CN103127251A - 大黄地上部分提取物及其提取纯化方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大黄地上部分提取物及提取纯化方法和用途。本发明大黄地上部分提取物，具有良好的泻下、抗炎、清除有机自由基作用，其活性与大黄相似，这对开发大黄的非药用部位提供了有效的理论依据，为扩展大黄药源提供了可能，降低了对大黄植物资源的浪费，带来巨大的经济效益和社会效益同时，极大促进生态环境保护和资源的持续利用；同时，本发明大黄地上部分提取物的制备方法，能够有效富集大黄地上部分中泻下、抗炎的有效成分，操作简便，方法稳定，具有良好的工业应用前景。

Description

大黄地上部分提取物及其提取纯化方法和用途

技术领域

本发明涉及大黄地上部分提取物及其提取纯化方法和用途。

背景技术

大黄，为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheumtanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎。

传统中医药仅以大黄地下部分入药，由于长期形成的用药习惯，大黄的地上部分基本弃之不用，导致了大黄药材资源的浪费。但是，在藏民族医药学中，大黄的叶、柄，性温，可除培根病以及治疗多种疾病。同时，大黄地上部位秋季自然枯萎，每年均可采收，资源丰富，如能对其加以研究开发，将产生极大的经济效益和社会效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大黄地上部分提取物及其提取纯化方法和用途。

本发明提供了大黄地上部分的提取纯化方法，它包括如下操作步骤：

（1）取大黄地上部分，用30-95%v/v乙醇提取，过滤，滤液回收乙醇后，再调节pH至8-10，取上清液调节pH至5～7，得大黄地上部位提取液母液备用；

（2）取步骤（1）制备的大黄地上部位提取液母液，上大孔吸附树脂柱，用水洗除去杂质后，先用5-15%乙醇洗脱至洗脱液无色，弃去洗脱液；再用碱性醇溶液洗脱至洗脱液无色，合并洗脱液，调节pH值至中性，浓缩至干浸膏，再加入75-95%v/v乙醇溶解，静置，取上清液，浓缩、干燥，即得大黄地上部分提取物；

其中，所述碱性醇溶液为0.05-0.4mol/L NaOH或KOH水溶液：35-95％v/v乙醇=1:（1-15）v/v。

进一步地，步骤（1）中，所述乙醇浓度为60～70%v/v，回收乙醇后的滤液调节pH至9-10；步骤（2）中，所述大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂，水洗除杂后，先用5～10%v/v乙醇洗脱至洗脱液无色，再用0.2-0.4mol/L NaOH或KOH水溶液：75％v/v乙醇=1:（5-15）v/v的碱性醇溶液洗脱。

更进一步地，步骤（1）中，乙醇浓度为65-70%v/v，回收乙醇后的滤液调节pH至9，取上清液调节pH至7；步骤（2）中，水洗除杂后，先用10%v/v乙醇洗脱至洗脱液无色，再用0.4mol/L NaOH或KOH水溶液：75％v/v乙醇=1:5v/v洗脱。

更进一步地，所述大孔吸附树脂型号为D101或X-5。

其中，所述碱性醇溶液的流速为2～4ml/min，其用量为5～10倍柱体积。

进一步地，步骤（1）中，溶解干浸膏的乙醇浓度为95%v/v。

其中，所述大黄为药用大黄Rheum officinale Baill.。

本发明还提供了一种大黄地上部分提取物，该提取物中，总蒽醌含量不低于15%w/w。

其中，所述提取物是由上述方法制备而成的。

本发明还提供了上述大黄地上部分提取物在制备泻下、抗炎、清除有机自由基的药物或保健品中的用途。

本发明大黄地上部分提取物，具有良好的泻下、抗炎、清除有机自由基作用，其活性与大黄相似，这对开发大黄的非药用部位提供了有效的理论依据，为扩展大黄药源提供了可能，降低了对大黄植物资源的浪费，带来巨大的经济效益和社会效益同时，极大促进生态环境保护和资源的持续利用；同时，本发明大黄地上部分提取物的制备方法，能够有效富集大黄地上部分中泻下、抗炎的有效成分，操作简便，方法稳定，具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1 D101型大孔树脂对大黄地上部位总蒽醌成分的动态吸附曲线

图2 不同药液浓度下D101树脂静态交换吸附总蒽醌趋势图

图3 大黄地上部位总蒽醌洗脱曲线图

具体实施方式

实施例1 大黄地上部分提取物的制备

准确称取540.0g大黄地上部位粉末，加入28倍量67.25%的乙醇，在80℃水浴回流提取2次，每次1.5h。过滤，滤液减压浓缩至无醇味，用NaOH溶液调节pH至9，3500r/min离心后，取上清液，用HCl调至中性，浓缩至十倍原浓度，得到大黄地上部位提取液母液。准确称取D101树脂150g，加入大黄地上部位提取液母液中，置于20℃恒温水浴箱中，静态吸附24h后，将树脂连同剩余药液一同装柱，流出液倒回柱中，反复动态吸附，至吸附均匀后，用重蒸水洗脱至流出液不呈黄色，再用10%乙醇冲洗至流出液接近无色，后用0.4mol/L NaOH与75％乙醇按体积比1:5进行洗脱，洗脱液用量为10柱体积，合并洗脱液，加入稀盐酸调节pH至中性，减压浓缩至干，95%乙醇溶解，离心静置过夜，取上清液，减压浓缩干燥，得大黄地上部分提取物10.3528g，出膏率为1.92%，经测定，总蒽醌含量为15.25%。

实施例2 大黄地上部分提取物制备方法的研究

1.仪器与试药

KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），UV1100紫外分光光度计（上海天美科学仪器有限公司），UPT-I-10T型优谱UPT系列超纯水器（成都超纯科技有限公司），BS124S型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司），旋转蒸发仪R-201，恒温水浴锅W201B（上海申胜生物技术有限公司），循环水式多用真空泵SHB-III（郑州长城科技工贸有限公司）。D101、D301、X-5、S-8树脂（安徽三星树脂科技有限公司），重蒸水、95%乙醇、甲醇、三氯甲烷、浓盐酸、氢氧化钠、乙酸镁等，以上分析纯试剂均购自成都科龙化工试剂厂。

实验药材于8月中旬采自四川松潘药用大黄栽培基地，经成都中医药大学李敏教授鉴定为蓼科植物药用大黄Rheum officinale Baill的干燥地上部分。大黄素（中国药品生物制品检定所110756-200110纯度>98%）

2.方法与结果

2.1 大黄总蒽醌提取液的制备

准确称取适量大黄地上部位粉末，加入28倍量67.25%的乙醇，在80℃加热回流提取2次，每次1.5h。过滤，滤液减压浓缩至无醇味，用NaOH溶液调节pH至9，3500r/min离心后，取上清液，用HCl调至中性，即得大黄地上部位提取液，生药浓度为0.216g/ml。

2.2 大黄总蒽醌含量的测定

2.2.1 标准曲线的绘制

精密称取大黄素标准品6.18mg，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，取出1ml加1%的乙酸镁-甲醇液至10ml，摇匀，以试剂空白调0，从200至600nm波长范围自动扫描，结果在511nm处有最大吸收峰。配置不同浓度的标准品溶液，在511nm处依次测定其吸光度，绘制吸光度与浓度之间的曲线y=0.0469x+0.0181，r=0.9990，线性范围：4.944-29.664μg/ml，表明其线性关系良好。

2.2.2 总蒽醌的含量测定

吸取5ml提取液，加入8%HCL 50ml，超声0.5h，再加入50ml三氯甲烷，60℃水浴回流1h，置分液漏斗中，加三氯甲烷萃取至三氯甲烷层无色，分取三氯甲烷层，挥干溶剂，甲醇定容至10ml，即得总蒽醌制备液。取适量体积总蒽醌制备液，加1％乙酸镁-甲醇溶液定容至10ml，测定吸光度，根据标准曲线方程计算总蒽醌的含量，得总蒽醌浓度为0.45mg/ml。

2.3 大孔树脂吸附与解吸附特性

2.3.1 大孔树脂的预处理

新购的大孔树脂用95%乙醇浸泡24h，装柱。先用95%乙醇冲至洗脱液加水不呈白色混浊，接着用重蒸水冲洗至洗脱液无醇味。然后用2倍柱体积的5％HCl按4～6ml/min流速冲洗，并浸泡24h，重蒸水冲洗至中性。最后用2倍柱体积的2％NaOH按4～6ml/min流速洗柱，并浸泡24h，重蒸水冲洗至中性，备用。

2.3.2 大孔树脂静态吸附量和吸附率的测定

分别准确称取经预处理过的4种大孔树脂各5.0g(吸干表面水)，分别装入100ml锥形瓶中，加入同浓度大黄地上部位提取液各30ml，振摇，放置24h，抽滤，滤液按2.2.2项下方法制成总蒽醌制备液，测定吸光度，并根据标准曲线方程计算总蒽醌成分的含量。4种大孔树脂对总蒽醌的静态吸附量和吸附率见表l。大孔树脂吸附量、吸附率、解吸量、解吸率计算公式如下：

吸附量=(母液浓度一滤液浓度)×溶液体积/干树脂量

吸附率=(母液浓度一滤液浓度)/母液浓度×100％

解吸量=洗脱液浓度×洗脱液体积/干树脂量

解吸率=解吸量/吸附量×100％

表1 4种大孔树脂对总蒽醌静态吸附量和吸附率

2.3.3 大孔树脂动态吸附量、吸附率、解吸量和解吸率的测定

准确量取预处理好的4种大孔吸附树脂各20g，装入树脂柱中，分别吸取等量大黄地上部位提取液，通过4种不同型号树脂柱，进行动态吸附。待吸附均匀一致时。停止上样，记录上样体积，计算上样量。用重蒸水冲洗树脂柱，收集所有冲洗液，定容，测定大黄总蒽醌冲洗量。计算大黄总蒽醌吸附量。将吸附的成分用95％乙醇洗脱至洗脱液近无色，定容，测定大黄总蒽醌解吸量，计算解吸率。4种大孔树脂对总蒽醌的动态吸附量和吸附率见表2。

表2 4种大孔树脂对总蒽醌动态吸附量、吸附率、解吸量和解吸率

综合考察吸附和解吸性能得出D101大孔树脂对大黄地上部位总蒽醌成分的吸附和解吸能力相当，是较为合适的纯化树脂。

2.4 大孔树脂吸附和解吸因素的确定

2.4.1 最大上样量的确定

准确称取D101树脂10g，装柱，加入含生药量为0．216g/ml的大黄地上部位提取液300ml进行交换吸附，调节流速为1ml/min，收集流出液，每10ml收集1次，共收集25份，编号，按2.2.2要求制成总蒽醌制备液，测定吸光度。D101型大孔树脂对大黄地上部位总蒽醌成分的动态吸附曲线见图1。当流出液体积为210ml时，流出液中总蒽醌含量与之后相比没有明显变化，故认为每克干树脂最大吸附大黄药材量为4.54g。

2.4.2 pH对D101树脂静态交换吸附大黄地上部位提取液的影响

准确称取3份吸干其表面水分的D101树脂各5g，置于100ml三角瓶中。分别量取大黄地上部位提取液3份各5ml，用稀盐酸调节pH分别至9、7、5，用重蒸水调整至相同体积，分别加入3份树脂中，置于20℃恒温水浴箱中，每间隔30min振荡1min，60次/min，8h后抽滤，滤液按2.2.2项下方法制成总蒽醌制备液，测定吸光度，计算总蒽醌含量，得出吸附量(mg/g)和吸附率(％)。结果如表3。

表3 不同pH下D101树脂对总蒽醌的静态吸附量和吸附率

结果可知，上样液呈中性时D101树脂对其中蒽醌类成分的静态吸附效果较好。

2.4.3 流速对D101树脂交换吸附容量的影响

准确量取大黄地上部位提取液30ml，用重蒸水稀释至90ml。准确称取4份吸干其表面水分的D101树脂各20g，分别加入30ml经过稀释的大黄地上部位提取液，考察流速1ml/min、2ml/min、3ml/min、4ml/min对D101树脂交换吸附大黄地上部位总蒽醌的影响。分别收集流出液，按2.2.2项下方法制成总蒽醌制备液，测定吸光度，计算总蒽醌含量。结果见表4.

表4 不同上样流速下流出液中总蒽醌的含量

由结果可知，流速越慢，流出液中的总蒽醌含量越少，即被D101树脂交换吸附的总蒽醌越多。

2.4.4 上样液浓度对D101树脂静态交换吸附大黄地上部位提取液的影响

准确量取大黄地上部位提取液5份各100ml，第1份稀释5倍，第2份浓度不变，第3份浓缩5倍，第4份浓缩10倍，第5份浓缩15倍。准确称取5份吸干其表面水分的D101树脂各20g，分别浸泡于上述5份提取液中，置于20℃恒温水浴箱中，每间隔30min振荡1min，60次/min，8h后抽滤，滤液按2.2.2项下方法制成总蒽醌制备液，测定吸光度，计算总蒽醌含量，得出吸附量(mg/g)，考察不同生药浓度下的吸附行为。结果如图2。

当上样浓度为原液浓度的10倍量时，D101树脂的吸附量与之后相比没有明显变化，故认为上样浓度达到原液10倍浓度即含生药量为2.16g/ml时，D101树脂的吸附量大。

2.4.5 洗脱液配对对D101树脂解吸的影响

准确称取5份已交换吸附大黄地上部位总蒽醌的D101树脂(取适量D101树脂用一定量大黄地上部位提取液浸泡过夜后抽滤)各5g，分别用100ml的50％乙醇、0.1mol/L的NaOH溶液、0.1mol/L的HCl溶液、0.1mol/L NaOH的50％乙醇溶液、0.1mol/L HCl50％乙醇溶液洗脱，洗脱5次，每次20mL溶液，溶液加入后各振荡1min，60次/min，静置30min后滤过，分别合并滤液，按2.2.2项下制成总蒽醌制备液，测定其中大黄总蒽醌的含量(mg)。各洗脱液中总蒽醌含量测定结果如表5。

表5 不同洗脱液配对洗脱下来的总蒽醌含量测定结果

可见，0.1mol/L NaOH的50％乙醇溶液洗脱下来的总蒽醌含量最大，故选用NaOH溶液与乙醇溶液混合作为洗脱剂。

4.2.6 不同碱浓度对树脂吸附影响

各取20g交换吸附大黄地上部位总蒽醌的D101树脂4份装柱，分别用0.05，0.10，0.20，0.40mol/L的NaOH洗脱剂100ml，按1.0ml/min的流速进行洗脱。分别收集洗脱液，按要求制成总蒽醌制备液，测定其中总蒽醌含量(mg)。结果见表6。

表6 不同碱浓度洗脱剂洗脱下来的总蒽醌含量测定结果

由结果可知，随着NaOH溶液浓度的增加，洗脱下来的总蒽醌也增加，但是NaOH溶液浓度太高可能会破坏大黄地上部位蒽醌类成分的性质，故选择0.40mol/L的NaOH。

2.4.7 不同醇浓度对树脂吸附影响

各取20g已交换吸附大黄地上部位总蒽醌的D101树脂装柱，分别用0.4mol/L NaOH的35％，55％，75％，95％乙醇溶液为洗脱剂，用量均为100ml，按1.0ml/min的流速进行洗脱。分别收集洗脱液，按要求制成总蒽醌制备液，测定其中总蒽醌含量(mg)。结果见表7。

表7 不同醇浓度洗脱剂洗脱下来的总蒽醌含量测定结果

由结果可知，0.4mol/L NaOH与75％乙醇溶液配对作为洗脱剂时，蒽醌类成分洗脱较完全，故选择0.4mol·L NaOH的75％乙醇溶液作为洗脱剂。

2.4.8 不同比例碱和醇影响

各取20g已交换吸附大黄地上部位总蒽醌的D101树脂4份，分别用50ml75％的乙醇和0.4mol/L的NaOH按体积比为15:1、5:1、1:1、1:4混合作为洗脱剂，用量均为100ml，按1.0ml/min的流速进行洗脱。分别收集洗脱液，按要求制成总蒽醌制备液，测定其中总蒽醌含量(mg)。结果见表8。

表8 不同比例碱和醇的洗脱剂洗脱下来的总蒽醌含量测定结果

由结果可知，用0.4mol/L NaOH与75％乙醇按体积比1:5混合，洗脱下来的总蒽醌含量最高，故确定0.4mol/L NaOH与75％乙醇按体积比1:5混合作为洗脱剂。

2.4.9 洗脱前用梯度醇冲洗考察

各取20g已交换吸附大黄地上部位总蒽醌的D101树脂3份装柱，用重蒸水洗脱至流出液不呈黄色，第1份用10%乙醇冲洗至流出液接近无色，后用选定的洗脱剂进行洗脱至洗脱液无色；第2份先用10%乙醇冲洗至流出液接近无色，再20%乙醇冲洗至流出液接近无色，后用选定的洗脱剂进行洗脱至洗脱液无色；第3份先用10%乙醇冲洗至流出液接近无色，再用20%乙醇冲洗至流出液接近无色，再用30%乙醇冲洗至流出液接近无色，后用选定的洗脱剂进行洗脱至洗脱液无色。分别收集洗脱液，按要求制成总蒽醌制备液，比较3份洗脱液总蒽醌浓度。结果显示第一份蒽醌浓度较高，故确定重蒸水洗后再用10%的乙醇冲洗至无色，后用洗脱液洗脱。

2.4.10 洗脱剂用量的确定

取D101树脂10g装柱，平行3份。分别加入含生药量2.16g/mL的大黄地上部位提取液15mL，待吸附后，用重蒸水洗脱至流出液不呈黄色，再用10%乙醇冲洗至流出液接近无色，后用0.4mol/L NaOH与75％乙醇按体积比1:5进行洗脱至洗脱液无色，收集洗脱液，每10mL作为一个流分，共收集15份。挥干，按要求制成总蒽醌制备液，测定吸光度。结果如图3。

当收集到第10份时，洗脱液中总蒽醌含量已降至0．0511mg/mL，故认为用0.4mol/L NaOH与75％乙醇按体积比1:5混合的洗脱剂十倍树脂量能将大黄总蒽醌基本洗脱下来。

2.5 结论

本实验通过对不同型号大孔吸附树脂的吸附性能进行筛选，确定采用D101树脂；通过对最大上样量、上样液pH、上样液浓度、洗脱流速、洗脱液配比、洗脱液浓度、洗脱前用梯度醇冲洗、洗脱液用量等方面的考察，得到D101树脂分离纯化大黄地上部位有效成分的技术参数：

准确称取540.0g大黄地上部位粉末，加入28倍量67.25%的乙醇，在80℃水浴回流提取2次，每次1.5h。过滤，滤液减压浓缩至无醇味，用NaOH溶液调节pH至9，3500r/min离心后，取上清液，用HCl调至中性，浓缩至十倍原浓度，得到大黄地上部位提取液母液。准确称取D101树脂150g，加入大黄地上部位提取液母液中，置于20℃恒温水浴箱中，静态吸附24h后，将树脂连同剩余药液一同装柱，流出液倒回柱中，反复动态吸附，至吸附均匀后，用重蒸水洗脱至流出液不呈黄色，再用10%乙醇冲洗至流出液接近无色，后用0.4mol/L NaOH与75％乙醇按体积比1:5进行洗脱至洗脱液无色，合并洗脱液，加入稀盐酸调节pH至中性，减压浓缩至干，95%乙醇溶解，离心静置过夜，取上清液，减压浓缩干燥，得浸膏10.3528g，出膏率为1.92%。

准确称取浸膏0.1031g，加入8%HCl50mL，超声0.5h，再加入50ml三氯甲烷，60℃水浴回流1h，置分液漏斗中，加三氯甲烷萃取至三氯甲烷层无色，分取三氯甲烷层，挥干溶剂，甲醇定容至25ml，即得总蒽醌制备液。取0.1ml总蒽醌制备液，加1％乙酸镁-甲醇溶液定容至10ml，测定吸光度为0.313，根据标准曲线方程计算总蒽醌含量为15.7225mg，纯度为15.25%。

以下通过试验例说明本发明的有益效果。

试验例1 本发明提取物的药效研究

1.仪器与试药

KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），UPT-I-10T型优谱UPT系列超纯水器（成都超纯科技有限公司），BS124S型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司），旋转蒸发仪R-201，恒温水浴锅W201B（上海申胜生物技术有限公司），循环水式多用真空泵SHB-III（郑州长城科技工贸有限公司）。D101树脂（安徽三星树脂科技有限公司），重蒸水、95%乙醇、甲醇、亚甲蓝、FeSO₄等，以上分析纯试剂均购自成都科龙化工试剂厂，地塞米松、H₂O₂购自药店，二苯基苦基苯肼(DPPH)为Sigma公司产品，三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)为Promega进口分装。

实验药材于8月中旬采自四川松潘药用大黄栽培基地，经成都中医药大学李敏教授鉴定为蓼科植物药用大黄Rheum officinale Baill的干燥药材及地上部位。大黄地上部分提取物按实施例1方法制备。

实验动物为昆明种I级小鼠（雌雄各半，体重20-25g），购于成都达硕生物科技有限公司。

2.提取物药理研究

2.1.药液制备

分别称取一定量药用大黄地下部位粉末、地上部位粉末以及大黄地上部位提取物。

药用大黄地下部位水煎液：称取大黄地下部位粗粉50g，加8倍量水浸泡30min，煎煮，煮沸15min后，过滤。于40-50℃浓缩至0.5g/ml。

药用大黄地上部位水煎液：称取大黄地上部位粗粉50g，加8倍量水浸泡30min，煎煮，煮沸15min后，过滤。于40-50℃浓缩至1g/ml。

浸膏浓缩液：5g浸膏（实施例1提取物）用50ml蒸馏水溶解(加入少量吐温)，微加热，趁热过滤，然后再定容为50ml，使其浓度为0.1g/ml，用时以蒸馏水稀释成不同浓度。

提取物高剂量液：浸膏浓缩液稀释2倍，相当于5g生药/ml。

提取物低剂量液：高剂量液稀释5倍，相当于2g生药/ml。

2.2.急毒试验

取一定数量健康小鼠（18-22g），雌雄各半，随机分为3组（空白组、浸膏母液组、高剂量组），每组个数相同。空白组灌胃给以生理盐水，浸膏母液组灌胃给以浸膏浓缩液，高剂量组灌胃给以高剂量液，按最大体积（0.4ml/10g）连续灌胃2次，中间间隔8h，每天观察记录小鼠的行为、体征表现以及活动，结果小鼠各方面表现均正常，无小鼠死亡。其结果表明，该浸膏为无毒物质。

2.3.泻下作用的研究

2.3.1.提取物对正常小鼠排便时间和数量的影响

①急性致泻

取一定数量健康小鼠（18-22g），雌雄各半，随机分为5组（空白组、地下组、地上组、提取物高剂量组、提取物低剂量组），每组个数相同。灌胃给药后置代谢笼中连续观察5小时(观察期间禁水禁食)，按粪便性状分为正常、软便(粪粒成形，但松软膨大，含水分较多，或在滤纸上呈水渍迹)、溏便(粪便略成形或不成形如稠状)、稀水便(稀薄或如水样)四等。分别记录软便、溏便和稀便第一次排出时间，如表9。

表9 急性致泻试验数据

结果显示，本发明提取物有一定的致泻作用，且与地上部位水提液相比作用强，但是与地下部位相比作用较弱。

②碳末法

取一定数量健康小鼠，雌雄各半，随机分为5组（空白组、地下组、地上组、提取物高剂量组、提取物低剂量组），每组个数相同。连续灌胃给予相应药物2日，每日1次，然后禁食不禁水，20-24小时后，灌胃给予相应碳末混悬药液（含碳末0.1g/ml），灌胃量为0.2ml/10g。此时开始计时，将各鼠分置于铺有滤纸的小鼠笼内进行观察。记录出现黑便的时间，排黑便的数量、性状以及稀粪沾染肛门的情况，连续观察4h，将结果进行统计学处理，如表10。

表10 碳末法试验数据

结果显示，本发明提取物有一定的促进排便作用，与地上部位水提液相比作用相差不大，与地下部位相比作用较弱。

2.3.2.自身粪便实热模型

取一定数量健康小鼠，雌雄各半，随机分为5组（空白组、地下组、地上组、提取物高剂量组、提取物低剂量组），每组个数相同。用自身粪便制成10%的相应混悬药液，连续灌胃给予相应混悬药液2日，每日1次，然后禁食不禁水12h后再次灌胃，30min后，灌胃给予相应碳末混悬药液，0.2ml/10g。此时开始计时，将各鼠分置于铺有滤纸的小鼠笼内进行观察。记录出现黑便的时间，排黑便的数量、性状以及稀粪沾染肛门的情况，连续观察至现象不发生变化，将结果进行统计学处理，如表11。

表11 自身粪便湿热模型实验数据

结果显示，提取物有一定的泻热作用，且与地上部位水提液相比作用强，但是与地下部位相比作用较弱。

2.4.抗炎作用的研究

实验用药液制备方法同泻下作用研究制备药液，另制备阳性药液地塞米松（0.1mg/ml）。

2.4.1.耳肿胀实验

取一定数量健康雄性小鼠，小鼠随机分成6组（空白组、阳性组、地下组、地上组、高剂量组、低剂量组），分别灌胃给予相应药物，每日1次，连续3天，实验前12h禁食不禁水，末次给药30min后，分别用移液枪取二甲苯15μl，均匀涂抹于每只小鼠左侧耳廓正反面，4h后将小鼠颈脱臼处死，剪下双耳，用打孔器分别在同一部位打下直径7mm耳片，精密称重。数据进行统计学处理，如表12。

水肿程度=（涂药耳片-未涂药耳片）/未涂药耳片×100%

表12 耳肿胀实验数据

结果显示，本发明提取物有抗炎效果，且效果优于地下部位水提液。

2.4.2.棉球肉芽肿试验

取一定数量健康雄性小鼠，随机分成6组（空白组、阳性组、地下组、地上组、高剂量组、低剂量组），每组个数相同。将棉花搓成0.01g左右的坚实棉球，消毒酒精浸泡0.5h后烘干。将棉球植入小鼠腋窝皮下，两天后开始给药。连续灌胃给予相应药物5日，最后一次灌胃1h后，将小鼠颈椎脱臼处死，取出棉球，将棉球先称湿重，再烘干至恒重后称干重。数据进行统计处理，如表13。

表13 棉球肉芽肿实验数据

本发明提取物与地下组比较差异显著，有统计学意义（^*p<0.05,^**p<0.01）。结果显示，提取物有抗炎效果，且效果优于地下部位。

2.5 抗氧化作用的研究

2.5.1 有机自由基的清除

分别取药用大黄地下、地上部位粉末各2g，28倍量67.25%的乙醇，在80℃加热回流提取2次，每次1.5h。过滤，滤液减压浓缩至无醇味，甲醇溶解定容至50ml，作为地下、地上的母液。另取本发明提取物0.02g，甲醇溶解定容至50ml，作为提取物母液。

取上述3种母液各0.1ml，分别与0.032mg/ml的DPPH无水甲醇溶液2.0ml混合均匀，避光环境反应30min后于517nm处测定吸光度(A_样)。以0.1ml甲醇代替试样测得的吸光度(A₀)。结果见表14。每组平行3次，取均值。

自由基清除率计算公式为：清除率＝[(A₀－A_样)/A₀]×100%

表14 有机自由基的清除

由结果可知，提取物对有机自由基有一定的清除作用，但是效果不及地下、地上部位原药材。

2.5.2 羟基自由基的清除

分别取药用大黄地下、地上部位粉末各1g，28倍量67.25%的乙醇，在80℃加热回流提取2次，每次1.5h。过滤，滤液减压浓缩至无醇味，蒸馏水溶解定容至50ml，作为地下、地上的母液。另取提取物0.01g，甲醇溶解定容至50ml，作为提取物母液。

在5ml容量瓶中依次加0.05mol/LpH8.0的Tris-HCl缓冲液1.0ml，0.02g/L亚甲蓝1.5ml，2mmol/LFeSO₄溶液0.50ml，上述三种试样溶液1.0ml，0.5%H₂O₂溶液0.5ml，蒸馏水稀释至刻度。37℃水浴中加热反应60min，在664nm处测其吸光度(A_样)。在其他条件不变的情况下，蒸馏水代替样品测得的吸光度为空白吸光度(A₀)。结果见表15。每组平行3次，取均值。

表15 羟基自由基的清除

由结果可知，提取物对羟基自由基有一定的清除作用，但是效果不明显。

3.结论与讨论

3.1此大黄茎叶提取物有一定的泻下、抗炎效果，且效果优于地上部位水提物，其中抗炎效果更优于地下部位，同时也具有一定的抗氧化作用。

3.2泻下实验中，提取物作用稍弱的原因可能是在纯化的过程中大量使用酸碱调节pH，使结合类蒽醌受到破坏，而大黄中泻下作用主要由结合类蒽醌发挥，所以提取物的泻下作用稍弱。

3.3急性致泻实验中，提取物在高剂量时出现稀便，说明此剂量下提取物有致泻作用；然在低剂量时没有稀便出现，仅有软便及溏便，说明此剂量下提取物致泻作用不明显，但可以润肠。

3.4提取物的抗炎效果优于地下部位原药材，说明地上部位中的抗炎成分很有可能被富集到本发明提取物中。

3.5该提取物具有一定的抗氧化作用，但效果不是十分理想，可能是因为原药材中具有抗氧化作用的成分在富集纯化的过程中有一部分被除去。

3.6该药用大黄地上部位提取物具有一定的泻下抗炎作用，可以作为减肥药物或者作为抗炎药物的中间体加以开发利用。提取物的药效与大黄药材药效相似，可以作为药材的替代资源加以使用。同时，作为浸膏来源的地上部位通常都被舍弃，若能将这些地上资源充分利用不仅对环境保护有巨大意义，而且有利于资源的综合开发利用。

本发明大黄地上部分提取物，具有良好的泻下、抗炎、清除有机自由基作用，其活性与大黄相似，这对开发大黄的非药用部位提供了有效的理论依据，为扩展大黄药源提供了可能，降低了对大黄植物资源的浪费，带来巨大的经济效益和社会效益同时，极大促进生态环境保护和资源的持续利用；同时，本发明大黄地上部分提取物的制备方法，能够有效富集大黄地上部分中泻下、抗炎的有效成分，操作简便，方法稳定，具有良好的工业应用前景。

Claims (10)

1.大黄地上部分的提取纯化方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

（1）取大黄地上部分，用30-95%v/v乙醇提取，过滤，滤液回收乙醇后，再调节pH至8-10，取上清液调节pH至5～7，得大黄地上部位提取液母液备用；

（2）取步骤（1）制备的大黄地上部位提取液母液，上大孔吸附树脂柱，用水洗除去杂质后，先用5-15%乙醇洗脱至洗脱液无色，弃去洗脱液；再用碱性醇溶液洗脱至洗脱液无色，合并洗脱液，调节pH值至中性，浓缩至干浸膏，再加入75-95%v/v乙醇溶解，静置，取上清液，浓缩、干燥，即得大黄地上部分提取物；

其中，所述碱性醇溶液为0.05-0.4mol/L NaOH或KOH水溶液：35-95％v/v乙醇=1:（1-15）v/v。

2.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：步骤（1）中，所述乙醇浓度为60～70%v/v，回收乙醇后的滤液调节pH至9-10；步骤（2）中，所述大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂，水洗除杂后，先用5～10%v/v乙醇洗脱至洗脱液无色，再用0.2-0.4mol/L NaOH或KOH水溶液：75％v/v乙醇=1:（5-15）v/v的碱性醇溶液洗脱。

3.根据权利要求2所述的提取纯化方法，其特征在于：步骤（1）中，乙醇浓度为65-70%v/v，回收乙醇后的滤液调节pH至9，取上清液调节pH至7；

步骤（2）中，水洗除杂后，先用10%v/v乙醇洗脱至洗脱液无色，再用0.4mol/L NaOH或KOH水溶液：75％v/v乙醇=1:5v/v洗脱。

4.根据权利要求2所述的提取纯化方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂型号为D101或X-5。

5.根据权利要求2或3所述的提取纯化方法，其特征在于：所述碱性醇溶液的流速为2～4ml/min，其用量为5～10倍柱体积。

6.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：步骤（1）中，溶解干浸膏的乙醇浓度为95%v/v。

7.根据权利要求1-6任意一项所述提取纯化方法，其特征在于：所述大黄为药用大黄Rheum officinale Baill.。

8.一种大黄地上部分提取物，其特征在于：该提取物中，总蒽醌含量不低于15%w/w。

9.根据权利要求8所述的大黄地上部分提取物，其特征在于：所述提取物是由权利要求1-7任意一项所述方法制备而成的。

10.权利要求8或9所述的大黄地上部分提取物在制备泻下、抗炎、清除有机自由基的药物或保健品中的用途。

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