CN113265486A - 一种用于快速筛查病原体的混样检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医疗检测领域，特别涉及用于快速筛查病原体的混样检测方法。应用三阶混样检测程序：第一阶段，将采集的样本分成混合样本池，混样池大小为12～16；第二阶段，将第一阶段的阳性混样池分成亚池，亚池大小为3～4；第三阶段，对第二阶段的阳性亚池进行单样检测。应用二阶混样检测程序：第一阶段，将采集的样本分成混合样本池，感染率为低于1％、1％～4.5％、4.5％～10％时，混样池大小分别为12～16、6～8、3～4；第二阶段，对第一阶段的阳性混样池进行单样检测。本发明通过研究设计和实验室检测，寻找到最优混样比例范围及混样程序，并对该方法的灵敏度和成本效益进行评价，为疫情防控提供科学的参考依据。
Description
技术领域
本发明涉及医疗检测领域，特别涉及一种用于快速筛查病原体的混样检测方法。
背景技术
自一种新型冠状病毒——严重急性呼吸综合征冠状病毒2型 (SARS-COV-2)，引发了一种高度传染性疾病——2019年冠状病毒病 (COVID-19)疫情全球暴发以来，病例的确诊是有效实施疫情防控的关键环节。实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，是检测急性呼吸道感染呼吸道分泌物中致病病毒的常规方法，在COVID-19的病毒学诊断中广泛应用，其灵敏度高达或接近100％。在我国，非药物干预(NPIs)有效遏制了SARS-CoV-2 的传播，并迅速减少了新发病例，但大规模检测仍是控制COVID-19流行的重要策略。当发现散发病例时，在社区人群中进行大规模SARS-CoV-2 RT-PCR检测的紧急行动是不可避免的，比如武汉、北京、深圳、瑞丽等。然而，这些紧急筛查面临着工作量大、劳动强度大、成本高、原材料有限等诸多挑战。例如：2020年4月底，武汉市常驻人口约1100万人，武汉市核酸检测机构有55家，核酸采样点211个，单日核酸检测量最多达6.3万人份，按此检测速度，完成全市、全民核酸检测筛查需要5个月左右。因此，开发适用于检测SARS-COV-2的混样检测方法，通过将一组样本中的数个样本混合在一起并检测混合物中是否存在目标病原体，从而节省了大量的分析工作，将有可能提高检测能力和成本效益。混样策略是一种成熟的筛选方法，能够明显提高核酸检测速度，已应用于从血液样本中检测人类免疫缺陷病毒 (HIV)、梅毒、乙型肝炎和丙型肝炎病毒，也可用于从鼻咽标本中检测流感病毒、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和肺炎克雷伯菌。在疾病预防控制系统中也有较多的应用，比如沙门志贺氏菌，在增菌液增菌之后进行10混样检测，国内血站在日常无偿献血标本中大多也会采用6混样检测方式。
目前已知的新型冠状病毒核酸检测方法分为两种，单样单测和混样检测。单样单测使用单个样本采集，单独进行RT-PCR检测，此方法灵敏度高，可以满足临床诊断的需求。当开展大规模人群筛查时，单样单检已不能解决所面临的工作量大、劳动强度大、成本高、原材料有限等诸多挑战。
国外已有部分地区采用混样检测，国家卫健委于2020年7月发布《新冠病毒核酸筛查稀释混样检测技术指引》，供大样本人群应急筛查中参考使用。所采用的混样方法是：将采集的数个样本(原则上不超过5个)各取200μL 进行充分混合，形成混合待检样本。2020年8月，国务院应对新冠疫情联防联控机制(医疗救治组)发布了《关于印发新冠病毒10合1混采检测技术规范的通知》。
在混样检测程序中，随着样本池大小的增加，每个个体的样本成为混合物中较小的一部分，该分析可能不够灵敏，甚至无法检测到SARS-COV-2的存在。也即，这种稀释效应可能会增加假阴性率。然而在新冠低流行率地区，或者聚集性疫情发生后的社区大规模排查中，高效、快速、节约成本的检测策略亟待解决。因此，需要通过研究设计和实验室检测，寻找到最优的混样比例范围，并对这一方法的灵敏度和成本效益进行评价，最终得出科学的混样方法，提高检出效率，实现更有效的疫情防控。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种用于快速筛查病原体的混样检测方法。本发明通过研究设计和实验室检测，寻找到最优的混样比例范围，并对这一方法的灵敏度和成本效益进行评价，为疫情防控提供科学的参考依据。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于快速筛查病原体的混样检测方法，包括：
应用三阶混样检测程序：
第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为12～16，对混合样本进行检测，得到第一阳性混合样本和/或第一阴性混合样本；
第二阶段，对第一阳性混合样本对应的单个样本进行混样分池，混合样本池大小为3～4，对混合样本进行检测，得到第二阳性混合样本和/或第二阴性混合样本；
第三阶段，对第二阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测。
或者，应用二阶混样检测程序：
当感染率低于1％时，具体如下：
第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为12～16，对混合样本进行检测，得到阳性混合样本和/或阴性混合样本；
第二阶段，对阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测；
当感染率为1％～4.5％时，具体如下：
第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为6～8，对混合样本进行检测，得到阳性混合样本和/或阴性混合样本；
第二阶段，对阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测；
当感染率为4.5％～10％时，具体如下：
第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为3～4，对混合样本进行检测，得到阳性混合样本和/或阴性混合样本；
第二阶段，对阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测。
本发明围绕新型冠状病毒大规模采样时的混样检测方法，通过不同比例混样策略的实验室检测结果分析，得出最优混样稀释比例范围，并采用统计模型对最优方案经行验证，最终为临床检测及社区疫情防控提供可靠的混检策略，整体的技术路线如图1所示。
作为优选，混样检测中的病原体，应为当前流行疾病的致病微生物，且缺少具有针对性的、完善的防治方法。
在本发明中，病原体可为冠状病毒、流感病毒、埃博拉病毒、肝炎病毒、登革热病毒、汉坦病毒、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌中的一种。但病原体种类并非局限于此。
在本发明提供的具体实施例中，病原体为新型冠状病毒。
作为优选，混样检测方法包括：
应用三阶混样检测程序：
第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为16，对混合样本进行检测，得到第一阳性混合样本和/或第一阴性混合样本；
第二阶段，对第一阳性混合样本对应的单个样本进行混样分池，混合样本池大小为4，对混合样本进行检测，得到第二阳性混合样本和/或第二阴性混合样本；
第三阶段，对第二阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测。
或者，应用二阶混样检测程序：
当感染率低于1％时，具体如下：
第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为16，对混合样本进行检测，得到阳性混合样本和/或阴性混合样本；
第二阶段，对阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测；
当感染率为1％～4.5％时，具体如下：
第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为8，对混合样本进行检测，得到阳性混合样本和/或阴性混合样本；
第二阶段，对阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测；
当感染率为4.5％～10％时，具体如下：
第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为4，对混合样本进行检测，得到阳性混合样本和/或阴性混合样本；
第二阶段，对阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测。
作为优选，样本采用灵敏性高、特异性强的检测方法进行检测。
在本发明提供的具体实施例中，样本采用RT-PCR方法进行检测。但检测方法并非局限于此。
在本发明中，群体为人类群体或动物群体。
在本发明中，混合样本的检测结果为阴性，则该结果代替混合样本中个体样本的检测结果。
在本发明中，感染率可以根据已有数据估计，或者在小范围内通过单样本检测估计。
本发明提供了一种用于快速筛查病原体的混样检测方法，该方法包括，应用三阶混样程序进行检测，具体如下：第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为12～16；第二阶段，对阳性混合样本对应的单个样本进行混样分池，混合样本池大小为3～4；第三阶段，对阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测；或者，应用二阶混样程序进行检测，具体如下：当感染率低于1％时，第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为12～16，第二阶段，对阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测；当感染率为1％～4.5％时，第一阶段，对待测样本群体进行混样分池，混合样本池大小为6～8，第二阶段，对阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测；当感染率为4.5％～10％时，第一阶段，对待测样本群体进行混样分池，混合样本池大小为3～4；第二阶段，对阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测。本发明具有的技术效果为：
本发明通过研究设计和实验室检测，寻找到最优的混样比例范围及混样程序，并对这一方法的灵敏度和成本效益进行评价，为疫情防控提供科学的参考依据。通过验证，本发明方法所需检测工作量可减少约50～90％，从而节省大量的分析工作，并提高检测能力和成本效益。
附图说明
图1技术路线；
图2稀释过程；
图3不同混样比例下，两种SARS-CoV-2检测方法的阳性预测值(PPVs) 和阴性预测值(NPVs)；其中，
a：试剂盒1，混样检测ORF1ab基因的PPV；
b：试剂盒1，混样检测N基因的PPV；
c：试剂盒1，混样检测E基因的PPV；
d：试剂盒2，混样检测ORF1ab基因的PPV；
e：试剂盒1，混样检测ORF1ab基因的NPV；
f：试剂盒1，混样检测N基因的NPV；
g：试剂盒1，混样检测E基因的NPV；
h：试剂盒2，混样检测ORF1ab基因的NPV；
图4Dorfman程序流程图。
具体实施方式
本发明公开了一种用于快速筛查病原体的混样检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
2019年冠状病毒病：冠状病毒是指一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。
实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)：是指一种基因检测方法，首先提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR(聚合酶链式反应)扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
混样检测：是指把要检测的样本混合在一起做一次检测。在具体实施时，由于样本量很大，通常会依据某个原则将检测样本分成若干组，对每组的k 个样本进行混样检测，根据检测结果判断这组样本的检测结果。
Ct值：是指在在荧光定量PCR中的一个重要数值，“C”代表Cycle(循环)，“t”代表threshold(阈)，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
样本池：是指含有多个样本的“池子”，也即将多个样本混合后产生的一个新样本。
灵敏度：又称真阳性率，实际患病按某诊断标准被正确地判为阳性的百分比，反映筛检试验确定病人的能力。
特异度：又称真阴性率，实际无病按某诊断标准被正确地判为无病的百分比，反映筛检试验确定非病人的能力。
阳性预测值(PPV，positive predictionvalue)：阳性预测值表示检验结果为阳性的池子中真正阳性的比例。
阴性预测值(NPV，negative predictionvalue)：阴性预测值表示检验结果为阴性的池子中真正阴性的比例。
混样方法：“混”可以通过不同的方法实现；第一种，混采，即将数个采样拭子放在一个采样管中；第二种，单个采样完成后，再吸取等体积的数个样本液混合。
感染率(prevalengce ofinfection)：是指在某时间内被检人群中某病原体现有感染者人数所占的比例，通常用百分率表示。
本发明用于快速筛查病原体的混样检测方法中所用试剂盒均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、实验设计
随机选择新冠阳性鼻咽拭子标本30例，参照其初始Ct值，平均分为3组：强阳性组(Ct值，26-)，中阳性组(Ct值，30-)、弱阳性组(Ct值，35-37)，阴性450例。设置系列稀释比例梯度1：4、1：8、1：16。将阳性样本和阴性样本按照稀释比例混合成若干个样本池(见图2)，并采用两种RT-PCR试剂盒进行检测，试剂盒1：新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR 法)，上海之江生物科技股份有限公司，货号Z-RR-0479-02-50，国械注准20203400057；试剂盒2：2019新型冠状病毒核酸检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)，深圳华大因源医药科技有限公司，国械注准20203400060。
2.实验过程
1)样本采集
所用阳性鼻拭子/鼻咽拭子标本均为临床核酸检测剩余物，标本保存于 -70℃，冰冻阳性标本应按《危险货物航空安全运输技术规程》标准包装。
2)核酸抽提
使用全自动核酸抽提仪，严格按照试剂盒说明书的操作步骤进行核酸抽提，得到的核酸提取物保存于-70℃。
3)RT-PCR
使用荧光定量PCR仪器，严格按照两种试剂盒说明书的操作步骤进行 PCR扩增，保存原始结果数据于计算机。结果判定标准：试剂盒1含三个靶标基因(ORF 1ab基因；E基因；N基因)，若Ct值不大于43，则判断为阳性结果，当ORF1ab基因为阳性且E基因和/或N基因为阳性，则判定 SARS-CoV-2阳性；试剂盒2仅针对ORF 1ab基因，Ct值不大于40则判定为阳性。
3.实验检测数据分析
经试剂盒1检测，30例原始阳性样本，ORF1ab基因Ct值范围是26.38 至37.85(均数±标准差＝32.91±4.33，中位数＝35.76，四分位数间距＝ 8.70)，N基因Ct值范围是25.28至36.50(均数±标准差＝31.90±4.41，中位数＝34.84，四分位数间距＝8.85)，E基因Ct值范围是23.28至35.64(均数±标准差＝29.60±4.31，中位数＝32.14，四分位数间距＝8.63)。经试剂盒 2检测，30例原始阳性样本，ORF1ab基因Ct值范围是23.28至35.64(均数±标准差＝29.98±4.10，中位数＝32.10，四分位数间距＝8.65)。
将阳性样本和阴性样本按照1:4、1:8、1:16体积混合后，按照试剂盒说明书判读结果，发现两种RT-PCR试剂盒在不同稀释比例的阳性结果敏感性均大于或等于80％，其中：试剂盒1的ORF1ab基因灵敏度分别为100％、 80％、80.33％；N基因灵敏度分别为100％、93.33％、76.67％；E基因灵敏度分别为100％、86.67％、76.67％；阳性结果敏感性分别为：100％、80％、80％。试剂盒2的ORF1ab基因灵敏度分别为100％、93.33％、86.67％，阳性结果敏感性等同之。
4.基于实验数据的模拟验证
1)验证RT-PCR检测混样检测的敏感性：
本发明使用了两个数据集。第一个数据集，来自本发明的实验数据。将单个原始阳性标本与3、7、15个等体积的阴性标本混合(即1:4、1:8、1:16 稀释，见图2)可得到Ct混样后，该值与对应的单个原始阳性样本在混样前的Ct值的差值(即Ct阳性样本混样后-Ct阳性样本混样前)定义为ΔCt值。本发明的实验过程中，单个原始阳性样本混样后的ΔCt值分别表示为ΔCt1:4(即Ct1:4混样-Ct原始)、ΔCt1:8(即Ct1:8混样-Ct原始)、ΔCt1:16(即Ct1:16混样-Ct原始)，因此1:4、1:8、 1:16稀释下ΔCt值的均数和标准差分别表示为E(ΔCt1:4)、E(ΔCt1:8)、E (ΔCt1:16)和SD(ΔCt1:4)、SD(ΔCt1:8)、SD(ΔCt1:16)，同时也构成了第一个数据集。第二个数据集是通过数据模拟生成的200例病毒载量数据。假设SARS-CoV-2感染者中病毒载量服从Gaussian分布或Gamma分布，根据 Kleiboeker等公布的7682份咽拭子SARS-CoV-2病毒载量数据，以均数5.66Log10拷贝/毫升和标准差2.03Log10拷贝/毫升为参考数值，模拟生成 200例病毒载量数据。绘制标准曲线后，将模拟的病毒载量值转换为两试剂盒中不同基因的Ct值。假设此200例样本在1:4、1:8和1:16混样稀释后的ΔCt值，服从Gaussian分布，分布参数即为第一个数据集中的均数和标准差。
结果判读按照试剂盒说明书，并计算不同基因片段的检测灵敏度。混样后的灵敏度计算为初始阳性样本在混样策略下仍检测为阳性结果的概率。
按照1:4、1:8、1:16的比例模拟混样试验，当病毒载量服从Gaussian分布时，试剂盒1的灵敏度：ORF1ab基因分别为94.50％、93.00％、93.00％， N基因分别为95.50％、94.50％、92.00％，E基因分别为为100％、98.50％、 98.50％，试剂盒2的ORF1ab基因灵敏度分别为95.50％、94.50％、92.00％。当病毒载量服从Gamma分布时，试剂盒1的灵敏度：ORF1ab基因分别为 98.00％、94.50％和94.00％，N基因分别为99.00％、95.50％和93.00％，E基因分别为100％、100％和100％，试剂盒2的ORF1ab基因灵敏度分别为99.00％、95.50％和94.00％。
此外，本发明估计了混样检测策略中的阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。阳性预测值反应的是所有阳性检测结果的样本中真正携带有目标病毒样本的概率；阴性预测值反应的是所有阴性检测结果的样本中真正未携带目标病毒样本的概率。本发明模拟生成6个社区，人口规模分别为1000、 5000、10000、50000、100000和150000，人群COVID-19患病率分别为0.01％、 0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％和10％(共42个组合)。假设混样检测的特异度为80％～99％，经计算得出不同混样比例下的检测方法的阳性预测值和阴性预测值：
PPV＝(灵敏度×患病率*)/(灵敏度×患病率*+(1-特异度)×(1-患病率*))
NPV＝(特异度×(1-患病率*))/((1-灵敏度)×患病率*+特异度×(1-患病率*))
患病率*＝1-(1-人群患病率)^(混样池大小)
阳性预测值表示检验结果为阳性的池子中真正阳性的比例；阴性预测值表示检验结果为阴性的池子中真正阴性的比例。当人群中流行率不同时，若混样池大小为4时(每个目标基因的灵敏度均为100％)，两种试剂盒的目标基因的NPV保持在1；池大小为8时，NPV都接近或高于0.8；池大小为 16时，试剂盒1的三个目标基因的NPV均接近或高于0.4，在试剂盒2中目标基因的NPV均接近或高于0.5。然而，PPV随人群患病率和特异度的变化，而发生显著的变化，从0.02至1不等，但随着人群感染率的增加，趋于稳定 (图3)。
2)评估实施混样策略的成本效益：
为了评估实施联合策略时检测数量的潜在减少，本发明模拟了6个社区，人口规模为1000、5000、10000、50000、100000和150000，人群COVID-19 患病率为0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％和10％(共42个组合)。随后，应用原始多夫曼(Dorfman)程序和三阶段多夫曼程序(图4)做成本效益估计。原始多夫曼程序实际上分为两个阶段：第一阶段，将目标人群中采集的样本分组为不同混样池(池大小分别为4、8和16)；第二阶段，将第一阶段中的阳性池分解，对其中的每个样本分别检测。三阶多夫曼程序则是插入了一个中间阶段：第一阶段，将目标人群中采集的样本分组为不同混样池(池大小分别为4、8和16)；第二阶段，将第一阶段中的阳性池子分成若干个亚池检测；第三阶段，将第二阶段中的阳性亚池分解，对其中的每个样本分别检测。
计算过程举例：当人口规模为1000，人群COVID-19患病率为0.01％时。使用单样检测方法时：需要检测1000次。若使用16-1的二阶混样检测程序：第一阶段每个混样池子大小为16，总池子数为63个，其中只有1个池子为阳性，需要检测63次；第二阶段对第一阶段的阳性池子经行单个检测，需要检测16次；则一共检测了79次。混样检测节约的检测次数为921，也即检测工作量减少92.1％。当使用16-4-1的三阶混样检测程序时，第一阶段每个混样池子大小为16，总池子数为63个，其中只有1个池子为阳性；需要检测63次；第二阶段将第一阶段的阳性池子分成4个亚池，每个亚池大小为4，其中只有1个亚池为阳性，需要检测4次；第三阶段，对第二阶段的阳性亚池经行单个检测，需要检测4次；则一共检测了71次。混样检测节约的检测次数为929，也即检测工作量减少92.9％。经计算，在混样检测策略下，模拟社区数据，得出不同检测程序和感染率时最佳的混样池大小，以及相应减少的工作量比例如下：
两阶混样检测程序：对于试剂盒1检测，无论种群大小如何变化，低感染率区(<1％)的最佳池大小为16，工作量(RNA提取和PCR的次数)减少约80～90％；相对低感染率区(约1～7.5％)的池大小为8，人口规模为1000 社区的上限感染率约为7.5～10％，对于1000人以上的人群，感染率约为6％，工作量减少约50％～80％。对于试剂盒2检测，无论种群大小如何变化，低感染率区(<1％)工作量数减少相近的最适池大小也为16；相对低感染率区(1～4.5％)，工作量减少约60％～80％的最适池大小为8；相对高感染率区 (>4.5％)，工作量减少约60％的最适池大小为4。三阶混样检测程序：第二阶段工作量的减少取决于亚池的大小。16-4-1的三阶段程序比其他程序表现更好，所需检测工作量减少约50～90％。
根据上述数据得出结论：混样检测可以应用于新冠检测，其具有较好的灵敏度和成本效益。具体策略如下：应用二阶混样检测程序：当人群感染率低于1％时，最优混样池大小为16；感染率为1-4.5％时，最优混样池大小为 8；而感染率为4.5-10％时，最优混样池大小为4；应用三阶混样检测程序：第二阶段工作量的减少取决于亚池的大小，16-4-1的三阶段程序比其他程序表现更好。从而节省大量的分析工作，并提高检测能力和成本效益。
5.实例实施方案
1)应用三阶混样检测程序
将16个样本混合成一个新的样本池，对每个样本池进行RT-PCR检测，根据检测结果判断这组样本的检测结果：
a.如果16个样本检测结果显示阴性，则说明这16个样本的检测结果都是阴性的，即用样本池检测结果代替混样个体样本检测结果。
b.如果16个样本检测结果为阳性，则说明这组样本中至少有一样本检测结果应是阳性，此时，需将16个样本分成4个亚组，每个亚组4个样本。
c.再对每个亚组进行检测，若检测结果显示阴性，则说明这4个样本的检测结果都是阴性的。
d.若亚组检测结果为阳性，需对这4个样本进行单样检测，进而确定本组每一个个体样本的结果。
2)应用二阶混样检测程序
当待测人群中SARS-Cov-2感染率低于1％时，将16个样本混合成一个新的样本池，对每个样本池进行RT-PCR检测，根据检测结果判断这组样本的检测结果：
a.如果16个样本检测结果显示阴性，则说明这16个样本的检测结果都是阴性的，即用样本池检测结果代替混样个体样本检测结果。
b.如果16个样本检测结果为阳性，则说明这组样本中至少有一样本检测结果应是阳性，需对这16个样本进行单样检测，进而确定本组每一个个体样本的结果。
当待测人群中SARS-Cov-2感染率为1-4.5％时，将8个样本混合成一个新的样本池，对每个样本池进行RT-PCR检测，根据检测结果判断这组样本的检测结果：
a.如果8个样本检测结果显示阴性，则说明这8个样本的检测结果都是阴性的，即用样本池检测结果代替混样个体样本检测结果。
b.如果8个样本检测结果为阳性，则说明这组样本中至少有一样本检测结果应是阳性，需对这8个样本进行单样检测，进而确定本组每一个个体样本的结果。
当待测人群中SARS-Cov-2感染率为4.5-10％时，将4个样本混合成一个新的样本池，对每个样本池进行RT-PCR检测，根据检测结果判断这组样本的检测结果：
a.如果4个样本检测结果显示阴性，则说明这4个样本的检测结果都是阴性的，即用样本池检测结果代替混样个体样本检测结果；
b.如果4个样本检测结果为阳性，则说明这组样本中至少有一样本检测结果应是阳性，需对这4个样本进行单样检测，进而确定本组样本每一个个体样本的结果。
6.在实际应用混样检测方法时，要注意以下几点：
1)一般情况下，在某个确定的疾病筛查区域，患病率p是随时间变化的，在做全体筛查之前p不是常数，此时，利用统计方法，可以根据已有数据估计p的近似值，或者在小范围内通过单样本检测估计出p的值。
2)疾病筛查检测通常会有多种检测方式与多种检测试剂等。为了保证混样检测结果准确有效，应尽可能地选择灵敏性高、特异性强的检测方式与检测试剂，避免可能出现的假阴性、假阳性等情况。
3)对有些特别检测结果，不但应采取多样本、多试剂的平行检测，还应与临床诊断结果相结合。
4)对于多夫曼程序的选择，实施应根据人力资源、硬件条件等经行考量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种用于快速筛查病原体的混样检测方法，其特征在于，包括：
应用三阶混样检测程序：
第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为12～16，对混合样本进行检测，得到第一阳性混合样本和/或第一阴性混合样本；
第二阶段，对第一阳性混合样本对应的单个样本进行混样分池，混合样本池大小为3～4，对混合样本进行检测，得到第二阳性混合样本和/或第二阴性混合样本；
第三阶段，对第二阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测。
或者，应用二阶混样检测程序：
当感染率低于1％时，具体如下：
第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为12～16，对混合样本进行检测，得到阳性混合样本和/或阴性混合样本；
第二阶段，对阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测；
当感染率为1％～4.5％时，具体如下：
第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为6～8，对混合样本进行检测，得到阳性混合样本和/或阴性混合样本；
第二阶段，对阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测；
当感染率为4.5％～10％时，具体如下：
第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为3～4，对混合样本进行检测，得到阳性混合样本和/或阴性混合样本；
第二阶段，对阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测。
2.根据权利要求1所述的混样检测方法，其特征在于，所述病原体为病原微生物。
3.根据权利要求2所述的混样检测方法，其特征在于，所述病原体为冠状病毒、流感病毒、埃博拉病毒、肝炎病毒、登革热病毒、汉坦病毒、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌中的一种。
4.根据权利要求1所述的混样检测方法，其特征在于，所述病原体为新型冠状病毒。
5.根据权利要求1所述的混样检测方法，其特征在于，包括：
应用三阶混样检测程序：
第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为16，对混合样本进行检测，得到第一阳性混合样本和/或第一阴性混合样本；
第二阶段，对第一阳性混合样本对应的单个样本进行混样分池，混合样本池大小为4，对混合样本进行检测，得到第二阳性混合样本和/或第二阴性混合样本；
第三阶段，对第二阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测。
或者，应用二阶混样检测程序：
当感染率低于1％时，具体如下：
第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为16，对混合样本进行检测，得到阳性混合样本和/或阴性混合样本；
第二阶段，对阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测；
当感染率为1％～4.5％时，具体如下：
第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为8，对混合样本进行检测，得到阳性混合样本和/或阴性混合样本；
第二阶段，对阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测；
当感染率为4.5％～10％时，具体如下：
第一阶段，对群体的待测样本进行混样分池，混合样本池大小为4，对混合样本进行检测，得到阳性混合样本和/或阴性混合样本；
第二阶段，对阳性混合样本对应的单个样本进行单样检测。
6.根据权利要求1所述的混样检测方法，其特征在于，所述样本采用灵敏性高、特异性强的检测方法进行检测。
7.根据权利要求6所述的混样检测方法，其特征在于，所述样本采用RT-PCR方法进行检测。
8.根据权利要求1所述的混样检测方法，其特征在于，所述群体为人类群体或动物群体。
9.根据权利要求1所述的混样检测方法，其特征在于，所述混合样本的检测结果为阴性，则该结果代替混合样本中个体样本的检测结果。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210817 |