CN107693588A - 一种来源于大黄非药用部位的活性提取物及其应用 - Google Patents

一种来源于大黄非药用部位的活性提取物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种来源于大黄非药用部位的活性提取物，该提取物是指将首先采摘于5~8月份的大黄茎、叶柄，去掉腐叶、花絮，并将茎对半剖开，阴干，得到干燥的大黄茎、叶柄；然后所述干燥的大黄茎、叶柄经切段、粉碎后过4号筛，得到大黄粉末；最后所述大黄粉末依次经加热回流提取、减压浓缩、冷冻干燥后即得。同时，本发明还公开了该提取物的应用。本发明可有效减少产品副作用。

Description

一种来源于大黄非药用部位的活性提取物及其应用
技术领域
本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种来源于大黄非药用部位的活性提取物及其应用。
背景技术
大黄为多年生高大草本植物，根粗壮，内部多为黄色。根状茎顶端常残存有棕褐色膜，质托叶鞘；茎直立，中空，具细纵棱，基生叶成密集或稀疏莲座状，茎生叶互生；叶片多宽大，全缘、皱波或不同程度的分裂；花小，白绿色或紫红色，通常排列成圆锥状花絮、头状花絮或者穗状花絮。
大黄是我国传统中药材之一，其药用历史至少有两三千年，最早记载大黄的医籍是《神农本草经》。2015版《中国药典》记载大黄药用来源为蓼科植物掌叶大黄（Rheumpalmatum L.）、唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.)或药用大黄(Rheumofficinale Baill.)的干燥根及根茎，有“泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄”的功效 。另外，大黄还是欧洲人少数仍在使用的传统草药，被列入1988年大不列颠药典。大黄本身在美国不作为药物使用，但它的提取物作为一种松弛剂使用。
2015版《中国药典》和国家食品药品监督管理局网站显示，含有大黄的中成药超过200种，功效涉及清热燥湿、泻火解毒、利湿退黄、化瘀降脂、健胃等。
雷湘等测定大黄素对小鼠的急性毒性作用，观察脏器组织学改变，发现中毒小鼠肝肿大，肝细胞和细胞间隙内均有瘀血，肾脏肾小球明显萎缩，管腔不干净、有管型。研究发现服用大黄药材（根和根茎）水提液后动物均表现出活动减少的症状，并且对胃肠道有一定得刺激作用，引起稀便甚至腹泻。
近30年来，随着饮食习惯、生活节奏的改变，高血脂人数逐年增加。《中国成人血脂异常防治指南（2016 年修订版）》显示：中国人群的血脂水平逐步升高，血脂异常患病率明显增加。中国成人血脂异常总体患病率高40.40%，较往年呈大幅度上升。
自从20世纪90年代末开始，含大黄、决明子等中药的各种降脂、减肥、瘦身保健药品或食品充斥市场，随之而来的各种副作用也越发严重，究其原因，主要是这些产品含有的蒽醌类成分，如番泻苷类，长期使用对人体有一定程度的损伤，如腹泻、腹痛等，且《中药及其制剂不良反应大典》、《中药现代研究与应用》、《中药不良反应与合理用药》、《中药不良反应与临床》等均记载了大黄药材对肝、肾、胃肠道、生殖系统和血液系统等有不同程度的毒性。
因此，亟需寻找一种新的、作用温和而又安全有效的大黄替代品。
《唐本草》记载，大黄茎味酸，苦，寒，无毒，有醒酒，堪生啖，亦以解热之作用。《中国医学大辞典》记载，大黄茎有通大便，清肠热的作用。《四部医典》、《妙音本草》、《晶珠本草》等藏医药典记载,大黄属植物的叶柄不仅生津止渴,还有消食、通便等功效，主治培根病（即消化不良）。我国西北地区少数民族有食用大黄茎的习俗，其茎视为水果，去皮食用，可与苹果相媲美。
在欧美、日本等国家早已广泛生产和消费食用大黄（国外专指叶柄、花茎）。美国每年速冻食用大黄3000~4000吨。近些年来，仅华盛顿和密执安等州，每年淡季在温室栽培食用大黄用于速冻加工达500至I000吨，英国每年用于堆藏加工的食用大黄达9000吨。
大黄作为一种蔬菜具有独特的风味，适于制作多种可爱的馅饼和餐后甜点。此外还有大黄沙拉、大黄酒、大黄汤、大黄蛋糕、大黄馅饼等。大黄茎也可鲜食，糖渍贮藏备用，或把它切成小块，在沸水中灼1分多钟，然后冷冻贮藏备用。这些食品除了它的特殊美味外，美国人公认它有助消化和利肝的作用，把它称作肝脏的清洁剂。
研究发现，大黄花茎及叶柄中营养成分丰富，富含多糖、蛋白质和粗纤维，苹果酸及果胶，氨基酸等成分。氨基酸组成全面，同时大黄含有人体必需的钙、镁、钾、钠、锌、铁、锰、铜、磷等矿物，其中钾、钙、镁、磷的含量较高，大黄茎、叶柄有机酸含量较高，与桃、李、杏及葡萄接近，因此，口感酸爽。
值得指出的是食用大黄的茎及叶柄部分有含量较丰富和凝冻力较强的果胶，它是由D-半乳糖醛酸甲氧酯形成的多聚糖，与水、糖和酸在适当比例配合下易形成胶冻，在人体胃肠中实际上不被消化，是属于膳食中的纤维组分之一。因此，利用这一不被消化的特性，除能促使肠道蠕动外，还可以给人提供“饱感”，因而已经被用来作为加工低能量食品的重要原料。果胶还是治疗胃肠道及胃溃疡等疾病的良好药剂，并与肠道有害物质结合，因而还有清洁肠道作用。
《中国植物志》记载大黄属植物约60种，我国约有39种2变种，分8组。我国大黄主要分布在甘肃、西藏、青海、陕西等省。而甘肃省每年大黄产量约占全国总产量的50%。更重要的是，大黄为多年生高大草本植物，为了促进药用部位根的生长发育，每年需在5~7月份多次人工剪除部分叶片（带叶柄）及茎杆，造成极大的资源浪费和经济损失。因此，对大黄地上部分资源加以开发利用，不仅可以给公司带来经济收入，也会产生良好的社会效益和经济效益。
而对于大黄茎水溶性成分的提取物降血脂的研究，目前尚未见国内外有关文献和专利报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种减少产品副作用的来源于大黄非药用部位的活性提取物。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供该活性提取物的应用。
为解决上述问题，本发明所述的一种来源于大黄非药用部位的活性提取物，其特征在于：该提取物是指将首先采摘于5~8月份的大黄茎、叶柄，去掉腐叶、花絮，并将茎对半剖开，阴干，得到干燥的大黄茎、叶柄；然后所述干燥的大黄茎、叶柄经切段、粉碎后过4号筛，得到大黄粉末；最后所述大黄粉末依次经加热回流提取、减压浓缩、冷冻干燥后即得。
所述提取溶剂为水。
所述水或所述乙醇的重量为所述大黄粉末重量的16~20倍。
所述加热回流提取的条件是指温度为90~100℃、提取次数3次，每次1~1.5 h。
所述减压浓缩的条件是指温度为60℃，压力为0.07MPa。
所述冷冻干燥的条件是指温度为-45℃~50℃，真空度为0.16~0.5mbar。
如上所述的一种来源于大黄非药用部位的活性提取物在降血脂、消食、润肠通便的医药或保健品中的应用，其特征在于：该医药或保健品中至少包含有该活性提取物，并配以药学上或生理学上可接受的载体，以常规的中药制备工艺制成药剂学上的任何一种剂型。
所述剂型是指口服片剂、胶囊剂、软胶囊、颗粒剂、分散片、滴丸中的任意一种。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明原材料来源广泛，所得提取物含有大黄多糖，酒石酸、苹果酸等成分。
提取的提取物成分分析如下：
【1】标准品及实验试剂
番泻苷A(批号YJ-C3-WG1160324)、番泻苷B(批号YJ-C3-WG1160324)购自江苏永健医药科技有限公司，纯度＞98%；芦荟大黄素(批号795-201503)、大黄素(批号756-201509)、大黄酚(批号895-201526)、大黄素甲醚(批号758-201506)均购自中国药品生物制品检定所，纯度均＞98%;L-苹果酸（批号1209A021）、D(+)-无水葡萄糖（20161019），纯度>98%，购自北京索莱宝科技有限公司;苯酚（批号：20131119，烟台市双双化工有限公司）；硫酸（批号：2015031901，成都市科龙化工试剂厂）。甲醇(色谱纯，SOECTRUM CHENICAL MFG.CORP)，甲醇(分析纯，立安隆博华(天津)医药化学有限公司)，磷酸(分析纯，天津科密欧化学试剂公司)，灭菌注射用水(四川科伦药业股份有限公司)，自制超纯水，其他试剂均为分析纯。
【2】常规成分的测定及参考标准（见表1）：
表1
【3】苹果酸、酒石酸的含量测定：
3.1仪器：
高效液相色谱仪（U3000），依利特色谱柱（sino-chrom ODDS 4.6*250mm）；流动相：用0.1 %磷酸溶液-甲醇=97：3 (体积比)比例的流动相等度洗脱10 min，然后用较短的时间梯度让甲醇相达到100%并平衡5 min，再将流动相调整为0.1 %磷酸溶液-甲醇=97：3 (体积比)的比例，平衡5 min。检测波长：210 nm；进样量：20μl。
3.2溶液的配置：
精密称取L-苹果酸标准品0.0073 g,L-酒石酸0.0231 g,用注射用水定容至10 ml容量瓶中，其中苹果酸质量浓度为0.73 mg/ml标准品溶液、酒石2.31 mg/ml；
精密称取L-苹果酸标准品0.0027 g,用注射用水定容至10 ml容量瓶中，得到苹果酸质量浓度为0.27 mg/ml；
精密称取L-酒石酸标准品0.014 g, 用注射用水定容至10 ml容量瓶中，得到苹果酸质量浓度为1.4 mg/ml；
样品溶液：称取唐古特大黄茎提取物三份：0.4669 g、0.5196 g、0.5117 g；分别加80%的乙醇，充分振摇至混悬液，减压过滤，滤液减压旋转蒸发至干，用注射用水溶解后定容至10 ml容量瓶中。
3.3苹果酸、酒石酸标准曲线的制作
分别吸取苹果酸、酒石酸标准品溶液0.2 ml、0.4 ml、 0.8 ml、1.6 ml、 3.2ml，用注射用水定容至5 ml容量瓶中，得苹果酸溶液质量浓度为0.0292 mg/ml 、0.0584 mg/ml、0.1168 mg/ml、 0.2336 mg/ml、 0.4672 mg/ml；酒石酸溶液质量浓度为0.0924 mg/ml、0.1848 mg/ml、 0.3696 mg/ml、 0.7392 mg/ml、 1.4784 mg/ml；进样20μl,以质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标得苹果酸回归方程y=10.522X+0.0567 ,R2 =0.9997，线性范围0.0292 mg/ml~0.4672 mg/ml线性范围良好；酒石酸回归方程y=20.733X+0.3132 ,R2 =0.9998，线性范围：0.0924 mg/ml~1.4784 mg/ml，在该线性范围内良好。
3.4苹果酸标准曲线见图1、酒石酸的标准曲线见图2。
3.5样品含量的测定
分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液20μl,按上述色谱条件，重复进样，记录峰面积，采用外标法，得苹果酸含量为1.64%、酒石酸含量为7.16%，其高效液相色谱图见图3、图4。
【4】蒽醌类成分分析
仪器：高效液相色谱仪（U3000），watersC-18柱（4.6*150mm）；流动相：0.1 %磷酸溶液:甲醇=15:85(体积比)。检测波长：254 nm；进样量：40μl；
4.1总蒽醌的测定：
4.1.1配置标准品溶液：分别精密称取大黄素0.0014 g,大黄素甲醚0.0012 g，大黄酚0.0016 g，大黄酸0.0018 g，芦荟大黄素0.0010 g，分别用色谱醇甲醇定容至10 ml,混匀。得大黄素质量浓度为0.14 mg/ml、大黄素甲醚质量浓度为0.12 mg/ml、大黄酚质量浓度为0.16 mg/ml、大黄酸质量浓度为0.18 mg/ml、、芦荟大黄素质量浓度为0.10 mg/ml；分别精密吸取大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素各1 ml，用色谱醇甲醇分别定容至10 ml容量瓶中；其中大黄素质量浓度为14μg/ml、大黄素甲醚质量浓度为12μg/ml、大黄酚质量浓度为16μg/ml、大黄酸质量浓度为18μg/ml、芦荟大黄素质量浓度为10μg/ml。
4.1.2标准曲线工作液:
分别吸取上述标准储备溶液0.15 ml、 0.3 ml 、0.6 ml 、1.2 ml 、2.4 ml，用色谱醇甲醇定容至10 ml容量瓶中，混匀，得标准曲线工作液1、2、3、4、5中大黄素质量浓度分别为0.21μg/ml、0.42μg/ml 、0.84μg/ml 、1.68μg/ml 、3.36μg/ml；大黄素甲醚质量浓度分别为0.18μg/ml、0.36μg/ml、0.72μg/ml、1.44μg/ml、2.88μg/ml；大黄酚质量浓度分别为0.24μg/ml、0.48μg/ml、0.96μg/ml、1.92μg/ml、3.84μg/ml；大黄酸质量浓度分别为0.27μg/ml、0.54μg/ml、1.08μg/ml、2.16μg/ml、4.32μg/ml；芦荟大黄素质量浓度分别为0.15μg/ml、0.30μg/ml、0.60μg/ml、1.20μg/ml、2.4μg/ml。
4.1.3提取物样品溶液的配置：
4.1.3.1提取物总蒽醌含量测定溶液：
称取唐古特大黄茎提取物约1g,加入甲醇20ml,加热回流1.5h,过滤，定容至50ml,吸取5ml, 置烧瓶中，挥去溶剂，加入8%的盐酸10 ml，超声2min,再加三氯甲烷10 ml ，加热冷凝回流1.5h,分取三氯甲烷层，酸液再加入氯仿萃取3次，每次10ml,合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇，定容于10ml容量瓶中。
4.1.3.2提取物游离蒽醌的含量测定溶液：
称取提取物约1 g,加入甲醇20ml,加热回流1 h,过滤，滤液定容至25 ml容量瓶中。
4.1.4标准曲线及线性范围
分别精密吸取上述对照品及样品溶液各40μl,按照上述色谱条件，进样测定，记录峰面积，以质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标制作大黄素标准曲线（见图5），得回归方程Y=1.5737x+0.1107 R2 =0.9993，结果表明大黄素质量浓度在0.21μg/ml～3.36μg /ml范围内与峰面积线性范围良好；
4.1.5实验结果：
分别精密吸取样品溶液各40μl,按上述色谱条件，进样测定，记录峰面积，采用外标法，得唐古特大黄茎提取物大黄素含量为0.0047%。具体色谱图见图6，图7。芦荟大黄素----2.4μg/ml；大黄酸----4.32μg/ml；大黄素----3.36μg/ml；大黄酚 ----3.84μg/ml；大黄素甲醚----2.88μg/ml；样品溶液----1.0020 g/ml。
4.1.6实验结论
唐古特大黄茎提取物总蒽醌中含有微量的大黄素。
4.2游离蒽醌的测定
按照总蒽醌提取回流1.5h的提取液进行进样测定，其中游离蒽醌类成分中检测到大黄素，含量为0.0014%。具体色谱图见图8，对照品色谱图见图6。
4.3.1对照品溶液的配置：
番泻苷A溶液的配置：精密称取番泻苷A 0.0016 g,用40%的甲醇溶液定容至10 ml容量瓶中，得番泻苷B溶液质量浓度为0.16 g/ml；
番泻苷B溶液的配置：精密称取番泻苷B 0.0016 g,用40%的甲醇溶液定容至10 ml容量瓶中，得番泻苷B溶液质量浓度为0.16 g/ml；
番泻苷A、B溶液的配置：吸取番泻苷A、番泻苷B溶液各4 ml,定容于10 ml容量瓶中，得番泻苷A质量浓度为0.064 mg/ml，番泻苷B质量浓度为0.064 mg/ml；
4.3.2样品溶液的配置：
精密称取唐古特大黄茎提取物0.5102 g；用40%的甲醇超声30 min,过滤，滤液定容至25 ml容量瓶中，得质量浓度为2.04 g/ml的唐古特大黄茎溶液。
4.3.3样品含量的测定
分别精密吸取对照品及样品溶液各10μl,按上述色谱条件，进样测定，具体色谱图见图9、图10。
【5】大黄多糖的测定
5.1标准品的配置：
96 mg/ml葡萄糖标准品溶液的配置：精密称取干燥无水葡萄糖标准品0.0096 g,用灭菌注射用水定容与100 ml容量瓶中，得葡萄糖质量浓度为96 mg/ml;
80%苯酚溶液:称取80 g的重蒸馏苯酚于100 mI一烧杯中，加水溶解，转至100 mI一棕色容量瓶中定容，置4℃冰箱中避光保存。
5%苯酚溶液:吸取5 ml 80%苯酚溶液，溶于75 ml水中，混匀，现用现配。
5.2标准曲线的绘制：
分别吸取0 ml,0.2 ml,0.4 ml,0.6 ml,0.8 ml,1.0 ml的标准葡萄糖工作溶液置于10ml具塞试管中，用蒸馏水补至1.0 ml。向试液中加人1.0 ml苯酚溶液,然后快速加入5.0 ml浓硫酸溶液 (与液面垂直加人，勿接触试管壁，以便与反应液充分混合)，静置10 min, 使用旋涡振荡器使溶液混合均匀，用注射用水补至7 ml刻度处，然后将试管放置于30℃水浴中反应20 min, 490 nm测吸光度。以葡萄糖质量浓度为坐标，吸光度值为纵坐标，制定标准曲线。
5.3样品溶液的配置：
分别称取唐古特大黄茎提取物0.2042 g,0.2047 g,0.2035 g,加水5 ml浸润，再加20ml无水乙醇，混匀，超声30 min,4000 r/min离心10 min，弃去上清液，不容物用10 ml 80%的无水乙醇洗涤。沉淀物中加入50 ml灭菌注射用水，超声30 min，过滤，定容至200 ml,容量瓶中，比色测定。
5.4样品中大黄多糖的测定：
按照上述步骤吸取0.5ml样品测定液于10 ml具塞试管中，按步骤操作，测定吸光度。
5.5实验结果
分别精密吸取葡萄糖标准品溶液0.6，样品溶液0.5ml,按上述显色步骤显色，得葡萄糖、大黄多糖紫外吸收曲线图分别见图11、图12。
5.6葡萄糖标准曲线及线性范围：
按照上述测定，以质量浓度（ug/ml）为横坐标，以吸光度值为纵坐标制作葡萄糖的标准曲线图（见图13）,得大黄素回归方程Y=0.0682x+0.022， R2 =0.9991，结果表明大黄素质量浓度在2.74μg/ml～13.71μg /ml范围内与峰面积线性范围良好。
5.7样品含量的测定
按照上述操作，根据回归方程计算大黄多糖含量见表2：
表2：样品大黄多糖的含量
5.8实验结果：唐古特大黄茎提取物中大黄多糖含量为6.62%。
2、本发明所得提取物来源于天然植物，安全性高，见效快，动物实验结果表明，该提取物可以显著降低血清中TC、TG，具有降血脂的功效，可以在辅助降血脂保健品中作为大黄药材的替代品，避免了含有蒽醌类成分的降血脂产品所带来的常见副作用。
【1】
材料、试剂及仪器：乙醚（批号：20131209，利安博隆华医药科技有限公司）；4%多聚甲醛（批号：20161017，北京索莱宝科技有限公司） ；甘油三酯测定试剂盒（批号：167511）、总胆固醇测定试剂盒（批号：161941）、高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒（批号：160621）、低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒（批号：160651）、葡萄糖测定试剂盒 （批号：163561）、均购自中生北控生物科技有限公司 ；辛伐他汀（批号：M029950，杭州默沙东制药有限公司）；灭菌注射用水（批号：M17021105，四川科伦药业股份有限公司）；Thermo离心机（Thermo科技公司）；Vitalab ISP-21半自动生化分析仪（荷兰Vital Scientific公司） ；全自动生化分析仪（型号：BX-3010，sysmex公司）；BP210S电子天平（赛多利斯有限公司） ；JD2000-2电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）。
【2】原理
用含有胆固醇、蔗糖、猪油、胆酸钠的饲料喂养动物可形成脂代谢紊乱动物模型，再给予动物受试样品，可检测受试样品对高脂血症的影响，并可判定受试样品对脂质的吸收、脂蛋白的形成、脂质的降解或排泄产生的影响。
【3】高脂饲料
在维持饲料中添加20.0%蔗糖、15%猪油、1.2%胆固醇、0.2%胆酸钠（北京科奥协力有限公司，合格证号：SCXK（京）20140010）。
【4】降血脂结果的判定
辅助降低血脂功能结果判定：模型对照组和空白对照组比较，血清甘油三酯升高，血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇升高，差异均有显著性，判定模型成立。（1）各剂量组与模型对照组比较，任一剂量组血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇降低，且任一剂量组血清甘油三酯降低，差异均有显著性，同时各剂量组血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于模型对照组，可判定该受试样品辅助降低血脂功能动物实验结果阳性。（2）各剂量组与模型对照组比较，任一剂量组血清总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇降低，差异均有显著性，同时各剂量组血清甘油三酯不显著高于模型对照组，各剂量组血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于模型对照组，可判定该受试样品辅助降低血清胆固醇功能动物实验结果阳性。（3）各剂量组与模型对照组比较，任一剂量组血清甘油三酯降低，差异均有显著性，同时各剂量组血清总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇不显著高于模型对照组，血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于模型对照组，可判定该受试样品辅助降低血清甘油三酯功能动物实验结果阳性。
【5】实验方法：
5.1高血脂动物模型的建立： SPF级，健康成年雄性SD大鼠60只，体重200±20g，由兰州军区总医院动物科提供，合格证号：SYXK（军）2012-0029。。适应性喂养7天后分组，按体重随机分为两组，一组10只，对照组；另一组为造模组，每组50只。对照组喂食正常饲料，高脂组喂食高脂饲料。对照组喂食正常饲料，造模组喂食高脂饲料，喂养10天后，测定血脂。将造模组按血脂再分组：模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性药物组，使每一组血脂无统计学差异。
5.2灌胃溶液的制备及灌胃剂量
称取唐古特大黄茎提取物25.0 g,12.0 g,6.75 g,分别倒入100 ml烧杯中，加注射用水溶解,制成质量浓度为250 mg/ml, 120 mg/ml, 675 mg/ml的溶液,放入冰箱冷藏，备用，用完再配；
取辛伐他汀片（20 mg/片）4片，加注射用水至110 ml,振摇至完全溶解，得辛伐他汀质量浓度为0.73 mg/ml，放入冰箱冷藏备用（用完再按上述剂量配置）；
5.3给药剂量
对照组和模型组灌胃灭菌注射用水(10 ml/Kg-1),高剂量组（2500 mg/Kg-1·d-1 ）、中剂量组（1250 mg/Kg-1·d-1 ）、低剂量组（675 mg/Kg-1·d-1 ），阳性药物组（7.3 mg/Kg-1·d-1 ）分别以相同剂量灌胃唐古特大黄茎提取物和辛伐他汀。
5.4指标的测定：
实验各组按相应剂量灌胃，毎隔10天大鼠乙醚麻醉，眼眶采血（采血前给食给水），静置30 min,4000r/ min离心，分离血清。灌胃30天后，禁食不禁水，大鼠断头采血，以相同方法分离血清，测定各组大鼠生化指标。
5.5统计方法
使用SPSS17.0进行统计学处理，各组数据均表示为。进行方差齐性检验，若方差齐，采用方差分析，两组间检验采用LSD-t检验，P<0.05表示具有统计学差异。
【6】实验结果：
6. 1各组大鼠摄食量的变化
如表3所示，与正常组比较，高脂饲料喂养各组摄食量减少，10 d、20 d、30 d时各组差异均有统计学意义；与模型组比较，高剂量组、中剂量组和低剂量组在10 d摄食量相对下降，差异有统计学意义，在20 d、30 d时高剂量组与模型组差异有统计学差异；
表3：各组大鼠摄食量的变化（g·bw-1 d-1，）
注:* P<0.05, ** P<0.01 ,与对照组比较；＃P<0.05 ，＃＃P<0.05，与模型组比较。
6. 2各组大鼠饮水量的变化
如表4所示，与正常组比较，高脂饲料喂养各组饮水量减少，10 d、20 d、30 d时各组差异均有统计学意义；与模型组比较，高剂量组在10 d、20 d、30 d饮水量相对下降，差异有统计学意义，在10d、30d时中剂量组与模型组差异有统计学差异；
表4：各组大鼠饮水量的变化（g·bw-1 d-1，）
注：* P<0.05, ** P<0.01 ,与对照组比较；＃P<0.05 ，＃＃P<0.05，与模型组比较。
6. 3灌胃后各组大鼠体重
如表5所示，造模前各组大鼠体重没有统计学差异。造模10天后，不禁食不禁水，眼眶采血，分离血清，测定各组大鼠血脂。将模型组各组大鼠随机分组，使得各组没有统计学差异。与正常组比较，高脂饲料喂养各组体重增加缓慢。 20 d、30 d、40 d时高剂量组与正常组有统计学意义；与模型组比较，40 d高剂量组有统计学差异。
表5：灌胃后各组大鼠体重情况（g·bw-1，）
注： * P<0.05, ** P<0.01 ,与对照组比较；＃P<0.05，＃＃P<0.05，与模型组比较；
6. 4灌胃前各组的血脂
如表6所示，造模10天后，不禁食不禁水，眼眶采血，静置30 min,4000r/ min离心，离心10 min,分离血清，测定各组大鼠血脂。将模型组各组大鼠随机分组，使得各组没有统计学差异。与正常组比较，造模组各组TC、TG、HDL-C、LDL-C显著升高，差异均有统计学意义，造模成功。
表6：灌胃前各组的血脂情况（mmol﹒L-1,）
注： * P<0.05, ** P<0.01 ,给药组与对照组比较； ＃P<0.05 ， ＃＃P<0.05，给药组与模型组比较；
6.5灌胃10天后各组的血脂
如表7所示，灌胃 10天后，不禁食不禁水，眼眶采血，静置30 min,4000r/ min离心，离心10 min,分离血清，测定各组大鼠血脂。与正常组比较，造模组各组TC、TG、HDL-C、LDL-C显著升高，其中，各组TC、TG、高剂量组LDL-C差异均有统计学意义；与模型组比较，高剂量组、中剂量组、低剂量组TG显著下降，其中，高剂量组差异有统计学意义。
表7：灌胃10天后各组的血脂情况（mmol﹒L-1,）
注： * P<0.05, ** P<0.01 ,与对照组比较； ＃P<0.05 ， ＃＃P<0.05，与模型组比较；
6. 6灌胃20天后各组的血脂
如表8所示，灌胃 20天后，不禁食不禁水，眼眶采血，静置30 min,4000r/ min离心，离心10 min,分离血清，测定各组大鼠血脂。与正常组比较，造模组各组TC、TG、HDL-C、LDL-C显著升高，其中，各组TC、TG、LDL-C差异均有统计学意义；与模型组比较，高剂量组、中剂量组、低剂量组TG显著下降，其中高剂量组、低剂量组差异有统计学意义。
表8：灌胃20天后各组的血脂变化（mmol﹒L-1,）
注：* P<0.05, ** P<0.01 ,与对照组比较；＃P<0.05 ，＃＃P<0.05，与模型组比较；
6. 7灌胃30天后各组的血脂
如表9所示，灌胃 30天后，不禁食不禁水，眼眶采血，分离血清，测定各组大鼠血脂。与正常组比较，造模组各组TC、TG、HDL-C、LDL-C显著升高，其中，各组TC差异均有统计学意义；与模型组比较，高剂量组、中剂量组、低剂量组TG显著下降，其中高剂量组、中剂量组、低剂量组差异有统计学意义。
表9：灌胃30天后各组的血脂（mmol﹒L-1, ）
注：* P<0.05, ** P<0.01 ,与对照组比较；＃P<0.05 ，＃＃P<0.05，与模型 组比较；
6. 8各组大鼠生化指标的测定
如表10所示，与正常组比较，给药组各组AST、ALT、BUN值有下降的趋势，其中，高剂量组、中剂量组AST、ALT，各组BUN差异均有统计学意义；与模型组比较，高、中、低3个剂量组AST、ALT与模型组有统。
表10：各组大鼠生化指标的测定
注：* P<0.05, ** P<0.01 ,与对照组比较；＃P<0.05 ，＃＃P<0.05，与模型组比较；
6. 9大鼠脏器指数的测定（g·bw-1，）
如表11所示，与正常组比较，给药组各组肝脏指数、脾脏指数及肾脏指数上升，其中各组肝脏指数差异均有统计学意义，给药组各组脾脏指数及模型组肾脏指数差异均有统计学意义；与模型组比较，高剂量脾脏指数显著上升，低剂量组有下降的趋势。
表11：各组大鼠脏器指数
注： * P<0.05, ** P<0.01 ,与对照组比较；＃P<0.05，＃＃P<0.05，与模型组比较；
【7】实验结论
成分组成与传统大黄有根本性不同；提取物具有良好的降脂、消食作用，安全性好；其降脂作用机理与传统大黄明显不同。
因大黄含有果胶等成分，在高剂量灌胃下，大鼠出现消化不良，导致摄食量减少，体重减轻外，未见明显的副作用。通过测定大鼠血清中肝脏相关生化指标发现，ALT，AST明显下降，提示该提取物可能有保护肝脏的作用。
通过测定大鼠血清中的TC、TG，发现该提取物可以很好的降低喂食高脂饲料导致的高血脂大鼠血清中的TC 、TG，尤其能够显著降低血清中TG，因此，可以作为纯天然辅助治疗降血脂保健品的研究和开发利用。
3、本发明所得提取物具有较好的润肠通便作用。
【1】药材、试剂及仪器：大黄提取物、集热式恒温加热磁力搅拌器（型号：DF-101S，巩义市予华仪器有限责任公司）、复方地芬诺酯片（新乡市常乐制药有限责任公司，批号：16102551），麻仁丸（福州海王金象中药制药有限公司，批号：160402）、阿拉伯树胶粉（天津市光复精细化工研究所）、水为蒸馏水、活性炭细粉、BP210S电子天平（Sartorius AG，德国）、带刻度卷尺、手术剪、镊子，小鼠所用饮水瓶均采用高温煮沸灭菌处理、药物溶液现用现配、实验温度20~25 ℃, 空调恒温，相对湿度:40% ~70%。
【2】 润肠通便实验参考《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）“通便功能检验方法”：
2.1实验对象：BALB/c雌性小鼠120只，体重20±2 g，由兰州军区兰州总医院动物实验中心提供，合格证号：SYXK（军）2012-0029。
2.2实验方法：
墨汁配制：准确称量阿拉伯树胶10 g加水80 ml，煮沸至溶液透明，称取活性炭细粉5 g加至上述溶液中并煮沸3次，待溶液常温后加水定容至100 ml，备用（造模前一天配制，并放置于4℃冰箱冷藏备用）。
0.025%复方地芬诺酯溶液的配置：取复方地芬诺酯片25 mg（10片），用研钵研碎呈粉末后加水至100 ml,临用前配置。
0.025%复方地芬诺酯溶液的配置：取复方地芬诺酯片50 mg（20片），用研钵研碎呈粉末后加水至100 ml,临用前配置。
大黄提取物的配置：称取大黄提取物22.0 g、11.0 g、5.5 g,分别溶解至100 ml烧杯中。
2.3大黄提取物对小鼠小肠运动的影响：
BALB/c雄性小鼠60只，按体重随机分为6组，即空白组、阳性对照（麻仁丸）组、复方地芬诺酯便秘模型组、大黄提取物高、中、低剂量组，实验采用灌胃法给予受试物，灌胃量为0.2mL /10 g.bw.d，。空白对照组、复方地芬诺酯便秘模型组, 给予灭菌注射用水灌胃; 阳性对照麻仁丸组给予1.0 g/kg.bw麻仁丸；大黄提取物高、中、低剂量组分别给予2200 mg/kg.bw、1100 mg/kg.bw、550 mg/kg.bw，以上各组连续给药7 d ，禁食16 h，空白对照组给予等容积蒸馏水，其余各组动物分别灌胃给予复方地芬诺酯（5 mg /kg.bw），给药体积为 0.2mL /10 g.bw。造模 30min后，药物各剂量组与阳性对照组按相应剂量给予含相应药物的炭末混悬液（含炭末0.05 g/mL），空白对照组和模型组给予等容积墨汁（含炭末0.05 g /mL），灌胃体积均为0.2 mL/10 g.bw。上述给药30 min后用颈椎脱臼法处死小鼠，剪取上端自幽门下端至回盲部的肠管，不加牵引并平铺成直线测量肠管长度为小肠总长度，从幽门至墨汁前沿为墨汁推进长度。
按下式计算墨汁推进率：
墨汁推进率（%）=墨汁推进长度（cm）/小肠总长度（cm）×100%
2.4大黄提取物对小鼠排便量的影响：
BALB/c雄性小鼠60只，按体重随机分为6组，即空白组、阳性对照组、复方地芬诺酯便秘模型组、大黄提取物高、中、低剂量组，实验采用灌胃法给予受试药物，灌胃量为0.2mL /10g.bw.d。空白对照组、复方地芬诺酯便秘模型组均给予灭菌注射用水灌胃; 阳性对照组给予麻仁丸1.0 g/kg.bw; 大黄提取物高、中、低剂量组分别给予2200 mg/kg.bw、1100 mg/kg.bw、550 mg/kg.bw。以上各组连续给药7 d，禁食16 h，空白对照组给予等容积蒸馏水，其余各组动物分别给予复方地芬诺酯（10 mg /kg.bw） , 复制小鼠便秘模型，给药体积为0.2 mL /10 g.bw。造模30 min后，药物各剂量组与阳性对照组按相应剂量给予含相应药物的炭末混悬液（含炭末0.05 g/mL），空白对照组和模型组给予等容积墨汁（含炭末0.05 g/mL），灌胃体积均为0.2 mL/10 g.bw。各组小鼠给药后单笼饲养，给食给水，观察并记录每只小鼠首次排黑便时间、6 h内排便粒数及排便时间点。
2.5实验结果：
a大黄提取物对小鼠小肠运动的影响（见表12）。
表12 小鼠小肠推进率
注：*表示模型与空白组相比 P<0.05、**表示模型与空白组相比 P<0.01；#表示模型与给药组相比P<0.05，# # 模型与给药组P<0.01。
从表12可以得出，模型组小鼠小肠炭末推进率与空白组相比具有显著性差异（P<0.01），证明本实验采用复方地芬诺酯成功获得便秘小鼠模型；大黄提取物高、中剂量与复方地芬诺酯模型组相比,有显著性差异（ P< 0.01）、低剂量组（550 mg/kg）与模型组相比无明显差异；通过小肠运动实验发现，大黄提取物高、中、低剂量组显示出一定的量效关系。
b小鼠首次排黑便时间、6 h排便次数以t检验统计处理数据, 结果见表13。
表 13 小鼠首次排黑便时间、6 h排便次数
注：*表示模型与空白组相比 P<0.05、**表示模型与空白组相比 P<0.01；#表示模型与给药组相比P<0.05，# # 模型与给药组P<0.01。
从表13可以得出，复方地芬诺酯模型组小鼠首次排黑便时间与空白组间存在显著性差异（P< 0.01），证明本实验采用复方地芬诺酯成功获得便秘小鼠模型；大黄提取物剂量组及阳性组小鼠首次排黑便时间较模型组明显缩短，与复方地芬诺酯模型组相比均具有显著性差异（P< 0.01）。6 h内复方地芬诺酯模型组小鼠排黑便粒数及排便量较少，与空白组正常小鼠相比具有显著性差异（P< 0.01），大黄提取物灌胃各组小鼠排黑便粒数及重量增加，高、中、低剂量与模型组相比均具有显著性差异（P< 0.05）。
2.6实验结论：
2.6.1大黄提取物成分分析及安全性
大黄植物地上部分（茎、叶柄）的提取物经HPLC分析表明，该提取物仅含有很低大黄素成分、大黄多糖及有机酸等成分，不含番泻苷A、番泻苷B，因此，与大黄药材（根及根茎）含有的蒽醌类成分有根本性的区别，避免了大黄药材中因番泻苷类成分引起的腹痛、腹泻及黑结肠病变等副作用。
本实验对小鼠连续7天灌胃大黄提取物(2.2g/Kg,20 ml/kg)，该剂量没有引起小鼠腹泻，实验结束后解剖各组小鼠，未见明显的脏器病理变化。
综上所述，该提取物润肠通便可能是由该提取物中含有果胶等膳食纤维，增强了肠道自然排便反射，因而促进肠道蠕动、缩短粪便通过肠道时间而改善肠道功能。
2.6.2润肠通便的研究
通过采用复方地芬诺酯建立小鼠便秘模型，选取小肠推进率、6 h排便量及6 h的排便颗粒等3个指标研究大黄提取物对复方地芬诺酯所致便秘小鼠的润肠通便作用。表1中灌胃大黄提取物的各组小鼠小肠推进率均高于模型组，且与剂量呈正相关，显示大黄提取物可以显著促进小鼠肠蠕动。从表2中我们可以看到，模型组首次排黑便的时间显著长于正常组，证明造模成功。大黄各剂量组6 h排便粒数和6 h排便重量与模型组有显著差异，证明大黄提取物可以显著促进小鼠一定时间内的排便。
通过上述3个指标的研究表明，该提取物具有较好的润肠通便作用，可以开发成一种润肠通便保健食品。
4、本发明提取工艺简单，质量可控，生产成本低，不但可以促进大黄资源的合理利用，实现良好的生态效益，而且社会效益和经济效益显著。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明中苹果酸标准曲线。
图2为本发明中酒石酸标准曲线。
图3为本发明中酒石酸、苹果酸标准品色谱图。
图4为本发明中大黄茎提取物样品溶液。
图5为本发明中大黄素标准曲线图。
图6为本发明中对照品色谱图（1：芦荟大黄素2：大黄酸、3：大黄素、4：大黄酚、5：大黄素甲醚）。
图7为本发明中提取物样品溶液(3：大黄素)。
图8为本发明中唐古特大黄茎提取物(3：大黄素)。
图9为本发明中番泻苷A、番泻苷B标准品溶液色谱图（1：番泻苷B、2：番泻苷A）。
图10为本发明中唐古特大黄茎提取液（2.04 g/ml）。
图11为本发明中葡萄糖标准溶液的紫外吸收曲线图。
图12为本发明中样品溶液的紫外吸收曲线图。
图13为本发明中葡萄糖的标准曲线。
具体实施方式
实施例1 一种来源于大黄非药用部位的活性提取物，该提取物是指将首先采摘于5~8月份的大黄茎、叶柄，去掉腐叶、花絮，并将茎对半剖开，阴干，得到干燥的大黄茎、叶柄；然后干燥的大黄茎、叶柄切段后放入粉碎机粉碎，过4号筛，得到大黄粉末；最后，取大黄粉末0.5 Kg, 装入煎煮袋中，放入多功能动态提取罐中，加16倍量水，加热回流提取，温度100℃，煎煮1.5 h，煎煮3次，过滤、合并3次滤液，在温度为60℃、压力为0.07MPa的条件下减压浓缩至浸膏状，分装浸膏至冷冻干燥瓶中，于温度为-45℃、真空度为0.16mbar的条件下进行冷冻干燥后即得。以大黄多糖计含量>6.0%。
实施例2 一种来源于大黄非药用部位的活性提取物，该提取物是指将首先采摘于5~8月份的大黄茎、叶柄，去掉腐叶、花絮，并将茎对半剖开，阴干，得到干燥的大黄茎、叶柄；然后干燥的大黄茎、叶柄切段后放入粉碎机粉碎，过4号筛，得到大黄粉末；最后，取大黄粉末0.5 Kg, 装入煎煮袋中，放入多功能动态提取罐中，加20倍量水，加热回流提取，温度100℃，煎煮1.5 h，煎煮3次，过滤、合并3次滤液，在温度为60℃、压力为0.07MPa的条件下减压浓缩至浸膏状，分装浸膏至冷冻干燥瓶中，于温度为50℃、真空度为0.5mbar的条件下进行冷冻干燥后即得。以大黄多糖计含量>6.0%。
实施例3 一种来源于大黄非药用部位的活性提取物，该提取物是指将首先采摘于5~8月份的大黄茎、叶柄，去掉腐叶、花絮，并将茎对半剖开，阴干，得到干燥的大黄茎、叶柄；然后干燥的大黄茎、叶柄切段后放入粉碎机粉碎，过4号筛，得到大黄粉末；最后，取大黄粉末0.5 Kg, 装入煎煮袋中，放入多功能动态提取罐中，加18倍量水，加热回流提取，温度90℃，煎煮1 h，煎煮3次，过滤、合并3次滤液，在温度为60℃、压力为0.07MPa的条件下减压浓缩至浸膏状，分装浸膏至冷冻干燥瓶中，于温度为0℃、真空度为0.33mbar的条件下进行冷冻干燥后即得。以大黄多糖计含量>6.0%。
实施例4 一种来源于大黄非药用部位的活性提取物，该提取物是指将首先采摘于5~8月份的大黄茎、叶柄，去掉腐叶、花絮，并将茎对半剖开，阴干，得到干燥的大黄茎、叶柄；然后干燥的大黄茎、叶柄切段后放入粉碎机粉碎，过4号筛，得到大黄粉末；最后，取大黄粉末0.5 Kg, 装入煎煮袋中，放入多功能动态提取罐中，加18倍量水，加热回流提取，温度95℃，煎煮1.2 h，煎煮3次，过滤、合并3次滤液，在温度为60℃、压力为0.07MPa的条件下减压浓缩至浸膏状，分装浸膏至冷冻干燥瓶中，于温度为-25℃、真空度为0.25mbar的条件下进行冷冻干燥后即得。以大黄多糖计含量>6.0%。
实施例5 一种来源于大黄非药用部位的活性提取物，该提取物是指将首先采摘于5~8月份的大黄茎、叶柄，去掉腐叶、花絮，并将茎对半剖开，阴干，得到干燥的大黄茎、叶柄；然后干燥的大黄茎、叶柄切段后放入粉碎机粉碎，过4号筛，得到大黄粉末；最后，取大黄粉末0.5 Kg, 装入煎煮袋中，放入多功能动态提取罐中，加20倍量水，加热回流提取，温度100℃，煎煮1.5 h，煎煮3次，过滤、合并3次滤液，在温度为60℃、压力为0.07MPa的条件下减压浓缩至浸膏状，分装浸膏至冷冻干燥瓶中，于温度为25℃、真空度为0.45mbar的条件下进行冷冻干燥后即得。以大黄多糖计含量>6.0%。
上述实施例1~5中所得的来源于大黄非药用部位的活性提取物在降血脂、消食、润肠通便的医药或保健品中的应用是指：该医药或保健品中至少包含有该活性提取物，并配以药学上或生理学上可接受的载体，以常规的中药制备工艺制成药剂学上的任何一种剂型。
其中：剂型是指口服片剂、胶囊剂、软胶囊、颗粒剂、分散片、滴丸中的任意一种。
实施例6 大黄提取物颗粒剂的制备：
取大黄提取物25.0 g，加水适量，润湿，再加乳糖100.0 g，制成软材，过40~40目筛，60~70℃减压干燥，过筛整粒，即得。
实施例7 大黄提取物口服液的制备：
取大黄提取物25g，加水溶解至200ml，即得。
上述实施例是对本发明的进一步详细说明，但不意味着对本发明的任何限制。在不脱离本发明上述思想的情况下，根据本领域普通技术知识和常规手段做出的各种替换方式或变更，均包含在本发明之内。

Claims (8)

1.一种来源于大黄非药用部位的活性提取物，其特征在于：该提取物是指将首先采摘于5~8月份的大黄茎、叶柄，去掉腐叶、花絮，并将茎对半剖开，阴干，得到干燥的大黄茎、叶柄；然后所述干燥的大黄茎、叶柄经切段、粉碎后过4号筛，得到大黄粉末；最后所述大黄粉末依次经加热回流提取、减压浓缩、冷冻干燥后即得。
2.如权利要求1所述的一种来源于大黄非药用部位的活性提取物，其特征在于：所述提取溶剂为水。
3.如权利要求2所述的一种来源于大黄非药用部位的活性提取物，其特征在于：所述水或所述乙醇的重量为所述大黄粉末重量的16~20倍。
4.如权利要求1所述的一种来源于大黄非药用部位的活性提取物，其特征在于：所述加热回流提取的条件是指温度为90~100℃、提取次数3次，每次1~1.5 h。
5.如权利要求1所述的一种来源于大黄非药用部位的活性提取物，其特征在于：所述减压浓缩的条件是指温度为60℃，压力为0.07MPa。
6.如权利要求1所述的一种来源于大黄非药用部位的活性提取物，其特征在于：所述冷冻干燥的条件是指温度为-45℃~50℃，真空度为0.16~0.5mbar。
7.如权利要求1所述的一种来源于大黄非药用部位的活性提取物在降血脂、消食、润肠通便的医药或保健品中的应用，其特征在于：该医药或保健品中至少包含有该活性提取物，并配以药学上或生理学上可接受的载体，以常规的中药制备工艺制成药剂学上的任何一种剂型。
8.如权利要求7所述的一种来源于大黄非药用部位的活性提取物在降血脂、润肠通便的医药或保健品中的应用，其特征在于：所述剂型是指口服片剂、胶囊剂、软胶囊、颗粒剂、分散片、滴丸中的任意一种。
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