CN115869358A - 一种治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物,它是由下列重量份的原料药制成:生黄芪5‑25份、苍术3‑15份、虎杖3‑15份、杠板归3‑15份、泽兰3‑15份、广陈皮2‑10份。本发明还提供了上述药物在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的用途。其优点在于:方中生黄芪益气健脾,脾气旺而水湿消,为君药;臣以苍术燥湿健脾,虎杖利湿祛痰,合用加强健脾祛痰之效;佐以杠板归清热利水,泽兰活血祛瘀,利水消肿,合用加强清热利湿之效;广陈皮健脾燥湿,兼有理气化痰之效为使药。诸药合用共凑健脾祛痰、清热利湿功效,使脾气健旺,湿热通利,痰湿消减而愈。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物及其应用,具体地说,是以中草药为原料制成的中成药。
【背景技术】
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种代谢失调性疾病,以非酒精因素导致的肝脏内脂质堆积和肝细胞大泡性脂肪病变为特征的临床综合征,常伴有血脂紊乱,胰岛素抵抗等,严重可进展为非酒精性脂肪肝炎、肝硬化和肝癌。据全球流行病学调查,NAFLD在全球的发病率为10%~30%,亚洲国家平均为11%~16%,其中我国的患病率约为15%。NAFLD的发病机制非常复杂,涉及多个途径,包括胰岛素抵抗、炎症、脂肪毒性、脂肪代谢紊乱、氧化应激等。非酒精性脂肪肝目前没有特效药物,现有的降糖和降脂药物存在明显的副作用包括食欲不佳、腹胀、腹泻等消化道病症以及肝脏转氨酶上升和亚急性黄疸等。
非酒精性脂肪性肝病属于中医“肝癖”范畴,多因饮食不节、湿热疫毒、情志抑郁、肥胖少动,引起肝失疏泄、脾失健运而导致湿热内蕴、痰浊内结。本课题组在全国范围内纳入780例非酒精性脂肪性肝炎患者,收集患者中医四诊信息,采用聚类分析及主成分分析等方法归纳非酒精性脂肪性肝炎的基本病机为脾虚湿热兼有痰湿。
中国专利文献CN:200910057416.6,公开了治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物,该中药组合物由下列重量份数比的重要原料制成:丹参10~20份、葛根10~20份、垂盆草20~40份、女贞子10~20份、白术10~20份、片姜黄5~15份;以健脾祛湿、化瘀消痰为治则,切中非酒精性脂肪肝中医病因病机,该组合物具有治疗非酒精性脂肪性肝病的疗效。
中国专利文献CN:202110237402.3,公开了一种治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物,该中药组合物由下列重量份数比的重要原料制成:茯苓10-20重量份、荷叶5-15重量份、净山楂5-15重量份、陈皮6-15重量份、佛手10-20重量份、决明子8-15重量份、丹参8-15重量份和玉米须10-30重量份;该组合物具有改善NAFLD患者的肝功能,降低甘油三酯及低密度脂蛋白水平,减轻肝脏脂肪沉积及体重指数。
诸如此类治疗非酒精性脂肪肝的中药组合物有很多,但是都有或多或少的缺点,例如,药味过多,取材难,价格昂贵;药效不明显,治疗效果差等。因此,亟需一种治疗非酒精性脂肪肝效果明显、药味数少、便于制备的药物。
【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供一种治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物。
本发明的再一目的是,提供一种上述药物的用途。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:
一种治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物,是由以下重量份的原料药制成:生黄芪5-25份、苍术3-15份、虎杖3-15份、杠板归3-15份、泽兰3-15份、广陈皮2-10份。
优选地,所述的中药组合物是由以下重量份的原料药制成:生黄芪份10-20份、苍术6-12份、虎杖6-12份、杠板归6-12份、泽兰6-12份、广陈皮4-8份。
更优选地,所述的中药组合物是由以下重量份的原料药制成:生黄芪15份、苍术9份、虎杖9份、杠板归9份、泽兰9份、广陈皮6份。
所述的药物的药剂是颗粒。
优选地,所述的中药组合物的制备方法,(1)采用“2204挥发油测定法”中甲法提取挥发油:称取麸炒苍术、广陈皮,加入8倍量的水,浸泡一定时间后,连接挥发油提取器,加热持保持微沸提取一定时间,关火静置1h,读取挥发油体积。(2)饱和水溶液法制备挥发油包合物,按照所得挥发油体积:β-环糊精质量=1:9的比例,称取β-环糊精,于64℃下纯水中使充分溶解,持续搅拌(转速960r/min),逐滴加入以无水乙醇稀释的挥发油(50%,v/v),于该温度下搅拌一定时间后,冷却至室温,置4℃冷藏24h,抽滤,用石油醚(45mL,15mL/次)洗涤,置于37℃烘箱干燥4h,称重,即得挥发油包合物。(3)水提工艺:麸炒苍术与广陈皮提取挥发油后的药渣与与其余药味一起,加入12(1368mL)倍量水,浸泡1h后,加热至药液沸腾开始计时,提取3次,每次1.5h,过滤,合并所有提取液,即得。
为实现上述第二个目的,本发明采取的技术方案是:
所述的药物在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用。
优选地,所述的非酒精性脂肪性肝病为脾虚湿热兼有痰湿型非酒精性脂肪性肝病。
本发明优点在于:
1.芪术方是由上海中医药大学附属曙光医院肝病科研发治疗非酒精性脂肪性肝炎的有效验方,主要适用于非酒精性脂肪性肝炎中医辨证为脾虚痰阻兼湿热患者,治宜健脾祛痰、清热利湿佐以疏肝理气为主。
2.方中生黄芪益气健脾、脾气旺而水湿消,为君药;臣以苍术燥湿健脾、虎杖利湿祛痰,二者合用加强健脾祛痰之效;杠板归清热利水、泽兰活血祛瘀、利水消肿,二者合用加强清热利湿之效,为佐药;广陈皮健脾燥湿,兼有理气化痰之效是为使药。诸药合用共凑健脾祛痰、清热利湿功效,使脾气健旺,湿热通利,痰湿消减而愈。
【附图说明】
图1为各组大鼠肝组织炎症及脂肪变性HE染色(200×);
图2为各组大鼠肝组织脂肪变性,油红染色(200×);
图3为各组大鼠肝细胞糖原染色检测(200×);
图4(a、b、c)为芪术方中药材的薄层鉴定结果;
图5为浸泡时间对混合挥发油提取量的影响;
图6为提取时间对混合挥发油提取量的影响;
图7为加水量对混合挥发油提取量的影响;
图8为苍术素HPLC色谱图(A:对照品;B:挥发油供试品;1:苍术素);
图9(a、b)为各因素对综合评分的影响;
图10为薄层色谱图(A.β-环糊精;B.包合物;C.挥发油;D.包合物中提取的挥发油);
图11为红外光谱图(A.挥发油;B.β-环糊精;C.物理混合物;D.包合物);
图12为差示扫描量热图谱(A.β-环糊精;B.物理混合物;C.包合物);
图13为典型高效液相色谱图(A:对照品;B:缺广陈皮阴性对照;C:缺虎杖阴性对照;D:缺黄芪阴性对照;E:药液供试品;1:毛蕊异黄酮葡萄糖苷;2:虎杖苷;3:橙皮苷);
图14为药材吸水率考察结果。
【具体实施方式】
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物的制备(一)
生黄芪15份、苍术9份、虎杖9份、杠板归9份、泽兰9份、广陈皮6份。
实施例2治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物的制备(二)
生黄芪5份、苍术15份、虎杖6份、杠板归12份、泽兰9份、广陈皮2份。
实施例3治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物的制备(三)
生黄芪25份、苍术6份、虎杖12份、杠板归9份、泽兰3份、广陈皮10份。
实施例4治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物的制备(四)
生黄芪10份、苍术12份、虎杖9份、杠板归3份、泽兰15份、广陈皮4份。
实施例5治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物的制备(五)
生黄芪20份、苍术9份、虎杖3份、杠板归15份、泽兰6份、广陈皮8份。
实施例6治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物的制备(六)
生黄芪15份、苍术3份、虎杖15份、杠板归6份、泽兰12份、广陈皮6份。
实施例7治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物的制备(七)
生黄芪5份、苍术6份、虎杖12份、杠板归9份、泽兰3份、广陈皮10份。
实施例8治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物的制备(八)
生黄芪25份、苍术12份、虎杖9份、杠板归3份、泽兰15份、广陈皮4份。
实施例9治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物的制备(九)
生黄芪10份、苍术9份、虎杖3份、杠板归15份、泽兰6份、广陈皮8份。
实施例10治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物的制备(十)
生黄芪20份、苍术3份、虎杖15份、杠板归6份、泽兰12份、广陈皮6份。
实施例11治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物的制备(十一)
生黄芪15份、苍术15份、虎杖6份、杠板归12份、泽兰9份、广陈皮2份。
实施例12动物实验
1.实验材料
1.1药物
芪术方组:黄芪、苍术、杠板归、虎杖、泽兰、陈皮(购自上海中医药大学曙光医院),1.33g芪术方,定容成约0.67g/ml的芪术方煎剂;
阿托组:阿托伐他汀钙片,购自上海曙光医院,0.24mg阿托伐他汀钙片,配成浓度0.12mg/ml的溶液;
正常饲养(NCD)组:2mlUP(超纯水)水;
高脂饲料(HFD)组:2mlUP水。
1.2动物
SD雄性大鼠28只,体重200±20g,清洁级,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,SCXK(京)2021-0006。上海中医药大学实验动物中心清洁级动物房饲养。
1.3试剂及仪器
60%高脂饲料(HF60):购于深圳益青生物科技有限公司;油红染液、苏木素染料:上海毓秀生物科技有限公司;无水乙醇:货号100092683;二甲苯:货号10023418;中性树胶:货号10004160;异丙醇:货号80109218,均购于国药集团化学试剂有限公司。
冰冻切片机:Thermo公司;病理切片机:上海徕卡仪器有限公司;组织摊片机:浙江省金华市科迪仪器设备有限公司;组织烤箱:天津市莱玻瑞仪器设备有限公司。
2.方法
2.1造模分组及给药
将SD雄性大鼠28只,体重200±20g,按随机方法将大鼠分为正常组(N),模型组(M)、芪术颗粒组(Q)和阳性药阿托组(A)各7只。自造模之日起,除正常组予基础饲料外,其余3组予60%高脂饲料喂养(脂肪60%、碳水化合物20%、蛋白质20%),自由饮水。每日予正常组、模型组2mlUP水灌胃,芪术方组、阿托组予2ml药物溶剂灌胃,每周测量体重后,根据大鼠体重变化调整给药量,共造模8周。
2.2取材
取材前试剂、器械及动物准备:异氟烷,PBS1×缓冲液,多聚甲醛固定液,70%乙醇消毒液,OCT包埋胶;大鼠固定板、手术剪、尖头直镊、刀片、一次性采血针、负压促凝采血管(10ml)、10cm培养皿、15ml离心管、1.5mlEP管、无菌棉球、锡箔纸、冰盒,干冰。大鼠禁食24小时。
取材步骤:
(1)将大鼠放入加有异氟烷的气麻机中,观察状态,待大鼠麻醉后取出,固定四肢,充分暴露腹部,大鼠鼻侧放置浸有异氟烷的棉球,保证取材过程的持续麻醉状态。
(2)用70%乙醇消毒液喷消大鼠腹部皮毛后,剪开外皮及肌肉组织,暴露腹腔脏器。
(3)用无菌棉球将多余脏器拨至体侧,找到腹主动脉,刺入一次性采血针,针头尾部连接负压促凝采血管,血液样本采集结束后将采血管置于冰盒保存。离心机3000r/10min离心后,吸取上层血清分装于1.5mlEP管中,-80℃保存。
(4)分离大鼠肝脏组织,取下后放入盛有PBS1×缓冲液的10cm培养皿中微微晃动,洗去多余血液后,转移至盛有冰的10cm培养皿(加盖)上,将组织切成1cm×1cm的立方块,HE染色的组织放入装有14ml多聚甲醛固定液的15ml离心管中,充分固定,常温保存;油红冰冻切片的组织置入加有OCT胶的离心管盖中,叠加OCT胶将全部组织包埋后,用锡箔纸包裹,置入干冰中速冻保存。
2.3组织H&E染色和油红染色
(1)H&E染色
①石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯I20min,二甲苯II20min,无水乙醇I5min,75%酒精5min,自来水洗;
②苏木精染色:切片入苏木素染液染3-5min,自来水洗,分化液分化,自来水洗,返蓝液返蓝,流水冲洗;
③伊红染色:切片依次入85%、95%的梯度酒精脱水各5min,入伊红染液中染色5min;
④脱水封片:切片依次放入无水乙醇I5min,无水乙醇II5min,无水乙醇III5min,二甲苯I5min,二甲苯II5min透明,中性树胶封片。
⑤显微镜镜检:图像采集分析,细胞核呈蓝色(颜色部分:因说明书附图中呈现灰色,以此说明),细胞质呈红色。
(2)油红染色
①新鲜冰冻切片固定:将冰冻切片复温干燥,固定液中固定15min,自来水洗,晾干;
②油红染色:切片入油红染液浸染8-10min(加盖避光);
③背景分化:取出切片,停留3s后依次浸入两缸60%异丙醇分化,各3s、5s。切片依次浸入2缸纯水中浸洗,各10s。
④苏木素染色:取出切片,停留3s后浸入苏木素复染3-5min,3缸纯水浸洗,各5s、10s、30s。分化液分化2-8s,2缸蒸馏水洗各10s,返蓝液返蓝1s,将切片轻轻浸入2缸自来水中浸洗,各5s、10s,镜检染色效果;封片:
甘油明胶片剂封片;
⑤显微镜镜检:图像采集分析,脂滴呈橘红色至鲜红色,细胞核蓝色。
2.4检测指标
(1)肝组织学检查:HE染色观察肝组织脂肪变性程度;油红O染色观察肝组织脂肪变性程度;糖原染色观察肝组织糖原累积程度。
(2)血清ALT、AST、TC、TG值检测。
2.5统计学方法
3.结果
3.1肝脏大体形态观察
正常组肝表面颜色普遍黯红,色泽鲜亮,中等硬度,切面略有颗粒感,无油腻感。模型组肝脏表面颜色微发黄,肝脏体积较正常组偏大,包膜紧张,切面有油腻感,无颗粒感。其余各用药组颜色、质地基本介于两者之间。芪术方组肝脏较正常组偏大,有弹性,阿托伐他汀钙组肝脏颜色较芪术方组红润,个别偏黄,略增厚,与模型大鼠形态相似。
3.2肝脏病理组织学观察
1)HE染色显示:模型大鼠肝脏脂肪变性明显,随机视野中,肝细胞气球样变性面积约70%-80%,胞浆疏,出现大脂肪滴聚集,部分细胞可见细胞核挤向胞膜,可见少量淋巴细胞浸润和灶状坏死。而芪术方组大鼠脂肪变性程度明显减轻,脂滴数量减少,偶见散在的点状坏死灶。阿托伐他汀钙组肝组织脂肪变性程度与芪术方组相似,较模型组显著减轻,脂滴数量减少。药物组间相比,阿托伐他汀组肝脏脂肪变性程度及炎症情况较芪术方组轻微(见图1)。
2)油红O染色显示:与正常大鼠比较,油红O染色显示模型大鼠肝细胞脂肪滴累积明显,脂滴大而多,肝小叶中央区染色较深,边缘区染色较淡,芪术方各组大鼠肝脏脂滴显著减少,阿托伐他汀钙组脂滴数量与芪术组相比略有减少(见图2),模型组肝细胞中脂质含量显著升高,各用药组肝细胞中脂质含量较模型组明显降低。
3)糖原PAS染色显示:正常组大鼠肝细胞胞质内可见散在糖原颗粒,无明显阳性反应,模型组可见大范围块状,弥漫状紫红色区域,芪术方组胞质呈淡红色,可见少量红色颗粒,较模型组阳性程度显著减轻,阿托伐他汀钙组胞质内阳性结果明显,呈紫红色,可见粗大块状糖原聚集,较芪术方组程度加重(见图3)。
3.3大鼠血清肝功能ALT、AST的变化
与正常组相比,模型组大鼠血清ALT,AST均显著升高(P<0.01),与模型组相比,芪术方组血清ALT显著下降(P<0.01),阿托伐他汀钙组血清ALT有上升趋势;芪术方组及阿托组大鼠血清AST较模型组比均下降(P<0.01)。(见表1)。
注:△表示与模型组比较,P<0.01,*表示与模型组比较,P<0.01。
3.4大鼠血清TC、TG的变化
与正常组相比,模型组大鼠肝组织TC、TG有所升高,芪术组和阿托组的TC、TG值较模型组有所降低(P<0.01),从结果来看,阿托组的疗效优于芪术组。(见表2)。
注:△表示与模型组比较,P<0.01,*表示与模型组比较,P<0.01。
4.总结
芪术方可降低单纯高脂饮食诱导的大鼠非酒精性脂肪性肝病大鼠模型血清ALT、AST活性,改善肝功能,降低肝组织TC和TG含量,减轻炎症损伤和肝脂肪变性,改善肝组织病理,肝脏脂质代谢。
实施例13制备工艺研究
1.工艺研究
1.1最优剂型选择
本处方经前期预实验测得出膏率约在25%-34%,全方57g,得干膏粉约14g-19g,再加以适量辅料后,患者每天需服用药量较大,不适合制成片剂、胶囊、滴丸等其它剂型,而颗粒剂载药量大,服用便捷,稳定性好,工业生产成本低,患者顺应性更好。综合以上原因选择颗粒剂作为该制剂的剂型。
1.2提取工艺路线的设计
芪术方由黄芪、麸炒苍术、虎杖、杠板归、泽兰、广陈皮六味药组成。其中麸炒苍术和广陈皮中含有较多的挥发油类成分,通过前期文献调研显示,该类成分具有健脾、燥湿、保肝、抗炎和抗氧化等作用,与以健脾祛痰、清热利湿为功效的芪术方治则一致,为重要的药效成分,为防止其在制剂过程中损失,故先提取两味药材中的挥发油,药渣再与其余四味药共同提取,黄芪有效成分及其多糖水溶性均较好,且有研究表明,黄芪水煎液能有效干预非酒精性脂肪肝大鼠血脂水平、肝功能和脂质过氧化水平。虎杖中有效成分虎杖苷易溶于热水,虎杖水煎液可抑制脂质过氧化、减少氧化应激来改善肝功能,同时水提法安全性较高,操作方便,成本低。因此选择水提法作为本方的提取方法。
1.3指标成分选择
芪术方由黄芪、麸炒苍术、虎杖、杠板归、泽兰、广陈皮六味药组成。君药黄芪中黄酮类,比如毛蕊异黄酮葡萄糖苷,可以影响胰岛素抵抗,改善肝纤维化,从而预防、治疗非酒精性脂肪性肝炎。麸炒苍术、虎杖、杠板归、泽兰四味臣药中,仅虎杖中具有专属性较好且较为稳定的化学成分虎杖苷,该成分可通过抑制机体炎症反应,降低胰岛素抵抗及调节相关蛋白表达来治疗非酒精性脂肪肝。使药广陈皮中有效成分橙皮苷具有性质稳定、分布均匀的特定,可通过抑制肝脏组织内相关蛋白的表达,起到调节血脂,保护肝脏的作用。因此选择黄芪中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、虎杖中的虎杖苷、广陈皮中的橙皮苷作为工艺跟踪指标进行研究。
1.4药材产地的确定
药材的质量与产地具有很大的相关性,对方中药材的道地产地进行文献及市场的调研,选择出能满足工业大生产需求、药材质量较好的产地药材。黄芪,道地产区为内蒙古、山西、甘肃,市场流通的多为甘肃与内蒙古两地所产黄芪,故选择此地区作为主要产地来源。苍术,分布广泛,道地产区为河北、山西,市面上的苍术药材多来自内蒙古,故选择内蒙古作为主要产地。广陈皮,产自广东,其中又以新会陈皮质量最佳,故选择广东新会区作为药材主产地,在选择广陈皮的储存年限上,一方面考虑到市场流通情况,一年陈广陈皮来源丰富,更易购得,另一方面考虑到经济效益,广陈皮价格与其储存年限直接相关,每增加一年,价格上涨接近一倍,同时未出现文献报道不同储存年限广陈皮存在明显差异的药效,因此,本研究选择一年储存期的广陈皮。杠板归、泽兰、虎杖则分布广泛,无道地产区的研究,市场调研发现,杠板归主要产区多为广西、河北;泽兰主要产区多为安徽、江苏;虎杖主要产区主要为江苏、安徽、江西,均可作为药材的产地来源。
1.5药材质量研究
按照《中国药典》(2020年版)一部药材和饮片项下含量检测方法对本研究所用药材进行含量测定与薄层鉴定,结果见表3、图4(a、b、c)。各药材检测鉴定结果均符合要求。
表3芪术方中药材含量检测
2.挥发油提取工艺
芪术颗粒方中麸炒苍术、广陈皮均含有挥发油,具有健脾、燥湿、保肝、抗炎和抗氧化等作用,与以健脾祛痰、清热利湿为功效的芪术颗粒治则一致,为重要的药效成分。本研究采用水蒸馏提取法对麸炒苍术和广陈皮中混合挥发油进行提取,以挥发油提取量为指标采用单因素试验考察浸泡时间、提取时间、加水量3个因素对挥发油提取工艺的影响;在此基础上,采用挥发油提取量、挥发油中特征物质苍术素质量为指标进行综合评分,开展正交试验考虑各因素的交互作用,以确定挥发油的提取工艺。
2.1挥发油提取
称取麸炒苍术45g、广陈皮30g,加入适量水,浸泡一定时间后,按《中国药典》(2020年版)四部“2204挥发油测定法”中甲法,连接挥发油提取器,加热持保持微沸提取一定时间,关火静置1h,读取挥发油体积。
2.2单因素实验
2.2.1浸泡时间
按“2.1”项下挥发油提取方法,称取药材,平行4份,加入10倍量(750mL)的水,分别浸泡0h、1h、2h、3h后,保持微沸提取6h,记录所得混合挥发油体积。考察浸泡时间对混合挥发油提取量的影响,结果见图5。
由图5可知,随浸泡时间延长,所得挥发油体积呈先降低后增加的趋势。浸泡时间为0h时,所得混合挥发油体积最大,为0.81mL;浸泡时间为2h时,所得混合挥发油体积最小,为0.73mL。在浸泡时间为0~2h范围内,提取所得麸炒苍术、广陈皮挥发油体积随着浸泡时间的延长而稍有降低,可能是因为延长浸泡时间导致药材中水溶性成分浸出增多,对挥发油的提取产生影响;当浸泡时间为3h时,混合挥发油体积又稍有增加,这一变化可能是因为麸炒苍术质地较厚,在经过长时间浸泡后组织结构才出现充分膨胀破坏,增加了苍术挥发油的浸出引起。考虑到后期工业生产的效率,故后续选择0h、1h、2h三个水平进行下一步正交试验优化。
2.2.2提取时间
按“2.1”项下挥发油提取方法,称取药材,平行3份,加入10倍量(750mL)的水,浸泡3h,保持微沸提取,每隔30min记录一次所得混合挥发油体积读数,维持8h。考察提取时间对混合挥发油提取量的影响,结果见图6。
由图6可知,随着提取时间的延长,麸炒苍术、广陈皮挥发油的提取量呈增加趋势。在提取时间0.5~6.5h范围内,提取得混合挥发油体积平稳升高;提取时间为6.5h后,混合挥发油体积增加的量开始减少、增速变缓;提取时间为7.5h时,混合挥发油体积达到最大,为1.04mL;提取时间延长至8h时,混合挥发油体积不再增加,说明混合挥发油已提取完全。综上,后续选择4.5h、6h、7.5h三个水平进行下一步正交试验优化。
2.2.3加水量
按“2.1”项下挥发油提取方法,称取药材,平行4份,分别加入6倍量(450mL)、8倍量(600mL)、10倍量(750mL)、12倍量(900mL)的水,浸泡3h后,保持微沸提取6h,记录所得混合挥发油体积。考察加水量对混合挥发油提取量的影响。结果见图7。
由图7可知,随着加水量的增加,麸炒苍术、广陈皮挥发油的提取量呈先增加后降低趋势。当加水量为10倍时所得混合挥发油体积最大,为0.80mL,说明适当增加溶剂用量有助于挥发油充分浸出提取;当加水量增加为12倍时,混合挥发油的提取量略有下降,为0.78mL,可能是因为溶剂用量过大会增加挥发油在提取液中的溶解量。故后续选择加水量为药材质量的6倍(450mL)、8倍(600mL)、10倍(750mL)三个水平进行下一步正交试验优化。
通过单因素实验,初步得到挥发油提取工艺为:称取麸炒苍术45g、广陈皮30g,加10倍量水,不浸泡,提取7.5h。接下来将在此基础上进行正交试验进一步优化提取工艺。
2.3正交试验
2.3.1正交试验设计
根据麸炒苍术、广陈皮混合挥发油提取单因素试验结果,按照L9(34)正交表进行实验设计,选择浸泡时间、提取时间、加水量为考察因素,每个因素设置3个水平,因素水平见表4。
表4麸炒苍术、广陈皮混合挥发油提取的正交试验因素水平表
按“2.1”项下挥发油提取方法,称取药材,平行9份,按照表2因素水平进行挥发油提取,记录各组提取的混合挥发油体积读数,并收集各组挥发油测定其中苍术素含量。
2.3.2挥发油苍术素含量测定方法
2.3.2.1色谱条件
色谱仪:Agilent 1260II 色谱柱:Kromasil 100-5C18
进样量:10μL 流速:1mL/min
流动相:甲醇-水(79:21) 柱温:30℃
2.3.2.2对照品溶液制备
精密称定适量苍术素对照品,加甲醇制成每1mL含20μg的苍术素对照品溶液。
2.3.2.3供试品溶液制备
取混合挥发油10μL,用甲醇稀释并定容于10mL容量瓶中,取1mL于离心管中,离心(13000r/min,10min,4℃),取上清液过0.22μm有机相滤膜,即得。
典型色谱图见图8,在该液相色谱条件下,对照品和供试品的色谱峰峰形良好,无杂峰,苍术素在对照品和供试品图谱的保留时间基本一致,为17.71min,表明该色谱条件可以用于苍术素的含量测定。计算所得挥发油中苍术素的质量:挥发油苍术素质量(mg)=苍术素含量(mg/ml)×挥发油体积(ml)。
2.3.3综合评分指标
选用挥发油中苍术素质量和挥发油体积进行加权评分计算。以单项挥发油苍术素质量及混合挥发油体积最高者为该项100分,各组每项结果分别与其最高分项作比后乘100作为该组单项得分。对两项进行加权赋分,其中,麸炒苍术为芪术方中臣药、广陈皮为使药,且苍术素为评判苍术挥发油药效的重要指标,故设置挥发油苍术素质量权重系数为0.6,挥发油体积权重系数为0.4。
计算公式:评分=[(挥发油苍术素质量/最大挥发油苍术素质量)×0.6+(挥发油体积/最大挥发油体积)×0.4]×100。
2.3.4正交试验结果与方差分析
对结果进行直观分析和方差分析。正交试验直观分析结果见表5,方差分析结果见表6。
表5挥发油提取工艺正交试验结果
表6挥发油提取工艺正交试验方差分析
由表5可知,各因素极差分别为1.554、23.045、3.642,RB>RC>RA,说明各因素对挥发油提取工艺的影响大小顺序为B(提取时间)>C(加水量)>A(浸泡时间)。通过直观分析的均值可知,因素B(提取时间)中,B3(7.5h)>B2(6h)>B1(4.5h),提取时间为7.5h混合挥发油提取效果最好;因素A(浸泡时间)中,A1(0h)>A3(2h)>A2(1h),浸泡时间为0h提取效果最好;因素C(加水量)中,C2(8倍)>C3(10倍)>C1(6倍),加水量为8倍时提取效果最好。由表6可知,方差分析结果显示因提取时间对挥发油提取工艺具有显著性影响,浸泡时间、加水量两个因素对挥发油的提取工艺无显著性影响。
综合考虑提取效果、生产能耗及时间成本等因素,选择最佳提取工艺。考虑到因素A(浸泡时间)A1、A2、A3间几乎无差异,故选择浸泡时间最短的A1;因素B(提取时间)存在显著性差异,且在一定范围内提取时间越长混合挥发油提取效果越好,故选择B3;直观分析中,加水量因素中C2提取效果更好,故选择C2。综合上述各角度,挥发油工艺的最佳条件为A1B3C2,即:浸泡时间0h、提取时间7.5h、加水量8倍(600mL)。
2.4验证试验
按“2.1”项下挥发油提取方法,称取药材,平行三份,加8倍量(600mL)水,不浸泡,保持微沸提取7.5h,记录各组提取得挥发油体积,并收集挥发油测定苍术素含量,对最佳提取工艺条件进行验证,结果见表7。
表7挥发油提取工艺验证试验结果
由表7可知,正交试验优选工艺所得3份混合挥发油体积分别1.22mL、1.30mL、1.29mL,平均值1.27mL。苍术素含量分别48.86mg、49.19mg、51.06mg,平均值为49.70mg。三份挥发油所含苍术素质量和体积RSD<3%,平行性较好,说明工艺较为稳定。提取得挥发油量与挥发油中苍术素质量均优于正交试验中评分最高的第9组,说明正交试验优化的提取工艺较为成功。
3.挥发油包合物制备工艺
由于挥发油类成分易挥发、易被氧化、易发生生物转化而不稳定,用传统的喷洒工艺加入至颗粒剂中,难以使该类成分在制剂中充分保留,影响芪术颗粒全方药效的发挥。因此,本研究选用饱和水溶液法制备芪术颗粒挥发油β-环糊精包合物,采用单因素试验与Box-Behnken响应面优化设计相结合研究包合物的制备工艺,并对所得包合物进行薄层鉴定、红外光谱及差示扫描量热分析等表征,以期最大限度的保留挥发油成分并增强其稳定性。
3.1包合物制备方法
采用饱和水溶液法进行包合物制备。取β-环糊精适量,加设定温度的纯水使充分溶解,持续搅拌(转速960r/min),逐滴加入2.0mL以无水乙醇稀释的挥发油(50%,v/v),于恒温条件下搅拌一定时间后,冷却至室温,置4℃冷藏24h,抽滤,用石油醚(45mL,15mL/次)洗涤,置于37℃烘箱干燥4h,称重,即得,计算包合物得率。结果见表8。
包合物得率=(包合物质量/环糊精质量+挥发油质量)×100%。
3.2包合物评价方法
3.2.1空白回收率测定
移取挥发油1.0mL,加入600mL纯水,平行三份,连接挥发油提取器,按“2.1”项下挥发油提取方法,加热提取3h,静置冷却1h后读取挥发油体积,计算空白回收率。
空白回收率=(提取的挥发油量/加入的挥发油量)×100%。
表8挥发油空白回收率
三次实验提取的挥发油体积分别为0.90mL、0.90mL、0.88mL,计算挥发油的空白回收率为89.33%,RSD为1.29%,说明挥发油在回收过程中损失较少,该方法可用于包合率的测定。
3.2.2包合率测定
取包合物,称定质量,加入600mL纯水,按照“3.2.1”项下空白回收率测定法进行挥发油提取,静置1h后读取挥发油体积,计算包合率。
包合率=(包合物中挥发油体积/挥发油加入体积×空白回收率)×100%。
3.2.3综合评分
采用主观加权综合评分法。包合率可以反映挥发油被包合的效率及包合物的稳定性,是评价包合效果的主要指标,包合物得率可以判断包合工艺的原料使用情况,兼顾生产中的成本问题,作为另一指标。因此,将包合率权重系数定为0.7、包合物得率权重系数定为0.3,计算综合评分。
综合评分=包合率×0.7+包合物得率×0.3。
3.3包合物制备工艺研究
根据前期文献调研及预实验结果,选用单因素实验与Box-Behnken响应面设计相结合,对包合温度、包合时间、挥发油与β-环糊精的比例等包合过程中的关键因素进行考察,以确定包合物的制备工艺。
3.3.1包合温度考察
按“3.1”项下包合物制备方法,取β-环糊精4g,挥发油1.0mL(用等量无水乙醇溶解),分别于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃温度下,恒温搅拌60min,制备挥发油包合物,按“3.1”、“3.2.2”项下方法测定包合物得率、包合率,并计算综合评分,考察温度对包合物制备工艺的影响。结果见表9。
表9包合温度考察结果
由表9可知,随着包合温度的增加,包合率呈先增加后降低的趋势。当包合温度为60℃时,包合率最大,为51.49%,说明温度升高可加快包合过程;当包合温度超过60℃时,包合率下降至44.78%,可能是较高的温度会造成挥发油成分损失的缘故。当包合温度超过40℃时,包合物得率均可达到80%以上。综合考虑包合温度对包合率、包合物得率的影响,兼顾较高温度对挥发油造成损失的情况,选择50℃进行后续包合物制备工艺考察。
3.3.2投料比考察
按“3.1”项下包合物制备方法,分别取β-环糊精4g、6g、8g、10g,挥发油1.0mL(用等量无水乙醇溶解)4份,于50℃下恒温搅拌60min,制备挥发油包合物,按“3.1”、“3.2.2”项下方法测定包合物得率、包合率,并计算综合评分。考察投料比对包合物制备工艺的影响,结果见表10。
表10投料比考察结果
由表10可知,随着β-环糊精用量的增加,包合率呈现不断增加的趋势。当β-环糊精用量为8g时,包合率与包合物得率均达到最大,分别为90.68%、86.53%;当β-环糊精用量增加至10g时,包合率不再增加,但包合物得率下降;表明投料比为1︰8时制备包合物较合适。综合考虑,选择挥发油与β-环糊精的投料比为1︰8进行后续包合物制备工艺考察。
3.3.3包合时间考察
按“3.1”项下包合物制备方法,取β-环糊精8g,挥发油1.0mL(用等量无水乙醇溶解),平行5份,分别于50℃条件下搅拌15、30、45、60、90min,制备挥发油包合物,按“3.1”、“3.2.2”项下方法测定包合物得率、包合率,并计算综合评分,考察包合时间对包合物制备的影响。结果见表11。
表11包合时间考察结果
由表11可知,随着包合时间的增加,包合率逐渐增加,由60.45%增加至88.44%。当包合时间为60min时,包合率达到最大,包合时间继续增加,包合率则保持不变,包合物得率也无明显变化,表明β-环糊精于60min内能完成对挥发油的包合并达到体系平衡。因此,选择包合时间为60min制备挥发油包合物。
通过单因素实验考察,得到芪术颗粒挥发油包合工艺的主要参数为:包合温度50℃,挥发油与β-环糊精比例(mL∶g)1∶8,包合时间1h。考虑到各因素间的交互作用可能对包合物制备产生影响,根据单因素实验结果,采用Box-Behnken响应面法对挥发油包合工艺进行优化。
3.3.4Box-Behnken响应面法优化工艺
3.3.4.1因素水平与试验设计
根据单因素试验中各因素的最佳水平所在位置进行区间选择:包合温度在50℃、60℃综合评分变化不明显,故选择40~70℃这一区间对最佳包合温度进行预测;投料比选择1∶6~1∶10这一区间;包合时间在60min后对综合评分的影响较小,将60min作为最佳水平意义不大,故选择30~60min这一区间。以上三因素作为自变量,综合评分作为响应值,按Box-Behnken的中心组合试验设计原理得到三因素三水平表(见表12),结果见表13、表14。
表12Box-Behnken响应面法因素水平
表13试验设计与结果
表14方差分析
3.3.4.2模拟拟合与方差分析
通过Design Expert 13.0.1软件对表6数据进行多元回归拟合,得到方程Y=0.8318+0.0251A+0.0297B+0.1077C+0.0079AB+0.0145AC+0.0302BC-0.0113A2-0.0465B-0.0949C2。方差分析结果见表14中,模型P=0.0003<0.01,达到极显著水平,失拟项p=0.1619>0.05,不显著,说明该回归方程能够较好的拟合出包合物制备的真实水平,F值的大小可反映各因素对包合工艺综合评分的影响程度,依次为C(包合温度)>B(投料比)>A(包合时间)。R2=0.9628>0.9,表明综合评分实测值与预测值有较高的相关性,模型能较好的预测综合评分随包合工艺各因素的变化。
3.3.4.3响应面分析
通过Design Expert 13.0.1软件绘制三维响应面图,结果如图9所示,可以直观的反映各因素对综合评分的影响。包合物的综合评分随包合时间的增加呈现不断升高的趋势,该因素的坡度在三因素中最为平缓,说明该因素对综合评分影响程度较低;随着投料比中β-环糊精用量的增加,综合评分呈现先升高再降低的趋势,在较高包合温度时,逐渐趋于平缓,其坡度较包合时间更陡峭;随着包合温度的升高,综合评分呈现先升高再降低的趋势,β-环糊精用量较大时逐渐趋于平缓,其曲面坡度较包合时间与投料比更陡峭,变化趋势为三因素中最大。说明对包合物综合评分影响最大的因素是包合温度,其次是β-环糊精用量,包合时间影响最小,这与F值的判断一致。
3.3.4.5验证实验
通过Design Expert 13.0.1软件对回归模型进行数学分析,得到包合物制备的最优工艺参数为:包合时间58min、投料比1︰9.45、包合温度64℃,按此条件制备包合物的综合评分预期值为89.96%。结合实际操作与生产,包合时间调整为60min,β-CD用量调整为1:9,包合温度64℃,按该工艺进行3次平行实验进行验证,测定其各项指标,见表15。结果显示,综合评分平均值为87.59%,RSD值0.864%,与预期值89.96%接近,表明回归模型可靠性较高,工艺稳定可行。
表15验证试验结果
3.4包合物表征
3.4.1薄层色谱鉴定
称取β-环糊精、包合物各0.1g,加10mL50%乙醇溶解,滤过,取上清液;取挥发油0.2mL,加2mL无水乙醇溶解;取包合物按“2.2.1”项下方法提取挥发油,取0.2mL,加2mL无水乙醇溶解。吸取上述4种溶液各5μL,点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60-90℃)∶乙酸乙酯∶三氯甲烷(15∶1∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸乙醇溶液显色,105℃下显色至斑点清晰,见图10。结果显示,β-环糊精、包合物的供试品图谱中均未出现斑点,包合物中提取的挥发油与挥发油的供试品图谱中,在相同位置处显相同颜色斑点,说明包合物已形成,其表面无挥发油残留,且包合前后挥发油的主要成分无明显变化。此外,β-环糊精色谱中无挥发油的斑点出现,表明辅料无干扰。
3.4.2红外光谱
取挥发油、β-环糊精、物理混合物和包合物适量,挥发油以溴化钾涂片法制备样品,其余采用溴化钾压片法制备样品,于400~4000cm-1波数范围,进行红外光谱扫描,结果见图11。
图11显示,挥发油分别在2900cm-1、1645cm-1、1395cm-1和880cm-1处有-C-H伸缩振动、-C=C-吸收峰、-CH3面内弯曲振动和芳香环振动,可能来自挥发油中D-柠檬烯、β-蒎烯等萜类及苍术素等呋喃烯类成分;挥发油和β-环糊精的特征峰在物理混合物图谱中均有出现;但包合物的红外图谱显示,挥发油在2900cm-1、1645cm-1和880cm-1处的特征峰均消失,推测挥发油中的主要成分苍术素、D-柠檬烯等成分被包合在β-环糊精中,表明挥发油包合物制备成功。
3.4.3差示扫描量热法
称取β-环糊精、物理混合物和包合物各5mg,置于铝制坩埚中,用差式扫描量热仪进行分析。测定参数设置如下:氮气体积流量40mL/min,升温速度10℃/min,升温范围25~400℃,结果见图12。
如图12所示,β-环糊精与物理混合物在100℃、230℃和320℃出现吸热峰,分别为β-环糊精空腔中结晶水蒸发的吸热峰、β-环糊精的熔融峰和分解峰;包合物的曲线中,β-环糊精100℃的吸热峰消失,可能是包合在β-环糊精空腔中的挥发油将结晶水置换出来的缘故,这也从另一个角度说明挥发油包合物的形成;230℃的吸热峰消失可能与包合物形成后β-环糊精热稳定性提高有关。此外,物理混合物和包合物的曲线中,在320℃左右出现数个吸热峰,可能是受到挥发油中高沸点成分的影响所致。
3.3.5小结
该部分研究通过Box-Behnken响应面法优化了芪术颗粒中挥发油环糊精包合物制备工艺,该法既补足了单因素试验中无法充分体现各因素间交互作用的缺陷,也改善了正交试验受线性模型限制的缺点,得到了稳定可靠的包合物制备工艺,即:挥发油与β-环糊精比例1∶9,包合温度64℃,包合时间1h,所得包合物包合率90.68%,包合物得率80.40%。同时结合薄层鉴定、红外光谱及差示扫描量热分析三种方法确证了包合物的形成。本研究将有助于芪术颗粒中挥发油类成分在制剂及储存过程中最大限度的保留,为后期芪术颗粒的制备工艺研究奠定了基础。
4.水提工艺
4.1药液提取
称取黄芪30g、虎杖18g、杠板归18g、泽兰18g、麸炒苍术18g、广陈皮18g,麸炒苍术与广陈皮先按“2.1”项下方法提取挥发油,药渣与其余药味一起,加入一定倍量水,浸泡后,加热至药液沸腾开始计时,进行提取、过滤,合并所有提取液,记录药液体积。
4.2水提工艺评价方法
选用芪术方中君药黄芪、臣药虎杖、使药广陈皮中易于检测且专属性良好的有效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、虎杖苷、橙皮苷作为指标成分,计算提取药液中各成分的转移率,并测定出膏率。
4.2.1对照品溶液的制备
精密称定毛蕊异黄酮葡萄糖苷、虎杖苷和橙皮苷对照品适量,以80%甲醇制成每1mL含10μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、100μg虎杖苷和400μg橙皮苷的混合对照品溶液。
4.2.2供试品溶液的制备
取药液1mL,离心(13000r/min,10min,4℃),取上清液过0.22μm水系滤膜,即得。
4.2.3色谱条件
色谱仪:Agilent 1260II 色谱柱:Kromasil 100-5C18
进样量:10μL 流速:1mL/min
流动相:乙腈-0.2%甲酸水 柱温:30℃
流动相梯度变化如表(16-17):
表16流动相变化梯度
表17检测波长变化时间
由图13可知,在该色谱条件下,对照品和供试品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、虎杖苷和橙皮苷色谱峰峰形良好,与其他色谱峰之间分离度也较好,保留时间基本一致,分别为15min、16min、22min左右,表明该色谱条件可用于芪术方提取液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、虎杖苷和橙皮苷的浓度测定,计算转移率。
转移率=(测得浓度×水提液总体积)/(药材中指标成分含量×药材质量)×100%。
4.2.4出膏率测定
移取芪术方药液5.0mL于干燥至恒重的扁形称量瓶中,精密称定,开启瓶盖在105℃下干燥3小时,将瓶盖盖好,移置干燥器,放冷30分钟,精密称定,再在上述温度干燥1小时,放冷,称重,至连续两次称重的差异不超过5mg为止,根据减失的重量,计算得膏率。
得膏率=(干膏质量/所取供试品体积)×(总提取液体积/所取药材质量)×100%。
4.3水提工艺单因素实验
4.3.1浸泡时间考察
麸炒苍术、广陈皮参与了挥发油提取工艺,其药渣吸水不会再对吸水率产生影响,故考察剩余四位药的吸水率。称取黄芪30g、虎杖18g、杠板归18g、泽兰18g,加入10倍量水(840mL)浸泡,在别在15、30、45、60、75、90min时过滤,量取滤液体积,加入水量与滤液体积的差值即为药材吸水体积,与药材质量的比值,即为药材吸水量,结果见图14。
吸水率(%)=[(加水量-滤液体积)/药材质量]×100%。
在45min前,药材的吸水率有较明显的增高趋势,45min后变化趋势减缓,于浸泡75min后不再增加达到最大吸水率154.8%,这可能与药材性质有关:黄芪、虎杖为根类药物,泽兰、杠板归为茎类药物,其吸水效果均稍差,且吸收速度较缓慢,经浸泡后黄芪、虎杖质地变软,泽兰和杠板归的茎类部分仍较坚硬。浸泡60min与75min的吸水率无显著性差异,考虑到生产上节约时间,选择60min作为浸泡时间进行下一步的实验。
4.3.2提取次数考察
按“4.1”项下药液提取方法,称取药材,平行三份,加入药材10倍量(1140mL)的水,浸泡1h后,加热至药液沸腾开始计时,分别提取1、2、3次,每次提取1h,过滤,合并所有提取液记录所得药液体积。按“4.2”项下方法测定指标成分转移率和出膏率,考察提取次数对各指标成分转移率及出膏率的影响,结果见表18。
表18提取次数考察结果
由表18可知,在提取次数为一次时,毛蕊异黄酮葡萄糖苷、虎杖苷、橙皮苷的转移率分别为39.83%、28.34%、55.18%;提取次数为两次时,三个指标成分的转移率分别为64.08%、46.31%、88.96%,较提取一次时的指标成分转移率明显上升;第3次提取后,虎杖苷、橙皮苷的转移率进一步增加,分别达到了56.88%和98.68%,毛蕊异黄酮葡萄糖苷的转移率较提取次数为一次时未出现明显变化,考虑到虎杖苷、橙皮苷仍存在增长的趋势,故选择煎煮三次进行下一因素的考察。
4.3.3加水量考察
按“4.1”项下药液提取方法,称取药材,平行四份,分别加入药材6(684mL)、8(912mL)、10(1140mL)、12(1368mL)倍量的水,浸泡1h后,加热至药液沸腾开始计时,提取2次,每次1h,过滤,合并所有提取液,记录所得药液体积。按“4.2”项下方法测定指标成分转移率和出膏率,考察加水量对各指标转移率及出膏率的影响,结果见表19。
表19加水量考察结果
由表19可知,加6倍量水时,毛蕊异黄酮葡萄糖苷、虎杖苷、橙皮苷的转移率分别为60.56%、38.85%、51.58%;加入8倍量水时,三个指标成分的转移率分别为64.50%、39.35%、77.32%,毛蕊异黄酮葡萄糖苷和虎杖苷的转移率较6倍量水时有较小幅度的增加,橙皮苷的转移率则出现明显增加;加入10倍量水时,毛蕊异黄酮葡萄糖苷、虎杖苷、橙皮苷的转移率分别为68.17%、47.28%、83.68%,三个指标成分转移率均较的加入8倍量水时较小幅度增加;加入12倍量水时,毛蕊异黄酮葡萄糖苷、虎杖苷、橙皮苷的转移率分别为58.34%、52.32%、84.67%,毛蕊异黄酮葡萄糖的转移率出现下降的情况,这可能是因毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积较小,受基线波动引起的误差虎杖苷和橙皮苷指标成分转移率存在较小幅度的增加,几乎不再增长,故选择加入10倍量水作为最佳水平。
4.3.4提取时间考察
按“4.1”项下药液提取方法,称取药材,平行四份,加入药材10倍量的水(1140mL),浸泡1h后,加热至药液沸腾开始计时,提取2次,提取时间分别为0.5h、1h、1.5h,记录所得药液体积。按“4.2”项下方法测定指标成分转移率和出膏率,考察提取时间对各指标转移率及出膏率的影响,结果见表20。
表20提取时间考察结果
由表20可知,提取时间为0.5h时,毛蕊异黄酮葡萄糖苷、虎杖苷、橙皮苷的转移率分别为55.97%、49.22%、68.83%;提取时间为1h时,三个指标成分的转移率分别为69.38%、50.06%、84.06%,毛蕊异黄酮葡萄糖苷和橙皮苷的转移率较提取时间为0.5h时有明显上升;提取时间为1.5h时,三个指标成分的转移率分别74.41%、50.79%、83.23%,毛蕊异黄酮葡萄糖苷的转移率增长趋势变缓,虎杖苷与橙皮苷的转移率则未出现明显变化。考虑到三个指标成分转移率在提取时间为1h后均未出现明显的增长,故选择提取时间为1h作为最佳水平。
通过单因素实验,得到初步提取工艺,即:称取黄芪30g、虎杖18g、杠板归18g、泽兰18g、麸炒苍术18g、广陈皮18g,麸炒苍术与广陈皮先按“2.1”项下方法提取挥发油,药渣与其余药味一起,加入10倍量(1140mL)的水,浸泡1h,加热至药液沸腾开始计时,提取三次,每次提取1h,过滤,合并所有提取液,即得。将在此基础上进行正交试验进一步优化提取工艺。
4.4水提工艺正交试验
4.4.1正交试验设计
根据L9(34)正交表进行实验设计,以提取时间、提取次数、加水量为考察因素,每个因素设置三个水平,因素水平表见表21。
表21水提工艺正交试验因素水平表
按“4.1”项下药液提取方法,称取药材,平行9组,每组平行三份,按照正交试验因素水平表进行提取,过滤,合并所有提取液,记录药液体积。并按“4.2”项下方法测定指标成分转移率和出膏率,计算综合评分。结果见表22-23。
在三指标成分中,毛蕊异黄酮葡萄糖苷为君药黄芪中成分,但该指标但含量较低,峰面积较小,可能会受基线波动影响,故赋以0.4分;虎杖苷为臣药虎杖中成分,峰面积较大且稳定,赋以0.4分;橙皮苷为使药成分,同时参与了挥发油的提取,较其他两成分更易溶出,对整体的代表性不强,赋以0.2分。后进行综合评分。
综合评分=毛蕊异黄酮葡萄苷转移率×0.4+虎杖苷转移率×0.4+橙皮苷转移率×0.2。
表22水提工艺正交试验结果
表23水提工艺正交试验方差分析
4.4.2正交试验结果与方差分析
由表22可知,A3B3C3的因素组合综合评分最高,该提取工艺条件下,芪术方中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、虎杖苷、橙皮苷的转移率分别为78.11%、71.75%、97.73%,均高于其他组;根据直观分析,以毛蕊异黄酮葡萄糖苷、虎杖苷和橙皮苷的综合评分为指标,各因素极差分别为0.003、0.002、0.027,Rc>RA>RB,说明对水提工艺指标转移率影响力大小次序为C>A>B,即提取次数>提取时间(h)>加水量(倍)。由各因素的均值可知,因素C(提取次数)中,C3(3次)>C2(2次)>C1(1次),提取次数为3次提取效果最好;因素A(提取时间)中,A3(1.5h)>A2(1h)>A1(0.5h),提取时间为1.5h提取效果最好;因素B(加水量)中,B3(12倍)>B2(10倍)>B1(8倍),加水量为12倍时提取效果最好。由表23可知,多因素方差分析结果显示,三因素对转移率均存在显著性影响。其中因素C(提取次数)则对指标成分的转移率存在极显著影响,这与直观分析所表现的趋势一致。
综上所述,选择最佳提取工艺为A3B3C3,即:加入药材12倍量水(1368mL),提取三次,每次提取1.5h。
4.5验证试验
按“4.1”项下药液提取方法,平行三份,按正交试验优化的最佳工艺,加药材12倍量的水(1368mL),浸泡1h后,提取三次,每次1.5h,过滤,合并所有提取液,记录各组药液体积。按“4.2”项下方法测定指标成分转移率和出膏率,对最佳提取工艺条件进行验证,结果见表24。
所得三份药液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、虎杖苷、橙皮苷转移率分别为75.13%、73.16%、94.40%,三指标成分转移率RSD值均小于3%,与正交第九组78%、71%、97%相近,工艺重现性较好,稳定可靠。
表24水提工艺验证试验结果
4.6小结
通过单因素实验及正交试验优化后,确定芪术方的水提工艺为:称取黄芪30g、虎杖18g、杠板归18g、泽兰18g、麸炒苍术18g、广陈皮18g,麸炒苍术与广陈皮先按“2.1”项下方法提取挥发油,药渣与其余药味一起,加入12(1368mL)倍量水,浸泡1h后,加热至药液沸腾开始计时,提取3次,每次1.5h,过滤,合并所有提取液,即得。
5.研究内容总结
本研究目前确定工艺为,称取黄芪30g、虎杖18g、杠板归18g、泽兰18g、麸炒苍术18g、广陈皮18g。麸炒苍术与广陈皮加入8倍量的水,按《中国药典》(2020年版)四部“2204挥发油测定法”中甲法,连接挥发油提取器,保持微沸提取7.5h,关火静置1h,读取挥发油体积,并收集挥发油。以饱和水溶液法制备挥发油包合物,按照所得挥发油体积:β-环糊精质量=1:9的比例,称取β-环糊精,于64℃下纯水中使充分溶解,持续搅拌(转速960r/min),逐滴加入以无水乙醇稀释的挥发油(50%,v/v),于该温度下搅拌一定时间后,冷却至室温,置4℃冷藏24h,抽滤,用石油醚(45mL,15mL/次)洗涤,置于37℃烘箱干燥4h,称重,即得挥发油包合物。麸炒苍术与广陈皮提取挥发油后的药渣与与其余药味一起,加入12(1368mL)倍量水,浸泡1h后,加热至药液沸腾开始计时,提取3次,每次1.5h,过滤,合并所有提取液,即得。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种治疗非酒精性脂肪性肝病的中药组合物,其特征在于,是由下列重量份的原料药制成:生黄芪5-25份、苍术3-15份、虎杖3-15份、杠板归3-15份、泽兰3-15份、广陈皮2-10份。
2.根据权利要求1所述的中药组合物,其特征在于,是由下列重量份的原料药制成:生黄芪份10-20份、苍术6-12份、虎杖6-12份、杠板归6-12份、泽兰6-12份、广陈皮4-8份。
3.根据权利要求2所述的中药组合物,其特征在于,是由下列重量份的原料药制成:生黄芪15份、苍术9份、虎杖9份、杠板归9份、泽兰9份、广陈皮6份。
4.根据权利要求1-3所述的中药组合物,其特征在于,所述的药物的药剂是颗粒剂。
5.根据权利要求1-3任一所述的中药组合物的制备方法,其特征在于,具体的步骤为:
(1)采用“2204挥发油测定法”中甲法提取挥发油:称取麸炒苍术、广陈皮,加入8倍量的水,浸泡一定时间后,连接挥发油提取器,加热保持微沸提取一定时间,关火静置1h,读取挥发油体积;
(2)饱和水溶液法制备挥发油包合物,按照所得挥发油体积:β-环糊精质量=1:9的比例,称取β-环糊精,于64℃下纯水中使充分溶解,持续搅拌(转速960r/min),逐滴加入以无水乙醇稀释的挥发油(50%,v/v),于该温度下搅拌一定时间后,冷却至室温,置4℃冷藏24h,抽滤,用石油醚(45mL,15mL/次)洗涤,置于37℃烘箱干燥4h,称重,即得挥发油包合物;
(3)水提工艺:麸炒苍术与广陈皮提取挥发油后的药渣与与其余药味一起,加入12(1368mL)倍量水,浸泡1h后,加热至药液沸腾开始计时,提取3次,每次1.5h,过滤,合并所有提取液,即得。
6.根据权利要求1-3任一所述的中药组合物在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用。
7.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述的非酒精性脂肪性肝病为脾虚湿热兼有痰湿型非酒精性脂肪性肝病。
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Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101125185A (zh) * | 2006-08-16 | 2008-02-20 | 孙瑞山 | 治疗脂肪肝的中药 |
CN101124932A (zh) * | 2007-06-08 | 2008-02-20 | 李运乃 | 一种治疗病毒性肝炎合并脂肪肝等疾病的煎饮茶制剂 |
CN104013856A (zh) * | 2014-06-26 | 2014-09-03 | 成光宇 | 一种治疗脂肪肝的中药制剂 |
CN104707106A (zh) * | 2015-03-18 | 2015-06-17 | 苏州市天灵中药饮片有限公司 | 一种治疗脂肪肝的中药组合物及其制备方法 |
CN105327045A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-02-17 | 潘建荣 | 治疗非酒精性脂肪性肝病的降脂中药以及治疗方法 |
CN105560779A (zh) * | 2014-10-15 | 2016-05-11 | 上海中医药大学附属龙华医院 | 防治非酒精性脂肪性肝病的复方制剂及其用途 |
CN106109767A (zh) * | 2016-07-13 | 2016-11-16 | 郑亮 | 一种防治非酒精性脂肪性肝病的复方制剂 |
CN109589388A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-04-09 | 王世豪 | 一种治疗脾气虚、肝肾郁热的中药组合物及其制备方法 |
WO2022014580A1 (ja) * | 2020-07-13 | 2022-01-20 | 国立大学法人信州大学 | 非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー、非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法、それに用いる試薬及び分析用キット |
CN115252737A (zh) * | 2022-05-23 | 2022-11-01 | 崔翔 | 治疗非酒精性脂肪性肝的中药组合物、制备方法及应用 |
-
2022
- 2022-12-13 CN CN202211594359.7A patent/CN115869358B/zh active Active
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101125185A (zh) * | 2006-08-16 | 2008-02-20 | 孙瑞山 | 治疗脂肪肝的中药 |
CN101124932A (zh) * | 2007-06-08 | 2008-02-20 | 李运乃 | 一种治疗病毒性肝炎合并脂肪肝等疾病的煎饮茶制剂 |
CN104013856A (zh) * | 2014-06-26 | 2014-09-03 | 成光宇 | 一种治疗脂肪肝的中药制剂 |
CN105560779A (zh) * | 2014-10-15 | 2016-05-11 | 上海中医药大学附属龙华医院 | 防治非酒精性脂肪性肝病的复方制剂及其用途 |
CN104707106A (zh) * | 2015-03-18 | 2015-06-17 | 苏州市天灵中药饮片有限公司 | 一种治疗脂肪肝的中药组合物及其制备方法 |
CN105327045A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-02-17 | 潘建荣 | 治疗非酒精性脂肪性肝病的降脂中药以及治疗方法 |
CN106109767A (zh) * | 2016-07-13 | 2016-11-16 | 郑亮 | 一种防治非酒精性脂肪性肝病的复方制剂 |
CN109589388A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-04-09 | 王世豪 | 一种治疗脾气虚、肝肾郁热的中药组合物及其制备方法 |
WO2022014580A1 (ja) * | 2020-07-13 | 2022-01-20 | 国立大学法人信州大学 | 非アルコール性脂肪性肝疾患マーカー、非アルコール性脂肪性肝疾患を検出するための方法、それに用いる試薬及び分析用キット |
CN115252737A (zh) * | 2022-05-23 | 2022-11-01 | 崔翔 | 治疗非酒精性脂肪性肝的中药组合物、制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
QIAN LI, 等: "Atractylenolide III ameliorates Non-Alcoholic Fatty Liver Disease by activating Hepatic Adiponectin Receptor 1-Mediated AMPK Pathway", INT BIOL SCI, vol. 18, no. 4, pages 1594 - 1611 * |
刘阳军;郭峰;曾斌芳;: "芪茵颗粒治疗非酒精性脂肪性肝病(肝郁脾虚型)临床研究", 新疆中医药, no. 03, pages 8 - 10 * |
厉姣龙,等: "柔肝方对肝纤维化小鼠肝脏内IL-22分泌和IL-22R1表达作用的研究", 上海中医药大学学报, vol. 36, no. 5, pages 69 - 76 * |
尹述平;: "非酒精性脂肪性肝病的中医证候及用药分析", 中国处方药, no. 03, pages 87 - 88 * |
海仁古丽・艾尔肯;谢晶日;梁国英;栾凤;: "中医药治疗脂肪肝研究进展", 辽宁中医药大学学报, no. 01, pages 98 - 101 * |
王昆;黎华;龚月鹏;周寒;吴红;夏志鸿;: "加味平胃散抗脂肪肝的实验性研究", 光明中医, no. 12, pages 1905 - 1906 * |
王柏果;程婉红;唐聪聪;王芳婷;唐标;尹抗抗;谭达全;: "中医药治疗非酒精性脂肪肝的用药规律研究", 湖南中医杂志, no. 01, pages 135 - 137 * |
覃伟华;王振常;黄晶晶;陈松林;: "柔肝化纤颗粒逆转肝纤维化随机平行对照研究", 实用中医内科杂志, no. 21, pages 33 - 35 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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