CN111850166A - 一种大规模筛查新型冠状病毒感染人群的核酸检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大规模筛查新型冠状病毒感染人群的核酸检测方法及应用。首先将新型冠状病毒核酸的待检人群分组，混合采样或者单独采样获取咽拭子标本；然后将标本定量取样混合、离心，分别留取离心前混合物、离心后上清和细胞沉淀物共三份混检标本快速提取全部核酸，最后完成新型冠状病毒核酸上机检测与结果判读。阴性结果，代表可能没有感染新型冠状病毒；阳性结果，将分层进行核酸筛查和验证，最终检测出新型冠状病毒核酸阳性的患者。本发明联合单采/混采、混检和浓缩三管齐下进行新型冠状病毒核酸检测，可以快速、高效完成大规模筛查新型冠状病毒感染的待筛人群，尤其适用于低风险和健康人群是否感染新型冠状病毒的核酸普筛。
Description
技术领域
本发明涉及病毒感染的检测领域，尤其是对大规模低风险人群是否感染新型冠状病毒进行快速筛选的 核酸检测方法。
背景技术
新型冠状病毒感染疫情在局部地区爆发后，不仅需要对密接人员、次密接人员和确诊病例所在的住宅 小区、重点场所以及高风险人群进行隔离和逐一进行新型冠状病毒核酸检测，而且在全面解除隔离、复工 复学前，往往需要对疫情爆发相关的整个区域或者城市的人群进行新型冠状病毒核酸全面彻查。对疫区周 边低风险和健康人群是否感染新型冠状病毒进行大规模、快速的核酸筛查，混检是一个非常好的方式，但 是如何科学规划和合理使用，目前还没有详细的文献来加以说明。
在现有已公开的数据和方案中，对于疫情后期或者低风险、健康人群进行大规模新型冠状病毒感染的 普筛，有过少数案例使用新型冠状病毒核酸混检。比如2020年JAMA杂志中发表的数据对2888名咽拭子 标本混合为292组，从中找出2名冠状病毒感染的阳性病例(Hogan，C.A.，et al.JAMA，2020)；2020 年4月底Lancet也曾有短篇文献报道可以进行30例咽拭子标本的混合(Lohse，S.，et al.Lancet Infect Dis，2020)；此外，还有些零星的报道出现在新闻媒体或尚未正式发表。这些已公开的数据中，没有提 及详细的混合采样、混合核酸提取、混合检测方法，只有一个共同的较为模糊的处理方式，即将待筛人群 分组后的咽拭子标本直接混合，结果是多数情况下阳性标本经混合后其CT值较独立标本CT值更高，提示 CT值介于疑似和阳性之间的标本因为混合后被稀释可能导致更难以被检测出来。
一般而言，新型冠状病毒的咽拭子标本中，不少研究认为病毒颗粒主要存在于唾液和呼吸道的分泌物 内(Cheuk，S.，et al.Clin Infect Dis，2020；Mccormick-Baw，C.，etal.J Clin Microbiol，2020； Williams，E.，et al.J Clin Microbiol，2020)。最新的研究表明，鼻咽、口咽等处的上呼吸道上皮 细胞是新型冠状病毒感染和复制的主要细胞，其内含有大量的病毒颗粒(Hou，Y.J.，et al.Cell，2020)。 咽拭子取材过程中，上呼吸道内的分泌物和大量的上皮细胞被刮取下来。如果只是将采样管内的咽拭子标 本进行简单混合后再提取核酸，无论分泌物还是细胞内的病毒颗粒，理论上都会被稀释，比如10∶1混检 采用10人的咽拭子标本各取200μl放在一起混合均匀，再从中取200μl进行核酸提取，与一份标本单 独取200μl进行核酸提取相比较，10∶1混检时每份咽拭子标本的分泌物和细胞只有单独标本中的十分之 一，因此每份标本被稀释了10倍，显而易见，如果混合到一起的标本数量越大，每份标本被稀释的倍数就 越大，在进行核酸扩增时每份标本的起始核酸模板量可能就越低，那么阳性标本在检测过程中就会有出现 假阴性的可能性。本发明中所用方法，是采用先混合均匀，离心前先取部分混合物、离心后取上清以及包 含所有细胞混合沉淀物一共三组标本，既坚持了现用的混检方案即混匀后取部分混合物，同时将混检时所 有细胞混合沉淀物完整收集，最大程度的保留了所有混检标本的细胞内病毒颗粒，大大降低了混检造成假 阴性的可能性。实际应用中，我们阴性和阳性标本混检离心后的上清进行新型冠状病毒核酸检测，发现部 分混检标本经离心后上清中的病毒核酸明显降低，说明咽拭子获取的部分标本中，新型冠状病毒主要存在 于细胞内，这一点与文献报道也相符合。还有部分混检标本离心后的上清中可检测出新型冠状病毒核酸， 也不排除标本灭活、反复冻存过程中细胞发生死亡和裂解，病毒颗粒被释放到上清所致。
总之，本发明方法在既往研究基础上，提出了一种较为科学的新的大规模筛查新型冠状病毒感染人群 的核酸检测方法，不是简单混合后取样检测，而是将混合后标本中所含的尽可能全的细胞一起用于核酸检 测，并经实际工作中的反复验证，发现其能够满足对低风险和健康人群是否感染新型冠状病毒进行大规模、 快速的核酸筛查的需求。不过，需要指出的是，对于新型冠状病毒感染的高风险、密切接触人群，不建议 采用混检方式，还是沿用传统的每人单独采样、单独提取核酸和扩增检测与结果判定。
发明内容
本发明的目的在于实现新型冠状病毒感染疫情在局部地区爆发后对疫区周边低风险和健康人群是否 感染新型冠状病毒进行大规模、快速的核酸筛查，有助于疫情期间的疫情防控，解决制约大规模人群新型 冠状病毒核酸检测每日通过量的“瓶颈”问题。为解决上述问题，本发明采取的技术方案是：
首先将需要筛查新型冠状病毒感染的待筛人群分组，获取混合采样的咽拭子标本，或者直接获取待筛 人群单独采样的咽拭子标本。
然后将获得的咽拭子标本先分组再定量取样混合、离心，分别留取离心前混合物、离心后上清和细胞 混合沉淀物共三份混检标本。
随后利用自动化核酸提取仪分别从三份混检标本中快速获得待筛人群的全部核酸，采用新型冠状病毒 核酸检测试剂盒在核酸扩增仪内完成第一次上机检测与结果判读。
阴性的检测结果，代表其对应组的人群在此次检测中可能没有感染新型冠状病毒。
阳性的检测结果，将分层进行核酸筛查和验证；可以将阳性检测孔对应的所有单独采样管标本逐一提 取核酸，再采用新型冠状病毒核酸检测试剂盒在核酸扩增仪内完成第二次上机检测和数据分析，阴性检测 孔代表其所对应的单独采样管的待筛人群该批次新型冠状病毒检测结果为阴性，对从阳性检测孔对应的单 独采样管中获取的同一份核酸标本，换用第二家新型冠状病毒核酸检测试剂盒在核酸扩增仪内进行第三次 上机检测完成再验证，从而明确筛查出感染新型冠状病毒的核酸阳性患者；或者将阳性检测孔对应组内的 所有混合采样管，逐一提取核酸，采用新型冠状病毒核酸检测试剂盒在核酸扩增仪内进行第二次上机检测， 阴性检测孔代表其所对应的混合采样管的待筛人群该批次新型冠状病毒检测结果为阴性，阳性检测孔对应 的混合采样管，对其所对应的待筛人群的单独采样管标本，逐一提取核酸，再用新型冠状病毒核酸检测试 剂盒在核酸扩增仪内完成第三次上机检测和结果分析，阴性检测孔代表其所对应的单独采样管的待筛人群 该批次新型冠状病毒检测结果为阴性，对从阳性检测孔对应的单独采样管中获取的同一份核酸标本，换用 第二家新型冠状病毒核酸检测试剂盒在核酸扩增仪内进行第四次上机检测完成再验证，从而明确筛查出感 染新型冠状病毒的核酸阳性患者。
本发明通过联合单采/混采、混检和浓缩并结合离心前混合物、离心后上清和细胞混合沉淀物三份标 本三管齐下提取混合标本核酸进行新型冠状病毒核酸检测，可以快速、高效完成大规模筛查新型冠状病毒 感染的待筛人群，尤其适用于大中型城市疫情小爆发情况下或者疫情控制后期对于低风险和健康人群是否 感染新型冠状病毒的核酸普筛。
附图说明
图1是本发明实施例的一种大规模筛查新型冠状病毒感染人群的核酸检测方法及应用的操作流程示意 图。
具体实施方式
下面结合附图说明和实施例，对本发明所涉及方法的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用 于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
第一实施例
120名来自新型冠状病毒感染疫情爆发后的低风险地区无发热等相关症状的待检人员，首先按每人一 管，取口咽拭子，获得单独采样管标本。
然后，将120个单独采样管标本，按24管一组，分成5组，分别为A、B、C、D、E，每组内每管取 200ul标本，置于5ml离心管内，混合均匀后，每组各取200ul标本，为混检1号标本，分别为A1、B1、 C1、D1和E1，余下混合物离心机3000转/分，离心10分钟，留取200μl离心后的上清，为混检2号标 本，分别为A2、B2、C2、D2和E2，余下上清完全去除前，保留200μl用于稀释离心后离心管内的细胞混 合沉淀物，混匀，转入核酸提取仪专用深孔板内，为混检3号标本，分别为A3、B3、C3、D3和E3，利用 自动化核酸提取仪提取自每组内的混检1、2和3号标本，获得A1、B1、C1、D1、E1、A2、B2、C2、D2、 E2、A3、B3、C3、D3和E3共15份混合核酸。
最后，利用新型冠状病毒核酸检测试剂盒对提取的15份混合核酸按标准化流程在核酸扩增仪中完成 核酸的检测，并利用仪器自带的操作软件进行分析，混检1、2和3号标本均为阴性的检测孔代表对应的 分组人群在该批次新型冠状病毒检测结果为阴性，可能没有感染新型冠状病毒；混检1、2和3号标本任 何一份出现阳性的检测孔代表其对应的分组人群中有新型冠状病毒感染者，找出该孔对应的混合核酸提取 组内所含的单独采样管标本，逐一提取核酸，再次采用新型冠状病毒核酸检测试剂盒在核酸扩增仪内进行 第二次上机检测，找出阳性单独采样管标本，对同一份核酸标本，换用第二家新型冠状病毒核酸检测试剂 盒在核酸扩增仪内进行第三次上机检测，完成阳性结果的再验证，从而从待检人员中明确筛查出感染新型 冠状病毒的核酸阳性患者。
第二实施例
120名来自新型冠状病毒感染疫情爆发后的低风险地区无发热等相关症状的待检人员，首先按3人一 组，取口咽拭子，完成3∶1混合采样和单独采样，获得40个混合采样管标本和120个单独采样管标本。
然后，将40个混合采样管标本，按10管一组，分成4组，分别为A、B、C、D，每组内每管取200ul 标本，置于5ml离心管内，混合均匀后，每组各取200ul标本，为混检1号标本，分别为A1、B1、C1和 D1，余下混合物离心机3000转/分，离心10分钟，留取200μl离心后的上清，为混检2号标本，分别为 A2、B2、C2和D2，余下上清完全去除前，保留200μl用于稀释离心后离心管内的细胞混合沉淀物，混匀， 转入核酸提取仪专用深孔板内，为混检3号标本，分别为A3、B3、C3和D3，利用自动化核酸提取仪提取 自每组内的混检1、2和3号标本，获得A1、B1、C1、D1、A2、B2、C2、D2、A3、B3、C3和D3共12份混 合核酸。
最后，利用新型冠状病毒核酸检测试剂盒对提取的12份混合核酸按标准化流程在核酸扩增仪中完成核酸 的检测，并利用仪器自带的操作软件进行分析，混检1、2和3号标本均为阴性的检测孔代表对应的分组 人群在该批次新型冠状病毒检测结果为阴性，可能没有感染新型冠状病毒；混检1、2和3号标本任何一 份出现阳性的检测孔代表其对应的分组人群中可能有新型冠状病毒感染者，对该孔对应的混合核酸提取组 内的混合采样管，逐一提取核酸，采用新型冠状病毒核酸检测试剂盒在核酸扩增仪内完成第二次上机检测， 筛出阳性的混合采样管，并对其所对应的3个单独采样管标本，逐一提取核酸，利用新型冠状病毒核酸检 测试剂盒在核酸扩增仪内完成第三次上机检测和结果分析，根据获得阳性结果的单独采样管标本找出对应 的感染新型冠状病毒的核酸阳性患者，并对从阳性检测孔对应的单独采样管获取的同一份核酸标本，换用 第二家新型冠状病毒核酸检测试剂盒在核酸扩增仪内第四次上机进行再验证，从而明确筛查出感染新型冠 状病毒的核酸阳性患者。或者，混检1、2和3号标本任何一份出现阳性的检测孔代表其对应的分组人群 中有新型冠状病毒感染者，对该孔对应组人群单独采样管标本逐一提取核酸，采用新型冠状病毒核酸检测 试剂盒在核酸扩增仪内完成第二次上机检测和数据分析，筛选出阳性的单独采样管标本，对同一份核酸， 换用第二家新型冠状病毒核酸检测试剂盒在核酸扩增仪内完成第三次上机检测和结果确认，最终从待筛人 群中筛查出感染新型冠状病毒的核酸阳性患者。
以上所述实施例仅表达了本发明的两种实施方式，对其中涉及的操作步骤做了具体和详细的描述，但 并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的专业技术人员来说，在不脱 离本发明技术和方法的构思及原理的前提下，还可以做出若干替换和改进，这些都属于本发明的保护范围。 因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种大规模筛查新型冠状病毒感染人群的核酸检测方法，其特征在于，所述方法包括单独采样、混合采样、混合核酸提取、分层检测和结果认定。
2.如权利要求1所述的大规模筛查新型冠状病毒感染人群的核酸检测方法，其特征在于：所述单独采样，将待筛查新型冠状病毒感染的人群，按1人采取一支咽拭子标本，放入一个采样管，为单独采样管标本，做好编号与登记。
3.如权利要求1所述的大规模筛查新型冠状病毒感染人群的核酸检测方法，其特征在于：所述混合采样，可将待筛查新型冠状病毒感染的人群，按2人一组、3人一组、4人一组、5人一组、6人一组、7人一组、8人一组、9人一组或者10人一组，同时采取咽拭子标本，每人两支，先采的一支集中放入同一个采样管内，为混合采样管标本，根据前面分组，对应的即为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1混合采样，后采的一支每人单独一个采样管为单独采样管标本，将待筛查人群的混合采样管标本和单独采样管标本分别编号与登记。
4.如权利要求1所述的大规模筛查新型冠状病毒感染人群的核酸检测方法，其特征在于：所述混合提取核酸，将混合采样管标本先震荡、混匀，然后以1管、2管、4管、6管、8管、10管、20管或者1-20管之间的任一固定标本管数组成一组，每组内每管吸取1ml、2ml或者0.2-2ml中的任一固定体积含咽拭子标本的保存液至5ml、10ml、15ml或者50ml离心管内，混合均匀后先留取200μl混合物，为混检1号标本，余下混合物离心机3000转份，离心5分钟，留取200μl离心后的上清，为混检2号标本，余下上清完全去除前，保留200μl用于稀释离心后离心管内的细胞混合沉淀物，混匀，转入核酸提取仪专用深孔板内，为混检3号标本，按8组、16组、24组、32组、48组、72组或者96组进行批量自动化核酸提取每组内的混检1、2和3号标本，获得混合核酸。
5.如权利要求1所述的大规模筛查新型冠状病毒感染人群的核酸检测方法，其特征在于：所述分层检测和结果认定，利用新型冠状病毒核酸检测试剂盒对批量提取的混合核酸按标准化流程在核酸扩增仪中完成核酸的检测与分析，阴性检测孔代表对应的分组人群在该批次新型冠状病毒检测结果为阴性，可能没有感染新型冠状病毒，或者感染新型冠状病毒，咽拭子取样时未获得足够数量能被核酸扩增仪检测出病毒感染后或者正在复制中的含感染病毒的细胞。
6.如权利要求1所述的大规模筛查新型冠状病毒感染人群的核酸检测方法，其特征在于：所述分层检测和结果认定，利用新型冠状病毒核酸检测试剂盒对批量提取的核酸按标准化流程在核酸扩增仪中完成核酸的检测与分析，阳性检测孔代表其对应的分组人群中可能有新型冠状病毒感染者，找出该孔对应组内的所有混合采样管，逐一提取核酸，采用新型冠状病毒核酸检测试剂盒在核酸扩增仪内进行第二次上机检测，阴性检测孔代表其所对应的混合采样管的待筛人群该批次新型冠状病毒检测结果为阴性，阳性检测孔对应的混合采样管，对其所对应的待筛人群的单独采样管标本，逐一提取核酸，再用新型冠状病毒核酸检测试剂盒在核酸扩增仪内完成第三次上机检测和结果分析，阴性检测孔代表其所对应的单独采样管的待筛人群该批次新型冠状病毒检测结果为阴性，对从阳性检测孔对应的单独采样管中获取的同一份核酸标本，换用第二家新型冠状病毒核酸检测试剂盒在核酸扩增仪内进行第四次上机检测完成再验证，从而明确筛查出感染新型冠状病毒的核酸阳性患者。
7.如权利要求1所述的大规模筛查新型冠状病毒感染人群的核酸检测方法，其特征在于：所述分层检测和结果认定，利用新型冠状病毒核酸检测试剂盒对批量提取的核酸按标准化流程在核酸扩增仪中完成核酸的检测与分析，阳性检测孔代表其对应的分组人群中可能有新型冠状病毒感染者，将该孔对应组内所含的所有待筛人群留存的单独采样管标本逐一提取核酸，再采用新型冠状病毒核酸检测试剂盒在核酸扩增仪内完成第二次上机检测和数据分析，阴性检测孔代表其所对应的单独采样管的待筛人群该批次新型冠状病毒检测结果为阴性，对从阳性检测孔对应的单独采样管中获取的同一份核酸标本，换用第二家新型冠状病毒核酸检测试剂盒在核酸扩增仪内进行第三次上机检测完成再验证，从而明确筛查出感染新型冠状病毒的核酸阳性患者。
8.如权利要求4-6所述的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：采用实时荧光PCR技术，一步法完成新型冠状病毒核酸的扩增和检测，具体为提取混合核酸，在同一反应管内先进行逆转录反应将病毒核酸逆转录为脱氧核糖核酸，随后利用特异性引物及荧光探针在荧光定量PCR仪中扩增新型冠状病毒特异的N基因和ORFlab的靶区域，检测荧光信号，根据实时扩增曲线判断有无N基因和ORFlab的靶区域扩增，从而得出对应采样管内新型冠状病毒核酸阴性、阳性和可疑结果；扩增和检测的同时，在同一反应管内应当加入作为内参对照的“管家”基因如RNase P基因的特异性引物及荧光探针，用于对标本采集、核酸提取及扩增与检测过程的监控，尽量减少出现假阴性的报告结果。
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