质类固醇鼻喷剂、鼻凝胶、顺势疗法过敏缓解鼻喷剂、咽喉锭剂、奥司他韦、抗生素软膏和全身性抗生素测试显示无干扰。Afrin Original鼻喷剂在10％v/v时显示出干扰，因此对其进行滴定以找到未观察到抑制的浓度。两种仪器和所有测试的病毒的最大非抑制浓度为0.6％。结果总结在下面的表24中。
表24.用于多病原体多重测定的RT-qPCR方案
| 潜在的干扰物质 | 最终浓度 | 结果 |
| 粘蛋白 | 0.1mg/mL | 通过 |
| 血液 | 1％v/v | 通过 |
| 喷鼻剂 | 10％v/v | 通过 |
| 鼻用皮质类固醇 | 5μg/mL | 通过 |
| 鼻凝胶 | 1％w/v | 通过 |
| 顺势疗法过敏缓解药物 | 10％v/v | 通过 |
| 咽喉锭剂 | 1％w/v | 通过 |
| 磷酸奥司他韦 | 33μg/mL | 通过 |
| 抗生素、鼻软膏 | 5μg/mL | 通过 |
| 全身性抗生素 | 0.6mg/mL | 通过 |
还进行了竞争性干扰研究，以评估4重SARS-CoV-2、Flu A和Flu B测试在存在另一种高浓度的靶病毒的情况下检测低浓度的每种靶病毒的能力。竞争性干扰测试是使用具有SARS-CoV-2、Flu A和Flu B的人为设计的NP样本进行的，其中一种病毒的浓度小于或等于其LoD的三倍，而另一种测试的病毒的浓度大于或等于105TCID50/mL。结果的总结在下面的表25中。
表25.竞争性干扰结果
| 病毒组合 | 通过的浓度 |
| SARS-CoV-2lo FluBhi | 3X LoD |
| FluBloSARS-CoV-2hi | 3X LoD |
| FluAlo FluBhi | 3X LoD |
| FluBlo FluAhi | 3X LoD |
| SARS-CoV-2lo FluAlo FluBlo | 3X LoD |
| SARS-CoV-2lo FluAhi | 4X LoD |
| FluAloSARS-CoV-2hi | 4X LoD |
实例8：检测限
本研究的目的是确定用于96孔实时PCR平台的SARS-CoV-2、A型流感、B型流感、RSVA和RSV B的检测限(LoD)。实验使用靶向SARS-CoV-2的S蛋白和N蛋白的引物。靶向S蛋白区域的引物是SEQ ID NO:100和337，具有SEQ ID NO:864的相关联的探针。靶向N蛋白区域的引物是SEQ ID NO:211和510，具有SEQ ID NO:833的相关联的探针。LoD将被确定为在至少95％的时间可以检测到的每种病毒的基因组拷贝当量(GCE)的最低数量(浓度)。
通过COVID/Flu/RSV测试检测到的每种病毒的单独的LoD是使用人为设计的试样确定的，这些试样包含灭活的SARS-CoV-2病毒和活的A型和B型流感病毒，以及以不同水平掺入到汇合的鼻咽(NP)拭子标本中的呼吸道合胞病毒。灭活的SARS-CoV-2病毒获自BEIResources(PN NR-52287,LN 70033322)。从ZeptoMetrix获得两个活的A型流感病毒的毒株(分别被称为Perth和Brisbane)：A型流感H3N2(毒株A/Perth/16/2009；PN 0810251CF,LN313219)和A型流感H1N1(毒株A/Brisbane/59/2007；PN 0810244CF,LN 323919)。从ZeptoMetrix获得两个活的B型流感病毒的毒株(分别被称为Florida和Wisconsin)：B型流感Yamagata谱系(毒株B/Florida/04/2006；PN 0810255CF,LN 312479)和B型流感Victoria谱系(毒株B/Wisconsin/01/2010；PN 0810241CF,LN 324993)。从ZeptoMetrix获得一个RSVA病毒的毒株(PN 0810040ACF,LN 324695)。从ZeptoMetrix获得一个RSV B病毒的毒株(PN0810480CF,LN 322742)。通过dPCR来确定贮备材料的定量GCE/mL值，并且基于此信息适当地调配稀释液。
使用MagMAX病毒/病原体II核酸分离试剂盒和KingFisher Flex系统进行样本提取。在Applied Biosystem 7500快速实时PCR仪器上使用COVID/Flu/RSV测试和TaqPath 1步多重主混合物(无ROX)对样本进行测试。该研究分三个阶段进行：在研究的阶段I中确定初步LoD，在阶段II中确定精细化的LoD，并且在阶段III中确认LoD。在阶段I中，从样本提取开始，通过使用六种水平的已知GCE对人为设计的样本进行测试来确定初步LoD。在每个GCE水平使用三个重复的人为设计的样本进行初步LoD测试。在确定初步LoD之后，阶段II在初步LoD处、低于初步LoD和高于初步LoD每五个水平使用五个重复试样细化LoD，并且阶段III在20个重复样本中以至少95％的检出率确认LoD。
测试是在制造商推荐的用于KingFisher Flex和实时PCR仪器的条件下进行的。室温步骤在实验室中进行，其中温度在15℃和30℃之间。
所有剩余的非寡核苷酸试剂(例如，主混合物、水、dNTP等)均从TaqPathTM COVID-19Combo试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录号A47814)获得并且根据随其提供的方案进行RT-PCR。
程序
准备了至少175mL的NP试样池，并为五种病毒平均分配；对于整个研究阶段使用相同的每种病毒池。
获得灭活的SARS-CoV-2病毒，并在根据表26提取前在核酸稀释溶液(NADS)或VTM中稀释；每种稀释液都轻轻而彻底地混合。为了防止交叉污染，在进行中间稀释后和在开始LoD稀释之前更换手套。下表中的计算基于1.75×109GCE/mL(2.8×109TCID50/mL)的储备浓度；如果灭活的SARS-CoV-2病毒未以该浓度配制，则修改计算以产生以下浓度。
表26.
| 稀释液ID | 最终浓度病毒 | 病毒储库的体积 | 稀释剂的体积 | NP池的体积 |
| 中间体1 | 5.0×107GCE/mL | 2.0μL的储库 | 68.0μL | -- |
| 中间体2 | 5.0×105GCE/mL | 10μL的中间体1 | 990μL | -- |
| 中间体3 | 5.0×103GCE/mL | 20μL的中间体2 | 1980μL | -- |
| 1 | 2.5×103GCE/mL | 1500μL的中间体3 | -- | 1500μL |
| 2 | 1.25×103GCE/mL | 1500μL的稀释液1 | -- | 1500μL |
| 3 | 5.0×102GCE/mL | 1200μL的稀释液2 | -- | 1800μL |
| 4 | 2.5×102GCE/mL | 1500μL的稀释液3 | -- | 1500μL |
| 5 | 100GCE/mL | 1200μL的稀释液4 | -- | 1800μL |
| 6 | 50GCE/mL | 1500μL的稀释液5 | -- | 1500μL |
| 7 | 0GCE/mL | -- | -- | 1500μL |
获得活的RSV A、RSV B、Flu A和Flu B病毒，并通过数字PCR对病毒基因组RNA进行定量。基于通过数字PCR确定的浓度，将活的RSV A、RSV B、Flu A病毒和Flu B病毒稀释至相同的浓度。NADS或VTM被用作病毒稀释剂。
LoD阶段I
每个测试水平包括至少三次重复提取。初步LoD是所有三次提取重复产生阳性的结果的最低浓度。
使用步骤12.2和12.3中制备的试样，从制备的试样中以一式三份提取人为设计的样本，并在7500快速平台上通过RT-qPCR进行测试。初步LoD被计算为所有三次提取重复产生阳性的结果的最低浓度(最高测试水平ID)。
在7500快速实时PCR仪器上，SARS-CoV-2的初步LoD在阶段I中被确定为50GCE/mL，Flu A(Perth)的初步LoD在阶段I中被确定为250GCE/mL，Flu A(Brisbane)的初步LoD在阶段I中被确定为384GCE/mL，Flu B(Florida)的初步LoD在阶段I中被确定为500GCE/mL，FluB(Wisconsin)的初步LoD在阶段I中被确定为250GCE/mL，RSV A的初步LoD在阶段I中被确定为50GCE/mL，并且RSV B的初步LoD在阶段I中被确定为250GCE/mL。
LoD阶段II
每个测试水平包括至少五次重复提取。精细化的LoD是所有五次提取重复产生阳性的结果的最低浓度。
将人为设计的样本制备至下表27中的水平，每个测试水平至少重复五次。配制与待测试的浓度兼容的病毒稀释液，并在7500快速平台上通过RT-qPCR提取和测试人为设计的样本。将每种病毒的精细化的LoD计算为所有五次提取重复产生阳性的结果的最低浓度(最高测试水平ID)。
表27.
| 测试水平ID | 最终浓度病毒 | 复制品 |
| 1 | 3X初步LoD | 5 |
| 2 | 2X初步LoD | 5 |
| 3 | 初步LoD | 5 |
| 4 | 0.5X初步LoD | 5 |
| 5 | 0.33X初步LoD | 5 |
| 6 | 0GCE | 5 |
在7500快速实时PCR仪器上，SARS-CoV-2的精细化的LoD在阶段II中被确定为50GCE/mL，Flu A(Perth)的精细化的LoD在阶段II中被确定为250GCE/mL，Flu A(Brisbane)的精细化的LoD在阶段II中被确定为768GCE/mL，Flu B(Florida)的精细化的LoD在阶段II中被确定为1000GCE/mL，Flu B(Wisconsin)的精细化的LoD在阶段II中被确定为250GCE/mL，RSV A的精细化的LoD在阶段II中被确定为150GCE/mL，并且RSV B的精细化的LoD在阶段II中被确定为200GCE/mL。
LoD阶段III
在阶段II中确定的精细化的LoD通过至少20次重复提取被确认。如果20次提取重复中至少有19次产生阳性的结果，则确认LoD。
将人为设计的样本制备至下表28中的水平，每个测试水平至少重复二十次。配制与待测试的浓度兼容的病毒稀释液，并在7500快速平台上通过RT-qPCR提取和测试人为设计的样本。如果至少95％的提取重复产生阳性的结果，则确认每个试样的LoD。如果对于五种病毒中的任何一种都未确认LoD，则对该病毒以更高的浓度重复阶段III。
表28.
| 测试水平ID | 最终浓度病毒 | 复制品 |
| 1 | 精细化的LoD | 20 |
| 2 | 0GCE | 1 |
在7500快速实时PCR仪器上，在阶段III中确定的SARS-CoV-2的确认的LoD为50GCE/mL，在阶段III中确定的Flu A(Perth)的确认的LoD为350GCE/mL，在阶段III中确定的Flu A(Brisbane)的确认的LoD为384GCE/mL，在阶段III中确定的Flu B(Florida)的确认的LoD为1250GCE/mL，在阶段III中确定的Flu B(Wisconsin)的确认的LoD为350GCE/mL，在阶段III中确定的RSV A的确认的LoD为200GCE/mL，并且在阶段III中确定的RSV B的确认的LoD为200GCE/mL。
TaqPath COVID-19、Flu A/Flu B、RSV Combo试剂盒(COVID/Flu/RSV测试)的LoD是使用7500快速实时PCR仪器(例如，7500快速Dx用于96孔板，使用17.5μL的反应体积输入，并且QS7 Flex用于384孔板，使用14μL的反应体积输入)建立的；结果总结在下面的表29中。
表29.检测限(LoD)的汇总工作流
实例9：SARS-CoV-2快速PCR测定
将原始唾液样本在95℃水浴中加热30分钟，然后允许平衡至室温。以最大速度涡旋每个热处理的样本持续10秒或直到样本看起来均匀。将100μL的每个经加热的处理的唾液样本转移至其中制备有100μL的TBE-T混合物的96孔板的各个孔中。TBE-T混合物包括50μL的TBE缓冲液和50μL的吐温-20洗涤剂。通过轻轻移液混合每个孔。在RT-PCR之前的任何储存都在4℃或在冰上进行长达2小时。
将表30中的组分组合以制成对于反应总数加上10％过量的RT-PCR反应混合物(分别使用从赛默飞世尔科技公司以目录号A47701和956125获得的多重试剂和对照试剂)。
表30.RT-qPCR反应混合物
将反应混合物涡旋约10–30秒并短暂离心。对于每个反应，将下表31中的组分在MicroAmp光学384孔反应板(0.2mL/孔)中组合：
表31.RT-qPCR反应
该板用MicroAmp光学粘合膜密封并短暂涡旋以混合内容物。将板短暂离心以收集孔的底部处的内容物。将板加载到7500实时PCR仪器中并运行表32中的方案。
表32.用于多病原体多重测定的RT-qPCR方案
在Applied Biosystems qPCR仪器上使用基线阈值算法和手动阈值设置来确定适当的分析参数以计算Ct值。使用该算法，存在影响Ct值的两个主要的分析设置—基线和阈值。基线是为每条扩增曲线单独设置的，并且定义了检测到的基线显著荧光信号的区域，这可以有助于在早期循环期间归一化背景噪声的孔间差异。使用起始循环为5的自动基线最初用于TaqCheckSARS-CoV-2快速PCR测定。
一旦建立了主要分析设置，就为样本和对照的每个靶标定义Ct截止值。使用没有模板对照和其他阴性对照生成的数据来评估截止值，以排除虚假扩增，例如从环境引入的污染。还在评估测定的动态范围的数据的背景下评估了截止值。例如，可接受的Ct截止值排除NTC中的背景污染，同时在验证的动态范围内捕获真正的扩增。
第一个实验确定了背景荧光信号的最大水平，因此确定了可以设置ΔRn阈值的最低水平。本实验包括在8个不同QuantStudio 5仪器上在4个角孔和384孔板中心的4个孔中运行来自SARS-CoV-2的单扩增孔体外转录的RNA(1×107个拷贝/孔)和人通用人参考RNA(1mg)。
第二个实验评估了RNAse P Ct值的可变性以及抑制对qPCR扩增的整体强度的实际影响，因此可以设置多高的ΔRn阈值。该实验是使用冷冻的阴性唾液样本(一式三份)并以10,000GCE/mL掺入灭活的病毒的稀释液来完成的。
最后的实验建立了测定靶标的ΔRn和Ct截止值。这是通过在3个不同的实验室地点运行总共8个384孔NTC板以确定不同实验室之间RNase P背景信号的可变性并建立该测定的Ct截止设置来实现的。在实验室之间存在固有的可变性，因为人类细胞虽然无处不在，但在不同的实验室之间以不同的水平存在。
结果：一旦收集了数据，就在不同的循环中绘制RNase P存在和不存在的代表性样本的ΔRn，以确定将存在RNase P与不存在RNase P的样本分开的初步Ct截止值和阈值。初步实验表明，样本的RNase P的32的Ct截止值提供了分析灵敏度并防止由于样本不足而导致的错误调用。基于这些实验，在无模板对照(NTC)和阳性对照(PC)中为RNase P选择35的Ct截止值以控制RNase P污染，因为这些对照不应包含人类基因组材料。初步实验进一步表明，SARS-CoV-2的37的Ct截止值提供了分析灵敏度，同时解决低水平的SARS-CoV-2污染。重要的是要注意，高水平的污染(例如来自交叉污染事件)很难通过阈值和Ct截止值来解决—应在实验室SOP中实施最佳实践以防止污染。
在下表33中提供了鉴定的阈值和Ct截止值的总结。
表33.
| 靶标 | 样本类型 | 阈值(ΔRn) | Ct截止值 |
| RNase P | 样本 | 0.2 | 32 |
| SARS-CoV-2 | 样本，NTC | 0.1 | 37 |
| RNase P | PC,NTC | 0.2 | 35 |
| SARS-CoV-2 | PC | 0.1 | 37 |
基于前述，对样本(如下表34中所述)以及NTC和PC(如下表35中所述)应用二次分析Ct截止值。
表34.
表35.
为了确定分析灵敏度，进行了实验以确定每毫升的基因组拷贝数当量(GCE/mL)，其中检测到超过95％的预期存在样本。γ辐照的病毒被掺入到SARS-CoV-2阴性唾液样本中。然后如在TaqCheckTMSARS-CoV-2快速PCR测定快速参考指南中所述制备样本，并通过RT-PCR进行分析。基于确定的阈值和本文包含的Ct截止值分析的来自代表性实验的数据在表36中呈现。基于实验的结果，分析灵敏度被确定为6,000GCE/mL。
表36.
| 拷贝(GCE/mL) | 复制品# | 检测到的阳性样本数 | 阳性％ |
| 1000 | 92 | 46 | 50％ |
| 3320 | 96 | 87 | 91％ |
| 4000 | 300 | 192 | 64％ |
| 6000 | 80 | 79 | 99％ |
| 6680 | 96 | 93 | 97％ |
| 9000 | 60 | 60 | 100％ |
| 10000 | 280 | 274 | 98％ |
| 12000 | 60 | 60 | 100％ |
| 20000 | 161 | 161 | 100％ |
实例10：生物样本中SARS-CoV-2的变体的区分
在一些实施例中，所公开的引物和探针所具有的一个固有优势是能够区分含有‘正常’或‘参考’版本的SARS-nCoV-2的患者样本(如在GenBank登记号:MN908947.3中所举例说明的)和被某些病毒变体(特别是涉及缺失由S基因编码的刺突蛋白的氨基酸残基69和/或70的变体)感染的患者样本。因此，所公开的引物和探针可以用于快速和廉价地确定某些SARS-CoV-2变体在患者摄入或分诊期间是否可能存在于临床样本中。对三个病毒靶序列(N、S和ORF1ab)中的两个测试呈阳性的样本最初被归类为阳性，并且使用更广泛和更昂贵的确认方法(如病毒基因组的测序)进行进一步评估。如文献中所报道的，此类引物和探针已经被英国的卫生机构广泛用于获得B.1.1.7变体是否存在于患者体内的初步指示。
参见，例如，英国公共卫生部(Public Health England)，技术简报1(TechnicalBriefing 1)，新型SARS-COV-2变体研究，值得关注的变体(nvestigation of NovelSARS-CoV-2Variant,Variant of Concern)202012/01，可在https://assets.publishing.serv ice.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_data/file/959438/ Technical_Briefing_VOC_SH_NJL2_SH2.pdf获得。
作为实例，对通过鼻咽拭子、鼻咽抽吸物或支气管肺泡灌洗从人类采集的样本进行测试，以确定是否可能存在SARS-CoV-2的某些变体。使用MagMAX病毒/病原体核酸分离试剂盒(由赛默飞世尔科技公司以目录号A42356出售)，根据随其提供的说明来分离来自患者样本的病毒DNA。
然后使用下面指定的示例性引物和探针并使用来自TaqPath COVID-19Combo试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录号A47814)的主混合物和其他通用组分，根据随其提供的方案对样本进行多重扩增。在QuantStudio 7500(赛默飞世尔科技公司)上进行扩增，并且分别使用VIC、ABY和FAM探针标记来监测N、S和ORF1ab靶序列的扩增，而使用JUN探针标记来监测阳性对照(MS2)。
表37.
| FOR引物 | REV引物 | 探针 | |
| ORF1ab | SEQ ID NO:160 | SEQ ID NO:468 | SEQ ID NO:1049 |
| S | SEQ ID NO:100 | SEQ ID NO:337 | SEQ ID NO:864 |
| N | SEQ ID NO:211 | SEQ ID NO:510(mod) | SEQ ID NO:833 |
使用由赛默飞世尔科技公司发布的COVID解释软件来分析所得的数据。对于每个板，确认对照反应以按预期进行(即，无模板对照具有未确定的Ct值，并且阳性对照具有小于或等于30的Ct值)。
病毒样本的Ct截止值被设置为37。如果确定了N、S和ORF1ab靶序列中的每一个的Ct值，则该样本被称为对靶序列是阳性的，其中该靶序列的Ct值等于或小于37。在几个样本中，对于N和ORF1ab基因靶序列，结果是阳性的，但对于S基因靶序列，结果是阴性的。
对两个或更多个SARS-CoV-2靶序列测试呈阳性的样本被归类为具有有效结果；卫生当局建议对三个SARS-CoV-2靶序列中的两个仅显示阳性的那些样本进行进一步测试。这些通常但不一定可以包括对N和ORF1ab基因靶序列均测试为阳性而对S基因靶序列测试为阴性的样本。
结论
在不背离其精神或基本特征的情况下，本公开内容可以以其他具体形式实施。所描述的实施方式在所有方面都应被视为只是例示性的而不是限制性的。因此，本发明的范围是由所附的权利要求而不是由上述描述来表示。尽管为了例示本公开的实施例的目的，某些实施例和细节已经被包括在本文和所附的公开内容中，但对于本领域的技术人员来说显然的是，可以在不偏离本公开内容或本发明的范围的情况下对本文公开的方法、产品、装置和设备进行各种改变。因此，尽管本文已经公开了各种方面和实施方式，但也考虑到了其他方面和实施方式。落入权利要求书的等效方案的含义和范围内的所有改变都将涵盖在权利要求书的范围内。
随后的项目是优选的实施例的列表：
1.一种用于核酸样本中SARS-CoV-2的方法，其包含：
(a)产生含有核酸样本、正向引物和反向引物的反应混合物；和
(b)使所述反应混合物经受适合进行聚合酶链式反应(PCR)的反应条件。
2.根据项目1所述的方法，其进一步包括通过PCR产生一种或多种扩增子。
3.根据项目1或项目2所述的方法，其中所述反应混合物进一步包括含有荧光报告物和相应淬灭剂的探针。
4.根据项目1至3中任一项目所述的方法，其进一步包括监测在PCR期间产生的荧光。
5.根据任何前述项目所述的方法，其进一步包括确定样本中存在的核酸的量。
6.根据任何前述项目所述的方法，其中所述正向引物和所述反向引物结合至冠状病毒基因组的区域，其中SARS-CoV-2和bat-SL-CoVZC45之间的区域的同源性小于50％、20％、10％或5％。
7.根据项目6所述的方法，其中所述区域在SARS-CoV-2基因组的ORF1ab基因、S蛋白基因或N蛋白基因内。
8.根据任何前述项目所述的方法，其中所述正向引物选自SEQ ID NO:4-SEQ IDNO:251。
9.根据任何前述项目所述的方法，其中反向引物选自SEQ ID NO:267-SEQ ID NO:504。
10.根据任何前述项目所述的方法，其中所述探针序列选自SEQ ID NO:520-SEQID NO:1295。
11.根据项目3至10中任一项目所述的方法，其中所述探针在5'端用选自6FAM、ABY、VIC、JUN和FAM的染料标记。
12.根据项目11所述的方法，其中所述探针在3'端用选自QSY、BHQ(黑洞淬灭剂(Black Hole Quencher))和DFQ(暗荧光淬灭剂(Dark Fluorescent Quencher))的淬灭剂标记。
13.根据任何前述项目所述的方法，其中阳性对照和阴性对照连同所述样本一起分析。
14.根据项目13所述的方法，其中所述阳性对照的核酸模板是合成质粒，所述合成质粒包含来自SARS-CoV-2ORF1ab基因、SARS-CoV-2S蛋白基因、SARS-CoV-2N蛋白基因和/或人RNase P基因的序列。
15.一种用于检测来自核酸样本的SARS-CoV-2的存在的组合物，其包含含有靶区域的核酸序列的核酸引物和/或探针，所述核酸引物和/或探针包含EQ ID NO:4-SEQ IDNO:251、SEQ ID NO:267-SEQ ID NO:504以及SEQ ID NO:520-SEQ ID NO:1295内的引物和/或探针。
16.根据项目15所述的组合物，其中所述核酸引物是第一正向引物，所述第一正向引物被配置为与SARS-CoV-2病毒RNA基因组中第一靶区域内的第一靶序列的一端杂交，或与所述第一靶序列的互补序列杂交。
17.根据项目15或16所述的组合物，其中所述靶区域的所述核酸序列是SEQ IDNO:1。
18.根据项目15或16所述的组合物，其中所述靶区域的所述核酸序列是SEQ IDNO:2。
19.根据项目15或16所述的组合物，其中所述靶区域的所述核酸序列是SEQ IDNO:3。
20.根据项目15至19中任一项目所述的组合物，其进一步包括第一反向引物，所述第一反向引物被配置为与所述第一靶序列或其互补序列的另一端杂交。
21.根据项目15至20中任一项目所述的组合物，其进一步包括核酸样本、聚合酶、缓冲液和dNTP。
22.根据项目15至21中任一项目所述的组合物，其进一步包括含有可检测标记的第一探针。
23.根据项目22所述的组合物，其中所述可检测标记是荧光标记并且所述第一探针进一步包括淬灭所述荧光标记的淬灭剂。
24.根据项目22或项目23所述的组合物，其中所述第一探针被配置为与第一靶子序列杂交或者与所述第一靶序列或其DNA拷贝的互补序列杂交，所述第一靶子序列与所述第一靶序列、其DNA拷贝内的至少10个连续核苷酸互补或相同。
25.一种用于扩增SARS-CoV-2基因组中的一个或多个靶序列的组合物，其包含：第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物和所述第一反向引物被配置为扩增存在于SARS-CoV-2基因组的第一靶区域中的第一靶序列，其中所述第一靶序列包括所述第一靶区域的至少10个连续核苷酸，所述第一靶区域与bat-SL-CoVZC45中的类似区域具有小于50％、40％、30％、20％或10％的同一性。
26.根据项目25所述的组合物，其中所述第一正向引物和所述第一反向引物被配置为与第一靶序列的不同末端、其DNA拷贝或其相应的互补序列杂交，并在其间形成扩增子。
27.根据项目25或项目26所述的组合物，其中所述第一靶区域的所述核酸序列是SEQ ID NO:1。
28.根据项目25或项目26所述的组合物，其中所述第一靶区域的所述核酸序列是SEQ ID NO:2。
29.根据项目25或项目26所述的组合物，其中所述第一靶区域的所述核酸序列是SEQ ID NO:3。
30.根据项目25至29中任一项目所述的组合物，其进一步包括核酸样本、聚合酶、缓冲液和dNTP。
31.根据项目25至30中任一项目所述的组合物，其进一步包括含有可检测标记的第一探针。
32.根据项目31所述的组合物，其中所述可检测标记是荧光标记并且所述第一探针进行包括淬灭所述荧光标记的淬灭剂。
33.根据项目31或32所述的组合物，其中所述第一探针被配置成与第一靶子序列、其DNA拷贝或它们相应的互补序列杂交，所述第一靶子序列与所述第一靶序列的至少10个连续核苷酸互补或相同。
34.根据项目33所述的组合物，其进一步包括第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物和所述第二反向引物被配置为扩增SARS-CoV-2基因组的第二靶区域内的第二靶序列。
35.根据项目34所述的组合物，其中所述第二正向引物和所述第二反向引物被配置为结合至所述第二靶序列的不同末端或其cDNA互补序列。
36.根据项目34或35所述的组合物，其中所述第一靶区域和所述第二靶区域的核酸序列不同并且选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
37.根据项目36所述的组合物，其进一步包括第三正向引物和第三反向引物，所述第三正向引物和所述第三反向引物被配置为扩增SARS-CoV-2基因组的第三靶区域内的第三靶序列。
38.根据项目37所述的组合物，其中所述第三正向引物和所述第三反向引物被配置为结合至所述第三靶序列的不同末端或其DNA拷贝或DNA互补序列。
39.根据项目38所述的组合物，其中所述第一靶区域、所述第二靶区域和所述第三靶区域的所述核酸序列不同并且选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
40.根据项目26至39中任一项目所述的组合物，其中对所述第一靶序列特异性的引物序列选自SEQ ID NO:4、320、34、423、160和468。
41.根据项目34至40中任一项目所述的组合物，其中对所述第二靶序列特异性的引物序列选自SEQ ID NO:5、441、100和337。
42.根据项目37至41中任一项目所述的组合物，其中对所述第三靶序列特异性的引物序列选自SEQ ID NO:248、487、211和501。
43.一种组合物，可在检测样本中的SARS-CoV-2核酸、A型流感(Flu)和/或B型流感(Flu)核酸和/或呼吸道合胞病毒(RSV)核酸的反应中用作扩增对照，所述组合物包含线性或环状核酸分子，所述核酸分子以任何顺序包括至少一个源自SARS-CoV-2的N基因的靶序列、至少一个源自SARS-CoV-2的S基因的另外的靶序列，以及任选地至少一个源自SARS-CoV-2的ORF1ab基因的靶序列。
44.一种用于检测样本中的SARS-CoV-2核酸、A型流感(Flu)和/或B型流感(Flu)核酸和/或呼吸道合胞病毒(RSV)核酸的试剂盒，其包含项目15至43中任一项所述的组合物，或其任何组合。
45.根据项目44所述的试剂盒，其进一步包括PCR主混合物。
46.根据项目45所述的试剂盒，其中所述主混合物是TaqMan快速病毒1步主混合物或TaqPath 1步RT-qPCR主混合物，CG。
47.根据项目44至46中任一项目所述的试剂盒，其中所述组分中的至少一种是干燥的或冷冻干燥的。
48.根据项目44至47中任一项目所述的试剂盒，其进一步包括qPCR测定的阵列，每个qPCR测定位于所述阵列的不同基因座。
49.根据项目48所述的试剂盒，其中所述不同基因座包括在所述阵列的表面上形成的孔、通道、凹槽、空腔、位点或特征。
50.一种检测样本中存在的SARS-CoV-2病毒核酸的方法，其包含：
(a)提供根据项目15至43中任一项目所述的组合物；
(b)通过以任何顺序或组合使所述组合物与聚合酶、dNTP和从取自生物体的身体组织获得的核酸样本接触来形成反应体积；和
(c)在所述反应体积中形成一种或多种含有扩增的SARS-CoV-2序列的扩增产物，其中所述形成包括使所述反应体积经受适于在扩增之前从所述核酸样本中存在的SARS-CoV-2核酸扩增靶SARS-CoV-2序列的扩增条件。
51.根据项目50所述的方法，其进一步包括在形成步骤期间或之后检测扩增产物中的至少一种。
52.根据项目50或51所述的方法，其进一步包括诊断生物体内的SARS-CoV-2感染。
53.根据项目50至52中任一项目的方法，其中所述生物体是人类受试者并且所述核酸样本来源于SARS-CoV-2。
54.根据项目50至53中任一项目的方法，其中所述形成包括从所述核酸样本中扩增至少三种不同的且特异性的SARS-CoV-2靶序列。
55.根据项目54所述的方法，其中所述至少三种不同的三种不同的SARS-CoV-2靶序列包括一种来源于N基因的靶序列、一种来源于S基因的靶序列和一种来源于ORF1ab基因的靶序列。
56.根据项目13或项目50至54中任一项目所述的方法，其中所述阳性对照是外源性RNA序列或内源性DNA或RNA序列。
57.根据项目56所述的方法，其中所述外源性RNA序列是MS2噬菌体序列并且其中所述内源性DNA或RNA序列是人RNase P序列。
58.根据项目56或57所述的方法，其进一步包含选自外源性RNA序列和内源性核酸序列的第二阳性对照。
59.根据项目1至14或50至58中任一项目所述的方法，其中所述方法进一步包括检测所述核酸样本中来源于A型流感(Flu A)和/或B型流感(Flu B)病毒的靶序列。
60.根据项目59所述的方法，其中所述检测包含使用选自SEQ ID NO:252、SEQ IDNO:253或SEQ ID NO:257的正向引物；选自SEQ ID NO:505和SEQ ID NO:506的反向引物；和/或选自SEQ ID NO:1296和SEQ ID NO:1297的探针。
61.根据项目1至14或50至60中任一项目所述的方法，其中所述核酸样本中的SARS-CoV-2和/或Flu A和/或Flu B的检测被检测低至每个反应至少10个基因组拷贝当量(GCE/rxn)。
62.根据项目1至14或50至60中任一项目所述的方法，其中在107至10GCE/rxn的检测的线性动态范围(LDR)上检测所述核酸样本中的SARS-CoV-2和/或Flu A和/或Flu B的检测。
63.根据项目1至14或50至60中任一项目所述的方法，其中所述核酸样本中SARS-CoV-2的检测被检测低至每个反应1-10个拷贝/μL。
64.根据项目1至14或50至60中任一项目所述的方法，其中在至少5个对数的线性动态范围(LDR)上检测所述核酸样本中SARS-CoV-2的检测。
65.一种用于检测核酸样本中SARS-CoV-2和A型流感(Flu A)和/或B型流感(FluB)的存在的组合物，其包含至少两对核酸引物，每对核酸引物具有分别选自SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:257和SEQ ID NO:267-SEQ ID NO:510的正向引物和反向引物；以及任选地至少两个核酸探针，其含有选自SEQ ID NO:520-SEQ ID NO:2533中任何一个的核酸序列。
66.根据前述项目中任一项目所述的方法、试剂盒或组合物，其中所述探针是针对SARS-CoV-2的ORF1ab基因的FAM标记的探针。
67.根据前述项目中任一项目所述的方法、试剂盒或组合物，其中所述探针是针对SARS-CoV-2的N蛋白基因的VIC标记的探针。
68.根据前述项目1中任一项目所述的方法、试剂盒或组合物，其中所述探针是针对SARS-CoV-2的S蛋白基因的ABY标记的探针。
69.根据前述项目中任一项目所述的方法、试剂盒或组合物，其中所述阳性对照是MS2qPCR测定，所述MS2 qPCR测定包含针对存在于所述MS2 qPCR测定中的MS2核酸的一部分的JUN标记的探针。
70.一种用于检测核酸样本中SARS-CoV-2的方法，其包含：
(a)产生含有核酸样本、正向引物和反向引物的反应混合物；和
(b)使所述反应混合物经受适合进行环介导的等温扩增(LAMP)的反应条件。
71.根据项目1至14、50至64和66至70中任一项目所述的方法，其中所述方法包含服务点(POS)系统。
72.根据项目1至14、50至64和66至70中任一项目所述的方法，其中所述核酸样本在护理点(POC)位置收集，和/或在POC位置处的装置中进行分析。
73.根据项目71所述的方法，其中在所述POC位置处的装置被配置为在短的时间段(例如少于1-2小时)内分析小体积临床样本。
74.根据项目71或项目72所述的方法，其中所示方法在所述POC位置处的POS系统上进行。
75.根据项目71或项目72所述的方法，其中所述核酸样本在所述POC位置获得。
76.根据项目71或项目72所述的方法，其中所述方法用于在所述POC位置分析临床样本。
77.根据项目71或项目72所述的方法，其中所述POS方法包括对单个小体积临床样本或对其等分试样进行多次测定。
78.根据项目71所述的方法，其中所述POS系统在POS位置实施，并且其中所述方法在短的时间段内进行。
79.根据项目71所述的方法，其中所述方法在所述POS位置处的POS系统处实施，其中所述方法用于对单个小体积临床样本或对其等分试样进行多个测定，并且可以在短的时间段内进行。
80.根据项目78或项目79所述的方法，其中所述短的时间段小于24小时。
81.前述项目中任一项目所述的方法、试剂盒或组合物，其中所述PCR是逆转录PCR(RT-PCR)。
82.前述项目中任一项目所述的方法、试剂盒或组合物，其中正向RNase P引物包含SEQ ID NO:2552，反向RNase P引物包含SEQ ID NO:2553，和/或RNase P探针选自SEQ IDNO:2554-SEQ ID NO:2556。
83.根据项目1至14或50至64或66至82中任一项目所述的方法，其中所述方法进一步包括检测所述核酸样本内的呼吸道合胞病毒(RSV)特异性靶标。
84.根据项目83所述的方法，其中RSV的检测包含使用选自SEQ ID NO:254和SEQID NO:255的正向引物、选自SEQ ID NO:507和SEQ ID NO:508的反向引物和/或选自SEQ IDNO:1298和SEQ ID NO:1299的探针来检测A型RSV和/或B型RSV。
85.根据项目1至14或50至64或66至84中任一项目所述的方法，其中所述核酸样本中的SARS-CoV-2、Flu A和/或Flu B、和/或RSV A和/或RSV B的检测被检测到低至每个反应至少10个基因组拷贝当量(GCE/rxn)。
86.根据项目1至14或50至64或66至84中任一项目所述的方法，其中在107至10GCE/rxn的检测的线性动态范围上检测所述核酸样本中的SARS-CoV-2、Flu A和/或FluB,和/或RSV A和/或RSV B的检测。
87.根据项目1至14或50至64或66至84中任一项目所述的方法，其中所述方法进一步包括检测所述核酸样本中的A型流感(Flu A)病毒、B型流感(Flu B)病毒、A型呼吸道合胞病毒(RSV A)和/或B型呼吸道合胞病毒(RSV B)。
88.根据项目87所述的方法，其中所述SARS-CoV-2探针包含VIC染料和QSY淬灭剂，所述Flu A/B探针包含FAM染料和QSY淬灭剂，并且所述RSV A/B探针包含ABY染料和QSY淬灭剂。
89.一种如本文所公开的用于检测SARS-CoV-2的方法。
90.根据项目1至14、50至64或66至89中任一项目所述的方法，其中所述样本包含唾液样本。
91.根据项目89或项目90所述的方法，其中所述方法不包括用于从所述样本中纯化或提取含核酸部分的步骤。
92.根据项目89至91中任一项目所述的方法，其中所述样本中的SARS-CoV-2的检测是通过利用未纯化的样本作为验证性模板的核酸扩增反应进行的。
93.根据项目92所述的方法，进一步包含加热所述样本持续足以灭活所述样本中的核酸酶和/或破裂真核细胞、使病毒衣壳变性和/或破坏其中的包膜病毒粒子的膜部分的时间段。
94.根据项目89至93中任一项目所述的方法，其进一步包含将未纯化的样本加热至约80℃或高于约80℃，优选地约90℃或高于约90℃，更优选约95℃或高于约95℃的温度。
95.根据项目94所述的方法，其中将所述未纯化的样本加热持续至少5、10、15、20、25、30、35或40分钟，或加热持续由选自其中的上限和下限形成的任何时间范围。
96.根据项目90至95中任一项目所述的方法，其进一步包含将所述样本与裂解缓冲液组合。
97.根据项目93至96中任一项目所述的方法，其进一步包含在将热处理的样本与所述裂解缓冲液混合之前和/或之后混合所述热处理的样本。
98.根据项目96或97所述的方法，其中所述裂解缓冲液包含适合核酸的缓冲液和洗涤剂和/或乳化剂。
99.根据项目96至98中任一项目所述的方法，其中所述裂解缓冲液包含TBE缓冲液和聚山梨醇酯型非离子表面活性剂如吐温-20的组合。
100.根据项目89至99中任一项目所述的方法，其中所述样本包含汇合的受试者样本。
101.根据项目89至100中任一项目所述的方法，其中检测所述样本中的SARS-CoV-2发生在从接收所述样本的时间起少于约3小时内，优选地少于约2小时内。
102.一种用于检测核酸样本中SARS-CoV-2冠状病毒的方法，其包含：
(a)在95℃下加热样本持续15-45分钟，优选地约30分钟；
(b)将热处理的样本与裂解溶液混合以形成一定体积的验证性模板；
(c)产生包含至少一部分所述体积的验证性模板、一种或多种对SARS-CoV-2特异性和/或诊断性的引物和核酸聚合酶的核酸扩增反应混合物；和
(d)如果在所述样本中存在SARS-CoV-2核酸，则使核酸扩增反应混合物经受适合产生SARS-CoV-2特异性扩增子的条件。
103.根据项目102所述的方法，其进一步包含接收样本。
104.根据项目103所述的方法，其中接收所述样本包含接收样本收集装置或包含所述样本的其他容器。
105.根据项目104所述的方法，其中所述样本收集装置是可密封管。
106.根据项目103至105中任一项目所述的方法，其中在由受试者自行收集所述样本之后接收所述样本。
107.根据项目103至106中任一项目所述的方法，其中接收所述样本包含接收原始唾液样本。
108.根据项目102至107中任一项目所述的方法，其进一步包含涡旋所述热处理的样本。
109.根据项目102至108中任一项目所述的方法，其进一步包含检测扩增子，或与所述扩增子的产生相关联的一种或多种可检测标记，同时使所述核酸扩增反应混合物经受适合产生所述扩增子的条件。
110.根据项目102至108中任一项目所述的方法，其进一步包含在所述核酸扩增反应混合物经受适合于产生所述扩增子的条件后，检测所述扩增子或与所述扩增子的产生相关联的一种或多种可检测标记。
111.根据项目102至110中任一项目所述的方法，其进一步包含在将所述热处理的样本与所述裂解溶液混合之前将所述热处理的样本平衡至室温。
112.根据前述项目中任一项目所述的方法，其中所述样本是在由所述样本提供者自行收集之后接收的。
113.根据前述项目中任一项目所述的方法，其中所述样本是在由除了样本提供者之外的个体收集之后接收的。
114.根据前述项目中任一项目所述的方法，其中所述方法步骤中的一个或多个步骤使用样本收集装置进行。
115.根据项目114所述的方法，其中至少接收和加热的步骤是使用所述样本收集装置进行的。
116.根据前述项目中任一项目所述的方法，其中所述方法用于无症状测试和/或高频或广泛筛查。
117.一种用于检测病毒核酸的方法中的组合物，所述组合物包含热处理的样本。
118.根据项目117所述的组合物，其中所述热处理的样本包含热处理的原始唾液。
119.根据项目117或项目118所述的组合物，其进一步包含缓冲液。
120.根据项目119所述的组合物，其中所述缓冲液包含TBE。
121.根据项目117至120中任一项目所述的组合物，其进一步包含洗涤剂和/或乳化剂。
122.根据项目121所述的组合物，其中所述洗涤剂和/或乳化剂包含聚山梨醇酯型非离子表面活性剂。
123.根据项目117至122中任一项目所述的组合物，其进一步包含一种或多种PCR试剂。
124.根据项目123所述的组合物，其中所述一种或多种PCR试剂包含一种或多种用于扩增如本文所述的特定病毒核酸序列的引物或探针。
125.根据项目123或项目124所述的组合物，其中所述一种或多种PCR试剂包含PCR主混合物或其组分。
126.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述核酸样本来源于非人类动物。
127.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述核酸样本来源于哺乳动物。
128.根据项目127项中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒,其中所述核酸样本来源于水貂、猫、狗、雪貂、仓鼠、蝙蝠、灵长类动物，例如恒河猴、食蟹猴、黑长尾猴(grivets)和普通狨猴、动物园动物、实验室动物或农场动物。
129.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第一靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列选自SEQ ID NO:248和487，或211和501。
130.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第二靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列选自SEQ ID NO:5和441，或100和337。
131.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第三靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列选自SEQ ID NO:4和320，或34和423，或160和468。
132.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第一靶序列、第二靶序列和/或第三靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列是：
SEQ ID NO:4和320、SEQ ID NO:5和441和/或SEQ ID NO:248和487；
SEQ ID NO:34和423、SEQ ID NO:5和441和/或SEQ ID NO:248和487；
SEQ ID NO:160和468、SEQ ID NO:5和441和/或SEQ ID NO:248和487；
SEQ ID NO:4和320、SEQ ID NO:100和337和/或SEQ ID NO:248和487；
SEQ ID NO:34和423、SEQ ID NO:100和337和/或SEQ ID NO:248和487；
SEQ ID NO:160和468、SEQ ID NO:100和337以及SEQ ID NO:248和487；
SEQ ID NO:4和320、SEQ ID NO:5和441以及SEQ ID NO:211和501；
SEQ ID NO:34和423、SEQ ID NO:5和441以及SEQ ID NO:211和501；
SEQ ID NO:160和468、SEQ ID NO:5和441以及SEQ ID NO:211和501；
SEQ ID NO:4和320、SEQ ID NO:100和337以及SEQ ID NO:211和501；
SEQ ID NO:34和423、SEQ ID NO:100和337以及SEQ ID NO:211和501；或
SEQ ID NO 160和468、SEQ ID NO:100和337以及SEQ ID NO:211和501。
133.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述探针选自由SEQ ID NO:565、599、971、930、1160、1106、1203、1049、864和/或833组成的组。
134.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第一靶序列、第二靶序列或第三靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列中的任何一个是SEQ ID NO:248。
135.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第一靶序列、第二靶序列或第三靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列中的任何一个是SEQ ID NO:487。
136.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第一靶序列、第二靶序列或第三靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列中的任何一个是SEQ ID NO:211。
137.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第一靶序列、第二靶序列或第三靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列中的任何一个是SEQ ID NO:501。
138.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第一靶序列、第二靶序列或第三靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列中的任何一个是SEQ ID NO:5。
139.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第一靶序列、第二靶序列或第三靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列中的任何一个是SEQ ID NO:441。
140.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第一靶序列、第二靶序列或第三靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列中的任何一个是SEQ ID NO:100。
141.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第一靶序列、第二靶序列或第三靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列中的任何一个是SEQ ID NO:337。
142.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第一靶序列、第二靶序列或第三靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列中的任何一个是SEQ ID NO:160。
143.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第一靶序列、第二靶序列或第三靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列中的任何一个是SEQ ID NO:468。
144.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第一靶序列、第二靶序列或第三靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列中的任何一个是SEQ ID NO:4。
145.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述探针是SEQID NO:565。
146.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述探针是SEQID NO:599。
147.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述探针是SEQID NO:971。
148.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述探针是SEQID NO:930。
149.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述探针是SEQID NO:1160。
150.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述探针是SEQID NO:1106。
151.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述探针是SEQID NO:1203。
152.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述探针是SEQID NO:1049。
153.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述探针是SEQID NO:864。
154.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述探针是SEQID NO:833。
155.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第一靶序列、第二靶序列或第三靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列中的任何一个是SEQ ID NO:320。
156.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第一靶序列、第二靶序列或第三靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列中的任何一个是SEQ ID NO:34。
157.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其中对所述第一靶序列、第二靶序列或第三靶序列特异性的所述反向引物序列和正向引物序列中的任何一个是SEQ ID NO:423。
158.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其包含SEQ ID NO:160的第一正向引物和SEQ ID NO:468的第一反向引物。
159.根据项目134所述的方法、组合物或试剂盒，其进一步包含SEQ ID NO:1049的探针。
160.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其包含SEQ ID NO:100的第二正向引物和SEQ ID NO:337的第二反向引物。
161.根据项目136所述的方法、组合物或试剂盒，其进一步包含SEQ ID NO:864的探针。
162.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，其包含SEQ ID NO:211的第三正向引物和SEQ ID NO:501和/或510的第三反向引物。
163.根据项目138所述的方法、组合物或试剂盒，其进一步包含SEQ ID NO:833的探针。
164.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，可用于扩增和/或检测SARS-CoV-2的ORF1ab基因的区域，其包含：SEQ ID NO:160的正向引物，SEQ ID NO:468的反向引物，和SEQ ID NO:1049的探针。
165.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，可用于扩增和/或检测SARS-CoV-2的S基因的区域，其包含：SEQ ID NO:100的正向引物，SEQ ID NO:337的反向引物，和SEQ ID NO:864的探针。
166.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，可用于扩增和/或检测SARS-CoV-2的N基因的区域，其包含：SEQ ID NO:211的正向引物，SEQ ID NO:501的反向引物，和SEQ ID NO:833的探针。
167.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，可用于扩增和/或检测SARS-CoV-2的N基因的区域，其包含：SEQ ID NO:211的正向引物，SEQ ID NO:510的反向引物，和SEQ ID NO:833的探针。
168.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，可用于多重检测来源于SARS-CoV-2的S基因和N基因的靶序列，其包含：
(i)SEQ ID NO:211的第一正向引物、SEQ ID NO:501的第一反向引物和SEQ IDNO:833的第一探针；和
(ii)SEQ ID NO:100的第二正向引物、SEQ ID NO:337的第二反向引物和SEQ IDNO:864的第二探针。
169.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，可用于多重检测来源于SARS-CoV-2的S基因和N基因的靶序列，其包含：
(i)SEQ ID NO:211的第一正向引物、SEQ ID NO:510的第一反向引物和SEQ IDNO:833的第一探针；和
(ii)SEQ ID NO:100的第二正向引物、SEQ ID NO:337的第二反向引物和SEQ IDNO:864的第二探针。
170.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，可用于多重检测来源于SARS-CoV-2的S基因、N基因和ORF1ab基因的靶序列，其包含：
(i)SEQ ID NO:160的第一正向引物、SEQ ID NO:468的第一反向引物和SEQ IDNO:1049的第一探针；
(ii)SEQ ID NO:100的第二正向引物、SEQ ID NO:337的第二反向引物和SEQ IDNO:864的第二探针；和
(iii)aSEQ ID NO:211的第三正向引物、SEQ ID NO:501的第三反向引物和SEQ IDNO:833的第三探针。
171.根据前述项目中任一项目所述的方法、组合物或试剂盒，可用于多重检测来源于SARS-CoV-2的S基因、N基因和ORF1ab基因的靶序列，其包含：
(i)SEQ ID NO:160的第一正向引物、SEQ ID NO:468的第一反向引物和SEQ IDNO:1049的第一探针；
(ii)SEQ ID NO:100的第二正向引物、SEQ ID NO:337的第二反向引物和SEQ IDNO:864的第二探针；和
(iii)SEQ ID NO:211的第三正向引物、SEQ ID NO:510的第三反向引物和SEQ IDNO:833的第三探针。
172.根据前述项目中任一项目所述的组合物或试剂盒，其进一步包含选自SEQ IDNO:252、253或257的引物。
173.根据前述项目中任一项目所述的组合物或试剂盒，其进一步包含选自SEQ IDNO:505和506的引物。
174.根据前述项目中任一项目所述的组合物或试剂盒，其进一步包含选自SEQ IDNO:1296和1297的探针。
175.根据前述项目中任一项目所述的组合物或试剂盒，其进一步包含选自SEQ IDNO:254和255的引物。
176.根据前述项目中任一项目所述的组合物或试剂盒，其进一步包含选自SEQ IDNO:507和508的引物。
177.根据前述项目中任一项目所述的组合物或试剂盒，其进一步包含选自SEQ IDNO:1298和1299的寡核苷酸。
178.根据前述项目中任一项目所述的组合物或试剂盒，其进一步包含选自SEQ IDNO:2552和2553的寡核苷酸。
179.根据前述项目中任一项目所述的组合物或试剂盒，其进一步包含选自SEQ IDNO:2554、2555和2556的寡核苷酸。
180.根据前述项目中任一项目所述的组合物或试剂盒，其进一步包含一种或多种选自SEQ ID NO:256、509和1300的寡核苷酸。
181.根据前述项目中任一项目所述的组合物或试剂盒，其中所述引物和探针中的任何一种或多种包括荧光染料标记。
182.根据前述项目中任一项目所述的组合物或试剂盒，其中所述引物和探针中的任何一种或多种包括选自由以下组成的组的荧光染料标记：VIC、ABY、FAM和JUN。
183.一种用于使用前述项目中任一项目所述的组合物或试剂盒的方法，其包含使用所述组合物或试剂盒扩增靶序列；和检测所述靶序列。
184.根据项目183所述的方法，其进一步包括确定生物样本是否包括来自病毒的DNA或RNA。
185.根据项目184所述的方法，其进一步包括诊断所述生物样本来源的受试者中的病毒感染。
186.根据项目185所述的方法，其进一步包括诊断所述生物样本来源的受试者中的特定病毒感染。
187.根据项目183至186中任一项目所述的方法，其进一步包括排除所述生物样本来源的受试者中的特定病毒感染。
188.一种用于检测核酸样本中SARS-CoV-2冠状病毒的方法，其包含：
(a)产生含有所述样本、正向引物和反向引物的反应混合物；和
(b)使所述反应混合物经受适合进行聚合酶链式反应(PCR)的反应条件。
189.根据项目188所述的方法，其进一步包括通过PCR产生一种或多种扩增子。
190.根据项目188或189所述的方法，其中所述反应混合物进一步包括含有荧光报告物和相应淬灭剂的探针。
191.根据项目188至190中任一项目所述的方法，其进一步包括监测和/或检测在PCR期间产生的荧光。
192.根据项目191所述的方法，其进一步包括确定所述样本中存在的核酸的量。
193.根据项目188所述的方法，其中所述正向引物和所述反向引物结合至冠状病毒基因组的区域，其中SARS-CoV-2冠状病毒和bat-SL-CoVZC45冠状病毒之间的同源性小于50％、20％、10％或5％。
194.根据项目193所述的方法，其中在SARS-CoV-2冠状病毒和bat-SL-CoVZC45冠状病毒之间具有小于50％同源性的冠状病毒的区域在所述冠状病毒基因组的orf1ab基因、S蛋白基因或N蛋白基因内。
195.根据项目193或194所述的方法，其中所述正向引物选自SEQ ID NO.4-SEQ IDNO.251。
196.根据项目193或194所述的方法，其中所述反向引物选自SEQ ID NO.267-SEQID NO.504。
197.根据项目193或194所述的方法，其中探针序列选自SEQ ID NO.520-SEQ IDNO.1295。
198.根据项目197所述的方法，其中所述探针在5'端用选自6FAM、ABY、VIC、JUN和FAM的染料标记。
199.根据项目198所述的方法，其中所述探针在3'端用选自QSY、BHQ(黑洞淬灭剂)和DFQ(暗荧光淬灭剂)的淬灭剂标记。
200.根据项目193或194所述的方法，其中阳性对照和阴性对照连同所述样本一起分析。
201.根据项目200所述的方法，其中所述阳性对照是包含来自冠状病毒orf1ab基因、S蛋白基因、N蛋白基因和RNase P的靶标的合成质粒。
202.一种用于检测DNA样本中SARS-CoV-2的存在的组合物，其包含核酸引物，所述核酸引物含有选自包含本文公开的任何引物的组的核酸序列。
203.根据项目202所述的组合物，其中所述核酸引物是第一正向引物，所述第一正向引物被配置为与SARS-CoV-2病毒RNA基因组中的第一靶区域内的第一靶序列的一端杂交，或者与所述第一靶序列的互补序列杂交。
204.根据项目202所述的组合物，其中所述靶区域的所述核酸序列是SEQ ID NO:1。
205.根据项目202所述的组合物，其中所述靶区域的所述核酸序列是SEQ ID NO:2。
206.根据项目202所述的组合物，其中所述靶区域的所述核酸序列是SEQ ID NO:3。
207.根据项目202至206所述的组合物，其进一步包括第一反向引物，所述第一反向引物被配置为与所述第一靶序列或其互补序列的另一端杂交。
208.根据前述项目中任一项目所述的组合物，其进一步包括核酸样本、聚合酶、缓冲液和核苷酸。
209.根据项目202至208中任一项目所述的组合物，其进一步包括含有荧光或其他可检测标记的第一探针。
210.根据项目209所述的组合物，其中所述第一探针的标记是荧光标记，并且所述寡核苷酸探针进一步包括淬灭所述荧光标记的淬灭剂。
211.根据项目209或210所述的组合物，其中所述第一探针被配置为与第一靶序列杂交，或者与所述第一靶序列或其DNA拷贝的互补序列杂交，所述第一靶序列与所述第一靶序列、其DNA拷贝内的至少10个连续核苷酸互补或相同。
212.一种用于扩增SARS-CoV-2基因组中的一个或多个靶序列的组合物，其包含：第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物和所述第一反向引物被配置为扩增存在于所述SARS-CoV-2基因组的第一靶区域中的第一靶序列，其中所述第一靶序列包括所述第一靶区域的至少10个连续核苷酸，所述第一靶区域与bat-SL-CoVZC45冠状病毒和SARS-CoV-2具有小于50％、40％、30％、20％或10％的同一性。
213.根据项目212所述的组合物，其中所述第一正向引物和所述第一反向引物被配置为与第一靶序列的不同末端、其DNA拷贝或它们相应的互补序列杂交。
214.根据项目212或213所述的组合物，其中所述第一靶区域的所述核酸序列是SEQ ID NO:1。
215.根据项目212或213所述的组合物，其中所述第一靶区域的所述核酸序列是SEQ ID NO:2。
216.根据项目212或213所述的组合物，其中所述第一靶区域的所述核酸序列是SEQ ID NO:3。
217.根据项目212至217中任一项目所述的组合物，其进一步包括核酸样本、聚合酶、缓冲液和核苷酸。
218.根据项目212至217中任一项目所述的组合物，其进一步包括含有荧光或其他可检测标记的第一探针。
219.根据项目218所述的组合物，其中所述第一探针的标记是荧光标记，并且所述探针进一步包括淬灭所述荧光标记的淬灭剂。
220.根据项目218或219所述的组合物，其中所述第一探针被配置为与第一靶序列、其DNA拷贝或它们相应的互补序列杂交，所述第一靶序列与所述第一靶序列的至少10个连续核苷酸互补或相同。
221.根据项目212至220中任一项目所述的组合物，其进一步包括第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物和第二反向引物被配置为扩增所述SARS-CoV-2基因组的第二靶区域内的第二靶序列。
222.根据项目221所述的组合物，其中所述第二正向引物和所述第二反向引物被配置为结合至所述第二靶序列的不同末端或其cDNA互补序列。
223.根据项目221或222所述的组合物，其中所述第一靶区域和所述第二靶区域的所述核酸序列不同并且选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组。
224.根据项目221至223所述的组合物，其进一步包括第三正向引物和第三反向引物，所述第三正向引物和所述第三反向引物被配置为扩增所述SARS-CoV-2基因组的第三靶区域内的第三靶序列。
225.根据项目224所述的组合物，其中所述第三正向引物和所述第三反向引物被配置为结合至所述第三靶序列的不同末端或其DNA拷贝或DNA互补序列。
226.根据项目224和225所述的组合物，其中所述第一靶区域、所述第二靶区域和所述第三靶区域的所述核酸序列不同并且选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组。
227.根据项目226所述的组合物，其中对所述第一靶序列特异性的引物序列选自SEQ ID NO:248和487，或211和501。
228.根据项目226或227所述的组合物，其中对所述第二靶序列特异性的引物序列选自SEQ ID NO:5和441，或100和337。
229.根据项目226至228中任一项目所述的组合物，其中对所述第三靶序列特异性的引物序列选自SEQ ID NO:4和320，或34和423，或160和468。
230.一种组合物，可在检测样本中的SARS-CoV-2病毒核酸的反应中用作扩增对照，所述组合物包含线性或环状核酸分子，所述核酸分子以任何顺序包括至少一个来自SARS-CoV-2的N基因的靶序列，至少一个来自SARS-CoV-2的S基因的靶序列，和至少一个来自SARS-CoV-2的orf1ab基因的靶序列。
231.一种用于检测样本中SARS-CoV-2病毒核酸的试剂盒，其包含根据项目202至230中任一项目所述的组合物或其任意组合。
232.根据项目231所述的试剂盒，其进一步包括主混合物。
233.根据项目232所述的试剂盒，其中所述主混合物是TaqMan快速病毒1步主混合物或TaqPath 1步RT-qPCR主混合物，CG。
234.根据项目231至233中任一项目所述的试剂盒，其中所述组分中的至少一种是干燥的或冷冻干燥的。
235.根据项目231至234中任一项目所述的试剂盒，其进一步包括qPCR测定的阵列，每个qPCR测定位于所述阵列的不同基因座中。
236.根据项目235所述的试剂盒，其中所述不同基因座包括在所述阵列的表面上的孔、通道、凹槽、空腔、位点或特征。
237.一种检测样本中存在的SARS-CoV-2病毒核酸的方法，其包含：
(c)提供根据项目202至230中任一项目所述的组合物；
(d)通过使所述组合物以任何顺序或组合与聚合酶、核苷酸和从取自生物体的身体组织获得的样本接触来形成反应体积；和
(e)在所述反应体积中形成含有扩增的冠状病毒序列的一种或多种扩增产物，其中所述形成包括使所述反应体积经受适合于从冠状病毒核酸扩增靶冠状病毒序列的扩增条件，其中所述冠状病毒核酸在扩增之前存在于所述样本中。
238.根据项目237所述的方法，其进一步包括在所述形成步骤期间或之后检测所述扩增产物中的至少一种。
239.根据项目238所述的方法，其进一步包括诊断所述生物体中的冠状病毒感染。
240.根据项目237至239所述的方法，其中所述生物体是人类患者并且所述冠状病毒核酸来源于SARS-CoV-2。
241.根据项目237至240所述的方法，其中所述形成包括从所述冠状病毒核酸扩增至少三种不同的冠状病毒靶序列。
242.根据项目241所述的方法，其中所述至少三种不同的冠状病毒靶序列包括一种来自N基因的靶序列、一种来自S基因的靶序列和一种来自orf1ab基因的靶序列。
附录1
附录2
附录3
附录4
附录5
附录6
附录7
附录8
附录9
附录10
附录11
附录12
附录13
附录14
Claims (16)
1.一种用于扩增SARS-CoV-2基因组中的三种不同靶序列的组合物，其包含：
(a)第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物和所述第一反向引物被配置为扩增存在于所述SARS-CoV-2基因组的第一靶区域中的第一靶序列，其中所述第一靶序列包括所述第一靶区域的至少10个连续核苷酸；
(b)第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物和所述第二反向引物被配置为扩增存在于所述SARS-CoV-2基因组的第二靶区域中的第二靶序列，其中所述第二靶序列包括所述第二靶区域的至少10个连续核苷酸；和
(c)第三正向引物和第三反向引物，所述第三正向引物和所述第三反向引物被配置为扩增存在于所述SARS-CoV-2基因组的第三靶区域中的第三靶序列，其中所述第三靶序列包括所述第三靶区域的至少10个连续核苷酸；
其中所述第一靶区域、所述第二靶区域和所述第三靶区域与bat-SL-CoVZC45中的类似区域各自具有小于50％的相似性。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一靶区域是SEQ ID NO:1。
3.根据权利要求1和2所述的组合物，其中所述第二靶区域是SEQ ID NO:2。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第三靶区域是SEQ ID NO:3。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一靶区域在SARS-CoV-2的N基因内。
6.根据权利要求1或5所述的组合物，其中所述第二靶区域在SARS-CoV-2的S基因内。
7.根据权利要求1、5或6所述的组合物，其中所述第三靶区域在SARS-CoV-2的ORF1ab基因内。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其进一步包括核酸样本、聚合酶、缓冲液和核苷酸。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其进一步包括含有第一标记的第一探针，所述第一标记是荧光标记或其它可检测标记。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述第一探针的所述第一标记是荧光标记，并且所述探针进一步包括淬灭所述荧光标记的淬灭剂。
11.根据权利要求9或10所述的组合物，其进一步包括有包括第二荧光标记的第二探针和包括第三荧光标记的第三探针。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一正向引物和所述第一反向引物选自SEQ ID NO:248和487，或211和501或510。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二正向引物和所述第二反向引物选自SEQ ID NO:5和441，或100和337。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第三正向引物和所述第三反向引物选自SEQ ID NO:4和320，或34和423，或160和468。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其进一步包括用于扩增的阳性对照，其中所述阳性对照是包含来自所述SARS-CoV-2ORF1ab基因、所述S蛋白基因和所述N蛋白基因的靶区域的合成质粒。
16.一种用于检测生物样本中SARS-CoV-2的方法，其包含：
(a)提供含有至少一部分所述生物样本和前述权利要求所述的任何组合物的反应混合物；
(b)使所述反应混合物经受扩增条件，从而形成一种或多种扩增产物；和
(c)检测所述扩增产物中的至少一种。
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| CN113801963B (zh) * | 2021-09-17 | 2024-03-26 | 佛山科学技术学院 | 一种检测冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及方法 |
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| EP4317459A1 (en) * | 2022-08-04 | 2024-02-07 | National and Kapodistrian University of Athens | Method for the detection of sars-cov-2 by digital pcr |
| WO2024102839A1 (en) * | 2022-11-10 | 2024-05-16 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for detection of viral sequences |
Family Cites Families (46)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US5079352A (en) | 1986-08-22 | 1992-01-07 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
| US4889818A (en) | 1986-08-22 | 1989-12-26 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
| US5618711A (en) | 1986-08-22 | 1997-04-08 | Hoffmann-La Roche Inc. | Recombinant expression vectors and purification methods for Thermus thermophilus DNA polymerase |
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| US5994056A (en) | 1991-05-02 | 1999-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection |
| US5436134A (en) | 1993-04-13 | 1995-07-25 | Molecular Probes, Inc. | Cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes |
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| US5538848A (en) | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| US5801155A (en) | 1995-04-03 | 1998-09-01 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Covalently linked oligonucleotide minor grove binder conjugates |
| US5773258A (en) | 1995-08-25 | 1998-06-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification using a reversibly inactivated thermostable enzyme |
| EP1130114A1 (en) | 2000-03-03 | 2001-09-05 | Dr. van Haeringen Laboratorium B.V. | Universal variable fragments |
| EP1540009B1 (en) | 2002-08-05 | 2011-09-28 | Quanta Biosciences, Inc. | Improved compositions for in vitro amplification of nucleic acids |
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